CN114058532B - 一株产酶贝莱斯芽孢杆菌及其分离与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产酶贝莱斯芽孢杆菌及其分离与应用，贝莱斯芽孢杆菌为菌株NKY1，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M2021848，贝莱斯芽孢杆菌具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；具有生产纤维素酶、β‑葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和β‑甘露聚糖酶的能力，在生产中能够利用该菌株产酶对中药发酵工艺进行优化，提高药物有效成分提取率，且板蓝根本身价格较低，可以降低生产成本，优化工艺；通过对菌株NKY1进行产酶能力测定，菌种生物学特性的筛选，固态发酵培养基的筛选，固态发酵工艺的优化，发酵后成分分析，安全性试验后，得出菌株NKY1可以用于中药发酵生产。

Description

一株产酶贝莱斯芽孢杆菌及其分离与应用
技术领域
本发明涉及生物产酶技术领域，具体涉及一株产酶贝莱斯芽孢杆菌及其分离与应用。
背景技术
板蓝根(常用别名:靛青根、蓝靛根、大青根)是一种中药材，为十字花科植物菘蓝的干燥根，通常在秋季进行采挖，炮制后可入药，在中国各地均产，板蓝根分为北板蓝根和南板蓝根，北板蓝根来源为十字花科植物菘蓝(Isatis tinctoria L.)的根；南板蓝根为爵床科植物马蓝(Baphicacanthus cusia(Nees)Brem.)的根茎及根，其性寒，味先微甜后苦涩，具有清热解毒、预防感冒、利咽之功效，主要用于治疗温毒发斑、舌绛紫暗、烂喉丹痧等疾病，因此在药物制备过程中被广泛应用，
在实际生产和生活中，纤维素酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶是非常重要的酶种；而板蓝根属于低价格药材，如果能将板蓝根进行处理，来提高纤维素酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶的产量，既节省了生产成本，又提高了纤维素酶、β- 葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶的产量，这将是实际生产和生活的一大进步；
而在现有技术中，并没有相关的研究和记载。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一株产酶贝莱斯芽孢杆菌及其分离与应用，通过一板蓝根为原材料，生产培育出了一种具有产酶功能的贝莱斯芽孢杆菌，该菌能够用于纤维素酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶的生产，将贝莱斯芽孢杆菌应用到中药发酵中，可以大大提高中药有效成分的提取率，具有工艺简便，降低生产成本的特点。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一株产酶贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌为菌株NKY1，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2021848。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌的生化表型特征为：菌株分解葡萄糖、蔗糖，不发酵乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、覃糖、山梨醇、甘露醇和水杨苷，水解七叶苷，H2S、V-P、吲哚试验阳性，尿素酶、枸橼酸盐、甲基红试验阴性。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌的生长表型特征为：
(1)菌株NKY1为兼性厌氧菌，在营养琼脂培养24h，形成灰白色、干燥、不透明的大菌落，菌落表面粗糙，有褶皱，边缘不规则，有扩散；
(2)营养肉汤静置培养24h，肉汤澄清，不产生沉淀，肉汤表面形成灰白色菌膜。
一株产酶贝莱斯芽孢杆菌的分离方法，包括
步骤一：培养、筛选发酵菌，得到菌株NKY1；
步骤二：对菌株NKY1进行PCR扩增和分子生物学鉴定；
步骤三：分析扩增产物的形态及生物学特性。
优选的，步骤一所述的菌株NKY1的培养和筛选过程包括
S101.取中药板蓝根样品，粉碎后加等重量灭菌蒸馏水，在室温放置4～5d；
S102.取板蓝根样品接种营养琼脂，置37℃环境中培养，观察有细菌生长时，取不同形态菌落接种营养琼脂纯化；
S103.取纯化菌种接种板蓝根琼脂、点种纤维素刚果红琼脂，分别置37℃环境培养，观察细菌生长情况，筛选能在板蓝根琼脂生长，并能在刚果红培养基形成较大降解圈的细菌；
S104.测量筛选菌水解透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)，并初步判定筛选菌降解纤维素的活力；
