CN105255768A - 一种奶牛专用乳酸菌的制备方法 - Google Patents

一种奶牛专用乳酸菌的制备方法 Download PDF

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CN105255768A CN201510734864.0A CN201510734864A CN105255768A CN 105255768 A CN105255768 A CN 105255768A CN 201510734864 A CN201510734864 A CN 201510734864A CN 105255768 A CN105255768 A CN 105255768A
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蒋建军
剡根强
王鹏雁
杨龙龙
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Abstract

本发明公开了一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，主要包含如下步骤：瘤胃乳酸菌的提取、菌株环境抗逆性的鉴定、分离株耐药性及抑菌试验、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制。与现有技术相比，本发明具有在动物胃肠道能长期定居、繁殖活性强、且抗生素的抑制效果不明显，能有效的发挥生物活性作用等特点。

Description

一种奶牛专用乳酸菌的制备方法
技术领域
本发明属于乳酸菌制备领域，尤其涉及一种奶牛专用乳酸菌的制备方法。
背景技术
反刍动物胃肠道聚集着丰富的微生物菌群，乳酸菌是主要的固有优势菌群，在营养物质的消化吸收及抗肠道感染中发挥重要的生理作用。大量研究表明，乳酸菌产生的乳酸能降低肠道PH，酸化肠道，提高钙、磷、铁的利用率和维持维生素D的吸收率，其分泌的细菌素对革兰氏阳性菌及阴性菌产生广泛的抑制作用；乳酸菌的代谢产物还能激活巨噬细胞、NK细胞和B细胞。提高机体抗感染免疫功能，因此，乳酸菌作为胃肠道优势菌常用于动物微生态活菌制剂的细菌之一，但不同来源的乳酸菌其对环境的适应性差异较大，来自非宿主胃肠道乳酸菌和环境与食品源的乳酸菌在特定动物胃肠道的定居时间较短呈一过性增殖，而同一种动物胃肠道乳酸菌经过对宿主胃肠道的适应性选择，能适应胃肠道环境且大量繁殖，从而发挥其生物活性作用。
乳酸菌是反刍动物胃肠道中的优势益生菌群，具有多种生物活性与功能，是人用乳酸菌乳及动物饲用微生态活菌制剂的主要菌株之一，但目前商品化的畜用益生素所含的乳酸菌多来源于土壤、水源、植物及乳制品，其乳酸菌在动物胃肠道不能长期定居、繁殖活性差、且受抗生素的抑制，不能有效的发挥生物活性作用。
因此，一种具有在动物胃肠道能长期定居、繁殖活性强、且抗生素的抑制效果不明显，能有效的发挥生物活性作用等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种奶牛专用乳酸菌的制备方法。
本发明涉及一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的28～34株菌株，在pH2～4、0.2～0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出2～4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨8～12g，酵母膏5～10g，碳酸钙2～4g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服3～8mL，连用12～18天，犊牛口服1～3mL，连用8～12天，经测定血清钙及CD4+、CD8+、IFN-r免疫指标均高于对照组，犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均有明显的保健作用。
与现有技术相比，本发明具有在动物胃肠道能长期定居、繁殖活性强、且抗生素的抑制效果不明显，能有效的发挥生物活性作用等特点。
具体实施方式
实施例1：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的30株菌株，在pH2、0.2％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出3株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨10g，酵母膏5g，碳酸钙2g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例2：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的30株菌株，在pH2、0.3％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨11g，酵母膏8g，碳酸钙3g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例3：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的30株菌株，在pH3、0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出2株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨11g，酵母膏7g，碳酸钙4g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例4：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的32株菌株，在pH4、0.3％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出3株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨9g，酵母膏6g，碳酸钙2g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例5：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的32株菌株，在pH2.5、0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨10g，酵母膏10g，碳酸钙2g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例6：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的28株菌株，在pH3.5、0.2％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出3株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨8g，酵母膏10g，碳酸钙3g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例7：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的28株菌株，在pH3、0.3％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨11g，酵母膏8g，碳酸钙4g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例8：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的34株菌株，在pH2、0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出2株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨12g，酵母膏8g，碳酸钙3g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例9：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的34株菌株，在pH4、0.3％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨12g，酵母膏5g，碳酸钙3g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例10：一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的30株菌株，在pH2.5、0.2％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出3株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林(AZL)、青霉素(P)、氨苄青霉素(Amp)、阿莫西林(AMC)、新霉素(N)、庆大霉素(CN)、链霉素(STR)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、林肯霉素(CD)、红霉素(E)中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm，说明筛选出的菌株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用强；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨12g，酵母膏10g，碳酸钙2g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL，实际应用时将乳酸菌活菌数配制为2×1010CFU/mL为优。
上述培养基选用SL培养基，SL培养基配方如下：10g酪蛋白水解物；5g酵母提取物；2g柠檬酸二铵；25g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)；0.58gMgSO4·7H2O；15g琼脂；20g葡萄糖；1.0ml吐温80；6g磷酸氢二钾；0.03gFeSO4·7H2O；0.15gMnSO4·4H2O。以上用量为1000ml培养基的用量。溶解琼脂在400～600mL的沸水中，溶解其他组分在400～600mL的水中，用冰醋酸调pH＝5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
实施例11：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服5mL，连用12天，犊牛口服1mL，连用12天，经测定血清钙及CD4+、CD8+、IFN-r免疫指标均高于对照组，犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均有明显的保健作用。
实施例12：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服3mL，连用15天，犊牛口服2mL，连用8天，经测定血清钙及CD4+、CD8+、IFN-r免疫指标均高于对照组，犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均有明显的保健作用。
实施例13：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服7mL，连用13天，犊牛口服3mL，连用9天，经测定血清钙及CD4+、CD8+、IFN-r免疫指标均高于对照组，犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均有明显的保健作用。
实施例14：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服6mL，连用16天，犊牛口服3mL，连用11天，经测定血清钙及CD4+、CD8+、IFN-r免疫指标均高于对照组，犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均有明显的保健作用。
实施例15：一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，上述奶牛专用乳酸菌的制备方法所制备的奶牛专用乳酸菌，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服4mL，连用18天，犊牛口服2mL，连用10天，经测定血清钙及CD4+、CD8+、IFN-r免疫指标均高于对照组，犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均有明显的保健作用。

