CN111893056A - 贝莱斯芽孢杆菌ky01及其在降解厨余垃圾中的应用 - Google Patents

贝莱斯芽孢杆菌ky01及其在降解厨余垃圾中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌KY01及其在降解厨余垃圾中的应用，该菌株的分类命名为Bacillus velezensis KY01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020150。该菌株能同时降解厨余垃圾中的淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素，制成的菌剂能有效降解厨余垃圾，且降解产物为生物有机肥，使得厨余垃圾能够更加高效地被资源化利用。

Description

贝莱斯芽孢杆菌KY01及其在降解厨余垃圾中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌KY01及其在降解厨余垃圾中的应用。
背景技术
厨余垃圾是家庭、宾馆、饭店及机关企事业等饮食单位抛弃的剩余饭菜的通称。我国每天厨余垃圾的产生量超过2万吨，随着餐饮业的发展，厨余垃圾的产量正在快速地增长。传统的处理方式主要是混合后填埋或直接用于喂养生猪，这种方式很容易造成人畜之间疫病的交叉感染。随着非洲猪瘟的传播爆发，厨余垃圾喂养生猪已经被明令禁止。因此传统的处理方式已经不能满足目前人们对健康、环境和卫生的要求。我国部分城市已经开始集中收集厨余垃圾，并对厨余垃圾采用好氧堆肥或厌氧消化的方式制沼气。该种处理方式无法充分回收利用厨余中富含的营养成分，会造成资源浪费，而且经济效益较差。同时，由于厨余垃圾的高含水率、高含盐率和高油脂含量，还会导致堆肥品质不良以及二次污染等问题。
生物转化是处理厨余垃圾的主要发展方向之一，利用微生物的降解酶活性，促进厨余垃圾中的有机物发生降解。通过将具有淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶和纤维素酶的菌种置于合适的条件下，能够有效缩短厨余垃圾生物转化的周期，提高有机物降解效率，从而使垃圾的降解速率大幅度提高，并将残留物转化为高效有机肥。由于不同菌种在不同条件下降解酶活性、代谢能力不一，本领域技术人员致力于寻找新的具有优异降解性能的菌种。
发明内容
本发明的目的在于提供一株贝莱斯芽孢杆菌KY01及其在降解厨余垃圾中的应用，该菌株可有效降解厨余垃圾，有效减少厨余垃圾污染。
为此，本发明的第一方面提供了一株贝莱斯芽孢杆菌KY01，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020150，保藏日期为2020年05月28日。经鉴定，所述贝莱斯芽孢杆菌KY01可有效降解厨余垃圾。
所述贝莱斯芽孢杆菌KY01具有下述性质：在LB固体平板培养基37℃培养48h后，其菌落呈浅黄色，不透明，边缘不整齐，表面不光滑，中间无褶皱，产芽孢，在显微镜下观察菌体杆状。
将所述贝莱斯芽孢杆菌KY01进行DNA测序，并将测序结果与相应的数据库进行比对，经过序列测定和在http://https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站上进行序列比对，发现该菌株的基因序列与已登记贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的序列同源性最高，达到99％。因而确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。将筛选得到的菌株命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis KY01。通过鉴定，该贝莱斯芽孢杆菌KY01同时具有淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶和纤维素酶活性。
本发明的第二方面，提供所述贝莱斯芽孢杆菌KY01的发酵方法，包括：将所述贝莱斯芽孢杆菌KY01接种于发酵培养基进行发酵培养；所述发酵培养基包括葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨15g/L、玉米浆15g/L、NaCl 3g/L，MgSO40.2g/L。
进一步，所述发酵培养的温度为37℃，培养时间为18～32h；优选为24h。
进一步，所述贝莱斯芽孢杆菌KY01在接种于发酵培养基之前经过菌种活化步骤。
本发明的第三方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括本发明的贝莱斯芽孢杆菌KY01和/或其培养液和/或其菌悬液和/或其发酵产物。
进一步，所述菌剂还包括载体。
在具体实施方式中，所述菌剂包括贝莱斯芽孢杆菌KY01的发酵产物和载体。
进一步，所述菌剂中水分含量为30～35％，活菌数为1.8×108～3×108cfu/g。
进一步，所述发酵产物中，贝莱斯芽孢杆菌KY01芽孢的浓度为5×109～8×109cfu/mL。
进一步，所述载体的原料选自木屑、甘蔗渣粉末、麦麸、木糠、锯末、秸秆屑、芦苇屑、竹粉末中的一种或两种以上。
进一步，所述载体的制备方法包括：将各原料混合均匀后，加热处理以杀灭有害致病菌。