S105.从众多菌株中筛选出1株既能在板蓝根琼脂生长，又能在刚果红琼脂形成较大清晰降解圈的细菌，得到菌株NKY1；
其中：所述菌株NKY1在刚果红培养基形成的降解圈直径为15.7 mm，菌落直径为3.7mm，菌株H/C为4.24。
优选的，步骤二所述的菌株NKY1的PCR扩增和分子生物学鉴定过程包括
S201.提取菌株NKY1的总DNA；
S202.应用引物扩增菌株NKY1的16S rRNA，其中：
上游引物(P1)：5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；
下游引物(P2)：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；
S203.PCR扩增，所述PCR反应体系为50μL：其中TaqDNA聚合酶0.5μL、10×PCRreactionbuffer 5μL，模板DNA2μL，dNTP为 1μL，上下游引物各2μL，去离子水补至50μL：
S204.取5μL扩增产物于0.8％琼脂糖凝胶检测后，测序；
S205.利用NCBI-BLAST搜索程序进行同源性检索，观察所得序列与已知菌株基因序列的覆盖率，并运用CLUSTAL-X软件对所得序列和相似序列建树分析，构建16S rRNA基因系统发生树。
优选的，步骤S203所述的扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火复性40s，72℃延伸2min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。
一株产酶贝莱斯芽孢杆菌的应用，所述的菌株NKY1用于生产纤维素酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和β-甘露聚糖酶。
一株产酶贝莱斯芽孢杆菌的应用，所述的菌株NKY1用于中药发酵中。
本发明的有益效果是：本发明公开了一株产酶贝莱斯芽孢杆菌及其分离与应用，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
针对现有技术存在的问题，本发明通过以板蓝根为材料，经培养、筛选发酵菌，得到具有生产纤维素酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和β-甘露聚糖酶能力的菌株NKY1，该菌株核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在生产中，利用该菌株能够对发酵工艺进行优化，提高产酶能力，且板蓝根本身价格较低，可以降低生产成本，优化工艺；同时通过对菌株NKY1进行产酶能力测定，菌种生物学特性的筛选，固态发酵培养基的筛选，固态发酵工艺的优化，发酵后成分分析，安全性试验，质量标准研究后，得出本菌株NKY1均符合相关规定，可以用于中药发酵和酶的生产。
附图说明
图1为本发明莱斯芽孢杆菌的16S rRNA基因系统发生树图。
图2为本发明莱斯芽孢杆菌的菌体形态图。
图3为本发明莱斯芽孢杆菌的菌落形态图。
图4为本发明莱斯芽孢杆菌的产酶能力图。
图5为本发明莱斯芽孢杆菌的适宜生长温度测定图。
图6为本发明莱斯芽孢杆菌的适宜生长酸碱度测定图。
图7为本发明莱斯芽孢杆菌的菌株生长曲线图。
图8为本发明碳源对发酵中药中(R,S)-告依春含量的影响图。
图9为本发明氮源对发酵中药中(R,S)-告依春含量的影响图。
图10为本发明无机盐对发酵中药中(R,S)-告依春含量的影响图。
图11为本发明发酵工艺各因素间的等高线图与交互响应面图。
图12为本发明发酵培养基成分各因素间的等高线图与交互响应面图。
图13为本发明(R,S)-告依春含量液相色谱图。
图14为本发明高剂量组发酵板蓝根对大鼠脏器病理组织学的影响图。
其中：在图11中，图(a)表示中药比例与氮源比例的等高线图，图(b)表示中药比例与氮源比例的交互响应面图，图(c)表示中药比例与水比例的等高线图，图(d)表示中药比例与水比例的交互响应面图，图(e)表示氮源比例与无机盐比例的等高线图，图(f)表示氮源比例与无机盐比例的交互响应面图；
在图12中，图(a)表示接菌比例与培养温度的等高线图，图(b) 表示接菌比例与培养温度的交互响应面图，图(c)表示接菌比例与培养时间的等高线图，图(d)表示接菌比例因素与培养时间的交互响应面图，图(e)表示培养温度与培养时间的等高线图，图(f)表示培养温度与培养时间的交互响应面图；
在图13中，图(a)表示(R,S)-告依春标准品液相色谱图，图 (b)表示发酵提取组(R,S)-告依春含量液相色谱图，图(c)表示纤维素酶提取组(R,S)-告依春含量液相色谱图，图(d)表示水煎组(R,S)-告依春含量液相色谱图；
在图14中，图(a)表示肺脏病理组织学图，图(b)表示肝脏病理组织学图，图(c)表示脾脏病理组织学图，图(d)表示肾脏病理组织学图，图(e)表示心脏病理组织学图，图(f)表示胸腺病理组织学图，图(g)表示胃病理组织学图，图(h)表示十二指肠病理组织学图，图(i)表示回肠病理组织学图，图(j)表示结肠病理组织学图，图(k)表示空肠病理组织学图，图(l)表示盲肠病理组织学图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：参照附图1-14所示的一株产酶贝莱斯芽孢杆菌的分离方法，包括
