TW204370B - - Google Patents

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經濟部中央櫺準局员工消费合作杜印製 五、發明説明（1) 發明之領域 本發明俱有關一種突變型A0X2啓動子，一種攜有該啓動 子之微生物，該微生物之製法，及使用該微生物生産異種 蛋白質之方法。本發明又偽有鼸一種含有所述突變型A0X2 啓動子之質體，攜有所述質鼸之轉形體，及使用所述轉形 蘐生産異種蛋白質之方法。 發明之背景 甲醇利用型酵母使用甲醇作磺源及能源。甲醇利用徑路 始於甲醇氧化成甲醛。該氣化步驟僳由醇氣化_(A〇X, EC 1.1.3. 13)所催化。雖然AOX於含葡萄糖之培養基内被低度 表現，但在含甲醇之培養基内AOX占被溶解之胞内蛋白質 之 30%。 巴斯德畢赤酵母菌(P i c h i a p a s t o r i s ) S —種Φ I? ill @ 型酵母，撝有二AOX基因（A0X1基因及A0X2基因）。 A0X1啓動子與A0X2啓動子之活度差異顯著。巴斯德畢赤 酵母菌内之A0X活度大半來自位在A0X1位址之表現[分子與 細胞生物學，上，1 3 1 6 ( 1 989 )]。巴斯德畢赤酵母菌種条中 於A0X1位址取代有異種基因者於含甲醇培養基内生長缓慢 ,因而需要長時間培養，此乃歸因於甲醇之利用性單玀依 賴A0X2活度之故。 於编碼A0X之二A0X基因中，A0X1啓動子為A0X1基因之諏 節區，具有高活度而可用於甲醇利用型酵母内以高産率表 現異種蛋白質。而A0X2啓動子之活度弱，因此，不適合表 現異種蛋白質。 (請先間讀背而之注意苹項#项寫本頁) 線* 本紙張尺度逍用中BB家橒準(CNS)TM規格(210X297公龙） 3 S1. 2. 20,000

經濟部屮央櫺準局Μ工消t合作社印M 五、發明説明（2) 晚近，曾進行研究，使用所述Α0Χ基因之調節區來生産 異種蛋白質[參見EP-A-344459UP-A-2-104290)(文中所用 "JP-A"-詞代表日本待許公開案）；EP-A-343388UP-A-2-242694 ) ； GB-A-22 1 7332 (JP-A-2 -3 03497 ) ]〇 天然型Α0Χ2啓勤子述於美國第5,032,516號專利案。 一旦编碼異種蛋白質之基因藉取代而插入寄主之Α0Χ1基 因區後，甲醇利用度須單獨依靠Α0Χ2活度。此種突變體於 含甲醇之培養基内之生長速率比野生型寄主差，因此，不 利地使突變髏必須長期培育。 本發明之一目的係提供一種與其他缺Α0Χ1基因活度之酵 母種糸不同之酵母菌種条，其於含甲醇之培養基内生長良 好，又可表現異種蛋白質；以及提供此種種条之獲得方法。 本發明之另一目的偽提供一種可供高度表現異種蛋白質 之新穎啓動子，及此種啓動子之獲得方法。 又一目的偽提供一種包含含所述啓動子之質髏之轉形體 ，藉此建立一種異種蛋白質之生産条統。 發明之概述 前述各目的可藉由提供下列各者而完成： (1) 一種衍生自野生型Α0Χ2啓動子之突變型Α0Χ2啓動子 ，其偽藉由部份刪失或取代其氮嫌基序列，或將新穎氮驗 基序列加入其中衍生而得； (2) —種撖生物種条，於其染色腥上撝有處於前述（1)所 述之突變型Α0Χ 2啓動子之控制之下的A 0Χ基因； (3) —種播得如上（2)所述之種条之方法，該方法包括於 (請先閱讀背而之注意事項再项寫本頁) 裝· 訂 -線. 本紙張尺度遑用中a國家標準(CNS)T4規格(210x297公藿） 4 S1. 2. 20,000 2043^0 Λ 6 Π 6 經濟部中央標準局只工消#合作社印褽 五、發明説明（3 ) 含甲醇之培養基内培養一種，其中Α0Χ2基因偽由野生型 Α0Χ2啓動子控制之種条，藉此造成野生型Α0Χ2啓動子之突 變； (4) 一種生産異種蛋白質之方法，該方法包括培育如上 文（2)所述之種条； (5) —種質體，其中含有如上（1)所述之突變型Α0Χ2啓動 子； (6) —種轉形體，偽藉由引進如上（5)所述之質體而得者 ;及 (7) —種生産異種蛋白質之方法，該方法包括培育如上 (6)所述之轉形髏。 附圖之簡述 第1圖示例說明PC4130之構築計劃及GCP101之獲得方法 。第1画中，” P r 〇 m ”代表啓動子，” t ”代表终結子，而 ·’ Ρ ο 1 y A ” 代表 p ο 1 y A 區。 第2圖描繪A0X2基因附近之限剪誨圖譜。括弧内之數字 分別代表距Xbal址（距離0)之距離（X 100氮«基）。 第3團描繪其中之A0X2啓動子已經被選殖的質體PMM030 及PMM034,各別附有限剪《圖譜。括弧内之數目分別代表 距EcoR I址（距離0)之距離（X 100氮鹼基）。 第4圖描繪其中之A0X2啓動子已經被選殖的質髅PMM031 及PMM 0 3 5,各別附有限剪癱圖譜。括弧内之數目分別代表 距EcoR I址（距離0)之距離（x 100氮齡基）。 第5團示例說明整合媒介，PYI066及PYI068,之構築， (請先閲讀背而之注意事項再项艿本頁) 裝. 订 線· 本紙張尺度逍用中a國家樣準(CNS)肀4規格(2丨0X297公*) 5 S1. 2. 20,000 043^0 A (j H 6 五、發明説明（4 ) 經濟部中央標準局只工消赀合作社印製 供引發ΑΌΧ2啓動子序列之轉形。第5圖中，”BAP”代表細菌 驗性磷酸誨而：A0X2 p「ob”代表A0X2啓動子。 第6圖顯示播得帶有突變型Α0Χ 2啓動子之各種条之方法。 第7圖示例說明PPG001之構築。第7圖中，"P"代表啓動 子而” t "代表終結子。 第8圖示例說明質龌PMM041及PMM042之構築，此種質髏 可供於A0X2啓動子之控制之下表現HSA。 第9圖説明實施例7之程序。第9圖中，””代表探針 1 0 . 6 k b K p η I段），” P ””代表A 0 X 2啓動子，而° 4 "代表 B g 1 II割裂址。 發明之細節說明 (1 )突變型A0X2啓動子 本發明之突變型A0X2啓動子偽藉由部分刪失或取代天然 型（亦即野生型）A0X2啓動子之氮驗基序列或將新穎氮鹼基 序列加入其中而衍生得。 a. 野生型A0X2@動子之氮齡基序列之部分刪失 脚失部份並無持殊限制，只要位於野生型A0X2啓動子區 内即可。例如，此部位可介於，如序列鑑識编號：1所示 含於野生型A0X2啓動子之氮鹸基序列之氮_基编號730與 1 528間。刪失可包括一或一以上之氮驗基，且可出現於一 或一以上之位址。舉一特例，值得一提者為序列鑑識编號 :2所特別顯示之啓動子，其中序列鑑識编號：1所示之序 列由氮鹼基编號749(c)至1187(T)共439氰鹺！