CN106148349A

CN106148349A - 重组人神经生长因子基因,表达载体以及制备重组人神经生长因子的方法

Info

Publication number: CN106148349A
Application number: CN201610438276.7A
Authority: CN
Inventors: 黄志立; 沈丽; 王妍; 解桂秋
Original assignee: Shenzhen Polytechnic
Current assignee: Shenzhen Polytechnic
Priority date: 2016-06-20
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明公开了一种表达重组人神经生长因子的基因、重组表达载体及含有上述基因的工程菌和重组人神经生长因子的制备方法。针对人神经生长因子的蛋白质结构及原核和真核表达系统，通过密码子优化，获得重组人神经生长因子的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将所述表达重组人神经生长因子的基因可操作地插入质粒表达载体构建适于在大肠杆菌和酵母体系中表达的重组表达载体。本发明的重组表达系统可高效表达重组人神经生长因子，具有天然蛋白结构和天然活性。

Description

重组人神经生长因子基因,表达载体以及制备重组人神经生长因子的方法

技术领域

本发明涉及新的表达人神经生长因子(hNGF)的基因，含有其的重组载体及表达hNGF的工程菌。

本发明还涉及利用该大肠杆菌和酵母表达系统的制备重组人神经生长因子的方法。

背景技术

神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，对调节神经元的生长、发育、分化、存活及损伤神经的再生修复具有重要的理论和临床意义。目前的基础研究表明NGF可应用于神经中毒、周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面神经炎，以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。NGF从早期的发现到医学应用的历史过程，已逾半个世纪。人神经生长因子(human nerve growth factor，hNGF)是在人体中发现的一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向。对促进大脑的发育，神经系统的生长，损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。

完整的hNGF分子由1个β亚单位、2个α亚单位和2个γ亚单位以非共价键结合为α2βγ2的形式，分子中还包括2个锌指，以增加复合物的稳定性。β亚单位是由两个完全相同的肽链组成，每个肽链含118个氨基酸残基，分子量为26 518，其pI是9.3，通过非共价链结合而构成二聚体。其中，6个半胱氨基酸残基之间有二硫键相连，这些二硫键对维持NGF的生物活性十分重要，一旦破坏则活性全部丧失。

hNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子(rhNGF)是唯一的选择。

目前神经生长因子的上市产品主要来源于小鼠的颌下腺提取，而雄性小鼠颌下腺是纯化NGF和分析其生物活性的主要供体。从颌下腺匀浆中，以离子交换色谱分析法，在中性酸碱度条件下，可以分离出NGF。2002年首个小鼠颌下腺提取的神经生长因子获得新药证书。2003年武汉海特生物制药股份有限公司(与武汉大学医学院联合开发注射用鼠神经生长因子)、厦门北大之路生物工程有限公司(与兰州生物制品研究所联合开发注射用鼠神经生长因子)均获得了SFDA颁发的生产批文，分别以“金路捷”和“恩经复”上市。2004年人胎盘提取的神经生长因子获得一类新药证书(贵州华翰)，治疗糖尿病性神经病变。2006年，SFDA又批准了舒泰神(北京)药业的30μg注射用鼠神经生长因子生产，商品名为“苏肽生”。2010年丽珠基团研制的“丽康乐”获批生产。目前这些注射用鼠神经生长因子已经上市并应用于临床，主要应用的适应证有中毒性周围神经损伤、外伤性周围神经损伤、糖尿病性周围神经损伤、面神经炎、中小面积烧伤和瘢痕整形术中周围神经损伤、自身免疫性周围神经损伤、帕金森综合症等神经修复中使用。

利用基因工程技术，以微生物为载体，生产外源蛋白具有广阔的应用前景。到目前为止，已发展了多种蛋白表达系统。大肠杆菌表达系统是研究得最清楚的一套原核表达系统，人们对它的遗传背景和生化特性了解得很透彻,而且大肠杆菌因其具有容易操作，生长迅速,营养需求简单等优点，得到了广泛的应用。但是这一系统本身也存在着若干缺陷:①缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等；②表达的蛋白多以包涵体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性；③背景杂蛋白很多,纯化较麻烦；④表达一般不是很高。所以人们开始用更新的分子生物学技术进行大肠杆菌胞间的表达系统和真核细胞的表达系统，使蛋白得到分泌的表达或表达在胞间后，在后处理中不用破碎菌体，直接分泌到胞外或者采用冷冻渗透等温和的物理方法将蛋白引出膜外，大大减少包涵体表达纯化时出现的大量杂蛋白。

