CN113789279B - 一种降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于生物降解脂肪的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为热带芽孢杆菌YA‑01株。本发明还涉及一种降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂，该热带芽孢杆菌制剂含有上述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢。本发明所提供的用于生物降解脂肪的芽孢杆菌对人体安全，且能够高效生物降解脂肪，在去除脂肪用于人减肥方面具有重要的应用前景。

Description

一种降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用。
背景技术
肥胖已经成为一种全球性的流行病,世界卫生组织最新全球评估数据显示，自1975年以来，世界肥胖人数已增长近3倍，2016年18岁(含)以上成年人中逾19亿人超重，2019年，估计有3820万5岁以下儿童超重或肥胖，其中近一半生活在亚洲。在中国，2020年12月发布的《中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)》指出我国成年居民超重肥胖超过50％，6～17岁、6岁以下儿童青少年超重肥胖率分别达到19％和10.4％。肥胖已成为影响国民生命健康的因素，如肥胖人群中心血管疾病(主要是心脏病和中风)的发病率和死亡率显著高干正常人群，肥胖人群又多数伴有糖尿病发生，肥胖患者高血压发生率明显高于体重正常患者，另外肥胖易导致骨关节炎以及各种癌症的发生。
降解脂肪细菌能够产生一种水解油和脂质的酶即脂肪酶，其能够破坏脂质的酯键，产生脂肪酸和甘油。脂肪酸通过β氧化途径转化为乙酰辅酶a，最后进入三羧酸循环。目前，去除油脂的方式主要分为物理分离、化学去除和生物降解，其中微生物降解具有高效，成本低、安全性强等优点。目前发现可降解油脂的细菌主要有假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，碱杆菌属(Alcaligenes)，硝化杆菌属(Nitrobacter)。我国学者筛选获得一株变形杆菌(Proteus mirabilis)NY-201801，对油脂的降解率可达92％。
自2019年以来，我们经过多方面的研究探索，从酒窖窖泥中成功筛选出了一株高效降解油脂的微生物纯菌种，不仅具有非常重要的进一步研究的价值，而且在高效降解去除油脂方面具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一针对现有用于减肥的药物或食品效果不明显且存在副作用的问题，提供了一种用于生物降解脂肪的芽孢杆菌，该菌株的菌细胞、芽孢对人体安全，且均能够高效生物降解脂肪。
本发明的目的之二在于提供一种降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用，该菌能够高效生物降解脂肪，在生物降解去除脂肪减肥方面具有重要的应用前景。
为此，本发明第一方面提供了一种用于生物降解脂肪的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为热带芽孢杆菌YA-01株，其保藏编号为CGMCC No.22813。
在本发明的一些实施例中，所述热带芽孢杆菌YA-01株的菌细胞和/或芽孢在10天内能够将初始浓度为10g/L的牛脂或食用油(大豆油)全部降解去除。
本发明第二方面提供了一种降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂，其含有如本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢；优选地，所述热带芽孢杆菌制剂含有如本发明第一方面所述的芽孢杆菌的芽孢。
在本发明的一些实施例中，所述降解脂肪的芽孢杆菌为液态制剂；优选地，在所述降解脂肪的液态制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的浓度为(1-4)×1010/mL，优选为(2-3)×1010/mL。。
在本发明的另一些实施例中，所述降解脂肪的芽孢杆菌为固体粉末制剂；优选地，在所述降解脂肪的固体粉末制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的含量为(1-4)×1010/g，更优选为(2-3)×1010/g。
本发明第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂的制备方法，其包括：
步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得芽孢杆菌的发酵培养物；
步骤C，对芽孢杆菌的发酵培养物进行离心分离处理，收获芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢；
其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；
所述发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株的16SrDNA的同源性至少为90％的菌株；优选发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株的16S rDNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选发酵菌种的相应的菌株为本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株。
根据本发明，所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：
胰蛋白胨 5-10g；优选为8-10g；
酵母粉 5-10g；优选为8-10g；以及
NaCl 3-8g；优选为4-6g；
优选地，所述发酵培养基的pH值为7-8；
进一步优选地，在步骤B中，所述发酵培养的温度为30-45℃，优选为36-38℃。
本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述的降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂或如本发明第三方面所述的制备方法制备的降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂在制备减肥药剂中的应用，其包括：
