CN110452954B - 一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法。该方法利用疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力4个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌保鲜菌株的快速筛选方程：Y=0.151A+0.285B+0.029C+0.207D+0.184E+0.178F。其中，Y为综合得分，A为自凝聚率，B为疏水率，C共凝聚率，D为生物膜形成率，E为发酵上清液抑菌率，F为点种抑菌率。当0≤Y20%为低保鲜活性枯草芽孢杆菌，20%＜Y＜40%为中保鲜活性枯草芽孢杆菌，40%≤Y≤100%为高保鲜活性枯草芽孢杆菌。通过方程能够快速筛选得到具有高保鲜活性的枯草芽孢杆菌菌株。

Description

一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法。
背景技术
我国是世界上水产品产量最大的国家，鱼类养殖是我国主要的水产经济，如何有效保持水产鱼的鲜度和延长货架期是制约我国水产养殖业发展的重要问题。水产品含有丰富的蛋白质等营养物质，容易引起鱼体的腐败，导致水产品的变质，甚至影响水质和人体健康安全。因此，对水产保鲜技术的研究是当前的研究热点。
当前对水产品的保鲜主要是通过低温保藏和化学保鲜两种方式，过低的温度会影响水产品原有的风味，化学防腐保鲜技术的应用虽然有效延长了水产品的保质期，但是部分化学物质会与鱼肉发生反应从而影响其风味，同时存在对人体的健康安全隐患。
枯草芽孢杆菌是一种重要的微生态制剂，是被广泛应用于水产中的优质益生菌，且也被中国、美国FDA等列为安全的微生物菌株。它具有拮抗其他菌株黏附宿主、通过群体感应机制拮抗其他细菌成膜并生产抑菌活性物质抑制微生物生长等多种抑菌功能。因此，基于枯草芽孢杆菌的抑菌原理，利用黏附和抑菌指标可以筛选得到高效的微生态保鲜菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法。该方法利用疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率，枯草芽孢杆菌2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌菌株的快速筛选方程。该方程为得到高黏附性具有保鲜效果的枯草芽孢杆菌提供快速筛选方法。快速筛选所得高黏附效果的枯草芽孢杆菌用于鱼片保鲜，保鲜活性高，保鲜期长。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法：利用疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力4个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌菌株的快速筛选方程，通过方程快速筛选具有高保鲜活性的枯草芽孢杆菌菌株。
上述方法中，建立的枯草芽孢杆菌保鲜菌株的快速筛选方程为：Y=0.151A+0.285B+0.029C+0.207D+0.184E+0.178F
其中：Y为综合得分，A为自凝聚率，B为疏水率，C共凝聚率，D为生物膜形成能力，E为上清液抑菌率，F为点种抑菌率。
上述快速筛选方程中，当0≤Y20%为低保鲜活性枯草芽孢杆菌，20%＜Y＜40%为中保鲜活性枯草芽孢杆菌，40%≤Y≤100%为高保鲜活性枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌的疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力、抑菌活性及其上清液抑菌活性等测定方法如下：
（1）疏水性：参考微生物黏着碳氢化合物法测定枯草芽孢杆菌的表面疏水性，取过夜培养后发酵液离心重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0 ± 0.05。吸取2 mL各菌悬液和2 mL二甲苯进行混合，涡旋混合120s，于室温静置30min分层。取1mL水相，测定其OD600nm，每组平行3管，以生理盐水为空白对照组。细菌表面疏水率=（1-OD/OD0）×100%，其中OD0和OD分别是与二甲苯混匀前后水相所得OD600。
（2）自凝聚率：取过夜培养后发酵液离心重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0 ± 0.05。吸取4mL菌悬液置于10mL螺口试管中，室温静置5h后吸取1mL上层溶液测定OD600，每组每个时间点平行3管。细菌自凝聚率=（1-ODt/OD0）×100%，其中OD0和ODt分别是自凝聚前后上层溶液在600nm时测量所得吸光度值。