人神经生长因子在国内外己经研究多年,国内基本上是从人血白细胞中直接提取DNA，进行克隆和表达。鉴于NGF具有广阔的临床应用前景，因而受到医学界与企业界的重视。在异源蛋白的表达中,大肠杆菌因其具有容易操作，生长迅速,营养需求简单等优点，己成功地表达了多种外源蛋白，但是，由于hNGF分子包含3对二硫键，若用大肠杆菌进行包涵体表达，存在肽键不能有效折叠及二硫键容易错配等因素，而且纯化时需经过变性和复性步骤，复性率很低。

姜静等(姜静，姜桂香.中国生物工程杂志[J].2006,26(2):8-12.)致力于将构建于E.coli体系，经表达和体外复性后的rhNGF-β与CHO表达系统分泌的rhNGF-β比较，认为二者具有一致的理化性质和生物学活性,HPLC纯度均大于95％、生物学比活不低于1.8ng/U；显示E.coli表达体系可生产质量均一、高生物学活性的rhNGF-β。王革等(王革,王妍,孙海波等.食品与药品.2007,9(1)：9-11.)构建了表达质粒pPIC9K/rhNGF，转化毕赤酵母，筛选多拷贝转化子，进行摇瓶表达，结果得到高外泌表达的工程菌，并确定了纯化步骤，经疏水层析和阳离子交换层析纯化后，取得高活性高纯度的rhNGF。电泳结果表明，工程菌表达分泌rhNGF量约为每升发酵液50mg，约占外泌蛋白的50％。活性测定结果表明，分泌蛋白的活性约为每毫升培养液10⁴U。

乐伟等(乐伟，彭璐佳，史权威等，中国药事.2014,28(6)：601-606)通过基因合成、载体构建、细胞转染、加压筛选和克隆化等步骤，得到了高表达rhNGF的CHO-DG44单克隆细胞株。经过2步法纯化获得了纯度大于98％的精制rhNGF制品，最优单克隆细胞株在收获时重组人神经生长因子表达水平可以达到50毫克每升以上。

中国专利申请00111220.1公开了一种用二硫键异构酶PDI促进变性的重组人神经生长因子(rhNGF)正确折叠并提高其复性率的新型方法。在rhNGF的复性体系中加入一定比例的PDI，可以使rhNGF中错误配对的二硫键打开并形成正确的二硫键,从而提高复性率,降低异构体比例,提高rhNGF产率。然而,纯化仍然困难,成本居高不下,其产量和应用受到限制。虽然目前国内外对利用CHO细胞表达人神经生长因子进行了研究(付玲,于婷,等，军事医学科学院院刊，2003,27(4):319-320；白艳艳,杨吉成,等,中国免疫学杂志,2003,19(5):343-346)，但是由于CHO细胞表达系统存在的诸多缺陷而受到限制。未见报道具体的rhNGF的表达量。

目前为止rhNGF没有上市的主要原因之一是其蛋白质的结构特殊，三对二硫键使其在作为包涵体表达时复性困难，生物活性不稳定；用分泌系统表达时由于其特殊的结构多次造成溶菌等，使其产业化的进程缓慢，在它以后发现的GM-CSF；G-CSF；EGF；IGF-I等的开发进度都比它快，有的早已经上市。这使得国内外许多家的药厂和研究所最后放弃了其开发，转向研究NGF的二肽模拟物。

研究证明NGF虽然为一种糖蛋白,其功能同其N端糖基有关,但其糖基仅作为识别信息存在,许多基因工程产品证明不含糖基的亚基有较高的活性，因此提高表达的目的蛋白的生物学活性，并且同时使得筛选方法简单、易操作，筛选效果明显是设计NGF的引物序列和表达载体需要考虑的重要因素。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种表达重组人神经生长因子(rhNGF)的基因。

本发明的另一个目的在于提供含有上述基因的重组表达载体。

本发明的再一个目的在于提供一种含有上述基因的工程菌。

本发明的又一个目的在于提供重组人神经生长因子的制备方法。

根据本发明的一方面，针对人神经生长因子的蛋白质结构以及原核和真核表达系统，通过密码子优化，获得表达重组人神经生长因子的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述新的基因于大肠杆菌和酵母表达体系中均可高效表达出具有天然结构和生物活性的rhNGF，产物无需变性和复性。

根据本发明的另一方面，构建了重组表达载体，将所述表达重组人神经生长因子的基因可操作地插入质粒表达载体构建适于在大肠杆菌和酵母体系中表达的重组表达载体，优选的用于原核表达体系的质粒表达载体包括pET28a-hNGF，具有图8所示结构。优选的用于真核表达体系的质粒表达载体包括pPIC9K-hNGF，所述表达载体具有图14所示的结构。