步骤D，采用生理食盐水清洗芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢，获得芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢纯品；
步骤E，对芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行冷冻干燥，并对冷冻干燥后的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行稀释，制成用于减肥药剂。
在本发明的一些实施例中，在步骤E中，使用生理食盐水对冷冻干燥后的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行稀释，制成用于减肥药剂，制成液态减肥药剂。
在本发明的另一些实施例中，在步骤E中，使用食用淀粉冷冻干燥后的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行稀释，制成固态减肥药剂。
在本发明的一些优选的实施例中，所述减肥药剂为口服制剂。
研究发现，本发明所提供的用于生物降解脂肪的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢对人体安全，且均能够生物降解脂肪，在高效去除脂肪减肥方面具有重要的应用前景。
附图说明
为使本发明容易理解，下面结合附图来说明本发明。
图1示出热带芽孢杆菌YA-01基于16S rDNA的分子进化树。
图2示出热带芽孢杆菌YA-01生长曲线及生物降解牛脂的动力学过程。
图3示出热带芽孢杆菌YA-01生长曲线及生物降解食用油(大豆油)的动力学过程。
菌种保藏
热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)，由北京科技大学分离、鉴定，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)保藏，保藏日期：2021年7月5日，保藏编号：CGMCC No.22813。本发明中该菌株被命名为热带芽孢杆菌YA-01株(Bacillus tropicus strain YA-01)。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ、术语
本发明中所述用语“菌体”是指细菌的活细胞和/或死细胞。
本发明中所述用语“芽孢”是指芽孢杆菌在一定条件下形成的抗逆性非常强的休眠体。
本发明中所述用语“微生物制剂”是指具有医研价值的微生物为原料，利用传统技术或现代生物技术制造，作用于人体各类生理症状的预防(保健)、治疗和诊断的各种形态的制剂。
本发明所述用语“食用淀粉”是指达到“食用淀粉国家标准”(GB 31637-2016食品安全国家标准食用淀粉)的淀粉。
发明用于培养基或发酵培养过程中的“水”，在没有特别指定的情况下，是指经0.22μ滤膜过滤获得的无菌纯水。
Ⅱ、实施方案
如前所述，现有的用于减肥的药物或食品不尽如人意，存在这样或那样的问题，许多减肥药效果不明显且存在副作用。鉴于此，本发明人对于脂肪的生物降解进行了大量的研究。
在长期从事微生物研究的基础上，我们从酒窖窖泥中成功筛选出了一株高效生物降解脂肪的微生物纯菌种，不仅具有非常重要的研究价值，而且在高效生物降解去除脂肪方面具有重要的应用前景。
因此，本发明第一方面所涉及的用于生物降解脂肪的芽孢杆菌。
本发明人首先从酒窖中成功筛选出了一株芽孢杆菌。经提取基因组DNA，通过PCR扩增和基于16S rDNA测序的分子鉴定，确定为热带芽孢杆菌属(Bacillus tropicus sp.)，基于上述，该菌株被鉴定并命名为热带芽孢杆菌YA-01株(Bacillus tropicus strain YA-01)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCCNo.22813。
研究结果表明，所述热带芽孢杆菌YA-01株的菌细胞和/或芽孢在10天内能够将初始浓度为10g/L的食用油或牛脂全部降解去除。
基于上述，本发明第二至四方面进一步提供了本发明第一方面所述的用于生物降解脂肪的芽孢杆菌的用途或应用。
具体地，本发明第二方面提供了一种生物降解指脂肪的热带芽孢杆菌制剂，其属于一种生物降解脂肪的微生物制剂，其含有如本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢。
在本发明的一些优选的实施例中，所述热带芽孢杆菌制剂含有如本发明第一方面所述的芽孢杆菌的芽孢。
根据本发明的一些实施方式，所述生物降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂为液态制剂。
在本发明的一些实施例中，在所述生物降解脂肪的液态制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的浓度为(1-4)×1010/mL，优选为(2-3)×1010/mL。
根据本发明的另一些实施方式，所述生物降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂为固体粉末制剂。
在本发明的一些实施例中，在所述生物降解脂肪的固体粉末制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的含量为(1-4)×1010/g，优选为(2-3)×1010/g。
本发明第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的生物降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂的制备方法，其包括：
步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中,在30-45℃，优选为36-38℃，摇床转速100-300转/分钟下，进行发酵培养3-5天后，获得芽孢杆菌的发酵培养物；
步骤C，对芽孢杆菌的发酵培养物进行离心分离处理，收获芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢；
其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得。