步骤一：培养、筛选发酵菌，得到菌株NKY1，其具体步骤包括
S101.取中药板蓝根样品，粉碎后加倍量灭菌蒸馏水，在室温放置4～5d；
S102.取板蓝根样品接种营养琼脂，置37℃环境中培养，观察有细菌生长时，取不同形态菌落接种营养琼脂纯化；
S103.取纯化菌种接种板蓝根琼脂、点种纤维素刚果红琼脂，分别置37℃环境培养，观察细菌生长情况，筛选能在板蓝根琼脂生长，并能在刚果红培养基形成较大降解圈的细菌；
S104.测量筛选菌水解透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)，并初步判定筛选菌降解纤维素的活力；
S105.从众多菌株中筛选出1株既能在板蓝根琼脂生长，又能在刚果红琼脂形成较大清晰降解圈的细菌，得到菌株NKY1；
其中：所述菌株NKY1在刚果红培养基形成的降解圈直径为15.7 mm，菌落直径为3.7mm，菌株H/C为4.24；
步骤二：对菌株NKY1进行PCR扩增和分子生物学鉴定，其具体步骤包括
S201.应用Takara Mini BEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒，按照说明提取细菌总DNA；
S202.应用细菌通用引物扩增菌株NKY1的16S rRNA，其中：
上游引物(P1)：5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；
下游引物(P2)：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；
S203.PCR扩增，所述PCR反应体系为50μL：其中TaqDNA聚合酶0.5μL、10×PCRreaction buffer 5μL，模板DNA2μL，dNTP为 1μL，上下游引物各2μL，去离子水补至50μL；其中扩增条件为： 94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火复性40s，72℃延伸2min，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
S204.取5μL扩增产物于0.8％琼脂糖凝胶检测后，送吉林省库美生物科技有限公司测序，得到莱斯芽孢杆菌(菌株NKY1)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
S205.利用NCBI-BLAST搜索程序从GenBank进行同源性检索，观察所得序列与已知菌株基因序列的覆盖率，并运用CLUSTAL-X软件对所得序列和相似序列建树分析；
S206.采用MEGA4.0软件运用邻接法进行聚类分析，并构建16S rRNA基因系统发生树，得到莱斯芽孢杆菌(菌株NKY1)的16S rRNA 基因系统发生树如图1所示；
步骤三：分析扩增产物的形态及生物学特性，其具体步骤包括
S301.取在37℃环境培养16h、18h、24h、48h和72h的贝莱斯芽孢杆菌，涂片，革兰氏染色，镜检菌体形态；
S302.取菌种接种营养肉汤和营养琼脂平板，分别置有氧或厌氧条件在37℃环境培养24h、48h和72h，观察菌株培养特性及嗜氧性；
S303.取培养18h～20h菌液接种生化管，置37℃环境培养，测定细菌生化特性；
试验证实：
(1)菌株为革兰氏阳性大杆菌，两端钝圆，多单在，如图2所示；
(2)老龄菌变长，多呈短链状排列，如图3所示；
(3)细菌形成中生或次端生芽胞，芽胞椭圆形，芽胞直径小于菌体，如图4所示；
(4)莱斯芽孢杆菌的生化表型特征为：菌株NKY1为兼性厌氧菌，在营养琼脂培养24h，形成灰白色、干燥、不透明的大菌落，菌落表面粗糙，有褶皱，边缘不规则，有扩散；营养肉汤静置培养24h，肉汤澄清，不产生沉淀，肉汤表面形成灰白色菌膜；
(5)贝莱斯芽孢杆菌的生化表型特征为：菌株分解葡萄糖、蔗糖，不发酵乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、覃糖、山梨醇、甘露醇和水杨苷，水解七叶苷，H2S、V-P、吲哚试验阳性，尿素酶、枸橼酸盐、甲基红试验阴性。
上述贝莱斯芽孢杆菌NKY1(Bacillus velezensis NKY1)具有生产纤维素酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和β-甘露聚糖酶的能力，其原始菌株编号为NKY1，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2021848，保藏日期为2021 年7月9日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区东湖南路8号，邮政编码：430072。