本发明也包括表达重组人神经生长因子基因的原核表达工程菌，优选的工程菌为大肠杆菌表达体系。

本发明还包括表达重组人神经生长因子基因的真核表达宿主，优选的工程菌为毕赤酵母表达体系。

根据本发明的又一方面，提供制备重组人神经生长因子的方法，使用所述表达rhNGF的基因构建原核表达载体或真核表达载体，并于大肠杆菌或毕赤酵母中表达，经提取和纯化可获得重组人神经生长因子。

本发明的有益效果是：(1)制备出了分泌表达hNGF的大肠杆菌表达系统和酵母表达系统，将表达的外源蛋白hNGF分泌至细胞间质中，培养后经过简单的物理溶出法不需要破碎细胞，保证了下游纯化的目的蛋白高含量，而且表达产物具有天然蛋白结构和天然活性。大肠杆菌培养体系经济、简便，可提高产率,降低生产成本，比较适合于大规模工业化生产；(2)产物具天然结构和生物活性，无需变性和复性。

附图说明

图1是大肠杆菌表达hNGF密码子偏好性分析，黑色柱表示不同密码子在大肠杆菌中使用的频率，灰色柱表示hNGF原始基因中密码子的分布；

图2是毕赤酵母表达hNGF密码子偏好性分析，黑色柱表示不同密码子在毕赤酵母中使用的频率，灰色柱表示hNGF原始基因中密码子的分布；

图3上海生工公司合成基因测序结果；

图4是以pUC57-hNGF质粒为模板进行的PCR扩增结果，1-5分别为五个退火温度梯度：60℃，57℃，54℃，48℃，45℃；

图5是hNGF的PCR产物回收结果，在375bp有明显条带；

图6是pET28a用BamH I和Xho I双酶切后的回收结果；

图7是重组质粒pET28a-hNGF的双酶切结果；

图8是pET28a-hNGF重组质粒图谱；

图9是pET28a-hNGF重组质粒测序结果；

图10是鉴定hNGF原核表达的SDS-PAGE分析图；

图11是以pUC57-hNGF质粒为模板进行的PCR扩增结果，1-5分别为五个退火温度梯度：60℃，57℃，54℃，48℃，45℃；

图12是pPIC9K质粒双酶切后的纯化结果；

图13是pPIC9K-hNGF重组质粒(3个阳性克隆)的双酶切鉴定结果；

图14是pPIC9K-hNGF质粒图谱；

图15是pPIC9K-hNGF重组质粒测序结果；

图16是pPIC9K-hNGF重组质粒使用SacI单酶切线性化的结果；

图17是利用不同浓度遗传霉素筛选重组hNGF酵母，挑取4个抗遗传霉素的酵母单克隆提取的基因组DNA；

图18是使用特异性引物，以转化子基因组DNA为模板的PCR鉴定结果；

图19是使用AOX通用引物，以转化子基因组DNA为模板的PCR鉴定结果；

图20是鉴定hNGF真核分泌表达的SDS-PAGE分析图，1-3号样分别是1-3高拷贝转化子诱导表达结果，样品经过TCA法进行浓缩，4号样因没有目的条带舍弃。

图21是目标蛋白的SDS-PAGE图谱；

图22是目标蛋白的HPLC图谱；

图23是NGF作用下TF1细胞增殖情况；

图24是用TF-1细胞增殖法检测NGF活性，细胞培养72h做出的四参数拟合曲线。

具体实施方式

以下通过实施例进一步详细说明本发明的优点和特点，不应理解为是对本发明的限制，所使用的实验设备和材料如无特殊说明，均为普通市售。

【实施例1】hNGF基因的密码子优化和全基因合成

由于人神经因子的编码基因含有大量稀有密码子，不利于其在原核和真核表达体系中进行高水平表达，故对其进行密码子优化。

首先使用www.gcua.de网站分别进行毕赤酵母和大肠杆菌表达hNGF密码子偏好性分析(图1,2)，将hNGF含有的同时在毕赤酵母和大肠杆菌中使用频率很低的密码子进行同义替换。

同时，为便于后期得到不含有多余氨基酸残基的成熟hNGF蛋白，在hNGF编码基因前添加了肠激酶识别位点(DDDDK)的编码序列。

将优化好的序列送上海生工公司进行全基因合成，得到了含有目的基因的重组质粒pUC57-hNGF，测序报告如图3。

优化后的hNGF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【实施例2】构建原核表达hNGF基因的载体