（3）生物膜形成能力：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min收集菌体，生理盐水洗涤两次，8000r/min离心10min后，弃上清，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0± 0.05，与新鲜TSB按1:10稀释混匀，取200uL加至96孔酶标仪中，37℃静置培养24h后弃取培养液，用200ul无菌PBS轻柔清洗2次，除去游离菌，室温下干燥。每孔加入200uL 0.1%结晶紫溶液，室温染色15min，弃去染液，去离子水清洗5次。完全干燥后，加入200uL 95%乙醇溶液，待结晶紫充分溶解后，吸取100uL放于全新96孔板中，以结晶紫染色液为对照（一般为OD590nm=4），用多功能酶标仪检测OD590nm。生物膜形成率=ODt/4。
（4）共凝聚率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min收集菌体，生理盐水洗涤两次，8000r/min离心10min后，去上清，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，将菌液OD600值调整到0.5±0.02。腐败菌和益生菌各取1.5mL在一个试管中用旋涡振荡器充分混匀，30℃孵育4h后测定混合菌液的OD600nm值。每组做三个平行，以3ml单种菌液为对照。用Handley等的公式计算共凝聚率=[(SC+LC)/2-(S+L)/(SC+LC)/2]×100，SC、LC表示腐败菌或益生菌单独孵育4h的OD值，S+L表示混合菌孵育4h后的OD值。
（5）点种抑菌率：枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂平板上，再用无菌牙签在新的牛肉膏蛋白胨培养皿中央点种接种益生菌并在30℃培养12h后，在益生菌画十字周边每隔1cm用无菌牙签点种腐败菌继续培养36h，记录最外层（A1）和最内层（A2）腐败菌的直径均值。计算公式：抑菌率（%）=（A1-A2）/A1×100%。
（6）上清液抑菌率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min，取上清液过0.25um的滤膜制成无菌上清液。将OD600nm=0.7±0.02的腐败菌10ul分别加于1m牛肉膏蛋白胨液态培养基中，实验组加入80ul的益生菌无菌上清液，对照组不加入上清液，并在30℃下培养16h，酶标仪测定OD600.
上述枯草芽孢杆菌发酵培养液通过以下步骤得到：
（1）枯草芽孢杆菌发酵液的培养：分别从营养琼脂斜面培养基中挑取已活化的枯草芽孢杆菌，划线接种于牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30-37℃摇床培养12h，再将种子液以5%（v/v）接种量接种于新鲜的牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30-37℃摇床培养24h得到发酵液。
（2）枯草芽孢杆菌发酵液的制备：以新鲜牛肉膏蛋白胨液态培养基将（1）中所述发酵培养液菌浓度调至108CFU/mL。
筛选方程的建立：
随机选择分离自罗非鱼肠道和池塘的16株枯草芽孢杆菌（编号为BSS01 -BSS16），对各自的4个细胞黏附指标和2个抑菌指标进行检测，通过以上指标进行SPSS主成分分析，得各指标在各因子得分系数矩阵（表1），三个主成分及其对应的归一化权重为0.4434、0.4092、0.1474，每个因子在每一主成分得分矩阵对应的系数乘以每一个指标的数据乘以各自所占权重，加总得到各指标的综合得分。设A为自凝聚率，B为疏水率，C共凝聚率，D为生物膜形成率，E为上清液抑菌率，F为点种抑菌率，Y为综合得分，则加总得到各指标的综合得分，化简后的益生枯草芽孢杆菌得分公式如下，得分图见图1。
Y=(A×0.467+B×0.467+C×-0.122+D×0.193+E×-0.056+F×-0.036)×44.34%+(A×-0.061+B×-0.122+C×-0.015+D×0.272+E×0.479+F×0.475)×40.92%+(A×-0.128%+B×-0.21+C×0.868+D×0.604+E×0.071+F×0.088)×14.74%
=0.151A+0.285B+0.029C+0.207D+0.184E+0.178F
其中，综合指标得分越高的黏附效果越好。
表1三种主成分各指标的得分矩阵系数
Figure 711006DEST_PATH_IMAGE001
本发明的作用效果在于：
提供一个枯草芽孢杆菌快速筛选方程，能快速筛选得到具有保鲜活性的枯芽孢杆菌保鲜菌株，缩短了筛选周期，减少成本，提高了实验结果准确性。