实施例2：对于贝莱斯芽孢杆菌产酶能力、适宜生长温度、适宜生长酸碱度、菌株生长特性、菌株的安全性等性能进行测试，其测试过程及结果如下：
1.贝莱斯芽孢杆菌产酶能力的测试：
测试过程：
(1)无菌牙签分别接种芽孢杆菌于各筛选培养基上，每个平板做3个重复，37℃倒置培养72h；
(2)菌株产蛋白酶和植酸酶则相应的筛选平板上菌落周围出现透明圈，计算圈菌比；
(3)脂肪酶筛选平板观察细菌生长状况及菌落背面是否有红色物质出现，如有红色物在菌落背面沉积，说明脂肪被水解，计算圈菌比；
(4)淀粉酶筛选平板培养后加入的8mL吕氏碘液，轻旋至碘液均匀覆盖平板，静置10min，无水乙醇洗脱2h，淀粉遇碘变蓝，若菌株产淀粉酶，周围淀粉被分解，平板上出现显色圈，计算圈菌比；
(5)纤维素酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和β-甘露聚糖酶筛选平板培养好后加入8mL的刚果红水溶液(1g/L)，缓慢转动至溶液均匀覆盖平板表面，静置显色30min，倒出显色液，再加入8mL氯化钠溶液(1moL/L)洗脱，轻旋至均匀覆盖平板表面，洗脱处理15min，菌落产酶分解周围的大分子糖类物质，刚果红则无法与大分子糖类结合而被洗脱产生透明圈，计算圈菌比；
经测试，我们可以得到，贝莱斯芽孢杆菌对于纤维素酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和β-甘露聚糖酶的能力如图5所示，产酶活性如表1所示：
表1：贝莱斯芽孢杆菌产酶活性
Figure RE-RE-GDA0003402363480000111
2.适宜生长温度的测试：
测试过程：
测试过程：
(1)取贝莱斯芽孢杆菌菌株培养液，调整菌液浓度1.0×106 CFU/mL。接种营养肉汤，分别置10～70℃，130r/min振荡培养；
(2)分别在培养的18h、24h和42h取样，设置无菌肉汤作对照，试验设3个重复，测定各菌液的OD600nm值；
(3)以培养温度(℃)为横轴，OD600nm值为纵轴，绘制菌液含菌量对比图；
测试结果如图5所示，从图5可以看出，本贝莱斯芽孢杆菌的适宜生长温度环境为：菌株在10～60℃均能生长，30～40℃时生长良好，35～40℃是菌株的最适生长温度；10～40℃时，随温度的上升菌液的OD值也逐渐增大，至35℃达到峰值，但与40℃时菌液 OD值差异不显著(P>0.05)；当培养温度过大，大于40℃时，菌液 OD值逐渐降低，温度达60℃时，菌液的OD值急剧下降接近于0。
3.贝莱斯芽孢杆菌适宜生长酸碱度的测试：
测试过程：
(1)调整菌液浓度1.0×106CFU/mL，分别接种pH 2～9的营养肉汤，于37℃，130r/min振荡培养；
(2)分别在培养的18h、24h和42h取样，设置无菌肉汤作对照，试验设3个重复，测定各菌液的OD600nm值；
(3)以pH值为横轴，OD600nm值为纵轴，绘制菌液含菌量对比图。
测试结果如图6所示，从图6可以看出，本贝莱斯芽孢杆菌的适宜生长的酸碱度为：pH 5.0～8.0时菌株生长情况良好，最适pH约为 6.0；培养基pH 2.0～4.0时，不适宜菌株生长；培养基pH 9.0时，基本未见细菌生长。
4.贝莱斯芽孢杆菌的菌株生长特性
测试过程：
(1)调整菌液浓度1.0×106CFU/mL，接种营养肉汤，于37℃， 130r/min振荡培养；
(2)在培养的4～96h取样，设置无菌肉汤作对照，试验设3 个重复，测定各菌液的OD600nm值；
(3)以培养时间(h)为横轴，OD600nm值为纵轴，绘制细菌生长曲线；
测试结果如图7所示。
5.贝莱斯芽孢杆菌的菌株的安全性试验
测试过程：
(1)毒性试验
①急性毒性试验
在预试验基础上，依据试验菌临床用量，均分32只昆明小鼠，高剂量组(3.2×1011CFU/kg·bw)、中剂量组(2.2×1011CFU/kg·bw)、低剂量组(1.7×1011CFU/kg·bw)和对照组(生理盐水)，雌雄各半；在灌服试验菌前8h至灌服后4h禁食，不禁水；活化菌液培养20～ 22h，4℃条件下3000r/min离心10min，沉淀用生理盐水调整菌液至上述浓度后灌服小鼠。每天观察小鼠临床表现，14d后处死存活小鼠，剖检，异常器官制作病理切片。
②慢性毒性试验
依据试验菌临床用量，将另外32只昆明小鼠分为高剂量组 (1.7×1011CFU/kg·bw)、中剂量组(1.7×1010CFU/kg·bw)、低剂量组 (1.7×109CFU/kg·bw)和对照组(生理盐水)，8只/组，雌雄各半；每天各组灌服1次，连续灌服30d；每天观察小鼠临床表现，死亡鼠剖检；每周进行称重，记录采食量，计算增重和饲料转化率；
试验结束时处死存活小鼠，剖检，测定血液学、血液生化学指标，出现异常变化的器官进行组织病理学检查，并称量肝、肾等脏器重量，计算脏器系数。
(2)细菌易位试验
取健康昆明小鼠15只，随机分为3组，每组5只分别为高剂量组(1.7×1011CFU/kg·bw)、低剂量组(1.7×1010CFU/kg·bw)和对照组(生理盐水)；每天一次性灌服0.5mL/只，连续灌服10d；试验结束时剖杀全部小鼠，分别取肺脏、肝脏、心脏、肾脏和脾脏各1g，进行组织匀浆，分别涂营养琼脂，37℃培养48h。