以pUC57-hNGF为模板，用常规PCR方法扩增含有肠激酶识别位点编码序列的hNGF基因，通过分子克隆方法将目的基因插入到表达载体pET28a中，构建表达载体pET28a-hNGF，从而能表达N端带有6×His标签的目的蛋白，便于纯化。

实验材料和方法

引物设计：以pUC57-hNGF序列为模板，设计分别带有限制性内切酶BamH I和Xho I识别位点的上下游引物(SEQ ID No.2，SEQ ID No.3)，以获得两端可以被消化为相应粘性末端的目的基因。引物如下：

目的基因的扩增及纯化：PCR反应体系及反应程序为：

PCR反应结束后，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR产物，再用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，之后用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行目的基因纯化产物的检测，并根据Marker估算其浓度。

PCR纯化产物的限制性酶切及其纯化：

(1)将PCR纯化产物用BamH I和Xho I进行双酶切，酶切反应体系如下

反应体系：

反应条件：37℃进行酶切6h

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对酶切效果进行检测。

(2)对酶切后的PCR产物进行纯化回收：用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段进行回收，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测回收结果，并根据Marker估算其浓度。

载体DNA的限制性酶切及纯化：pET28a的限制性酶切与纯化与PCR纯化产物的处理方法相同。

结果：

目的基因的扩增：以pUC57-hNGF质粒为模板于不同的退火温度(50℃-60℃)进行PCR扩增(图4)，从图4中可以看出在大约380bp处有条很亮的带，PCR扩增成功，将扩增产物用凝胶试剂盒进行PCR产物的纯化回收。

目的基因的纯化回收：将目的基因进行双酶切后，参照凝胶试剂盒的方法进行纯化回收，在大约375bp有一条亮带,说明纯化成功(图5)。

【实施例3】重组质粒pET28a-hNGF的转化及鉴定

1.载体DNA的限制性酶切及纯化

pET28a(购于美国Novgen公司)的限制性酶切与PCR纯化产物的处理方法相同，纯化回收结果如图6所示。目的基因与载体的连接用T₄DNA连接酶对纯化的目的基因和载体进行连接，于16℃过夜进行。10μl反应体系如下：

2.重组质粒的转化

将重组的质粒转入经CaCl₂处理的E.coliDH5α细胞中，进行重组质粒的扩增。由于重组质粒上带有卡那霉素抗性基因，因此可以根据其抗生基因对阳性克隆进行筛选。选取生长状态较好的单克隆菌落进行培养，用终浓度12.5％的甘油保存菌种后提取质粒，用于后续的鉴定和转化表达宿主。

3.重组质粒pET28a-hNGF的鉴定

使用BamH I和Xho I进行双酶切鉴定，从电泳图(图7)中可以看到3个阳性克隆在约375bp处均有一条亮带，说明重组质粒构建成功，pET28a-hNGF重组质粒图谱如图8所示。

4.目的基因hNGF的测序

将阳性克隆的质粒进行测序，测序结果显示没有突变(图9)。

【实施例4】目的基因在E.coli中诱导表达及表达条件优化

目的基因的诱导表达

将重组质粒pET28a-hNGF转入经CaCl₂处理的E.coli BL21pLyS(DE3)中(购于美国Novgen公司)，构建工程菌，并将pET28a转入E.coliBL21pLyS(DE3)中，作为对照，同时用5ml的LB培养基分别培养，待工程菌长至OD₆₀₀值为0.6时保存菌种并加入终浓度为0.1M的IPTG25℃诱导以让目的基因表达，诱导12h后离心收集菌体并超声破碎后用SDS-PAGE进行检测，如图10所示，在17.5kDa分子量处有明显条带。

【实施例5】构建真核表达hNGF基因的载体

以pUC57-hNGF为模板，用常规PCR方法扩增含有6×His标签和肠激酶识别位点编码序列的hNGF基因，通过分子克隆方法将目的基因插入到表达载体pPIC9K中，构建表达载体pPIC9K-hNGF，从而能表达N端带有6×His标签的目的蛋白，便于纯化。

实验材料和方法

(1)引物设计：以pUC57-hNGF序列为模板，设计分别带有限制性内切酶SnaB I和Not I识别位点的上下游引物(SEQ ID No.4，SEQ ID No.5)，以获得两端可以被消化为相应粘性末端的目的基因。引物如下：

①上游引物下划线为内切酶SnaB I识别位点，黑色粗体为6×His编码序列

②下游引物下划线为内切酶Not I识别位点

目的基因的扩增及纯化：方法同实施例2。

(2)PCR纯化产物的限制性酶切及其纯化：

将PCR纯化产物用Q.Cut SnaB I和Not I进行双酶切，酶切反应体系如下反应体系：

反应条件：37℃进行酶切15min

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对酶切效果进行检测。

对酶切后的PCR产物进行纯化回收：用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段进行回收，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测回收结果，并根据Marker估算其浓度。