基對被刪失。 b. 野生型Α0Χ2啓動子之氮螓基序列之部分取代 (請先IV.1讀背而之注意苹項再艰寫本U) 裝- 表紙》尺度遑用中β B家«毕(CNS)甲4規格（210x297公*) S1. 2. 20,000 6 經濟部中央標準局A工消费合作社印製 五、發明説明（5 ) 取代部位並無持殊規定，只要位在野生型Α0Χ2啓動子區 内即可。例如，此部位可介於序列鑑識编號：1所示之含 Α0Χ2啓動子之氡鐮基序列的《鹼基编號730與1528間。取 代可包括一或一以上之氮驗基且可出現於一或一以上之位 址。舉一特例，值得一提者為序列鑑識编號：3特別顯示 之啓動子，其中序列鑑識编號：1所示之氮驗基序列之位 在位址编號1274(Τ)之氮鹼基已經由C所置換。 C.新氮鹸基序列加至野生型Α0Χ2啓動子内 加入部位並無待殊限制，只要位在野生型Α0Χ2啓動子區 内即可。舉例言之，此部位可介於序列鑑識编號：1所示 之含野生型Α0Χ2啓動子之氣鹼基序列之氮鹼基编號730與 1528間。可加入一或一以上個氮鹸基，且該加入可出現於 一或一以上個部位。舉一持例，值得一提者為序列鑑識编 號：4所特別顯示之啓動子，其於序列鑑識编號：1所示之 氮_基之氮驗基编號1314(A)與1315(C)間帶有序列鑑織编 號：7所示之額外序列。 於前述序列鑑識编號：2, 3及4分別顯示之氮鹸基序列 中，例如，由氮鹾基编號1至730之區域欲求簡便起見，顯 示為與野生型柑同之序列。然而，顯然易見，氮鹸基1-7 3 0區並非限於所示者，而偽包含適宜的刪失，取代及/或 插入。 於野生型Α0Χ啓動子之氮鐮棊序列之刪失，取代或加入 可使用一般使用之基因工程技術進行，例如址指導刪失 [N u c 1 . A c i d s R e s . , 11 , 1 6 4 ( 1 9 8 3 )],址指導突變發生及 (請先閲讀背而之注意事項洱蜞寫本頁) 裝· 訂 線. 本紙張尺度遑用中《明家標毕(CNS) T4規格（210><297公放） 7 S1. 2. 20,000 經濟部中央標準局A工消#合作杜印製 .043^0_^_ 五、發明説明（6) 合併使用合成基因與限剪痗處理。 (2) 於其染色體上攜有突變型A 0X2啓動子之微生物種条 本發明之微生物種条於其染色醱上撝有處於如上（1)所 述之突變型A0X2啓動子之控制下的Α0Χ基因。 待別，該種条之染色體撝有處於如上U)所述之突變型 A0X2啓動子之控制下的Α0Χ基因，而不生産A0X1基因编碼 的Α0Χ。更待定而言，該種条於其染色體上帶有A0X1啓動 子及如上文（1)所述之突變型A0X2啓動子，而異種蛋白質 基因僳處於A0X1啓動子之控制下及Α0Χ基因係處於突變型 A0X2啓動子之控制下。 至於此種微生物種糸，值得一提者為種条GCP101及 SHG4105-4〇 (3) 於其染色驩上攜有突變型A0X2啓動子之徹生物種条之 獲得方法 1) 起始微生物種条 用於實施本發明之起始撤生物種条於其染色體上攜有處 於野生型A0X2啓動子之控制下的A0X2基因。如此，該種条 於其染色髏上撝有A 0 X 1啓動子及A 0 X 2啓動子，而A 0 XI基因 偽處於A0X1啓動子之控制下及A0X2基因僳處於A0X2啓動子 之控制下。 此種微生物種条，例如為巴斯德畢赤酵母菌(野生型）， 而其特例，值得一提者為種条GTS115[HRRL託存编號Y-1 585 1 ;基因，1 1 5 - 1 25 ( 1 987) ] 〇 2) 異種蛋白質基因之引進 (諳先閱讀背而之注意事項再艰巧本頁) 裝- 線. 本紙張尺度边用中as家«準(CNS)甲4規格(2】0X297公;¢) 8 S1. 2. 20,000 Λ 6 Ιϊ 6 經濟部+央櫺準局只工消俾合作杜印製 五、發明説明（7) 一種異種蛋白質基因被引進如上文1)所述之起始種糸内 ,藉此造成該異種蛋白質基因取代於Α0Χ1基因區。 至於異種蛋白質，值得一提者有人血淸白蛋白（HSA), Β 型肝炎病毒抗原，尿檄動酶及干擾素，及其他。 如EP-A-3 4 4 4 5 9 UP-A-2 - 1 04 209 )所述，線形，對整合址 有特異性之媒介，於其Α0Χ1基因之5’與3’同源區域間含異 種蛋白質基因轉錄單元及標記等者，可用以取代Α0Χ1基因 (參見第1圖）。起始種条之轉形傜葙已知方法進行。 至於此種種条之恃例，值得一提者為P C 4 1 3 0及P C 4 1 0 5。 異種蛋白質基因插入Α0Χ1基因區，或Α0Χ1基因進行部分 修改（例如刪失，取代或加入），因此，由Α0Χ1基因生産 Α0Χ之産量減少，繼以於該條件下之突變，及逛以隨後引 進異種蛋白質基因。 3 )轉形體之獲得 如上2)所述之種条（轉形體中不再出現由Α0)Π基因生産 Α0Χ1者）於含甲醇之培養基内培育，藉此引起於Α0Χ 2啓動 子區之突變作用。 甲醇濃度例如為約1至53!。培養基可為天然者或人造者 。至於天然培養基，值得一提者例如為ΥΡ培養基（1：«酵母 抽取物+ 2¾聚蛋白驊）。培育通常偽於15至43t：(適合於 約30t：)進行約20至120小時，若有所需，伴以通氣及/或 攪拌。培育完成後，取部分或全部培養醪，移入新製含甲 醇之培養基内曲鑛培育。次培育時，取部分培養醪及稀釋 ，稀釋液展布於缺乏養分之含甲醇之培養皿上，例如23： (請先M請背而之注意苹項#塡寫本頁) 私紙張尺度遑用中困國家樣毕(CNS)T4規格(210x297公*) 9 S1. 2. 20,000 2〇43r^〇 Λ β Ιϊ 6 經 濟 部 中jkm 準 Μ 工 消 社 印 製 五、發明説明（S ) M e 0 Η - Y N B w / 〇 a . a .培養皿1 0 . 7 3ί酵母氮鐮基，不含胺基酸 ,2iS甲酵及1.5359脂粉），接箸於30¾培育。培育約3至14 曰後，由所得之菌落可獲得轉形體。 4)突變型A0X2啓動子之回收 藉由使用適當基因工程技術由A0X2啓動子區域選殖可由 如上2)所述之轉形醱回收突變型A0X2啓動子。 所回收之啓動子之氮齡基序列可藉已知技術分析。 (4)使用如上（2)所述之徹生物種糸生産異種蛋白質之方法 如上（2)所述之種条（轉形體）可於對該寄主細胞已知之 培養基内培養。培養基較好含有甲醇。甲醇瀵度例如為約 0.01至5¾。培養基可為天然者或人造者。天然培養基包含 YNB培養基（0.7¾酵母氮鹼基）及YP培養基（1¾酵母抽取物+ 2¾聚蛋白練）及其他。 培育通常偽於15至43Ό (較好約301 )進行約20至360小 時，若有所霈，伴随著通氣及/或攢拌。 培育後，回收培育上清液及藉己知方法例如藉親和，層 析或凝膠過濾分段法由上淸液中純化異種蛋白質。 (4)質體 本發明之質腥撕有如上（1)所述之突變型A0X2啓動子。 本發明之質驩可含有信號肽基因，結構蛋白質基因，終 結子，同種區，標記基因，可於寄主複製的自發複製序列 等。 可用作倍號肽基因者有人血清白蛋白前原肽基因或其改 質基因（EP-319641UP-A-2-167095)),酵母轉化痗信號肽 (請先閱讀背而之注意事項洱艰寫本頁) 裝- 訂- 線， 本紙»尺度逍用中B明家«準(CNS)肀4規格(210x297公Λ) S1. 2. 20,000 10 ^043^0 Λ 6 Π 6 五、發明説明（9 ) 基因，酵母