(3)有害代谢产物检测
①氨基脱羧酶检测
取活化菌涂营养琼脂平板，37℃培养18～22h，挑单个菌落接种氨基酸脱羧酶生化反应管，37℃培养18～22h；生化反应管变紫为阳性，生化反应呈黄色为阴性。
②吲哚试验
取活化菌接种蛋白胨水培养基，37℃培养72h，加8～10滴吲哚试剂。
(4)溶血试验
取活化菌划线接种血琼脂平板，37℃培养18～22h，观察菌落周围是否产生溶血环。
(5)药物敏感性试验
应用K-B法测定。取筛选菌株接种营养肉汤，37℃培养18～20 h，无菌营养肉汤调整菌液至0.5号麦氏标准管浊度，涂营养琼脂平板，贴药敏片，37℃培养18h，试验重复3次；测量抑菌圈直径(R)。
测试结果：
(1)毒性试验
①急性毒性
结果表明，试验组和对照组小鼠的精神状态、行为活动、食欲、粪便情况等均未出现异常，试验期间小鼠零死亡；14d后剖检小鼠内脏器官也未呈现异常，表明筛选菌无急性毒性。
②慢性毒性
整个试验期间，各组小鼠均无异常，剖检后各组小鼠脏器也未见病理变化；各组间小鼠增重、饲料转化率、血常规指标、血液生化学指标和脏器系数差异均不显著(P＞0.05)，试验结果见表2、表3、表4和表5所示；
表2：慢性毒性试验对各组小鼠血常规指标的影响
Figure RE-RE-GDA0003402363480000151
Figure RE-RE-GDA0003402363480000161
注：同一行标有不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，标有不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，标有相同小写字母或不标字母表示差异不显著(P＞0.05)，以下表格都依此标准；
表3：慢性毒性试验对各组小鼠脏器系数影响
Figure RE-RE-GDA0003402363480000162
表4：慢性毒性试验对各组小鼠血液生化指标的影响
Figure RE-RE-GDA0003402363480000163
Figure RE-RE-GDA0003402363480000171
表5：慢性毒性试验对各组小鼠体重的影响
Figure RE-RE-GDA0003402363480000172
(2)细菌易位试验
各组小鼠脏器接种的营养琼脂均未发现试验菌生长；表明筛选的解淀粉芽孢杆菌未在小鼠体内发生易位。
(3)有害代谢产物检测
①氨基脱羧酶检测：接菌的生化反应管变为黄色，空白对照管仍为紫色，说明试验菌代谢产物中不含有害代谢产物氨基脱羧酶。
②吲哚试验：呈阴性反应。
(4)溶血试验
观察菌落周围未发现溶血圈，表明细菌不会产生溶血素。
药物敏感性试验：所有受试药物中，菌株仅对林可霉素耐药，对其余药物均敏感，表明细菌的药物敏感性好，结果见表6；
表6：筛选菌的药敏试验
Figure RE-RE-GDA0003402363480000173
/>
Figure RE-RE-GDA0003402363480000181
通过以上试验表明：急性毒性试验小鼠全部健康存活；慢性毒性试验小鼠临床均无异常变化，剖检未见病变，试验组与对照组间小鼠的增重、饲料利用率、血液学、血液生化学指标及脏器系数均差异不显著；菌株未发生易位，氨基脱羧酶、吲哚试验均为阴性，在监测药物中，除林可霉素耐药外，其余23种药物均敏感。试验证实，贝莱斯芽孢杆菌的安全性良好。
实施例3：一株产酶贝莱斯芽孢杆菌的应用
所述的菌株NKY1可以用于中药发酵中：
1.发酵培养基成分的确定
测试过程：
(1)单因素筛选发酵培养基组成
按受试成分与基础培养基中碳源、氮源和无机盐基本一致原则替换。
①碳源筛选：分别以10g/L蔗糖、10g/L甘露醇、10g/L麦芽糖、 50g/L玉米面、50g/L可溶性淀粉和100g/L清肺组方中药粉替代葡萄糖，其他成分不变，同时以基础培养基作为对照；将发酵菌液以 2％接菌计量接种，置37℃以130r/min振荡培养18h，混匀取样，应用平板计数法计算每克固态发酵培养物中的活菌数，进行2次重复试验。
②氮源筛选：分别以50g/L黄豆粉、50g/L麸皮、10g/L酵母浸膏、10g/L硫酸铵，10g/L氯化铵、10g/L尿素替代蛋白陈，其他成分不变；其他操作按上述方法培养。
③无机盐筛选：分别以3g/L的CaCO3、2g/L的KH2PO4、2g/L 的MgSO4、0.2g/L的MnSO4替代NaCl，其他成分不变；其他操作按上述方法培养。
(2)发酵培养基成分优化
①响应面法优化培养基成分
在单因素试验基础上，以中药粉比例、氮源比例、无机盐比例、和水比例4个因素为自变量，以每克固态发酵培养物中的活菌数；按表7的因素水平表设计响应面试验方案，找出最优培养基参数。
表7：发酵培养基成分因素水平编码表
Figure RE-RE-GDA0003402363480000191
Figure RE-RE-GDA0003402363480000201
②验证试验
NKY1接种优化的固态发酵培养基，37℃培养24h，平板计数法计算每克固态发酵培养物中的活菌数，3次重复试验验证预测结果的准确性。
测试结果：
(1)发酵培养基成分的筛选
