CN100549162C - 产酸克雷伯氏菌lf-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了为产酸克雷伯氏菌LF-1，于2006年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC NO：M 206126；该产酸克雷伯氏菌LF-1能有效的降解植物毒素，特别是从冰川棘豆地上部分提取、分离出来的毒性生物碱2，2，6，6-四甲基哌啶酮(简称TMPD)的毒性，对彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。

Description

产酸克雷伯氏菌LF-1及其应用

技术领域

本发明涉及产酸克雷伯氏菌的新菌株及该菌株在制备植降解物毒素药物中的应用。

背景技术

疯草(Locoweed)是豆科黄芪属和棘豆属有毒植物的总称，也是世界范围内危害草原畜牧业最严重的一类毒草。在我国，疯草广泛分布于西北、华北和西南的广大草原，危害面积达1100万hm²。近年来，国内外在疯草的危害、有毒成分、毒理机制、防除和利用等方面的研究取得了重要进展，但迄今还没有控制疯草蔓延的特效方法，致使疯草中毒问题日趋严重，成为草原畜牧业的大患。

冰川棘豆(Oxytropis.glacialis)是疯草的一种，也是青藏高原特有草种之一，主要分布在西藏阿里地区，遍及措勤，改则，革吉，日土，喀尔，普兰等县。它具有很强的抗逆性，在荒漠中生长旺盛，蔓延速度明显高于当地的其它植物，容易形成优势群落。它可以引起多种动物发生慢性中毒，使其出现以中枢神经系统功能紊乱为特征的中毒症状(杨小平.动物棘豆属疯草中毒的临床症状.武汉科技学院学报，2002，15(3)：25-28；席琳乔，马丽萍.草地毒草棘豆的研究现状及进展.草原与草坪，2003，(3)：19-22)，严重的发生死亡。据1996年调查统计，措勤县11个乡实际放牧草场面积9.30万hm²，冰川棘豆危害严重的有5.40万hm²，1978～1993年的15年中因中毒导致牲畜死亡达25万头(只)，直接经济损失约2205万元，年均死亡约1.7万头(只)，每年经济损失150～250万元；改则县有166.67万hm²草地冰川棘豆危害比较严重，1987～1995年牲畜中毒死亡21.28万头(只)，直接经济损失达2562万元，9年中，年均中毒死亡牲畜约2.4万头(只)，经济损失达35O多万元；革吉县冰川棘豆蔓延较重的草场48.87万hm²，每年中毒死亡牲畜7500头(只)以上，经济损失120～150万元。到1995年为止，阿里东部三个牧业县因冰川棘豆中毒死亡的牲畜总数在53万头以上，损失超过6172万元(李勤凡，王建华.冰川棘豆生长的生态环境特点.家畜生态，2004，25(1)：42-44；王建华，张志恒，高巨星.西藏阿里地区动物“醉马草”中毒病调查报告.动物毒物学，1998，13(1-2)：22-27；张志恒，高巨星，沈颂东，关于对西藏阿里地区“醉马草”调查情况的报告.动物毒物学，1998，13(1-2)：11-13)；此外，采食冰川棘豆中毒未致死的牲畜，其性能和品质显著下降，不能骑乘或驮运，皮毛质量低劣，体重下降，奶肉减产、繁殖能力减弱，出现畸胎、流产和死胎等，其损失超过雪灾或疫灾。而且冰川棘豆耐干旱、抗寒冷，与优良牧草竞争草地，导致大批优良牧草产量降低和草场退化。在牲畜冰川棘豆中毒经常发生的地区，牧民不敢放牧，致使这些草场得不到充分利用(吴达，司红丽，王建华.疯草研究现状.草业科学，2003，20(2)：43-47)。由此可见，冰川棘豆对西藏南部地区家畜的危害非常严重，给西藏畜牧业带来很大损失。