正如本领域技术人员所知，目前，国际上常使用16S rRNA来进行细菌的分子鉴定，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的发酵菌株并不限定于本发明所使用的野外分离株，16S rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。图1显示了基于16S rDNA的分子进化树，本发明的所述芽孢杆菌为热带芽孢杆菌YA-01株。
因此，本发明中，所述发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株的16S rDNA的同源性至少为90％的菌株；优选发酵菌种的相应的菌株为与本发明第一方面所述的芽孢杆菌的菌株的16S rDNA的同源性至少为95％的菌株；进一步优选发酵菌种的相应的菌株为本发明第一方面所述的芽孢杆菌菌株。即在不改变热带芽孢杆菌YA-01的16S rDNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的热带芽孢杆菌YA-01，获得与本发明热带芽孢杆菌YA-01的16S rDNA高度同源菌株，并获得相应地具有相同或相似的生物降解脂肪的功能的菌株。
上述步骤C中，所述离心分离处理包括将液体发酵培养物经离心分离处理获得的沉淀物(即芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢)，利用生理食盐水重悬清洗后，再进行离心分离处理，获得芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢。
本发明对上述步骤C中的离心分离的条件没有特别的限制，在本发明的一些实施例中，例如，可以在8000-10000r/min条件下对待分离物离心处理10-20min。
根据本发明方法，所述发酵培养为菌种的摇床或发酵罐发酵培养，发酵菌种以种子液的形式接种到发酵培养基中。所述种子液的接种量为0.1％-1％(v/v)；优选所述种子液的接种量为0.2％-0.5％(v/v)；进一步优选所述种子液的接种量为0.5％(v/v)。
具体地，上述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：
胰蛋白胨 5-10g；
酵母粉 5-10g；以及
NaCl 3-8g。
优选地，上述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：
胰蛋白胨 8-10g；
酵母粉 8-10g；以及
NaCl 4-6g。
在本发明的一些实施例中，采用40％(wt/v)的氢氧化钠溶液和36％(v/v)盐酸溶液调整发酵培养基的初始pH值，所述发酵培养基的pH值为7-8。
根据本发明的一些实施方式，本发明所涉及的芽孢杆菌的制备方法还包括在步骤B之前种子培养的步骤A：挑取本发明所提供的热带芽孢杆菌YA-01株单克隆菌落接种到100mL发酵液体培养基中，在温度38℃、转速200r/min下摇床培养3天后，制得发酵菌种(种子液)。
发明人研究了不同温度对热带芽孢杆菌YA-01生长的效应，发现在温度38℃下热带芽孢杆菌YA-01生长快。
本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述的生物降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂或如本发明第三方面所述的制备方法制备的生物降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂在制备减肥药剂中的应用，其包括：
步骤D，采用生理食盐水清洗芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢，获得芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢纯品；
步骤E，对芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行冷冻干燥，并对冷冻干燥后的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行稀释，制成微生物药剂。
在本发明的一些实施例中，在步骤E中，使用生理食盐水对冷冻干燥后的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行稀释，制成用于减肥药剂，制成液态减肥药剂。
在本发明的另一些实施例中，在步骤E中，使用食用淀粉冷冻干燥后的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行稀释，制成固态减肥药剂。
在本发明的一些优选的实施例中，所述减肥药剂为口服制剂。
Ⅲ、本发明中的相关检测方法
(1)本发明中细胞和/或芽孢浓度采用以下方法测定：
热带芽孢杆菌YA-01细胞和/或芽孢浓度的测定，取热带芽孢杆菌YA-01培养物，经生理食盐水稀释一定倍数后，直接采用流式细胞仪(德国SYSMEX)测定其中的细胞和/或芽孢浓度。
(2)本发明中脂肪的浓度采用以下方法测定：
采用分光光度计法，分别对不同浓度的牛脂或大豆油的正己烷溶剂制作标准曲线，根据标准曲线测定培养基中牛脂或大豆油含量。
在45℃环境下取芽孢杆菌培养物10毫升于100毫升玻璃三角瓶中，加入20mL正己烷后密闭，在37℃摇床震荡10分钟，静置20分钟分层后取上清，在225nm处分别测定正己烷相的吸光度，根据标准曲线计算出牛脂或大豆油浓度。
Ⅲ、实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
实施例1：
(1)配制热带芽孢杆菌YA-01的生长培养基，其组成为(每升)：胰蛋白胨10.0g，酵母粉10.0g，NaCl 5.0g。用500毫升三角瓶加入配制好的液体培养基100毫升，在高温高压(121℃)下进行灭菌20分钟，然后在洁净工作台内紫外线照射下再消毒20分钟。
(2)在洁净工作台内无菌条件下，接种0.5毫升热带芽孢杆菌YA-01菌液于三角瓶液体培养基中，在温度38℃，摇床转速200转/分条件下进行批量培养3天后，通过离心后(8000转/分，10分钟)倒去上清液的方法收获热带芽孢杆菌YA-01细胞和/或芽孢。
(3)根据脂肪不同浓度，将培养制备热带芽孢杆菌YA-01细胞和/或芽孢作为一种快速、安全和高效的生物催化剂，按一定比例加入，达到迅速高效降解去除脂肪的目的。