①碳源筛选
结果如图8所示，以葡萄糖为碳源的培养基中每克中药中的(R,S) -告依春含量最高，为0.178mg/g，其次是清肺组方中药0.0177mg/g，可溶性淀粉0.0174mg/g，玉米粉0.0158mg/g，甘露醇0.0174mg/g，麦芽糖0.0158mg/g，蔗糖0.0148mg/g；综合(R,S)-告依春含量、生产成本和简化工艺考虑，所以选择清肺组方中药为碳源。
②氮源筛选
结果如图9所示，以黄豆粉为氮源的培养液中每克中药中的(R,S) -告依春含量最高，为0.0176mg/g，其次是对照尿素0.0174mg/g，蛋白胨0.0173mg/g，麸皮0.0166mg/g，酵母浸膏0.0169mg/g，氯化铵 0.0163mg/g，硫酸铵0.0155mg/g，故选用黄豆粉为氮源。
③无机盐筛选
结果如图10所述，以碳酸钙为无机盐的培养液中每克中药中的 (R,S)-告依春含量最高，为0.0175mg/g，其次是对照氯化钠和硫酸镁，均为0.0174mg/g，硫酸锰0.0170mg/g，磷酸二氢钾0.0165mg/g，故无机盐选用碳酸钙。
(2)发酵培养基成分优化
①响应面统计模型
按照表8的设计进行试验，得出结果，建立回归方程如下：
Y＝+8.25+0.30A+0.37B+0.075C+0.22D+0.73AB－0.075AC －0.60AD－0.70BC+0.000BD－0.25CD－1.71A2－2.02B2－1.35C2－ 1.46D2。
表8：试验设计及优化结果
Figure RE-RE-GDA0003402363480000211
Figure RE-RE-GDA0003402363480000221
②方差分析
方差分析见表9所示；模型F＝17.08，P＜0.0001，具有统计学意义，决定系数R2＝0.941，失拟项P＞0.05，说明回归模型拟合度高、回归方程拟合度好；其中B、AB、AD、BC、A2、B2、C2、D2和E2对方程影响显著。
表9：二次多项式模型方差分析表
Figure RE-RE-GDA0003402363480000222
注：*P＜0.05，表示对应因素对响应值的影响显著，以下表格都依此标准。
③双因素交互分析及最优值预测
根据拟合模型，使用Design-Expert 8.0.6软件绘制二维等高线图和3D效应图(图11)，从而筛选出最佳配方。经Design Expert软件分析得到的最佳理论培养基成分为：药粉30.5％、黄豆粉10.55％、碳酸钙0.198％和水59.85％，此条件下的每克发酵中药活菌数预测值为 8.29×108CFU/g。
④验证性试验
结合具体实验条件，最终选取最佳培养基成分为：中药粉30％、黄豆粉10％、碳酸钙0.2％和水59.8％；经3次重复固态发酵后，固态发酵物中的活菌数分别为8.3×108CFU/g、8.2×108CFU/g和8.4 ×108CFU/g，平均值为8.3×108CFU/g，与预测值标准差为0.001；真实值与预测值相吻度好，重现性良好，证明所得最佳培养基成分可靠。
2.发酵提取工艺考察
测试过程：
(1)响应面优化发酵提取工艺
依据单因素试验结果，以接菌剂量、发酵温度和发酵时间3个因素为自变量，以(R,S)-告依春含量为响应值(Y)；按表10的因素水平表设计响应面试验方案，每份以10倍水量提取2次，每次2h，合并两次滤液，滤过，每组3个重复；响应面法确定最佳发酵提取工艺；
表10：发酵提取工艺因素水平
Figure RE-RE-GDA0003402363480000231
/>
Figure RE-RE-GDA0003402363480000241
(2)验证试验
按确定的培养基成分和发酵提取工艺，通过3次平行试验测定 (R,S)-告依春含量，验证预测结果的准确性。
测试结果：
(1)响应面统计模型
按照表11的设计进行试验，根据表11的结果，建立回归方程如下：
Y＝+0.018+1.6A×10-3+5.0B×10-4+4.5C×10-4+3.5AB×10-4－ 2AC×10-4－2BC×10-4－1.495A2×10-3－1.495B2×10-3－1.345C2×10-3
表11：发酵提取试验设计及优化结果
Figure RE-RE-GDA0003402363480000242
(2)方差分析
方差分析表见表12，模型F＝814.39，P＜0.0001，具有统计学意义，决定系数R2＝0.9990，失拟项P＞0.05，说明回归模型拟合度高、回归方程拟合度好；A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2和C2均对方程影响显著。
表12：(R,S)-告依春含量二次多项式模型方差分析表
Figure RE-RE-GDA0003402363480000251
注：*P＜0.05，表示对应因素对响应值的影响显著，以下表格都依此标准。
(3)双因素交互分析及最优值预测
根据拟合模型，使用Design-Expert 8.0.6软件绘制二维等高线图和3D效应图(图12)，从而筛选最佳生物发酵提取工艺；经Design Expert软件分析得到的最佳发酵工艺为：接菌比例3％、培养温度 37.72℃、培养时间72.12h，在此条件下(R,S)-告依春含量预测值为0.0185mg/g。