(3)对酶切后的PCR产物进行纯化回收：用凝胶回收试剂盒对酶切后的目的片段进行回收，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测回收结果，并根据Marker估算其浓度。

结果：

目的基因的扩增：以pUC57-hNGF质粒为模板于不同的退化温度(50℃-60℃)进行PCR扩增(图11)，从图11中可以看出在约375bp处有条很亮的带，PCR扩增成功，将扩增产物用凝胶试剂盒进行PCR产物的纯化回收。

目的基因的纯化回收：将目的基因用SnaB I和Not I进行双酶切后,参照凝胶试剂盒的方法进行纯化回收在约375bp处有一条亮带,说明纯化成功。

【实施例6】重组质粒pPIC9K-hNGF的转化及鉴定

1.载体DNA的限制性酶切及纯化

pPIC9K(购于美国Novgen公司)的限制性酶切产物与PCR纯化产物的处理方法相同，回收结果如图12。目的基因与载体的连接用T₄DNA连接酶对纯化的目的基因和载体进行连接，方法同实施例3。

2.重组质粒的转化，方法同实施例3。

3.重组质粒pPIC9K-hNGF的鉴定

使用SnaB I和Not I进行双酶切鉴定，从电泳图(图13)中可以看到3个阳性克隆(泳道1、2、3)在约375bp处均有一条亮带，说明重组质粒构建成功，pPIC9K-hNGF重组质粒图谱如图14所示。

4.目的基因hNGF的测序

将阳性克隆的质粒进行测序，测序结果显示没有突变(图15)。

【实施例7】重组质粒pPIC9K-hNGF的线性化和转化真核表达宿主

1.重组质粒pPIC9K-hNGF的线性化

(1)重组质粒经SacI酶消化后，成为线性质粒。酶切反应条件如下：

反应条件：37℃进行酶切3h

用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对酶切效果进行检测，结果如图16。

(2)酶切产物的纯化

向酶切体系中加入等体积的预冷异丙醇，放-20℃静置20min，12000rpm离心10min，去上清，使用70％乙醇洗两次，晾干，用30μl无菌水溶解，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对酶切效果进行检测。

2.线性化的重组质粒转化GS115毕赤酵母感受态细胞

(1)GS115毕赤酵母感受态细胞制备

①将毕赤酵母GS115(补充实验来源)接种于5mlYPD培养基中(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖)，30℃过夜培养。

②将0.5ml过夜培养物接种到100mlYPD培养基中，过夜培养到OD₆₀₀＝1.3-1.5。

③3000rpm 4℃离心6min，用50ml冰冷的无菌水重悬菌体。

④3000rpm 4℃离心6min，用50ml冰冷的无菌水重悬菌体。

⑤3000rpm 4℃离心6min，用20ml冰冷的1M山梨醇重悬菌体。

⑥3000rpm 4℃离心6min，用冰冷的lM山梨醇重悬菌体，终体积约1ml。

分装80μl小份感受态细胞放冰浴中备用。

(2)电转化

①将80μl感受态细胞与5-20μg线性质粒DNA混合，并将它们转到冰冷的0.2cm的电穿孔小杯中。

②将带有细胞的小杯冰上温育5min。

③小杯放入电穿孔仪进行电激，电激参数为2000V/mm、5ms。

④即加1ml冰冷的1M山梨醇，将杯中的内容物转到一个无菌的微量离心管中。

⑤200μl铺MD(1.34％酵母氮源，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)平板，30℃过夜培养。直到长出菌落(HIS⁺转化子)。

(3)遗传霉素抗性转化子(高拷贝转化子)筛选

①无菌条件下，在每个微量测定板上加入200μl YPD

②用灭菌牙签在第一组平板中每孔接种单个HIS+转化子，轻轻搅动以悬浮细胞

③盖住微量测定板在30度孵育2天(不需摇动)

④2天后，取新的微量测定板，加入190μlYPD

⑤用多道移液器吸取10ul培养液于第二组测定板中，确保第二组板标记好并放置好，这样可指示细胞所在孔

⑥盖住第二组板，30度孵育过夜

⑦第二天，在第三组测定板上重复第5,6步

⑧准备10个YPD平板，每个的遗传霉素浓度为0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/ml，每个平板的底部画相同的格子

