CN104904751B

CN104904751B - 一种小麦赤霉病液体生防菌剂及其制备方法

Info

Publication number: CN104904751B
Application number: CN201510165246.9A
Authority: CN
Inventors: 陈亮; 关二旗; 李瑞静; 王金水; 卞科
Original assignee: Henan University of Technology
Current assignee: Henan University of Technology
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2015-04-09
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2035-04-09
Also published as: CN104904751A

Abstract

本发明属于微生物领域和农业病害防治领域，公开了一种小麦赤霉病液体生防菌剂及其制备方法。该生防菌剂有效活性成分由枯草芽孢杆菌及其发酵代谢产物、生化黄腐酸和壳寡糖等组成，所述的枯草芽孢杆菌优选已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.9377的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilius)LM3403。该生防菌剂各有效组份通过不同作用方式协同防治小麦赤霉病，防效更好，且环境友好、无残留、无公害和不产生抗药性。

Description

一种小麦赤霉病液体生防菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物领域和农业病害防治领域，具体涉及一种小麦赤霉病液体生防菌剂及其制备方法。

背景技术

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌侵染引起的真菌性病害，致病能力极强，可以侵染小麦的各个部位，主要危害穗部；在小麦生长各个阶段都能发病，苗期侵染引起苗腐，中后期侵染引起秆腐和穗腐，尤以穗腐危害最大。在大流行年份，一般减产10～20%，严重时达80～90%，甚至绝产，造成巨大损失。小麦赤霉病不仅造成麦类产量减少、品质下降、出粉率降低，而且病菌代谢产物含有脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉蜀黍赤霉烯酮等真菌毒素，可引起人畜中毒，发生呕吐、头昏、腹痛、怀孕母畜流产等严重后果。化学农药的长期施用带来了农药残留、病原菌抗药性增强和环境污染等严重问题，利用拮抗微生物及其活性物质防治作物病害的优点逐渐显现，绿色生防制剂的研究已成为热点。

生化黄腐酸是腐殖酸的一种，是以植物渣体为主要原料，经微生物发酵得到的分子量较小、活性较高的黄腐酸物质。除含有高含量黄腐酸外，生化黄腐酸还富含植物生长过程中所需的几乎全部氨基酸、氮、磷、钾、多种酶类、糖类、维生素等营养成份。研究报道，生化黄腐酸能够促进植物根系发育、提高根系活力，提高作物的抗冻、抗病性，提高多种酶活性，促进光合作用，促进糖分和干物质积累，提高作物产量和品质，是一种公认的绿色生理活性物质。

壳寡糖是一类由N-乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖通过β-(1,4)-糖苷键连接起来的低聚合度水溶性的糖类。壳寡糖可刺激植物生长和诱导植物产生抗病性，同时壳寡糖还具有广谱抑菌活性并对人畜无害。壳寡糖本身含有丰富的碳和氮，可促进有益微生物的生长而抑制一些植物病原菌。另外有研究报道，壳寡糖可解除DON毒素对小麦黄化苗生长及胚细胞启动的抑制作用，表明壳寡糖可提高小麦对DON毒素的抗性。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦赤霉病液体生防菌剂及其制备方法。

本发明提供的一种小麦赤霉病液体生防菌剂，其有效活性成分由枯草芽孢杆菌及其发酵代谢产物组成、生化黄腐酸和壳寡糖组成。

本发明所述枯草芽孢杆菌优选已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.9377的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilius)LM3403，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年6月25日。

枯草芽孢杆菌菌株LM3403能够合成三种抗菌脂肽(Surfactin、Fengycin和Iturin)和γ-聚谷氨酸。菌株LM3403抗菌谱广，对病原细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌等）、腐败真菌（黑曲霉、黄曲霉、灰绿曲霉、扩展青霉等）、病原真菌（禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、尖孢镰孢菌、链格孢霉、细极链格孢、根菌索菌、橄榄色盾壳霉、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、禾谷丝核菌、绿色木霉等）等均具有较好的抑制作用。

