CN100497597C - 一种新的弯曲芽孢杆菌lf-3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3，于2006年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC M206128；该弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3能有效的降解解植物毒素，特别是从冰川棘豆地上部分提取、分离出来的生物碱2，2，6，6-四甲基哌啶酮(简称TMPD)的毒性，对彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。
Description
技术领域
本发明属于植物毒素生物降解技术领域，具体涉及TMPD降解菌，还涉及该TMPD降解菌在降解冰川棘豆主要毒素TMPD中的应用。
背景技术
疯草(Locoweed)是豆科黄芪属和棘豆属有毒植物的总称，也是世界范围内危害草原畜牧业最严重的一类毒草。在我国，疯草广泛分布于西北、华北和西南的广大草原，危害面积达1100万hm2。近年来，国内外在疯草的危害、有毒成分、毒理机制、防除和利用等方面的研究取得了重要进展，但迄今还没有控制疯草蔓延的特效方法，致使疯草中毒问题日趋严重，成为草原畜牧业的大患。
冰川棘豆(Oxytropis.glacialis)是疯草的一种，也是青藏高原特有草种之一，主要分布在西藏阿里地区，遍及措勤，改则，革吉，日土，喀尔，普兰等县。它具有很强的抗逆性，在荒漠中生长旺盛，蔓延速度明显高于当地的其它植物，容易形成优势群落。它可以引起多种动物发生慢性中毒，使其出现以中枢神经系统功能紊乱为特征的中毒症状(杨小平.动物棘豆属疯草中毒的临床症状.武汉科技学院学报，2002，15(3)：25-28；席琳乔，马丽萍.草地毒草棘豆的研究现状及进展.草原与草坪，2003，(3)：19-22)，严重的发生死亡。据1996年调查统计，措勤县11个乡实际放牧草场面积9.30万hm2，冰川棘豆危害严重的有5.40万hm2，1978～1993年的15年中因中毒导致牲畜死亡达25万头(只)，直接经济损失约2205万元，年均死亡约1.7万头(只)，每年经济损失150～250万元；改则县有166.67万hm2草地冰川棘豆危害比较严重，1987～1995年牲畜中毒死亡21.28万头(只)，直接经济损失达2562万元，9年中，年均中毒死亡牲畜约2.4万头(只)，经济损失达350多万元；革吉县冰川棘豆蔓延较重的草场48.87万hm2，每年中毒死亡牲畜7500头(只)以上，经济损失120～150万元。到1995年为止，阿里东部三个牧业县因冰川棘豆中毒死亡的牲畜总数在53万头以上，损失超过6172万元(李勤凡，王建华.冰川棘豆生长的生态环境特点.家畜生态，2004，25(1)：42-44；王建华，张志恒，高巨星.西藏阿里地区动物“醉马草”中毒病调查报告.动物毒物学，1998，13(1-2)：22-27；张志恒，高巨星，沈颂东，关于对西藏阿里地区“醉马草”调查情况的报告.动物毒物学，1998，13(1-2)：11-13)；此外，采食冰川棘豆中毒未致死的牲畜，其性能和品质显著下降，不能骑乘或驮运，皮毛质量低劣，体重下降，奶肉减产、繁殖能力减弱，出现畸胎、流产和死胎等，其损失超过雪灾或疫灾。而且冰川棘豆耐干旱、抗寒冷，与优良牧草竞争草地，导致大批优良牧草产量降低和草场退化。在牲畜冰川棘豆中毒经常发生的地区，牧民不敢放牧，致使这些草场得不到充分利用(吴达，司红丽，王建华.疯草研究现状.草业科学，2003，20(2)：43-47)。由此可见，冰川棘豆对西藏南部地区家畜的危害非常严重，给西藏畜牧业带来很大损失。
目前国内外对冰川棘豆的防除主要采取人工挖除、化学灭除和生物防除的方法。冰川棘豆虽是毒草，但其属于豆科植物，营养全面，如能合理利用，变废为宝，将会取得很好的经济效益，这方面国内外学者已经进行了许多有益的探索，主要包括合理轮牧、间歇饲喂和日粮搭配、脱毒利用等方法。其中，在有毒植物的脱毒方面，其方法有物理脱毒、化学脱毒、免疫预防及微生物降解等。近年来，应用微生物降解有毒物质一直是国内外研究的热点，但在微生物降解植物毒素方面的研究较少，不过也取得了一定的成果，周斌从菜籽饼中分离到能够降解芥子甙的多种微生物70多株，经鉴定这些菌是白色球拟酵母(Torulopsis candida)、华根霉(Rhizopus chinensis)、总状毛霉(Mucor racemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)，通过发酵试验确定其脱毒率为80％(周斌，分离筛选脱菜籽饼中芥子甙毒素菌株的研究，云南大学学报，1996，18(2)：122-125)。谭蓓英等从广西涠洲岛的黄牛瘤胃中，分离出4株厌氧细菌，经鉴定为乳杆菌属(Lactobacillus)(2株)、牛链球菌(Streptococcus bovis)和生孢梭菌(Clostridium sporogenes)，上述菌株对含羞草素和二羟基吡啶类毒素具有降解活性，这些脱毒菌生活在瘤胃中，可以保护宿主动物免受银合欢的毒害(谭蓓英，王旭明，汪儆，降解有毒的含羞草素和二羟基吡啶化合物的瘤胃细菌.微生物学报，1994，34(5)：379-384)，其研究方法可用于冰川棘豆研究，以求彻底解决冰川棘豆的毒害问题，使动物利用冰川棘豆的丰富营养而不中毒。