在具体的实施方式中，所述载体的原料为木屑和甘蔗渣粉末；所述载体的制备方法为将木屑与甘蔗渣粉末按体积比2～3:2～3混合均匀后，60～80℃加热处理以杀灭有害致病菌；优选地，加热时间为1～3h，更优选为1h。
本发明的第四方面，提供所述贝莱斯芽孢杆菌KY01或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或所述菌剂在降解淀粉和/或蛋白质和/或脂肪和/或纤维素方面的应用。
本发明的第五方面，提供贝莱斯芽孢杆菌KY01或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或所述菌剂在降解厨余垃圾中的应用。
本发明的第六方面，提供贝莱斯芽孢杆菌KY01或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或所述菌剂在制备生物有机肥方面的应用。
本发明的第七方面，提供一种降解厨余垃圾和/或制备生物有机肥的方法，包括用贝莱斯芽孢杆菌KY01或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或所述菌剂对厨余垃圾进行处理。
进一步，所述处理的条件为有氧。
进一步，所述处理的条件适于所述贝莱斯芽孢杆菌KY01进行有氧发酵。
进一步，所述降解厨余垃圾和/或制备生物有机肥的方法包括：(1)培养所述贝莱斯芽孢杆菌KY01；(2)将步骤(1)的产物吸附于载体；(3)将步骤(2)的产物与所述厨余垃圾混合并提供有氧条件。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明经筛选得到一株能有效降解厨余垃圾的贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis KY01，该菌株能同时降解厨余垃圾中的淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素，制成的菌剂能有效降解厨余垃圾，且降解产物为生物有机肥，使得厨余垃圾能够更加高效地被资源化利用。
具体实施方式
下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
从金华双龙洞景区获得土壤样品，然后将样品接种到筛选培养基中，筛选培养基的配制如下：牛肉膏5.0g，蛋白栋10.0g，水1000ml，pH值7.0。配制分离培养基100ml，加入适量无菌玻璃珠，接入1.0g牛粪样品，然后进行富集3天。
将富集的培养液，用梯度稀释法，接入分离培养基中，分离培养基的配制如下：牛肉膏5.0g，蛋白栋10.0g，水1000ml，pH值7.0，2％的琼脂粉，然后从分离平板中挑出单菌落进行划线纯化，反复纯化2～3次，然后将得到的纯种的菌落画线培养，放在冰箱中留存备用，纯化得的菌种即为贝莱斯芽孢杆菌KY01。
实施例2
对实施例1得到的菌种进行淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶活力的鉴定，具体如下：
(1)淀粉降解能力检测
取菌样点种于淀粉琼脂培养基中，37℃培养48h后在平板中加入适量碘液，测量透明圈大小计算酶活。
经测定，淀粉透明圈直径D17.6mm，菌落直径d 6.7mm，酶活U＝(D/d)^2＝6.9。
(2)蛋白质降解能力检测
取菌样点种于酪蛋白琼脂培养基中，37℃培养48h后，测量透明圈大小计算酶活。
经测定，酪蛋白透明圈直径D10.8，菌落直径d 2mm，酶活U＝(D/d)^2＝29.2。
(3脂肪降解能力检测
取菌样点种于橄榄油-中性红琼脂培养基中，37℃培养48h后，观察菌落与菌落周围培养基的颜色，是否变为红色。
经观察，菌落与菌落所处位置显红色
(4)纤维素降解能力检测
取菌样点种于纤维素-刚果红琼脂培养基中，37℃培养120h后，测量透明圈大小计算酶活。
经测定，纤维素水解透明圈直径D 7.1mm，菌落直径d 2mm，酶活U＝(D/d)^2＝12.6
综上，经以上鉴定，贝莱斯芽孢杆菌KY01具有很强的淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶和纤维素酶活力。
实施例3
本实施例提供了贝莱斯芽孢杆菌KY01的发酵方法。
(1)斜面培养：将贝莱斯芽孢杆菌KY01接种于LB肉汤琼脂培养基斜面，37℃培养24h活化。
(2)种子液培养：将活化好的贝莱斯芽孢杆菌KY01接种于LB肉汤液体培养基中，37℃，200rpm摇床振荡培养24h，即制备得到种子液。
(3)产芽孢发酵培养：将贝莱斯芽孢杆菌KY01的种子液分别接种于改良的产芽孢发酵培养基(葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨15g/L、玉米浆15g/L、NaCl 3g/L，MgSO4 0.2g/L)，37℃，200rpm摇床振荡培养24h，得到芽孢发酵液，其中芽孢浓度为6×109cfu/mL。
实施例4
本实施例提供了贝莱斯芽孢杆菌KY01发酵方法。
(1)斜面培养：将贝莱斯芽孢杆菌KY01接种于LB肉汤琼脂培养基斜面，37℃培养24h活化。
(2)种子液培养：将活化好的贝莱斯芽孢杆菌KY01接种于LB肉汤液体培养基中，37℃，200rpm摇床振荡培养18h，即制备得到种子液。