因子信號肽基因及人工合成前導子序列（EP 經 濟 部 中 櫺 準 局 A 工 消 t 社 印 製 -329127 (JP-A-1-240191 ))〇 自發複袈序列之例有單離自巴斯徳畢赤酵母菌染色體 0以之？41?51及？41^2(美國第4,8 37,148號專利案）。 至於結構基因，值得一提者有異種蛋白質（例如人血清 白蛋白，原尿激動組織胞質素原活化劑，B型肝炎表 面抗原，各種干擾_等）基因，A 0 XI基因及A 0 X 2基因等。 至於终結子之例，值得一提者有A0X1終結子及A0X2,终結 子。 同種區包含HIS4, URA3, LEU2及ARG4等。 可用作標記基因者有抗生素抗藥性基因及異養型突變互 補基因等。至於抗生素，值得一提者有環己醛亞 (cycloheximide)， G_418,氣徽素（chloramphenicol), 博來徽素（bleomycin)及潮徽素（hygronycin)等。異養型 突變互補基因包含Η I S 4 , U R A 3 , L E U 2及A R G 4等。 轉錄單元以5’至3’之方向至少包含突變型A0X2啓動子， 信號狀基因，結構蛋白質基因及终結子，以該顒序呈作業 聯結。 本發明之質體可使用一般所接受之基因工程技術製備。 (5)轉形髏 本發明之轉形鼸含有引進其中的如上（4)所述之質臞。 實施本發明時以使用酵母作寄主為較佳。特佳者為巴斯 德畢赤酵母菌。至於其待例，值得一提者為種条GTS115 (N R R L 託存编號 Y - 1 5 8 5 1 )。 (請先閱讀背而之注意事項#项筠本頁) 本紙張尺度逍用中國國家楳準(CHS)肀4規格(210X297公Λ) 81. 2. 20,000 11 u 〇43^〇 Λ 6 \\ 6 五、發明説明（10)

夕L 經濟部屮央櫺準局K3:工消伢合作社印3i 寄主（酵母）細胞可藉已知方法轉形，例如遴酸鈣沈澱法 ,使用聚環氧乙烷之原生質髏融合法，或電穿孔法。隨後 可選出期望的轉形體。 質護可呈染色鱷之插子形式，藉由重組整备於染色鱧之 形式或質體形式，出現於寄主細胞。 引進寄主之外來基因之複本數可為一或一以上。 同一種条可含有本發明之質證連同另一質證，另一質體 可供表現處於另一啓動子之控制之下的異種基因。 (6)使用如上（5)所述之轉形體生産異種蛋白質之方法 藉由培育如上（5)所述而得之轉形證，可以如上（2)所述 之相同方式生産異種蛋白質。 下列工作冽及試驗例進一步示例説明本發明。但绝非藉 以限制本發明之範圍。 用以實施本發明之技術，反應程序及分析方法為業界眾 所周知。除非有其他指示，否則所有酯皆偽由商業來源獲 得，例如得自耷酒造公司。 除非有其他規定，否則用於誨反應之缓衝液及反應條件 像如誨供應商所推薦者。 酵母種糸巴斯德畢赤酵母菌GTS115, PC4130及PC4105及 質體pPGPI及pPGSI僳為本發明人所擁有。 以質醱轉形大腸捍菌，溶菌斑雜交及電泳偽如”分子選 殖”，冷泉港實驗室，1 982所述進行。 實施例1 GCP101之獲得（參見第1圔） 本紙張尺度逡用中a a家標準（CNS)甲4規格（210x297公龙）12 S1. 2. 20,000 (請先閲請背而之注总节項再塥窵本頁) 裝· 訂 線·

修正X 五、發明説明（11) (請先閲讀背而之注意苹項外填寫本頁) 種条 PC4130係藉由 EP-A-344459(JP-A-2-104290)所述方 法，以得自質體pPGPI之Mil割裂之斷Η取代 巴斯德畢 赤酵母a GTS115(his4)之A0X1基因B而得，其中質jjlpPGPl 帶有由A0X1啓動子控制且供表現HSA之轉錄單元。該種条 缺A0X1结構基因，因此，酵母於含有甲醇作碩源之培養基 内之生長速率低（MulT種条）。 ^ PC4130接種於3n文YPD培養基（1¾酵母抽取物，2¾巴克托 蛋白觫及2%«萄糖）内。經培育24小時後，培養後之細胞 接種於50BiL2!KMe〇H-YP培養基（1%酵母抽取物，2¾巴克托 蛋白臃及2¾甲醇）内，直至於540Π1»之初始光密度（0D 54〇) 經濟部屮央櫺準局Μ工消费合作社印製 為1為止。於301C培育3日後，培養醪接種於50B文2% MeOH -YP培養基内至初始〇t>540為1為止。每隔3日•重複相同之 次培養程序。各次雔代培養時，細胞懸浮液以無菌水稀釋 至濃度為107細胞/平板，以供展布於2XMeOH-YNB w/o a.a.培養皿（0.7¾酵母氮鐮基，不含胺基酸，2¾甲酵及1.5 ：«瓊脂）上，於301C培育5日，隨後檢査是否出現菌落。次 培養12日後，所得之細胞展布於2!1!1^0^”》/〇3.3.平 板上。生成20糰菌落。（於該種平板上，Mut_種条幾乎不 生長而Mu t+種糸可增生。）如此，於該平板上生成菌落， 代表獲得具有較高能力可利用甲醇之Mu t+突變體。所得菌 落之一以無菌水妥當稀釋，稀釋液展布於2XMeOH-YHB w/o a.a.平板上，供生成分離之單一菌落。其中一者定名為 GCP101〇 比較PC4130輿GCP101於各種培餐基上之生長速率。將一 81. 2. 20,000 .本紙張尺度逍用中國S家楳毕(CHS) Τ4規格(210X297公Λ) 13 五、發明説明（12) Λ fi It 6 接種環之細胞[於4¾下儲存於YNB w/o 3.3.培養皿（0.7» 酵母氮鹼基，不含胺基酸，2!«葡萄耱及1.5¾瓊脂粉）中者] 。接種於各試管之3bJL YPD培養基内及於30¾培育24小時 。然後將細胞接種入含50raJl各培養基之燒瓶内，至初始 0 1)54〇為0 . 1為止，及於3 0 υ培養。以2 4小時之間隔测定細 胞增生度及培養上清液内之人血清白蛋白濃度（表1)。藉 RPHA方法（歐洲專利案第122620號）測定人血清白蛋白濃度 。所用培養基為YPD培養基，2%MeOH-YP培養基（13；酵母抽 取物，2¾巴克托蛋白練及2¾甲醇）及4¾ MeOH-YP培養基（1¾ 酵母抽取物，2 %巴克托蛋白諫及4 S:甲醇）。 