目前国内外对冰川棘豆的防除主要采取人工挖除、化学灭除和生物防除的方法。冰川棘豆虽是毒草，但其属于豆科植物，营养全面，如能合理利用，变废为宝，将会取得很好的经济效益，这方面国内外学者已经进行了许多有益的探索，主要包括合理轮牧、间歇饲喂和日粮搭配、脱毒利用等方法。其中，在有毒植物的脱毒方面，其方法有物理脱毒、化学脱毒、免疫预防及微生物降解等。近年来，应用微生物降解有毒物质一直是国内外研究的热点，但在微生物降解植物毒素方面的研究较少，不过也取得了一定的成果，周斌从菜籽饼中分离到能够降解芥子甙的多种微生物70多株，经鉴定这些菌是白色球拟酵母(Torulopsis candida)、华根霉(Rhizopus chinensis)、总状毛霉(Mucor racemosus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)，通过发酵试验确定其脱毒率为80％(周斌，分离筛选脱菜籽饼中芥子甙毒素菌株的研究，云南大学学报，1996，18(2)：122-125)。谭蓓英等从广西涠洲岛的黄牛瘤胃中，分离出4株厌氧细菌，经鉴定为乳杆菌属(Lactobacillus)(2株)、牛链球菌(Streptococcus bovis)和生孢梭菌(Clostridium sporogenes)，上述菌株对含羞草素和二羟基吡啶类毒素具有降解活性，这些脱毒菌生活在瘤胃中，可以保护宿主动物免受毒害(谭蓓英，王旭明，汪儆，降解有毒的含羞草素和二羟基吡啶化合物的瘤胃细菌.微生物学报，1994，34(5)：379-384)，其研究方法可用于冰川棘豆研究，以求彻底解决冰川棘豆的毒害问题，使动物利用冰川棘豆的丰富营养而不中毒。

2，2，6，6-四甲基哌啶酮(2，2，6，6-tetramethyl-4-piperidone，TMPD)是从冰川棘豆地上部分提取、分离出来的一种主要毒性生物碱(谭远友，王建华，李勤凡等，西藏阿里地区冰川棘豆毒性生物碱的鉴定，畜牧与兽医，2002，34(5)：12-13)。目前，尚无有效方法使冰川棘豆中的TMPD毒性降低。如能应用微生物降解TMPD，将对彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明目的在于提供一种新的产酸克雷伯氏菌LF-1，该菌株能够有效的降解，2，6，6-四甲基哌啶酮(简称TMPD)的毒性，彻底解决冰川棘豆的毒害，为草原毒草的生物学控制和草原生态学研究起到积极作用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种新的产酸克雷伯氏菌LF-1(Klebsiella oxytocaLF-1)，其保藏号为CCTCC NO：M 206126。

产酸克雷伯氏菌LF-1已于2006年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M 206126，保藏单位地址；中国武汉武汉大学。

本发明还有一目的是产酸克雷伯氏菌LF-1菌株在降解植物毒素中的应用。

本发明还有一目的是产酸克雷伯氏菌LF-1菌株在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的应用。

本发明还有一目的是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)LF-1在制备降解植物毒素药物中的应用。

本发明还有一目的是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)LF-1在制备降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的应用。

该产酸克雷伯氏菌LF-1来自于西藏、内蒙、青海等地疯草生长的环境土壤中，经人工分离、筛选而得，具体的分离、筛选见后边的具体实施例。

以下是本发明产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)LF-1的特征描述。

1、形态学特征

LF-1菌株的菌体呈杆状，0.5～0.9μm×1.0～2.0μm，其在透射电镜下的形态见图1，其在扫描电镜下的形态见图2；革兰氏染色阴性，有荚膜，无芽孢，无运动性；菌落呈圆形，表面光滑，湿润，隆起，边缘整齐，灰白色，半透明；葡萄糖发酵产酸产气，兼性厌氧，产生吲哚，M.R试验阳性，V-P试验不稳定，还原硝酸盐，能利用柠檬酸盐和丙二酸盐，不产生H₂S，不液化明胶，接触酶阳性，氧化酶阴性，脲酶阳性。