图1显示我们筛选的菌株与热带芽孢杆菌的亲缘关系最近，因此命名为热带芽孢杆菌YA-01株。
图2表明在10天内伴随着热带芽孢杆菌YA-01细胞浓度从40亿/mL生长到230亿/mL，可以将初始浓度为10g/L的牛脂完全降解，说明热带芽孢杆菌YA-01对牛脂具有很强的生物降解能力。
图3表明在10天内伴随着热带芽孢杆菌YA-01细胞浓度从40亿/mL生长到240亿/mL，可以将初始浓度为10g/L的食用油(大豆油)完全降解，说明热带芽孢杆菌YA-01对食用油(大豆油)具有很强的生物降解能力。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (22)

1.一种用于生物降解脂肪的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为热带芽孢杆菌YA-01株，其保藏编号为CGMCC No.22813。
2.一种降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂，其含有如权利要求1所述的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢。
3.根据权利要求2所述的热带芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂为液态制剂。
4.根据权利要求3 所述的热带芽孢杆菌制剂，其特征在于，在所述降解脂肪的液态制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的浓度为(1-4)×1010/mL。
5.根据权利要求4 所述的热带芽孢杆菌制剂，其特征在于，在所述降解脂肪的液态制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢的浓度为(2-3)×1010/mL。
6.根据权利要求2 所述的热带芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂为固体粉末制剂。
7.根据权利要求6 所述的热带芽孢杆菌制剂，其特征在于，在所述降解脂肪的固体粉末制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞或芽孢的含量为(1-4)×1010/g。
8.根据权利要求7 所述的热带芽孢杆菌制剂，其特征在于，在所述降解脂肪的固体粉末制剂中，所述芽孢杆菌的菌细胞或芽孢的含量为(2-3)×1010/g。
9.一种如权利要求2-8中任意一项所述的降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂的制备方法，其包括：
步骤B，将发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养，获得芽孢杆菌的发酵培养物；
步骤C，对芽孢杆菌的发酵培养物进行离心分离处理，收获芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢；
其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得；
所述发酵菌种的相应的菌株为权利要求1所述的芽孢杆菌的菌株。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基以1L水计，包括在1L水中的以下组分：
胰蛋白胨 5-10g；
酵母粉 5-10g；以及
NaCl 3-8g。
11.根据权利要求10 所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH
值为7-8。
12.根据权利要求10 所述的制备方法，其特征在于，在步骤B 中，所述发酵培养的温度为30-45℃。
13.根据权利要求12 所述的制备方法，其特征在于，在步骤B 中，所述发
酵培养的温度为36-38℃。
14.根据权利要求10 所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基以1L
水计，包括在1L 水中的以下组分：
胰蛋白胨 8-10g；
酵母粉 8-10g；以及
NaCl 4-6g。
15.根据权利要求14 所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH
值为7-8。
16.根据权利要求14 所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述发酵培养的温度为30-45℃。
17.根据权利要求16 所述的制备方法，其特征在于，在步骤B 中，所述发
酵培养的温度为36-38℃。
18.一种如权利要求2-8中任意一项所述的降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂或如权利要求9-17中任意一项所述的制备方法制得的降解脂肪的热带芽孢杆菌制剂在制备减肥药剂中的应用，其包括：
步骤D，采用生理食盐水清洗芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢，获得芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢纯品；
步骤E，对芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行冷冻干燥，并对冷冻干燥后的热带芽孢杆菌制剂进行稀释，制成用于减肥药剂。
19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，
在步骤E中，使用生理食盐水对冷冻干燥后的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行稀释，制成用于减肥药剂，制成液态减肥药剂。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述减肥药剂为口服制剂。
21.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，在步骤E中，使用食用淀粉冷冻干燥后的芽孢杆菌的菌细胞和/或芽孢进行稀释，制成固态减肥药剂。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述减肥药剂为口服制剂。
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