(4)验证性试验
结合具体实验条件，最终选取最佳培养发酵条件为：接菌比例 3％、培养温度37℃、培养时间72h；经3次重复固态发酵后，每克固态发酵物中(R,S)-告依春含量分别为0.0184mg/g、0.0182mg/g 和0.0185mg/g，平均值为0.0184mg/g，与预测值标准差为0.0001；真实值与预测值相吻度好，重现性良好，证明所得最佳发酵条件可靠。
3.发酵提取工艺效果评价
测试过程：
比对发酵提取工艺、纤维素酶提取工艺和传统水煎工艺对板蓝根有效成分(R,S)-告依春含量的提取差异，通过高相液相色谱法进行 3次平行试验测定。
测试结果：
结果见图13，在相同物理条件下发酵提取法、酶提法和水煎法三种方法的(R,S)-告依春提取量分别为0.0185mg/g、0.0171mg/g 和0.0151mg/g，3种方法之间(R,S)-告依春的提取率存在着极显著的差异(P＜0.001)。
4.发酵工艺的安全性试验
测试过程：
(1)急性毒性试验
①半数致死量(LD50)试验
选取30只昆明小鼠，随机分为5组，每组6只雌雄各半。药物浓度1g/mL，设置20mL/kg·bw、30mL/kg·bw、45mL/kg·bw、67.5 mL/kg·bw和101.2mL/kg·bw 5个剂量组，禁食不禁水，12h后灌胃给药，给药后连续观察7d，记录小鼠临床表现及死亡数，对死亡小鼠及时剖检，观察组织器官的病理变化。
②最大给药量试验
将40只昆明小鼠随机分成2组，每组20只，雌雄各半，分别为药物组和空白对照组；禁食不禁水，在24h内分2次进行灌胃，药物组每次灌胃剂量为0.8mL/20g，空白对照组按同样的方式给药。
灌胃后30min内对小鼠继续观察，并在第2次给药结束后2h再观察1次。连续观察7d，每天观察1次；详细记录小鼠的行为活动，是否出现毒性反应及死亡情况；7d后剖杀所有小鼠，观察组织器官的病理变化。
(2)亚慢性毒性试验
将40只SD大鼠随机分为4组，每组10只，低、中、高3个剂量的给药组和空白对照组；低、中、高剂量组分别按照0.5mL/100g·bw、 1mL/100g·bw和2mL/100g·bw剂量灌胃给药，空白对照组按1 mL/100g·bw剂量灌服生理盐水；每天给药1次，连续给药35d。
①一般情况观察
给药后每周进行1次体重测定和进食量统计；给药期间每天观察动物精神状态、食欲、行为活动、排便情况等。
②血液学检查
红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MON)、中性粒细胞(NEUT)、嗜酸性粒细胞数(EOS)、嗜碱性粒细胞数(BAS)、血红蛋白(HGB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度 (MCHC)、血小板计数(PLT)和血小板平均体积(MPV)等血常规指标。
③血液生化指标检测
包括血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮 (BUN)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)、血清白蛋白(ALB)、血清总蛋白(TRP)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)和总胆红素(TBiL) 等生化指标。
④脏器系数测定
试验结束时取各组动物的主要脏器称重，计算脏器系数。
⑤病理学观察
试验结束时剖杀大鼠，肉眼观察各脏器的异常变化；给药组和空白对照组取主要脏器制备病理组织切片。
测试结果：
(1)急性毒性试验
①半数致死量的确定
连续观察7d，各组小鼠体重均增加，精神和食欲良好，大小便及分泌物正常，呼吸平稳，皮肤被毛光亮柔软，未出现不良反应及死亡情况。不能测出改良清肺颗粒的LD50，说明其剂毒副作用很低，改做最大给药量试验。
②最大给药量测定
最大给药量为1.6mL/20g，即每千克体重改良清肺颗粒的最大给药量为80g；此时试验小鼠未呈现任何异常变化，试验结束剖检小鼠也未见脏器的肉眼可见病变。
(2)亚慢性毒性试验
①一般情况检查
试验期间大鼠的精神状态、皮肤、毛发、眼睛、黏膜、粪便、呼吸和四肢活动等均无异常变化，也无大鼠死亡，给药组和对照组无差别；对大鼠的体重增加无显著性影响(P＞0.05)，结果见表13。
表13：慢性毒性试验对大鼠体重的影响
Figure RE-RE-GDA0003402363480000291
②血液学检查
给药组各组大鼠血常规检测结果与对照组大鼠相比均无显著差异(P＞0.05)，结果见表14。
表14：慢性毒性试验对大鼠血常规的影响
Figure RE-RE-GDA0003402363480000292
/>
Figure RE-RE-GDA0003402363480000301
③血液生化指标检测
给药组各组大鼠血液生化指标结果与对照组大鼠相比均无显著差异(P＞0.05)，结果见表15；
表15：慢性毒性试验对大鼠血液生化指标的影响