雖然於含葡萄耱作磺源之培養基内，二種条間並未觀察 得顯著差異，但與PC4130相較，GCP101於含甲醇作碩源之 培養基内之生長速率增加（轉形為Mu t+)。至於HSA之生産 ，GCP101與PC4130間之差異極小。 裝· 訂_ 線· 經濟部中央捃準局β工消ίν合作杜印製 本紙張尺度逍用中國《家標準(CNS)肀4規格(210X297公龙）14 S1. 2. 20,000 20 4柳 經濟部中央櫺準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（13) J_1__ 就於不同培養基内之細胞增生與HSA之生産比較GCP101與 PC4130 培養基 種系 培養期（小時） 0 24 48 72 YPD PC4130 0.1 67 80 78 PC4130 一- -- -一 GCP101 0.1 63 78 79 GCP101 珊— —- -- 2% MeOH-YP PC4130 0.1 16 36 46 PC4130 10 60 100 GCP101 0.1 24 63 . 63 GCP101 10 70 80 4% MeOH-YP PC4130 0.1 9 20 28 PC4130 1 30 80 GCP101 0,1 10 57 84 GCP101 2 60 120 註：上排：增生度（0D54O );下排：HSA産量（明/文）；一：各培餐基及各種条皆未測得。 本紙張尺度遑用中β »家標準(CHS)T4規格(210X297公Λ)15 S1. 2. 20,000 (請先間讀背而之注意肀項再填"本頁) 裝- 訂_ 線· 〇4於〇 經濟部屮央橾準局A工消费合作社印製 Λ βη 6_ 五、發明説明（14) 實施例2 Α0Χ2基因之装jj A0X2基因及其附近之序列及限剪_圖譜見於cregg等人 [Mo1. Cel1. Biol.,立，1316-1323(1989)]及 Koutz等人 [酵母，互，1 67 - 1 77 ( 1 989 )]之報告。因此，可參考該等報 告作A0X2基因之湮殖計剷。Α〇Χ2基因及其附近之限剪豳圖 譜示於第2圖。 首先，藉 Cameron等人[Nucleic Acid Res,, 土，1429 (1977)]之方法由pC4i30及GCP 101二種条抽取及純化染色 龌DNA。各染色鳢DHA以Xbal及PstI完全消化，獲得完整涵 蓋A0X2啓動子區，A0X2結構基因及A0X2終結子之一段。藉 乙醇沈澱及離心收集消化産物，然後將其乾燥及溶解於無 菌水内。加入Ec〇R I甲基誨（寶酒造）及培育該溶液。反應 一 . 混合物以飽和以TE之酚-氯仿抽取，然後以氛仿抽取，水 層進行乙醇沈醱。藉離心收集沈澱，然後將其乾燥，及溶 解於無菌水中。 末端使用DNAg化套件（寶酒造）及I聯結子鈍化， d(pG-G-A-A-T-T-C-C)(賫酒造）使用DNA接合套件（寶酒造） 與其接合。再度，以甲酵進行沈澱，沈澱物藉離心回收， 經乾燥及溶解於無菌水中。加入EcoRI及於37¾培育1小時 。於IX瓊脂糖睡上進行霄泳，切下相當於4-5kb之凝膠區。 於霣溶離凝謬區及使用DNA回收用之GEHE CLEANII (BI〇101)純化後，將回收得之DNA溶解於無菌水中且與 λ gtl0® (Protoclon eTM 条統；Promega)接合，使用 •本紙張尺度遑用中a B家樣準(CNS)肀4規格(210X297公Λ)16 S1. 2. 20,000 (請先閱讀背而之注意事項办项寫本頁) 裝· .^- Λ 6 Β6 204370 五、發明説明（15) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Gigapack G0LD3(Stratagene)進行試管試驗。所得混合物 暴露於大腸桿菌C600及C600hfl種条（調整為A600 = 2)。各 種条細胞播種於NZY培餐皿（UHZ胺，0.5X氛化納，0.5»!酵 母抽取物，0.02%硫酸鎂及1.5%瓊脂粉）上供生成存庫，遇 以進行滴定度测定。重組噬菌體被吸附於大腸捍 C600hfl細胞上，而細胞被播種於ΝΖΥ培養皿上，於各板上 生成約500溶菌斑。 為衍生自PC4130及GC101種条之轉形醱使用4張尼龍膜 (Colony/Plague ScreenTM, NEN)。細胞移至膜上’進订 變性，中和及固定處理。所用探針為相當於巴斯德畢赤酵_ 母菌IF0 1013衍生而得之A0X1結構基因首半之Ecp_R V -BjJ. H 段者，係經由使用逢機引子加標幟套件（寶酒造）加上32 P 標幟而製備。前雜交僳於含UBSA, lmM EDTA，0·5Μ NaH Ρ0 (ρΗ7.2)及7%SDS之溶液内於65t進行5分鐘。雜交 傜於含 13!BSA, lmM EDTA, 0.5M NaH2P〇4(PH7.2)及 7SJSDS 之溶液内於65¾進行5分鐘。雜交偽於含1«BSA, ImM EDTA 0.5M NaH2P04(pH7.2)及 73；SDS)之 32P探針溶液内於 65 進 經濟部中央標準局员工消費合作社印製 行整夜。供洗滌之用，細胞於0.5M NaH2P04(pH7.2)内於 室溫培育10分鐘，然後於含0.5%BSA, IraM EDTA, 40ml«l NaH2P〇4(PH7.2)及5XSDS之溶液内於37C培育30分鐘。後 述培育共計重複3次。濾片經風乾及各別於X-光曝光匣内 於-80t：與X -光底片接觸16小時進行自動放射線攝影。 由各種条，獲得二陽性種株。各種条之一種株進行噬菌 體增生及抽取噬菌體DNA。如此所得之DNA以juR I刻裂及 藉瓊脂糖膠電泳證S生成期望的片段（1.5kb及2.9kb)。 本紙張尺度遑用中國國家揉準(CNS)肀4規格(210X297公一yj ~ 明 、 五 a a e Λ 6 以