2、生理生化特征

具体生理生化特征见表1。

表1.LF-1菌株的生理生化特征

实验项目	结果	实验项目	结果
				碳水化合物产酸		V-P试验	V
葡萄糖	+	硝酸盐还原	+
				乳糖	+	柠檬酸盐利用	+
蔗糖	+	丙二酸盐利用	+
				D-甘露醇	+	KCN生长	+
碳水化合物产气	+	产H<sub>2</sub>S	-
				需氧	+	明胶液化	-
厌氧	+	接触酶	+
				吲哚产生	+	氧化酶	-
M.R试验	+	脲酶	+

注：“+”表示生长或反应阳性；“-”表示不生长或反应阴性；“V”表示反应不稳定。

3、16S rDNA序列测定与同源性分析

取LF-1菌株单菌落接种于10mlLB液体培养基中，37℃过夜振荡培养后取1.5ml菌液离心去上清，按照U-Gene公司的细菌基因组DNA提取试剂盒中所示的提取方法制备PCR模板DNA，-20℃保存备用。

用于16S rDNA的PCR反应的引物为一对通用引物。正向引物BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′；反向引物BSR1541/20：5′-AAGGAGGTGA TCCAG CCGCA-3′。

PCR反应体系(50μL)为：Taqmi x25μL，引物BSF8/20(10μmol/L)2μL，引物BSR1541/20(10μmol/L)2μL，模板DNA1μL，重蒸水20μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，循环29次；72℃10min。经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下显示的图像如图3所示，其中M1为D12000，LF-1为PCR产物，M2为200bp Ladder。PCR产物用U-Gene公司的凝胶回收试剂盒回收纯化。测序由上海博亚生物技术有限责任公司完成，测序用引物为引物BSF8/20。

LF-1菌株的16S rDNA的GenBank登录号为EF127829，16S rDNA序列如序列表中序列所示。

将LF-1菌株的16S rDNA序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，利用DNAStar软件构建系统进化树见图4。从图4得出，LF-1菌株的遗传进化距离与克雷伯氏杆菌属最近，它与产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiellaoxytoca)同处于一个最小的分支，与已知菌株Klebsiella oxytoca isolateDR.Y14(DQ226215)的同源性达到99.52％，说明该菌在分子系统发育分类学上属于产酸克雷伯氏杆菌。经16S rDNA序列同源性分析，依据同源性在系统发育中的分类原则并结合形态、生理生化特征，参考《伯杰细菌学手册(第八版)》，最终确定LF-1菌株为产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)。