按照本领域技术人员公知的方法，本发明所述的生防菌剂在实际应用时可制成农业上允许的任意剂型，较好的制剂剂型是水分散粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、微乳剂、水乳剂或悬乳剂。

本发明所述的生防菌剂可以以成品制剂形式提供，即生防菌剂中各组分已经混合；也可以以单剂制剂提供，使用前直接混合。

本发明的有益效果：

本发明提供的一种小麦赤霉病液体生防菌剂，其有效活性分由枯草芽孢杆菌及其发酵代谢产物、生化黄腐酸和壳寡糖组成，属于不同作用机理的活性成分，协同作用下对小麦赤霉病防效更好，且各组分均属于绿色的、环境友好的、无毒害的、兼有药效和肥效双重生物调节功能的活性成分。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1：菌株LM3403分离筛选

采集生长在海拔3000米以上高寒无污染草原的野生牦牛牛粪。采用梯度稀释、涂布分离的方法，对样品中细菌菌株进行涂布分离。挑取形态差异明显的菌落进行划线纯化、编号、保存备用。采用滤纸片法、平板对峙法考察待测菌株的抑菌能力，将得到的广谱抑菌能力最强的菌株命名为LM3403。菌株LM3403对禾谷镰刀菌抑菌带宽度为(6.7±1.1)mm。

实施例2：菌株LM3403鉴定

菌株LM3403在NA平板上菌落圆形、不透明乳白色、较黏稠、边缘不整齐；细胞呈杆状，革兰氏阳性，芽孢中生、椭圆形。需氧生长：阳性，运动性：阳性，V-P试验：阳性，过氧化氢酶试验：阳性，吲哚试验：阳性，淀粉水解：阳性，酪蛋白水解：阳性，明胶液化：阳性，葡萄糖发酵试验：阳性，硝酸盐还原：阳性，尿素利用：阳性，菌株LM3403的形态特征、生理生化特征与枯草芽孢杆菌标准株保持一致。菌株LM3403的16S rDNA序列与Bacillus subtilisstrain SPA N1(JQ308575)、Bacillus subtilis strain ME2(JQ900623)和Bacillus subtilis strain BDT3(HQ711982)的同源性达到100%。综合分析确定菌株LM3403为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例3：菌株LM3403抗菌脂肽提取和分析

将菌株发酵液于4℃、12000rpm离心15min，收集无菌上清液；用6mol/L的HCl将无菌上清液调至pH2.0，4℃静置过夜后12000r/min、4℃离心15min，收集沉淀；向沉淀中加入适量甲醇，于磁力搅拌器上搅拌30min后，放入4℃冰箱内静置抽提8h，抽提结束后4℃、12000rpm离心15min，得到甲醇抽提液。经减压浓缩、真空冷冻干燥后，得到抗菌物质，-20℃保存。取真空冷冻干燥后的抗菌物质，溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，配制成一定浓度的抗菌物质溶液，4℃保存备用。

样品红外光谱结果显示，1652cm⁻¹和1538.66cm⁻¹两处吸收分别为酰胺谱带Ⅰ和Ⅱ，表明样品中含有肽链；2960-2860cm⁻¹和1455-1380cm⁻¹两处吸收是脂肪酸链的C-H伸缩振动，1240cm⁻¹为内酯的特征吸收，表明样品中含有脂肪酸；故推测为脂肽类物质。样品茚三酮反应阴性，说明无自由N端；酸水解后茚三酮反应、双缩脲反应均阳性，故推测为环脂肽。