C 裂 割 後 收 回 被 段 Η 之 成 生 所 m: 理 處 誨 酸 性 驗 以 髏 菌 噬 與 菌 捍 。臈 合大 接形 物轉 産來 化用 消物 I' R.合 混 合 接 之 ο 含 於 0ΗΒ 8 摺 咆 細 將 文 m- 驗 之睐 林白 西蛋 比聚 00 安 0 62於 0解 將溶 像納 法化 製氯 - σο 之 5 皿及 養物 (¾取 (抽 母 酵 8 5 上 皿 養 培 西 為比 整安 調入 水加 加後 » 卻 中冷 水 ， 升 林 菌 } 滅化 壓固 高其 物使 合 及 混皿 ，膠 粉塑 脂至 瓊配 5g分 L其 將 入 加 (请先IV.I讀背而之注意事項#蜞寫本頁) 經濟部中央櫺準局EX工消"合作杜印姐 及於371培育整夜。 對所生成之各薗落，進行迷行型製備，質體經抽取出’ 利用_^RI消化進行篩檢。結果，自二種条PC4130及 GCP101皆獲得種株，其中帶有l.5kl^2.9kb段分別被插入 PUC19。種株於含s/njl安比西林之超级肉汁（其製法 像將12s巴克托胰蛋白睐，24g酵母抽取物及5nJl甘油溶解 於水，加水調整為900|«文，將溶液（溶液A)高歷滅菌及將 溶液A與溶液B以9 : 1之比混合；溶液B之製法偽將3. 酸二氫鉀及12.5g磷酸氫二鉀溶解於水中及加水調整為100 »义）内於37C葵搖培養整夜，質體DNA經抽取出及藉栽性 SDS法大量純化。 分別含自PC4130衍生而得之A0X2啓動子區及A0X2结構基 因的質龌分別被定名為P.NM030及PMM031，而分別含自GCP 101衍生得之A0X2啓動子區及AOX 2結構基因之質鼸分別被 定名為PMM034及pMM035(參見第3圖及第4圖）。經由以各種 限剪痗消化該等質體所得之片段大小僳與前文報告之類型 本紙張尺度遑用中β國家樣準(CNS)甲4規格(210x297公;Ϊ)18 S1. 2. 20,000 2 〇4於〇 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明（17) 吻合。 實施例3 A0X2啓動子S之氰鹹基序列之決定 PMM030及PMM034經與E c o R I消化’回收1.5kb名段及使用 DKA純化套件（寶酒造）形成鋪端。另外’ 以X b a I消化 ,使用綠豆核酸si (寶酒造）處理後，與經以驗性碟酸缠處 理之段接合。由對應之轉形體製備質體DNA。所述程序導 致PC4130。衍生得之A0X2啓動子區DNA及GCP101衍生得之 A0X2啓動子區DNA於pU. C19之Xbal址次選殖。 由各該質羅，使用決定千序列之刪失套件（寶酒造）製備 5或6刪失突變型種株，其插子大小相差150至300bp。刪失 突變體使用M13二去氣定序列套件（寶酒造）決定序列。結 果，由ATG開始之PC4130衍生得之A0X2啓動子區的1.5kb長 氮鹼基序列及GCP101衍生得之A0X2啓動子區之氮齡基序列 全體皆被決定。 比較由二種条衍生得之序列顯示雖然於PC4130衍生得之 A0X2結構基因中，位距起始字碼子ATG上游255bp之核#酸 [於序列鑑識编號：1中，於第1528核苷酸後方之1529至 1531核苷酸（未示出）],亦卽序列鑑識编號：1中之核哲酸 编號1274為T,於GCP101衍生而得之種株中對應之核哲酸 (序列鑑識编號：3中之第1274核苷酸）為C,邸一個氮_基 不同。 實施例4 使用GCP101衍生得之A0X2啓動子交換PC4130衍生得之 (請先閲讀背而之注意事項补艰寫本頁) 裝· 訂_ 線· 本紙》尺度遑用中B _家《準(CNS) T4規格(210x297公Λ)19 S1. 2. 20,000 Λ 6 Η 6 五、發明説明（1约 Α0Χ2啓動子，反之亦然（參見 EP_A_127304(JP_A_60_41488 )) 供A0X2啓動子交換用之質臞偽藉由將酵母衍生得之轉化 海（SUC2)基因插入PMM030及PMM034之Spel址而構築。如此 ,PMM030及PMM034各別以S pe I消化及，經鹼性磷酸瘺處理 後，回收4.2kb段。經由於其中盔殖SUC2基因而由PUC19衍 生而得之質體PYI056,以EcoR I及_SaJ I消化，各段使用D Η A 鈍化套件（寶酒造）形成鈍端而Spe I聯结子d(pG-A-C-T-A-G -T-C)(NEB)使用DHA接合套件（寶酒造）接合於其上。然後 ，使用Spe I進行消化及回收2.9kb段並與PMM030或PMM034 衍生得之段接合。如此構築得一質髁pYI066，其在衍生自 PC4130之Α0Χ2啓動子上游區含SUC2，及另一質體ΡΥΙ068， 其在衍生自GCP101之Α0Χ2啓動子上游區含SUC2(參見第5圖 )〇 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 此二質鼸用來轉形做為寄主之PC4130及GCP101。各質髏 以E c 〇 R I消化，獾得4.4kb段。由於於SUC2兩侧上存在有與 A0X2啓動子區同源的區域，故預期當各段引進巴斯德畢赤 酵母；g時，於A0X2基因啓動子匾将出現同源重組，結果導致 由二種条衍生得之A0X2啓動子互相交換。 R斯德畢赤酵母菌參照Cregg等人之方法[Mol. Cell. Biol.!_，3376-3385 (1985)]轉形。如此，PC4130及 GCP101 於5·^ YPD培養基内於培養整夜，然後用於接種 (0.01X)。經16至20小時培育後，此時A600由1增至5,各 培餐醪移至50·儿康挛管内雄心。所得細胞懸浮於20 1儿無 S1. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項寫本頁) 本張又度遑用中《 S家《準(CNS)T4規格(210X297公*) 20 經濟部屮央櫺準局貝工消伢合作社印製 五、發明説明（19) 菌水中及再度離心。如此所得細胞懸浮於10H义 SED缓衝液 (1N山梨糖醇，25nM EDTA及50nM二硫赤絲醇）内，離心及 以1M山梨糖醇溶液洗兩次。 然後，細胞懸浮於10π义酵解豳溶液（經由將酵解瘛100T 溶解於SED缓衝液内至50m g/mil濃度而製備）内，於301 培育30分鐘。於顯微鏡下觀察證實當以1/10體積之數童加 入10%SDS時，細胞可能破裂。藉離心收集細胞，以兩份1M山 梨糖醇溶液洗漉及懸浮於CaS缓衝液（1M山梨糖醇及10 u Μ氛 化鈣）内，逛以離心。回收得之細胞懸浮於1 a儿 C a S缓衝 液内及將所得100izil球形質髏懸浮液移入聚丙烯管内。 管内加入各1 0 a g之葙±c_o RI消化PYI066及PYI068所得的 4.4kb DHA段及令混合物於室溫放置20分鐘。然後，加入1 n文 PEG溶液（20¾{聚乙二醇3350, 10bM氛化鈣及10mMTris 鹼，PH7. 4)及所生成之混合物於室溫放置15分鐘。藉離心 收集細胞，懸浮於150u义 SOS溶液（1M山梨糖醇，10idM氛 化0及0.3X YPD)内及令其於室溫S(置30分鐘。加入850 WL 1M山梨糖醇後，10, 100及500 <ζ文之所得球形質鼸懸 浮液分別加入各10m义之面瓚脂（1 Μ山梨糖酵，1 . 35¾:酵母 氮鎊基，不含胺基酸，400 /zg/文生物素，2%葡萄糖及U 瓊脂）内及，經攢拌後，各懸浮液展布於培養皿底部（底部 组成與面瓊脂之組成相同，於皿上固化、）。 於30¾培育4日。