本发明的产酸克雷伯氏菌LF-1可降解冰川棘豆的主要毒素TMPD，为彻底解决冰川棘豆的毒害奠定基础。

附图说明

图1是LF-1菌株的透射电镜照片；

图2是LF-1菌株的扫描电镜照片；

图3是LF-1菌株的1％琼脂糖凝胶电泳图；

图4是利用DNAStar软件构建系统进化树；

图5是不同培养时间TMPD降解率曲线；

具体实施方式

下面结合附图和发明人给出产酸克雷伯氏菌LF-1的分离筛选办法及其产酸克雷伯氏菌LF-1在降解TMPD试验来进一步说明本发明的有益效果。

实施例1：产酸克雷伯氏菌LF-1的分离筛选

1、土样

采自西藏、内蒙、青海等地疯草生长的环境土壤；

2、菌株的分离筛选

分别取20g～30g疯草生长环境中的4个来源的土壤接种于种，37℃培养24h，挑出单个菌落接种于含50mg/L TMPD的普通肉汤中，37℃培养48h，保存菌种；将上一步保存下来的菌种接种于含100mg/L TMPD的普通肉汤中，置37℃培养48h；重复以上过程，每次培养均增加TMPD含量，降低培养液中有机营养成分的含量，保存菌种。经5次培养，当培养基中TMPD含量增加到300mg/L时，4℃保存菌种备用；将上述保存的菌种接种于普通肉汤中，37℃培养48h进行活化和扩菌，7500r/min离心15min，弃去上清液，沉淀的菌体用灭菌磷酸盐缓冲液冲洗3次，最后用灭菌磷酸盐缓冲液制成20mL的菌悬液，分别接种于含150mg/L TMPD培养基和无营养培养基上，37℃培养48h后，挑出TMPD培养基上生长良好的菌株，再划线分别接种于TMPD培养基和无营养培养基，重复培养，挑纯，得到一株降解菌，命名为LF-1菌株。

所述的普通肉汤培养基的组分及配比为：

牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH₂PO₄1g，蒸馏水1L，pH为7.4～7.6，121℃高压灭菌20mi n。

所述的普通琼脂培养基的组分及配比为：

牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH₂PO₄1.0g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.4～7.6，121℃高压灭菌20min。

所述的无营养培养基的组分及配比为：

NaCl 1.0g，K₂HPO₄1.0g，NH₄Cl 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.4g，FeCl₃0.01g，琼脂20g，溶于1000mL双蒸水中，pH为7.2～7.4，121℃灭菌30min。

根所述的TMPD培养基：

据不同需要，向无营养培养基中加入TMPD，调节pH 7.2～7.4，121℃灭菌30min。

试验例1：产酸克雷伯氏菌LF-1降解TMPD效果试验

采用紫外-可见分光光度计法测定该菌对TMPD的降解率。将该降解菌分别接种于普通肉汤中，37℃培养48h进行活化和扩菌，7500r/min离心15min，弃去上清液，沉淀的菌体用灭菌磷酸盐缓冲液冲洗3次，最后用灭菌磷酸盐缓冲液制成20mL的菌悬液，分别接种于含150mg/L TMPD培养液中，每隔3天测定培养液的吸光度，测定结果带入回归曲线，计算其浓度。具体TMPD的降解率见表2。从表2可以看出，经30天培养，LF-1菌株的TMPD降解率为82.54％。不同培养时间TMPD降解率曲线见图5，从图5可以看出该菌在接种后15d内降解速度最快，培养18d后，降解速度降低，说明该降解菌接种TMPD培养液培养15天后，TMPD能被很好的降解。

表2.不同培养时间TMPD的降解率(％)

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种新的产酸克雷伯氏菌LF-1及其应用

<160>1

<210>1

<211>1477

<212>DNA

<213>产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)

<400>1

gcaagtggcg gcagctacac atgcagtcga acggtagcac agagagcttg ctctcgggtg 60

acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgcct gatggagggg gataactact 120

ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gagggggacc ttcgggcctc 180

ttgccatcag atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaacggc tcacctaggc 240

gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag 300

actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca 360

tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg aggaaggcga 420

taaggttaat aaccttgtcg attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg 480

ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg 540

cacgcaggcg gtctgtcaag tcggatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt 600

cgaaactggc aggctggagt cttgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat 660

gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct 720

caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtgca cgctgtaaac 780

gatgtcgact tggaggttgt tcccttgagg agtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg 840

accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca 900

agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat 960

ccagagaact tagcagagat gctttggtgc cttcgggaac tctgagacag gtgctgcatg 1020

gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta 1080

tcctttgttg ccagcgattc ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccagtga taaactggag 1140

gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac 1200

aatggcatat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcata aagtatgtcg 1260

tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag taatcgtgga 1320

tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1380

agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc actttgtgat 1440

tcatgactgg ggtgaagtcg taacaagtac cgagcct 1477

Claims (3)

1.产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)LF-1菌株，其保藏号为CCTCCNO：M 206126。

2.权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌LF-1菌株在降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮中的应用。

3.权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌LF-1菌株在制备降解植物毒素2，2，6，6-四甲基哌啶酮药物中的应用。

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