2，2，6，6-四甲基哌啶酮(2，2，6，6-tetramethyl-4-piperidone，TMPD)是从冰川棘豆地上部分提取、分离出来的一种主要毒性生物碱(谭远友，王建华，李勤凡等，西藏阿里地区冰川棘豆毒性生物碱的鉴定，畜牧与兽医，2002，34(5)：12-13)。目前，尚无有效方法使冰川棘豆中的TMPD毒性降低。如能应用微生物降解TMPD，将对彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明目的在于提供一种新的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，该菌能够有效的降解，2，6，6-四甲基哌啶酮(简称TMPD)的毒性，彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种新的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3，简称CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：M206128。
弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3，已于2006年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：M206128。
本发明还有一目的是弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3在降解植物毒素中的应用。
本发明还有一目的是弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的应用。
本发明还有一目的是弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3在制备降解植物毒素药物中的应用。
本发明还有一目的是弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3在制备降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮药物中的应用。
该TMPD降解菌均来自于西藏、内蒙、青海等地疯草生长的环境土壤中，经人工分离、筛选而得，见后边的具体实施例。
以下是本发明弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3的特征描述。
1、形态学特征
LF-3菌株的菌体呈杆状，1.0～1.2μm×1.5～5.0μm，其在透射电镜下的形态见图1，其在扫描电镜下的形态见图2，革兰氏染色阴性，无荚膜，有芽孢，芽孢椭圆形或柱形，中生或偏中生，孢囊不膨大，有运动性；菌落呈菌丝体状，直径为0.5cm～4cm，表面不光滑，干燥，平升状，表面有同心圆，边缘不整齐，呈锯齿状，灰白色，半透明；葡萄糖发酵产少量酸，厌氧条件下不生长，不产生吲哚，M.R试验阴性，V.P试验阴性，水解淀粉，不还原硝酸盐，不能利用柠檬酸盐和丙二酸盐，不产生H2S，液化明胶，接触酶阳性，氧化酶阴性，尿素酶阴性，在5％NaCl和7％NaCl中生长，50℃时不生长。
2、生理生化特征，具体生理生化特征见表1。
表1.LF-3菌株的生理生化特征
| 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
| 碳水化合物产酸 | 硝酸盐还原 | - | |
| 葡萄糖 | + | 柠檬酸盐利用 | - |
| 乳糖 | + | 丙二酸盐利用 | - |
| 蔗糖 | 产H<sub>2</sub>S | - | |
| D—甘露醇 | + | 明胶液化 | + |
| 碳水化合物产气 | - | 接触酶 | + |
| 需氧 | + | 氧化酶 | - |
| 厌氧 | - | 脲酶 | - |
| 吲哚产生 | - | 5％NaCl生长 | + |
| M.R试验 | - | 7％NaCl生长 | + |
| V-P试验 | - | 50℃生长 | - |
| 淀粉水解 | + |
注：“+”表示生长或反应阳性；“—”表示不生长或反应阴性。
3、16S rDNA序列同源性分析
取LF—3菌株单菌落接种于10mlLB液体培养基中，37℃过夜振荡培养后取1.5ml菌液离心去上清，按照U-Gene公司的细菌基因组DNA提取试剂盒中所示的提取方法制备PCR模板DNA，—20℃保存备用。
用于16S rDNA的PCR反应的引物为一对通用引物。正向引物BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′；反向引物BSR1541/205′-AAGGAGGTGA TCCAG CCGCA-3′。
PCR反应体系(50μL)为：Taqmix25μL，引物BSF8/20(10μmol/L)2μL，引物BSR1541/20(10μmol/L)2μL，模板DNA1μL，重蒸水20μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，循环29次；72℃10min。经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下显示的图像如图3所示，M1为D12000，LF—3为PCR产物，M2为200bp Ladder。PCR产物用U-Gene公司的凝胶回收试剂盒回收纯化。测序由上海博亚生物技术有限责任公司完成，测序用引物为引物BSF8/20。
LF-3菌株16SrDNA的GenBank登录号为EF127831，16SrDNA序列如序列表所示。
将LF-3菌株的16S rDNA序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，利用DNAStar软件构建系统进化树，见图4。由图4得出，LF-3菌株的遗传进化距离与芽孢杆菌属最近，它与弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)同处于一个最小的分支，与已知菌株Bacillus flexus(DQ837542)的同源性达到99.80％，说明该菌在分子系统发育分类学上属于弯曲芽孢杆菌。经16S rDNA序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《伯杰细菌学手册(第八版)》，最终确定LF-3菌株为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，该菌能以TMPD为惟一碳源，可降解TMPD。