附图说明
图1：16株枯草芽孢杆菌综合得分图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
本发明中枯草芽孢杆菌的鉴定方法为：根据细菌鉴定手册及GB/T26428-2010，枯草菌落表面粗糙，不透明，灰白色或微黄色，有芽孢，芽孢椭圆形中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，在7%氯化钠中生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，能从D-甘露糖醇产酸，不利用丙酸盐者可判为枯草芽孢杆菌，结合16SDNA基因测序结果，均符合鉴定标准为枯草芽孢杆菌。
实施例1
随机选择分离自罗非鱼肠道和池塘的16株枯草芽孢杆菌（编号为BSS01-BSS16），对各菌株的4个细胞黏附指标和2个抑菌指标进行检测。
1. 16株枯草芽孢杆菌的疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力、抑菌活性及其上清液抑菌活性等测定方法如下：
（1）疏水性：参考微生物黏着碳氢化合物法测定枯草芽孢杆菌的表面疏水性，取过夜培养后发酵液离心重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0 ± 0.05。吸取2 mL各菌悬液和2 mL二甲苯进行混合，涡旋混合120s，于室温静置30min分层。取1mL水相，测定其OD600nm，每组平行3管，以生理盐水为空白对照组。细菌表面疏水率=（1-OD/OD0）×100%，其中OD0和OD分别是与二甲苯混匀前后水相所得OD600。
（2）自凝聚率：取过夜培养后发酵液离心重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0 ± 0.05。吸取4mL菌悬液置于10mL螺口试管中，室温静置5h后吸取1mL上层溶液测定OD600，每组每个时间点平行3管。细菌自凝聚率=（1-ODt/OD0）×100%，其中OD0和ODt分别是自凝聚前后上层溶液在600nm时测量所得吸光度值。
（3）生物膜形成能力：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min收集菌体，生理盐水洗涤两次，8000r/min离心10min后，弃上清，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0± 0.05，与新鲜TSB按1:10稀释混匀，取200uL加至96孔酶标仪中，37℃静置培养24h后弃取培养液，用200ul无菌PBS轻柔清洗2次，除去游离菌，室温下干燥。每孔加入200uL 0.1%结晶紫溶液，室温染色15min，弃去染液，去离子水清洗5次。完全干燥后，加入200uL 95%乙醇溶液，待结晶紫充分溶解后，吸取100uL放于全新96孔板中，以结晶紫染色液为对照（一般为OD590nm=4），用多功能酶标仪检测OD590nm。生物膜形成率=ODt/4。
（4）共凝聚率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min收集菌体，生理盐水洗涤两次，8000r/min离心10min后，去上清，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，将菌液OD600值调整到0.5±0.02。腐败菌和益生枯草芽孢杆菌各取1.5mL在一个试管中用旋涡振荡器充分混匀，30℃孵育4h后测定混合菌液的OD600nm值。每组做三个平行，以3ml单种菌液为对照。用Handley等的公式计算共凝聚率=[(SC+LC)/2-(S+L)/(SC+LC)/2]×100，SC、LC表示腐败菌或益生枯草芽孢杆菌单独孵育4h的OD值，S+L表示混合菌孵育4h后的OD值。
（5）点种抑菌率：益生枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂平板上，再用无菌牙签在新的牛肉膏蛋白胨培养皿中央点种接种益生枯草芽孢杆菌并在30℃培养12h后，在益生菌画十字周边每隔1cm用无菌牙签点种腐败菌继续培养36h，记录最外层（A1）和最内层（A2）腐败菌的直径均值。计算公式：抑菌率（%）=（A1-A2）/A1×100%。
（6）上清液抑菌率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min，取上清液过0.25um的滤膜制成无菌上清液。将OD600nm=0.7±0.02的腐败菌10ul分别加于1m牛肉膏蛋白胨液态培养基中，实验组加入80ul的益生菌无菌上清液，对照组不加入上清液，并在30℃下培养16h，酶标仪测定OD600.