Figure RE-RE-GDA0003402363480000302
/>
Figure RE-RE-GDA0003402363480000311
④脏器系数测定
给药组各组大鼠脏器系数与对照组大鼠相比均无显著差异(P＞ 0.05)，结果见表16，
表16：慢性毒性试验对大鼠脏器系数的影响
Figure RE-RE-GDA0003402363480000312
⑤剖检及组织病理学观察
a.剖检变化
与对照组相比，给药组大鼠主要脏器的大体形态学均无显著性改变。
b.病理变化
连续给药后，取大鼠的主要脏器进行病理学检测；与对照组相比，各给药组中的脏器均未出现病理变化，高剂量组的病理组织学结果见图14。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院
<120> 一株产酶贝莱斯芽孢杆菌及其分离与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1447
<212> DNA
<213> 产酶贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis NKY1)
<400> 2
gcagagctat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga tgttagcggc 60
ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg 120
gggctaatac cggatggttg tttgaaccgc atggttcaga cataaaaggt ggcttcggct 180
accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240
cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca 300
gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca 360
acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag 420
tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg 480
tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag 540
ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca 600
ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa 660
atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg 720
ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag 840
cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960
catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc 1020
atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg 1140
aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200
acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt 1260
ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1320
gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380
agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aacctttatg gagccagccg ccgaaaaggt 1440
acagggg 1447

Claims (2)

1.一株产酶贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌为菌株NKY1，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M 2021848。
2.根据权利要求1所述的一株产酶贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述的菌株NKY1用于生产纤维素酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和β-甘露聚糖酶。
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