⑨使用移液器将微量测定板上每个孔中的菌液接种到抗性平板的对应各自区域中

⑩在30度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2-5天出现，不含遗传霉素的YPD平板上克隆需2-3天出现。

(4)PCR鉴定阳性菌落

①酵母基因组DNA提取

挑酵母单克隆接种到含5ml YPD培养基的试管中，30℃培养16～18h至OD₆₀₀为1.0左右。取2mL酵母培养液，室温下，12000rpm离心2min收集菌体，用灭菌水洗1次。用900μl酵母裂解液(0.2moL/L醋酸锂，0.5mol/L NaCl，10mmol/L EDTA(pH 8.0)，100mmoL/L Tris·HCl(pH 8.0)，1％SDS)重悬细胞，70℃孵化20min。12000rpm离心5min，将上清转移到干净的离心管中。加1倍体积的异丙醇，充分混匀，12000rpm离心10min，将沉淀用70％的酒精洗涤一次后风干。风干后的基因组溶于500μl ddH₂0或TE缓冲液中，加入10μl RNase(10mg/mL)，37℃温浴10min。加入饱和酚和氯仿各300μl充分混匀，静置2min；12000rpm离心5min，转移上清到新的1.5mL离心管中，加入1/10体积的3moL/L NaAc，用2.5倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇进行沉淀，-20℃放置15min后，12000rpm离心10min；将沉淀用70％的酒精洗涤一次后风干，溶于30μl TE缓冲液或无菌水中。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳对提取的基因组DNA进行检测，结果如图17。

①PCR检测

使用上下游特异引物(SEQ ID No.6，SEQ ID No.7)和上下游AOX引物(SEQ IDNo.8，SEQ ID No.9)：

PCR反应体系和程序为：

PCR反应产物通用0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像仪下观察。使用特异引物进行PCR的结果，在375bp左右有明显条带(图18)；使用AOX引物PCR的结果，在2000bp和700bp都有明显条带(图19)。以上结果表明重组质粒pPIC9K-hNGF成功以插入的方式整合到酵母基因组中。

【实施例8】重组蛋白的诱导表达和鉴定

1.诱导表达步骤：

(1)单菌落接种于25ml的BMGY培养基(1％酵母粉，2％Peptone，0.1M磷酸钾溶液pH6.0，1.34％酵母氮源，4×10^-5％生物素，1％甘油)中，28-30℃震荡培养至OD₆₀₀达到2-6之间。(2)室温3000rpm离心5分钟收集细胞，弃上清，用BMMY培养基(1％酵母粉，2％Peptone，0.1M磷酸钾溶液pH6.0，1.34％酵母氮源，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)重悬细胞沉淀至OD₆₀₀＝1(约BMMY培养基100m1)。

(3)放入1000ml的培养瓶中，覆盖两层无菌纱布，放回培养箱中继续培养。

(4)每24小时向培养基中加l00％甲醇至终浓度为0.5％以保持诱导表达。

(5)在下述时间取lml培养物放于1.5m1微量离心管中，室温台式离心机最大转速离心2-3分钟，取上清，放-80℃冻存用于后续分析。时间点(小时)：0，24，48，72，96，120，144。

2.诱导表达样品的浓缩(TCA法)

(1)取1ml发酵上清液于1.5mlEP管中，10000rpm离心5min除去菌体

(2)将上清转移到新的离心管中

(3)向样品中加入100μl100％的三氯乙酸(TCA)，振荡混匀后与4℃静置30min

(4)4℃，10000rpm离心10min去上清

(5)沉淀中加入1ml-20℃预冷的丙酮，剧烈振荡后，4℃，10000rpm离心10min去上清。

(6)重复步骤5

(7)将EP管在室温放置30min干燥后溶解于缓冲液中SDS-PAGE分析(图20)。

【实施例9】重组蛋白的纯化

1.粗提：

缓冲液A：20％蔗糖，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH8.5；

缓冲液B：20mmol/L Tris-HCl,pH8.5；

缓冲液C：20mmol/L Tris-HCl,pH8.0,0.75mol/LNaCl。

将培养物6000g离心8分钟收集沉淀。

湿菌体按菌体：缓冲液A＝1g:25ml(0℃预冷)充分悬浮后(约与发酵体积相同的缓冲液A)，冰浴15分钟。立即冷冻离心(12000g，4℃，5min)，取沉淀，弃去上清。