(3)产芽孢发酵培养：将贝莱斯芽孢杆菌KY01的种子液分别接种于改良的产芽孢发酵培养基(葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨15g/L、玉米浆15g/L、NaCl 3g/L，MgSO4 0.2g/L)，37℃，200rpm摇床振荡培养32h，得到芽孢发酵液，其中芽孢浓度为8×109cfu/mL。
实施例5
本实施例提供了贝莱斯芽孢杆菌KY01菌剂的制备方法。
将木屑与甘蔗渣粉末按体积比3比2混合均匀后，60℃加热处理1h杀灭有害致病菌，即制备得到载体，将其用于贝莱斯芽孢杆菌KY01菌剂的制备。
将实施例3制备得到的芽孢发酵液稀释后与载体进行喷雾搅拌混匀，其中芽孢发酵液的体积(L)与载体的质量(kg)之比为3:10，40℃保温处理1h，最终将菌剂水分控制在30～35％之间，菌剂总有效活菌数1.8×108～3×108cfu/g。
实施例6
分别取实施例5制备得到的菌剂和载体各100kg，分别投放到两台KOYON200L型生物质垃圾处理设备(康扬环境科技有限公司)中，将投放菌剂的作为实验组，投放载体的作为对照组。将设备开启后，投放50kg厨余垃圾进行菌剂活化2天，之后每天投放100kg厨余垃圾，连续投料30天并计算厨余垃圾减重率。总共进行三轮测试，检测结果如表1所示。
其中，厨余垃圾降解率计算采用以下公式进行：减重率＝(A-B)/C×100％。其中A表示厨余垃圾、复合菌剂投入后的总重量；B表示厨余垃圾、菌剂处理后的总重量；C表示投入的餐厨垃圾的总重量。
表1
Figure BDA0002542355880000061
由表1可知，实验组的平均减重率为84.3％。将实验组30天后出料送样专业检测机构检测，产物经检测认证为高品质有机肥，有机质质量分数高达97.2％，总养分为5.26％，完全符合《生物有机肥》NY884-2012标准。
综上可知，本发明提供的生物菌剂能快速降解厨余垃圾，降解得到的最终产物是高品质有机肥，在做到源头减量的同时，还实现了厨余垃圾的资源化利用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.贝莱斯芽孢杆菌KY01，其保藏于中国典型培养物保藏中心，且具有保藏编号CCTCCNO:M 2020150。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌KY01的发酵方法，其特征在于，包括：将所述贝莱斯芽孢杆菌KY01接种于发酵培养基进行发酵培养；所述发酵培养基包括葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨15g/L、玉米浆15g/L、NaCl 3g/L，MgSO40.2g/L；
优选地，所述发酵培养的温度为37℃，培养时间为18～32h；
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌KY01在接种于发酵培养基之前经过菌种活化步骤。
3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌KY01和/或其培养液和/或其菌悬液和/或其发酵产物；
优选地，所述菌剂还包括载体。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中水分含量为30～35％，活菌数为1.8×108～3×108cfu/g。
5.如权利要求3或4所述的菌剂，其特征在于，所述载体的原料选自木屑、甘蔗渣粉末、麦麸、木糠、锯末、秸秆屑、芦苇屑、竹粉末中的一种或两种以上；
优选地，所述载体的制备方法包括：将各原料混合均匀后，加热处理以杀灭有害致病菌；
优选地，所述载体的制备方法为将木屑与甘蔗渣粉末按体积比2～3:2～3混合均匀后，60～80℃加热处理以杀灭有害致病菌。
6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌KY01或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或权利要求3～5任一项所述的菌剂在降解淀粉和/或蛋白质和/或脂肪和/或纤维素方面的应用。
7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌KY01或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或权利要求3～5任一项所述的菌剂在降解厨余垃圾中的应用。
8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌KY01或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或权利要求3～5任一项所述的菌剂在制备生物有机肥方面的应用。
9.一种降解厨余垃圾和/或制备生物有机肥的方法，其特征在于，包括用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌KY01或其培养液或其菌悬液或其发酵产物或权利要求3～5任一项所述的菌剂对厨余垃圾进行处理。
10.如权利要求9所述的降解厨余垃圾和/或制备生物有机肥的方法，其特征在于，所述处理的条件为有氧；
优选地，所述降解厨余垃圾和/或制备生物有机肥的方法包括：(1)培养所述贝莱斯芽孢杆菌KY01；(2)将步骤(1)的产物吸附于载体；(3)将步骤(2)的产物与所述厨余垃圾混合并提供有氧条件。
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