上述测定方法中所述腐败菌为假单胞菌：分离于罗非鱼肠道，经16SDNA扩增测序为假单胞菌，为鱼体腐败的优势腐败菌。
16株枯草芽孢杆菌发酵培养液通过以下步骤得到：
（1）枯草芽孢杆菌发酵液的培养：分别从营养琼脂斜面培养基中挑取已活化的枯草芽孢杆菌，划线接种于牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30-37℃摇床培养12h，再将种子液以5%（v/v）接种量接种于新鲜的牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30-37℃摇床培养24h得到发酵液。
（2）枯草芽孢杆菌发酵液的制备：以新鲜牛肉膏蛋白胨液态培养基将（1）中所述发酵培养液菌浓度调至108CFU/mL。
3. 16株枯草芽孢杆菌6个指标的检测结果见表2。
表2 16株枯草芽孢杆菌6个指标的检测结果
Figure 818639DEST_PATH_IMAGE002
4.筛选方程的建立：
通过对以上指标进行SPSS主成分分析，得各指标在各因子得分系数矩阵（表3），三个主成分及其对应的归一化权重为0.4434、0.4092、0.1474，每个因子在每一主成分得分矩阵对应的系数乘以每一个指标的数据乘以各自所占权重，加总得到各指标的综合得分。设A为自凝聚率，B为疏水率，C共凝聚率，D为生物膜形成率，E为上清液抑菌率，F为点种抑菌率，Y为综合得分，则加总得到各指标的综合得分，化简后的益生枯草芽孢杆菌得分公式如下，得分图见图1。
Y=(A×0.467+B×0.467+C×-0.122+D×0.193+E×-0.056+F×-0.036)×44.34%+(A×-0.061+B×-0.122+C×-0.015+D×0.272+E×0.479+F×0.475)×40.92%+(A×-0.128%+B×-0.21+C×0.868+D×0.604+E×0.071+F×0.088)×14.74%
=0.151A+0.285B+0.029C+0.207D+0.184E+0.178F
其中，综合得分越高的黏附效果越好。
表3三种主成分各指标的得分矩阵系数
Figure 10586DEST_PATH_IMAGE003
实施例2
利用实施例1建立的筛选方程，快速筛选具有高保鲜活性的枯草芽孢杆菌。
以筛选自罗非鱼肠道和池塘的另外6株枯草芽孢杆菌A01、A06、A03、A11、A12、A09进行方程回代验证试验。测定此6株菌的疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力、发酵上清液抑菌率及点种抑菌率，其测定结果见表4。
将此6株菌的疏水性、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成能力、发酵上清液抑菌率及点种抑菌率这6个指标，代入实施例1的筛选方程，综合得分分别为46.40%、43.69%、33.58%、26.15%、15.60%、19.63%，得到A01、A06菌株为高保鲜活性菌株，A03、A11菌株为中保鲜活性菌株，A12、A09菌株为低保鲜活性枯草芽孢杆菌。
表4 6株枯草芽孢杆菌的黏附指标及保鲜活性
Figure 152854DEST_PATH_IMAGE004
将新鲜鱼块分别浸泡于6株枯草芽孢杆菌的发酵液中以挥发性盐基氮（TVBN-N）为保鲜指标，验证该快速筛选方法的有效性。
枯草芽孢杆菌发酵液的制备：分别从营养琼脂斜面培养基中挑取已活化的枯草芽孢杆菌，划线接种于牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30-37℃摇床培养12h，再将种子液以5%接种量于新鲜的牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30-37℃摇床培养24h得到发酵液。以新鲜牛肉膏蛋白胨液态培养基将（1）中所述发酵培养基菌浓度调至108CFU/mL。
浸泡处理：将制备的质量为2.0±0.2g鱼片放入上述30mL菌悬液中浸泡20S，以浸泡牛肉膏蛋白胨液态培养基为空白对照，取出沥干20S。
鲜度测定：置于无菌均质袋中，4℃贮藏，每24h定期取样，参照GB5009.228-2016测定挥发性盐基氮含量（TVBN），TVBN含量不得超过国家鱼肉腐败标准30mg/100g。
6株枯草芽孢杆菌的保鲜实验的结果见表5。
表5 6株枯草芽孢杆菌的保鲜实验
单位：mg/100g
Figure 37634DEST_PATH_IMAGE005