按菌体：缓冲液B＝1g:25ml(0℃预冷)充分悬浮后(约与发酵体积相同的缓冲液B)，冰浴20分钟。立即冷冻离心(15000g，4℃，20min)，取上清。

澄清过滤：

上清进行超滤，先过100K滤膜，取滤过液；再过5K滤膜，浓缩至2L，取截留液，反复三次加入6L缓冲液C，浓缩至2L。

2.精提：

1)Ni螯合层析柱分离：

分离介质：Ni-NTA，GE Healthcare

缓冲液C：20mmol/L TrisCl，0.75mol/L NaCl，pH8.0

缓冲液D：20mmol/L TrisCl，0.75mol/L NaCl，pH7.0

缓冲液E：20mmol/L TrisCl，0.75mol/L NaCl，pH6.5，0.1mol/L咪唑

层析柱：50mm×200mm柱(GE Healthcare)，床高100mm，床体积200ml。

操作：

上样及洗脱流速：10-15ml/min，上样量不超过10g总蛋白。缓冲液C充分洗脱平衡。上样后分别用缓冲液C和缓冲液D各冲洗3-5个柱体积，即冲到基线。用缓冲液E为洗脱液，起峰收集。进行SDS-PAGE电泳，蛋白定量。

2)脱盐：

分离介质：Sephadex G-25，Fine，GE Healthcare

缓冲液B：20mmol/L Tris.Cl，pH8.5；

层析柱：50mm×1000mm柱，GE Healthcare，床体积约1900ml。

操作：上样及洗脱流速35ml/min。收集蛋白峰。蛋白定量。

3)DEAE-sepharose层析：

分离介质：DEAE-Sepharose，Fast Flow，GE Healthcare；

缓冲液F：20mmol/L Tris.Cl，pH8.5；

20mmol/L Tris.Cl，pH8.5+0.4mol/L NaCl；

层析柱：50mm×200mm柱，GE Healthcare，床高100mm，床体积约200ml。

操作：

上样量3-5g总蛋白，上样及洗脱流速10-15ml/min。上样后先用10倍体积的缓冲液F冲洗，再用缓冲液F+0.4mol/L NaCl洗脱。收集洗脱峰。进行SDS-PAGE电泳，测蛋白浓度及纯度。

4)脱盐：

分离介质：Sephadex G-25，Fine，GE Healthcare；

缓冲液G：50mmol/L Tris.Cl，pH8.0；

层析柱：50mm×1000mm柱，GE Healthcare，床体积约1900ml。

操作：上样及洗脱流速35ml/min。收集蛋白峰。蛋白定量。

5)CM-Sepharose层析：

分离介质：DEAE-Sepharose，Fase Flow，GE Healthcare；CM-Sepharose，FaseFlow，GE Healthcare；

缓冲液：20mmol/L pB pH7.2；20mmol/L pB pH7.2+0.1mol/L NaCl；

20mmol/L pB pH7.2+0.4mol/L NaCl

在4℃层析柜中操作。

层析柱：50mm×200mm柱，Pharmacia，床高100mm，床体积约200ml。

将DEAE柱和CM柱串联，DEAE在前。操作：上样量3-5g总蛋白，上样及洗脱流速5ml/min。收集洗脱峰。进行SDS-PAGE电泳，测蛋白浓度及生物学活性。

6)Sephacryl S-100层析：

分离介质：S-100，fine，GE Healthcare

缓冲液：20mmol/L PB，pH6.8；

层析柱：50mm×1000mm柱，GE Healthcare，床体积约1900ml。

操作：上样及洗脱流速35ml/min。收集蛋白峰，蛋白定量。此即为rhNGF原液(半成品)。

【实施例10】重组蛋白的理化性质分析

表1：SDS-PAGE电泳凝胶扫描分析结果

样品	样品1	样品2
			样品泳道编号	1 2 3	4 5 6
目标蛋白的纯度(％)	78 85 95	95 98 99

SDS-PAGE的图谱见图21；HPLC的图谱见图22，从结果看到两批蛋白(样品1:1、2、3泳道；样品2:3、4、5泳道)纯化后的纯度分别为95％(泳道3)和99％(泳道6)，rhNGF纯品经高效液相色谱检测，得到单一的吸收峰，保留时间为20.667min，峰面积为98.51％。

【实施例11】重组蛋白的生物活性分析

1.TF-1细胞依赖法MTT检测NGF的生物学活性

TF-1细胞表面的NGF高亲和力受体TrkA与NGF结合后，能诱导TrkA自身磷酸化，从而引起TF-1细胞的增殖。在实验中我们发现，TF-1细胞对rhNGF依赖性很重要，培养细胞时，rhNGF的使用浓度要适当，只有这样TF-1细胞对于rhNGF的效应才能体现出来。此外，在MTT法中，我们尝试了几种不同的溶解蓝紫色沉淀的方法，如DMSO法和酸化的SDS法，结果发现用DMSO法比酸化的SDS法灵敏，但是吸取上清会搅动沉淀引起误差，所以操作要格外仔细。用MTT法测定NGF生物学活性，操作简单易行，结果稳定可靠，重复性好，该方法的建立为NGF的活性测定奠定了基础，,具体样品的检测结果和对比的阳性样品结果即NGF作用下TF1细胞增殖情况见图23。