Claims (3)

1.一种奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于主要包含如下步骤：
a、瘤胃乳酸菌的提取：
利用乳酸菌选择SL培养基从健康奶牛的瘤胃液进行菌群的分离鉴定，分离出乳酸菌菌株；
b、菌株环境抗逆性的鉴定：
分离株乳酸菌的环境抗逆性鉴定与筛选：将a步骤中分离出的菌株先通过API50CHL生化鉴定试剂盒鉴定到种，根据生长特性选取其中的28～34株菌株，在pH2～4、0.2～0.4％的胆盐、25℃—40℃环境下进行培养，筛选出2～4株生长良好，具有较强的环境抗逆性的嗜乳酸杆菌及发酵乳杆菌；
c、分离株耐药性及抑菌试验：
耐药试验：将筛选出的具有良好环境抗逆性的菌株进行扩大培养，并在培养基中添加阿洛西林、青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、新霉素、庆大霉素、链霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、林肯霉素、红霉素中的至少一种抗生素，筛选出对以上药物耐受超过百分之八十的菌株；
之后进行抑菌实验：对牛源致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的拮抗抑制作用的实验；将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌涂抹在实验培养基上，再在培养基上接种筛选出的乳酸菌，观察抑菌斑的大小为抑菌圈直径分别为18.3mm和16.4mm；
d、乳酸菌的扩大培养及活菌制剂的配制：
用大麦芽汁400～600mL、水400～600mL，胰蛋白胨8～12g，酵母膏5～10g，碳酸钙2～4g，分别制成固体和液体培养基，将分离株接种后置于5％CO2培养箱培养18～30h，乳酸菌扩大培养浓度分别可以到达3.5×108CFU/mL、1.2×107CFU/mL。
2.根据权利要求1所述的奶牛专用乳酸菌的制备方法，其特征在于：乳酸菌扩大培养浓度为2×1010CFU/mL。
3.一种奶牛专用乳酸菌的使用方法，所述奶牛专用乳酸菌由权利要求1所述的方法制备，具体使用方法如下：每头奶牛每天口服3～8mL，连用12～18天，犊牛口服1～3mL，连用8～12天，经测定血清钙及CD4+、CD8+、IFN-r免疫指标均高于对照组，犊牛腹泻发病率与对照组相比降低60％，表明乳酸菌制剂对围产期奶牛和初生犊牛均有明显的保健作用。
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