ESI-MS质谱分析结果显示，m/z值1030、1044、1058处离子峰分别与C₁₃-Surfactin[M+Na⁺]、C₁₄-Surfactin[M+Na⁺]、C₁₅-Surfactin[M+Na⁺]分子量吻合，推测为脂肽Surfactin同系物；m/z值1065、1079、1093处离子峰分别与C₁₄-Iturin[M+Na⁺]、C₁₅-Iturin[M+Na⁺]、C₁₆-Iturin[M+Na⁺]分子量吻合，推测为脂肽Iturin同系物；m/z值1449、1463、1477处离子峰分别与C₁₅-Fengycin[M+H⁺]、C₁₆-Fengycin[M+H⁺]、C₁₇Fengycin[M+H⁺]分子量吻合，推测为脂肽Fengycin同系物。

实施例4：发酵液制备

取平板活化后的枯草芽孢杆菌LM3403二环，接入装液量150mL/500mL的营养肉汤培养基，30℃下175rpm摇床振荡培养24h得到种子液；将种子液全部接入装有3L发酵培养基的5L全自动发酵罐，33℃、转速300r/min、通气量18L/min、pH7.0下培养50h得到发酵液。

实施例4：发酵液制备

取平板活化后的枯草芽孢杆菌LM3403一环，接入装液量100mL/250mL的营养肉汤培养基，30℃下175rpm摇床振荡培养24h得到种子液；将种子液全部接入装液量1L/2L的大三角瓶，33℃、摇床转速250r/min、pH7.0下培养44h得到发酵液。

实施例6：液体生防菌剂制备

称取生化黄腐酸3g、壳寡糖5g加入1L发酵液(活菌数3×10⁸cfu/mL)，混合均匀，即得液体生防菌剂。

实施例7：液体生防菌剂制备

称取生化黄腐酸8g、壳寡糖1g加入1L发酵液(活菌数5×10⁷cfu/mL)，混合均匀，即得液体生防菌剂。

实施例8：液体生防菌剂制备

称取生化黄腐酸5g、壳寡糖3g加入1L发酵液(活菌数5×10⁸cfu/mL)，混合均匀，即得液体生防菌剂。

实施例9：小麦赤霉病防治试验

小区面积5m²，小麦品种，扬花初期喷雾，喷雾体积800mL，实验组为液体生防菌剂，阳性对照组为50%多菌灵1000倍液，空白对照为水。

实验组、阳性对照组、空白对照组喷雾处理后，立即进行禾谷镰刀菌菌悬液喷雾接种，喷雾体积800ml，菌悬液浓度5×10⁵cfu/mL。

每组重复4次。参照NYT 1464.15-2007进行病情调查、病情指数计算和防效计算。结果见表1。

表1 液体生防菌剂防治小麦赤霉病小区试验效果

处理	病情指数	防效(%)
			空白对照组	22.3	/
阳性对照组	14.8	33.63%
			实施例6	4.5	79.82%
实施例7	6.3	71.75%
			实施例8	3.9	82.51%

对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对上述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种小麦赤霉病液体生防菌剂，其有效活性成分由枯草芽孢杆菌及其发酵代谢产物、生化黄腐酸和壳寡糖组成，所述枯草芽孢杆菌为已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.9377的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LM3403，并且所述液体生防菌剂中生化黄腐酸、壳寡糖的浓度分别为3‰-8‰、1‰-5‰，液体生防菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数不小于5×10⁷cfu/mL。

2.权利要求1所述的液体生防菌剂在防治小麦赤霉病中的应用。

3.权利要求1所述液体生防菌剂的制备方法，包括：将枯草芽孢杆菌在营养琼脂平板活化16h后，接入营养肉汤种子培养基，30℃摇床振荡培养24h得到种子液；将种子液按体积比5%-10%接入发酵培养基，33℃好氧培养44h-50h得到发酵液；称取一定量的生化黄腐酸、壳寡糖加入发酵液，混合均匀，即得液体生防菌剂。

4.权利要求3所述的制备方法，其中，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖30g/L、谷氨酸5g/L、硝酸铵4g/L、磷酸二氢钾4.08g/L、磷酸氢二钠18.32g/L、硫酸镁0.096g/L、氯化钙0.78mg/L、EDTA-Na₂1.5mg/L、FeSO₄·7H₂O 556mg/L，pH7.0。