面瓊脂層上，若覆蓋有徽薗，則各別 以無菌藥匙刮下及通過3G1玻璃過濾器過濾，俾去除瓊脂 。含徽菌細胞之濾液各別取適量稀釋及接種至MSu培養皿 (請先閱讀背而之注意卞項寫木頁) 本紙張尺度遑用中國B家楳毕(CHS)肀4規格(210x297公；¢)21 S1. 2. 20,000 〇43"<〇 Λ 6 116 經濟部屮央標準局Κ3：工消费合作社印製 五、發明説明（20) (0.73；酵母氮鐘基，不含胺基酸，400ug/义生物素，0.5X 蔗糖及IX瓊脂粉）上。選出所得單一菌落中之一者，懸浮 於無菌水中，用於進一步接種。 相當大的單一菌落接種於2»!^011-¥«8«/〇3.3.培養皿 上及，經5日後，判定增生（Mutf)或未增生（MuO。由表2 可見，衍生自PC 4 130之轉型體（Mu IT種条）中有20¾經由引 進pYI068(突變型A0X2啓動子）而可於前述培養皿上生長。· 相反地，衍生自GCP101之轉形體（MutV種条）中有6¾由於引 進ρΥΙ066(天然型A0X2啓動子）而無法於該種培養皿上生長。 如此，突變型Α0Χ2啓動子替換天然型Α0Χ2啓動子導致啓 動子活度增高，因而使得Mu/種条轉成Mu t +種条。 表 2 Mut+種糸之百分率 所引進之質髏 pYI066(PC4130衍生）pYI068(GCP101衍生） % 主 (天然型A0X2啓動子）(突變型A0X2啓動子） PC4130 (Mut*) 0¾ 203ί GCP101 (Mut + ) 94¾ 100* 賁施例5 研究其他Mut—轉形釀内與A0X2啓動子之突變位置 可生産HSA之巴斯德畢赤酵母菌PC4105霍条為一種經由 實施前述方法使用HSA表現質臞pPGSI取代A0X1區而由S斯 德畢赤GTS115種条衍生而得之種条。pGPSI與例1之pPGPI 間之差異僅在於出現於PPGP1内之HSA 3,侧的P〇ly-A區於 (請先閲讀背而之注意事項洱巩寫本頁) 本紙張尺度逍用中ΒΒ家搮準(CNS)T4規格(2]0χ297公藿）22 S1. 2. 20,000 五、發明説明（21) Λ 6 Β 6 經濟部中央標準局ΚΧ工消费合作社印製 pPGSl中喪失。 對PC4105種条，使用7獨立瓶進行如例1之相同次培餐實 驗。結果，金部7瓶皆獲得於含甲酵之培餐基内顯示堪生 現象改良之種条（Mut+種条）。分別分離的單一菌落定名為 SHG4105-4, SHG4105-8, SHG4105-9, SHG4105-10, SHG4105-11, SHG4105-16及 SHG4105-18,(參見第 6圖）。 染色體 DHA藉 Cameron等人之方法[Nucleic Acids Res.， _£,1429(1977)]由7種粂及由PC4105抽取及純化。連同得自 例2二種条PC4130及GCP101之染色體DNA, DNA藉PCR方法進 行A0X2啓動子區DNA擴增（如此，首先合成引子。基於例3 所決定之氮鐮基序列（序列鑑識纗號：1),對應於位在A0X 2基因之ATG上游143氮鹼基至160氮鹼基，亦邸序列鑑識编 號：1之氮齡基编號1369至1386且有EcoRI址連接於上之相 對股序列用作3 ’側之引子（序列鑑織编號：5 )而對應於位 在該ATG上游786氮齡基至803氮鑛基，亦即序列鑑識编號 :1中氮鹼基編號726至733,且帶有Bam HI址連接其上之主 要股序列用作5'侧之引子（序列鑑識编號：6)。如上二序 列偽籍磷酸亞忭酸S方法使用應用生物粂統公司型號381A DNA合成儀合成 至於前述10染色臁DNA,其中各別用作棋販者，使用二 引子及如賨酒造（GeneABPT7M，套件之說明書敘述之過程進行 PCR。用於反應（PCR),使用 Perkin Elmer-Cetus型號 PJ2000 DNA熱循琛裝置，每一遇期包括DHA股於94t!熱變 性1分鏞，與引子於37P配對2分鐘及聚合瘛催化的鏈延長 (請先閲讀背而之注意事項洱填寫木頁) 本紙ft尺度遑用中a Β家«準(CNS)甲4規格(210x297公釐）23 S1. 2. 20,000 2〇43r^〇 經洧部中央描準局员工消费合作社印製 五、發明説明（22) 作用於72t：進行2分鐘，此等週期重複35遍。經瓊脂糖顧 霣泳後，使用SUPREC™-01 (賫酒造）回收及純化約650bP 大小之DNA。 至於SHG4105-16,擴增約250bp大小之DNA,如此回收及 純化DNA。另外，PUC19以EcoRI及B_gjLHI消化，回收2.7k b 段及進行驗性磷酸_處理。然後，該段與經擴增之DNA各 別接合，接合混合物用以轉形大腸桿菌勝任細胞条DH5 (Toyo bo)及由所得轉形髓中選出撝有預期質羅的轉形體種 条。藉ϋ性SDS法製備質體DNA。如此製得之10質體之DNA 使用Μ13二去氧定序列套件（寶酒造）決定距1址約2 00氮 驗基之序列。 至於SHG4105-16,測定經擴增的整體氮鐮基序列。 PC4130及PC4105擭得如前報告之序列鑑識编號·· 1之相同 氮_ 基序列 Uoutz et ai·, Yeast,立，167-177(1989)] 。至於GCP101,證實如例3所見者一般，於距ATG上游 255bp位址由T突變成C(序列鑑識编號：3)。至於SHG4105-4, SHG4105-9 , SHG4105-10, SHG4105-1 1¾ SHG4105-18 , 顯示如同GCP101之該種突變且帶有序列鑑識编號：3之啓 動子序列。於SHG4105-8中，位在ATG上游255bp之核甘酸T 保持不變，但介於距ATG上游約215bp與234bp間之位置之 G GAG A序列發現插入如序列鑑識编號：7所示之19氮齡基重 禊序列[獲得如同將序列结識编號：7插入介於氮鹼基编號 1314 (A)與氰籲基编號1315 (C)間之序列趣雜编號：1所得 的啓動子序列，如序列鑑識编號：4所示]。於SHG4105-16 (諳先間讀背而之注意苹項#碣窍本頁) .本紙Λ疋度遑用中β β家«毕(CNS) Ή規格(2丨0x297公龙>24 S1. 2. 20,000 2043^° 經濟部屮央榀準局EX工消费合作社印^ 五、發明説明（23) 中，仍保有距ATG上游255bP的T,但發現距ATG上游342bp 至780bp之439bp區W失[序列趣識编號：1中之氮鐮基编號 749cc)至氰錄基编號1187(T)](序列鑑識编號：2>。 實施例6 GCP101衍生得之Α0Χ2啓動子之活度 構築供於GCP101衍生得之Α0Χ2啓動子或PC4130衍生得之 Α0Χ2啓動子之控制下表現HSA用之媒介，俥證實其啓動子 活度。 