根据方程得到的高、中、低枯草芽孢杆菌生物保鲜剂进行鱼片保鲜实验，在2天后空白组鱼片已经腐败，第3天腐败时TVBN为30.43mg/100g，接种了低保鲜活性A12、A09枯草芽孢杆菌组无明显保鲜效果，中保鲜活性A03、A11枯草芽孢杆菌组则保鲜至第3天，TVBN分别为28.88mg/100g、28.16mg/100g，A01、A06枯草芽孢杆菌组鱼片则保鲜期至第4天TVBN为29.12mg/100g、28.30mg/100g。即筛选得到A01、A06为高生物防腐保鲜效果的枯草芽孢杆菌。高黏附性菌株比未进行任何处理的鱼片保鲜时间延长了2天，比低黏附延长了2天，比中黏附延长了1天。验证了本发明建立的枯草芽孢杆菌保鲜菌株的快速筛选方程的准确和有效，充分证明了本发明一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株快速筛选方法的有效性。本发明可有效缩短筛选具有生物防腐保鲜效果的枯草芽孢杆菌菌株的周期。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种枯草芽孢杆菌保鲜菌株筛选方法，其特征在于：利用疏水率、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成率4个细胞黏附相关指标和发酵上清液抑菌率、点种抑菌率2个抑菌指标建立枯草芽孢杆菌保鲜菌株的筛选方程，通过方程筛选得到具有保鲜活性的枯草芽孢杆菌菌株；
所述筛选方程为：Y=0.151A+0.285B+0.029C+0.207D+0.184E+0.178F；其中，Y为综合得分，A为自凝聚率，B为疏水率，C共凝聚率，D为生物膜形成率，E为发酵上清液抑菌率，F为点种抑菌率；
当0≤Y≤20%为低保鲜活性枯草芽孢杆菌，20%＜Y＜40%为中保鲜活性枯草芽孢杆菌，40%≤Y≤100%为高保鲜活性枯草芽孢杆菌；
所述的疏水率、自凝聚率、共凝聚率、生物膜形成率、点种抑菌率及发酵上清液抑菌活性测定方法如下：
（1）疏水率：参考微生物黏着碳氢化合物法测定枯草芽孢杆菌的表面疏水性，取过夜培养后发酵液离心重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0 ± 0.05，吸取2 mL各菌悬液和2 mL二甲苯进行混合，涡旋混合120s，于室温静置30min分层，取1mL水相，测定其OD600nm，每组平行3管，以生理盐水为空白对照组，细菌表面疏水率=（1-OD/OD0）×100%，其中OD0和OD分别是与二甲苯混匀前后水相所得OD600nm；
（2）自凝聚率：取过夜培养后发酵液离心重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0 ± 0.05，吸取4mL菌悬液置于10mL螺口试管中，室温静置5h后吸取1mL上层溶液测定OD600nm，每组每个时间点平行3管，细菌自凝聚率=（1-ODt/OD0）×100%，其中OD0和ODt分别是自凝聚前后上层溶液在600nm时测量所得吸光度值；
（3）生物膜形成率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min收集菌体，生理盐水洗涤两次，8000r/min离心10min后，弃上清，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液OD600nm=1.0± 0.05，与新鲜TSB按1:10稀释混匀，取200uL加至96孔酶标仪中，37℃静置培养24h后弃取培养液，用200ul无菌PBS轻柔清洗2次，除去游离菌，室温下干燥，每孔加入200uL0.1%结晶紫溶液，室温染色15min，弃去染液，去离子水清洗5次，完全干燥后，加入200uL95%乙醇溶液，待结晶紫充分溶解后，吸取100uL放于全新96孔板中，以结晶紫染色液为对照，对照值OD590nm=4，用多功能酶标仪检测OD590nm，测得值ODt，生物膜形成率=ODt/4×100%；
（4）共凝聚率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min收集菌体，生理盐水洗涤两次，8000r/min离心10min后，去上清，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，将菌液OD600nm值调整到0.5±0.02，腐败菌和益生枯草芽孢杆菌各取1.5mL在一个试管中用旋涡振荡器充分混匀，30℃孵育4h后测定混合菌液的OD600nm值，每组做三个平行，以3ml单种菌液为对照，用公式计算共凝聚率=[(SC+LC)/2-(S+L)/(SC+LC)/2]×100%，SC表示腐败菌单独孵育4h的OD值，LC表示益生枯草芽孢杆菌单独孵育4h的OD值，S+L表示混合菌孵育4h后的OD值；
（5）点种抑菌率：枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂平板上，再用无菌牙签在牛肉膏蛋白胨培养皿中央点种接种益生菌并在30℃培养12h后，在益生菌画十字周边每隔1cm用无菌牙签点种腐败菌继续培养36h，记录最外层A1和最内层A2腐败菌的直径均值，计算公式：点种抑菌率=（A1-A2）/A1×100%；
（6）发酵上清液抑菌率：取过夜培养后的培养液8000r/min离心10min，取上清液过0.25um的滤膜制成无菌上清液，将OD600nm=0.7±0.02的腐败菌10ul分别加于1mL牛肉膏蛋白胨液态培养基中，实验组加入80ul的益生枯草芽孢杆菌无菌上清液，对照组不加入上清液，并在30℃下培养16h，酶标仪测定OD600nm；所述腐败菌为假单胞菌。
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