所述的LB液体培养基的组分及配比为：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，蒸馏水1L，pH为7.0～7.2，121℃高压灭菌15min。
本发明的TMPD降解菌可降解冰川棘豆的主要毒素TMPD，为彻底解决冰川棘豆的毒害奠定基础。
附图说明
图1是LF—3菌株的透射电镜照片；
图2是LF—3菌株的扫描电镜照片；
图3是LF—3菌株的1％琼脂糖凝胶电泳图；
图4是利用DNAStar软件构建系统进化树；
图5是不同培养时间TMPD降解率曲线。
具体实施方式
下面结合附图和发明人给出弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3的分离、筛选办法及其弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3在降解TMPD试验来进一步说明本发明的有益效果。
实施例1：弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3的分离、筛选方法
1、土样：采自西藏、内蒙、青海等地疯草生长的环境土壤；
2、菌株的分离筛选：分别取20g～30g疯草生长环境中的4个来源的土壤接种于普通肉汤，37℃扩菌培养48h后在普通琼脂上进行划线接种，37℃培养24h，挑出单个菌落接种于含50mg/L TMPD的普通肉汤中，37℃培养48h，保存菌种；将上一步保存下来的菌种接种于含100mg/L TMPD的普通肉汤中，置37℃培养48h；重复以上过程，每次培养均增加TMPD含量，降低培养液中有机营养成分的含量，保存菌种。经5次培养，当培养基中TMPD含量增加到300mg/L时，4℃保存菌种备用；将上述保存的菌种接种于普通肉汤中，37℃培养48h进行活化和扩菌，7500r/min离心15min，弃去上清液，沉淀的菌体用灭菌磷酸盐缓冲液冲洗3次，最后用灭菌磷酸盐缓冲液制成20mL的菌悬液，分别接种于含150mg/L TMPD培养基和无营养培养基上，37℃培养48h后，挑出TMPD培养基上生长良好的菌株，再划线分别接种于TMPD培养基和无营养培养基，重复培养，挑纯，得到一株降解菌，命名为LF-3菌株。
所述的普通肉汤培养基的组分及配比为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH2PO1 1g，蒸馏水1L，pH为7.4～7.6，121℃高压灭菌20min。
所述的普通琼脂培养基的组分及配比为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH2PO1 1.0g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.4～7.6，121℃高压灭菌20min。
所述的无营养培养基的组分及配比为：NaCl1.0g，K2HPO1 1.0g，NH4Cl1.0g，MgSO4·7H2O 0.4g，FeCl3 0.01g，琼脂20g，溶于1000mL双蒸水中，pH为7.2～7.4，121℃灭菌30min。
所述的TMPD培养基：根据不同需要，向无营养培养基中加入TMPD，调节pH7.2～7.4，121℃灭菌30min。
试验例1：弯曲芽孢杆菌LF-3降解TMPD的效果试验
采用紫外—可见分光光度计法测定该菌对TMPD的降解率。将该降解菌分别接种于普通肉汤中，37℃培养48h进行活化和扩菌，7500r/min离心15min，弃去上清液，沉淀的菌体用灭菌磷酸盐缓冲液冲洗3次，最后用灭菌磷酸盐缓冲液制成20mL的菌悬液，分别接种于含150mg/L TMPD培养液中，每隔3天测定培养液的吸光度，测定结果带入回归曲线，计算其浓度。具体TMPD的降解率见表2。从表2可以看出，经30天培养，LF-3菌株的TMPD降解率为68.20％。不同培养时间TMPD降解率曲线见图5，从图5可以看出各菌种在接种后15d内降解速度最快，培养18d后，降解速度降低，说明三株降解菌接种TMPD培养液培养15天后，TMPD能被很好的降解。
表2.不同培养时间TMPD的降解率(％)
序列表
<110>西北农林科技大学
<120>一种新的弯曲芽孢杆菌LF-3及其应用
<160>1
<210>1
<211>1484
<212>DNA
<213>弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)
<400>1
Claims (3)
1.弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)LF-3，保藏编号为CCTCC NO：M206128。
2.如权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌LF-3在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的应用。
3.如权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌LF-3在制备降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮药物中的应用。
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