如此，pPGPI以J}_^I消化及使用DNA鈍化套件（寶酒造）生 成鈍端。其上接上以EcoR I聯結子d(pG-G-A-A-T-T-C-C) (寶酒造）。以S p h I完全消化及以上12R I部分消化後，回收 及純化6.5kb段。P11C19以EcoR I及i_Ei! I消化，而消化産物 進行鹼性磷酸痗皤理。媒介混合物於前述6.5kb&接合， 獲得PIJC19衍生得之質蘧PPG001，此質醱允許於A0X1啓動 子之控制下表現HSA及攜有HIS4作S殖標記（參見第7圖）。 pPG00U2_|^£R I部分消化及使用DNA鈍化套件（寶酒造）形 成鈍端。另外，使用應用生物糸統型號381 A DNA合成儀藉 磷酸亞眯酸鹽方法合成帶有序列GGGATCCC之BamH I聯結子 。聯结子使用T4聚核苷酸激動_ (寶酒造）碟酸化及與前述 已生成鈍端之段接合。經以Μϋ Π及ijJlH I消化後，純化 7.1kb段。另外，以HindM消化pPGPl及使用DHA鈍化套件 (寶酒造）形成鈍端。於其上接合以IliH I睇结子d(pG-G-G-A_T_C_C-C)及，以立及I消化後，純化1.9 kb段。 該段與前述7.1kb段接合獲得質鼸，定名為PPG002。 (請先間讀背而之注意亊項孙碼寫本頁) 裝· 訂_ .本紙ft尺度遑用中B *家揲毕(CNS)肀4規格(2】0 x 297公 S1. 2. 20,000 25 2043^0 Λ 6 Η 6 經濟部中央櫺準局β工消#合作社印製 五、發明説明（24) ΡΜΜ030及ΡΜΜ034各以E a e I消化，回收1.5kb段及藉由以 緣豆核酸誨（寶酒造）處理形成鈍端。使用應用生物条统型 號3 8 1 A D N A合成ί義藉磷酸亞眯酸鹽方法合成帶有序列 CTTCGAAG之Asu I聯结子，使用T4聚核苷酸激動寶酒造 )磷酸化及與前述經生成鈍端之各段接合。經以EcoR I及 Asu K消化後，回收1.5kb A0X2啓動子區段。 另外，質體PPG002允許於/\(^1啓動子之控制下表現1^/\ 及帶有HIS4區，質體PPG002以EcoR I及I消化，經鹼性 磷酸_處理後，回收不含A0X1啓動子區之8.1kb段。該段 與1.5kb A0X2啓動子區段結合。如此，構築一質體PMM041 ,其可於PC4130衍生得（天然型）A0X2啓動子之控制下表現 HSA,及一質體PMM042,其可於GCP101衍生得（突變型） A0X2啓動子之控制下表現HSA(參見第8圖）。 PPG002, PMM041及PMM042各別以_ StuI消化轉成線性， 於HIS4區之單一割裂址割裂質髅，及引入GTS115内。由於 同種重組結果質臛整合入GTS115之his4區。巴斯德畢赤酵 母菌以例5之相同方式轉形。 由於所用之培養基為蒲要組胺酸者，經轉形後所生成之 菌落考廉皆為轉形體菌落。經由3G1玻璃過濾器過濾去除 瓊脂及將部分濾液接種於YPD培養基内。於30t：培育整夜 後，培養醪分布於各培養基（50nL)内，獾得初始A 540為 0.1。以24小時間隔由各培養醪中探樣，及藉RPHA方法（歐 洲專利案第122620號）檢定培養上清液内之人血清白蛋白 濃度。 (請先閱讀背而之注意事項洱蜞寫木頁) ⑽尺度通用中國因家料陳賴1〇魏、 81. 2. 20,000 五、發明説明C25) A 6 Π 6 發現雖然以PC4130衍生得之A0X2啓動子生成人血清白蛋 白之活度低，但GCP101衍生得之A0X2啓動子之誘使生成人 血清白蛋白之活度，可與A0X1啓動子相比擬。結果示於表 3〇 表 3 種条 於培養上清液内之HSA産量Ug/L) 培育時間（小時 培養基 24 4 8 (請先閲讀背而之注意节項洱蜞艿本頁)

經濟部中央櫺準局兵工消#合作社印M 12Θ 40 120 1 1 PPG002/GTS115 2% MeOH-YP 8 (AOX1 promoter)4% MeOH-YP 2 pMM041/GTS115 2% MeOH-YP - (PC4103-衍生 4% HeOH-YP _ 得之天然型 A OX 2啓動子） pMM〇42/GTS115 2% MeOH-YP (PCP101-衍生 4% MeQH—Yp 得之突變型 A0X2啓動子） -未測得 實施例7 使用突變型A0X2啓動子製備HSA生産者 PMM042如同例6以消化及引入GTS1 15種条内。雖整 合像經由與GTS115種糸之his4匾進行同源重組而進行。但 於某些例中，一種轉形程序可能導致二或二以上複本之整 30 60 裝· 訂- -線. 8 1 20 60 40 120 本紙51尺度遑用中a國家樣準(CNS) 規格(210x297公龙）27 S1. 2. 20,000 2〇43^〇 Λ 6 Β 6 經濟部屮央標準局貝工消t合作社印製 五、發明説明（2® 合。轉形後生成之各菌落經由3G1玻璃遇滅器過滅去除瓊 脂而收集•濾液以無菌水稀釋，穰得嫌度為100細胞/培餐 皿及稀釋液展布於Y N B w / 0 a . a .培餐皿（0 . 7 X酵母®鐮基 ，不含胺基酸，2¾¾萄糖及1.5¾理脂粉）上。於30υ進行 培育3日供生成單一菌落。 以如例2之相同方式由如此所得之10種株各別抽取染色 體D Ν Α。使用巴斯德畢赤酵母菌衍生得之染色謾HIS4區作 探針進行南方分析[southern，E· M.，J. Μο1· Βί〇ι.， 503(1975)]及測定己經整合之PMM04 2複本數目。如此 ,各5u s染色體DNA以卫[消化及進行瓊脂糖膠電泳。凝 膠以0.2N HCJI處理30分鐘，移至鹼性變性溶液（0.2N NaOH及0.6M HaCJl)内及，經反應30分鐘後，移至中和溶 液[0.2M Tris(pH7.4), 0.6M NaCiL]内。中和處理（30 分 鐘）共進行兩次。以習知方式對Hy bond-N.(Amer sham )進行吸 漬〇 巴斯徳畢赤酵母菌HIS4之段（0.6kb)加標幟用作探 針。探針之製備，雜交及洗滌僳使用DIG-ELISA之DHA標幟 及檢测套件（Boehringer Mannheim-Yananouchi)及遵循其 中所附之説明書而進行。使用GTS115,將出現2.7kb帶鎌 因於其帶有2.7kb HIS4區之故，如第9-(a)圔所示。PMM 042複本整合入GTS115之his4區將導致出現7.8kb帶及4.5 1^帶。2?»^042複本以相同方式整合，則除了7.81^及4.5 kb帶之外，又將出現一 9.6kb帶。整合了後本將生成7.8kb 及4.5kb帶以及具有雙重密度之9.6kb帶。整合4複本將生 (請先閲讀背而之注意苹項洱埸寫本頁) 裝. 