TF-1细胞增殖法检测NGF活性实验，细胞初始浓度为5*10⁴/ml(2500/孔)，NGF活力单位梯度是250，500，750，1000，1250，1500，1750，2000U/ml，分别培养24h，48h和72h后经MTT染色于490nm测吸光值，细胞培养72h做出四参数拟合曲线，曲线见图24，由图24可见，与对照组相比，NGF对细胞增殖有较为明显的促进作用，且随着NGF活力单位的增加而加速增长，当NGF高于一定浓度(1750U/ml)细胞增殖出现抑制。标准品：小鼠颔下腺神经生长因子(2.5s mNGF)，批号20150305，珠海丽珠集团生产，含量9000BU/支(20μg)；对照品：hNGF原型(基因没有改构)，以色列prospecbio(进口)(HEK产)，含量2ng/ml(支)，-30℃保存，临用前用生理盐水稀释。

活性结果如下表2：

表2.TF-1细胞检测NGF样品和对照品的活性结果

	蛋白浓度(μg/ml)	活性(ng/ml)	比活性(BU/mg)
				样品1	20	5	250
样品2	20	4.6	230
				样品3	20	5.8	290
标准品	20	2	100
				对照品(原型)	20	3	150

从TF-1细胞检测活性结果(表2)可见，本发明表达和纯化的目的蛋白的活性三个样品分别为5ng/ml、4.6ng/ml和5.8ng/ml，平均为5.13ng/ml，比活性分别为250BU/mg、230BU/mg、290BU/mg；而小鼠颌下腺提取的标准品的活性为2ng/ml，比活性为100BU/mg；基因没有改构的对照品(原型)的活性为3ng/ml，比活性为150BU/mg。本发明改构基因表达的蛋白活性明显高于基因原型表达的蛋白活性。

2.鸡胚神经节法测定NGF的生物学活性

标准品：小鼠颔下腺神经生长因子(2.5s mNGF)，批号20150305，丽珠集团生产，含量9000BU/支(20μg)；对照品：hNGF原型(基因没有改构)，以色列prospecbio(进口)(HEK产)，含量2ng/ml(支)，-30℃保存，临用前用生理盐水稀释。

样品活性结果计算方法:

样品活性＝标准品活性单位×(样品实测活性/标准品实测活性)

例如:样品A以“+++”为判定标准,即第二孔100倍稀释；

A样品活性＝1000×(100/500)＝200BU/ml

在倒置显微镜下观察，比较神经节周围突起的生长情况，选择突起最长最密者，每ml培养基中所含的NGF量定为一个活性单位。原液的稀释倍数即为半成品的活性，表示为BU/ml。

比活性测定：

根据蛋白含量测定及活性测定结果计算比活性，表示为BU/mg。

检测结果见表3：

表3.鸡胚神经节法检测样品和对照品的活性

从鸡胚神经节的方法测定的活性分析结果可见：改构的蛋白样品1和样品2的生物活性分别为267BU/ml和197BU/ml，而基因原型的阳性对照的生物活性是100BU/ml，本发明改构基因表达的蛋白活性明显高于基因原型表达的蛋白活性。

Claims

1.一种重组人神经生长因子基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1所述的重组人神经生长因子基因的重组表达载体。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于将所述重组人神经生长因子的基因插入pET28a质粒载体构建而成，其具有图8所示的结构。

4.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于将所述重组人神经生长因子基因插入pPIC9K载体构建而成，其具有图14所示的结构。

5.含有权利要求1所述的重组人神经生长因子基因的工程菌。

6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于所述工程菌为大肠杆菌。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于其含有权利要求3所述的质粒载体。

8.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于所述工程菌为酵母。

9.如权利要求8所述的工程菌，其特征在于其含有权利要求4所述的表达载体。

10.制备重组人神经生长因子的方法，包括下述步骤：

1)将表达重组人神经生长因子的基因可操作地连接于质粒表达载体，构建重组表达载体，所述表达重组人神经生长因子的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

2)将步骤1)构建的重组表达载体转入宿主细胞中，获得工程菌；

3)培养步骤2)所述的工程菌；

4)提取并纯化表达的重组人神经生长因子。