線· 本紙ft足度遑用中β B家«準(CNS) Ή規格(210x297公*) S1. 2. 20,000 23 043^0 A 6 η 6 經濟部中央橾準局只工消费合作社印91 五、發明説明（27) 成具有相同分子量之各帶，但具有三重密度。 發現J>MM042整合人GTS115之his4匾。獲得ΡΜΜ042禊本數 由1變化至4之種条。其中，經由整合一複本所得之一種条 定名為UHG42-15,整合2複本所得之一種条定名為UHG42-3 而整合3複本所得之一種条定名為UHG42-12[第9-(b)至（d) 圖]〇 經分開成種株之後，對UHG42-15, UHG42-3及UHG42-12 評估HSA生産力。此等種株接種於YPD培養基内及於3010培 養整夜。各培養醪接種於50mL2XMeOH-YP培養基至初始〇〇540 為1為止。以24小時間隔取培養醪樣品及藉RPHA方法（歐洲 專利案第122620號）測定各培養上淸液内之人血淸白蛋白 濃度。 如表4所示，使用UHG42-15所得HSA最高産量為80mg/义 ;U H G 4 2 - 3 為 1 0 0 *g / 儿；而 U H G 4 2 - 1 2 為 1 6 0 明 / 义。如此， 經由選殖獾得离度生産力種条，生産力随複本數目之增加 而增高。換言之，使用質體ΡΜΝ042,因而造成使用GCP101 衍生得（突變型）Α0Χ2啓動子表現HSA,可擭得能高度生産 HSA之種条。 (請先閲讀背而之注意事項#堝艿木頁) 裝. 訂- " S1. 2. 20,000 五、發明説明（28) Λ 6 η 6 表 4 若干種株於培養上清液内之HSA生 産 水 平 (mg /JL ) 培養時間 (小時） 種 % 24 48 72 UHG42 - 1 5 (1 複 本 ) 15 80 80 UHG42 - 3 (2複本） 30 100 100 UHG42- 12 (3複 本 ) 40 160 160 依 本 發 明 所 得 之 突 變 型 A 0 X 2 啓 動 子 比 較 天 然 型 (野生型） 啓 動 子 具 有 顯 著 增 高 的 啓 動 子活 度 0 經 由 使 用 此 種 突 變 型 啓 動 子 > 今 曰 可 以 大 量 表 現 -種 蛋 白 質 0 因 此 » 本 發 明 之 主 旨 相 信 作 為 基 因 工 程 業 界 之新 穎 表 現 % 統 有 其 重 要 性 0 文 中 出 現 之 所 有 參 考 文 獻 皆全 體 併 入 以 供 參 考 〇 雖 然 己 經 詳 細 且 參 照 其 待 例說 明 本 發 明 » 但 業 界 技 m 精 湛 人 士 顯 然 易 知 於 其 中 可 作 成各 種 變 化 與 修 改 而 未 背 離 其 精 鷂 及 範 圍 〇 (請先間讀背而之注意事項#填寫本頁) 裝- 訂' 經濟部屮央標準局貝工消伢合作社印製 本紙張尺度遑用中國《家《準(CNS)T4規格(210X25)7公:¾) S1. 2. 20,000 30 Λ 6 Π 6 五、發明説明（29) 序列清單 赓列進識编號：1序列長度：1 528 28 序j類型：核酸 股t雙股 形態：線性 分子類型：其他核酸，質體〇ΝΑ 特點： 名稱/關键：啓動子 鑑識方法：Ε 序列說明： (請先閲讀背而之注意事項办堝窵本頁) 經濟部屮央標準局员工消伢合作社印敗 AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC ΤΑΑΑΑΑΤΑΤΑ ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAA.G CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 本紙張尺度遑用中a Β家«準（CNS)肀4規格（210X297公；¢) 81. 2. 20,000 31 〇 經濟部屮央榣準局β工消价合作社印5i 五、發明説明（3〇> CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AA.GCGATGAG GAGACGATTA 1320 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 1380 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 1440 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA CGAAGTTTAC GACTTACTAA 1500 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 1528 序列捶雜编號：2 序列長度：1 0 8 9 序列類型：核酸 股數：雙股 形態：绨性 分子類型：其他核酸，質蘐DNA 特玷：S: 名稱/關鍵：啓動子 鑑識方法：E 序列說明： AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGCACTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAA.TCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 (請先閲讀背而之注意事項洱塥寫本頁) 裝- 訂 線- 本紙51c尺度逍用中困國家標準(CNS) TM規格(2丨0X297公龙） 81. 2. 20,000 32 五、發明説明（31)

AGGTTACAAC CAGAGACTAA TGTCTCGGAG GGTTGAGATG CAAAATCCCT TTAACTACAT GACTACATTG CTGAGAAAA

CCCTCAATTT GCGAGTCATC TGAAAACCCC GGGAGAAAAT TATTGTCCTT TGTTCTTACA ATCTTTTTTA

TCCATCCAAG ATCACCACCC TTTTATGTGA TAAGCGATGA TTCTGATCAG CATTGCAAAC ACGAAGTTTA

GGCGATCCTT AAGATGAGCT ACAGATTACA GGAGACGATT CATCAAAGAA CTCTTCCTTC CGACTTACTA

ACAAAGTTAA ATTTTTGTCG GAAGCGTCCT ATTGGTATAA. TATTGTCTTA TATTTCGGAT AATCCCCACA

TATCGAACAG CATAAATTTT ACCCTTCACC AAGAAGCAAC AAACGGGCTT CAACTGTATT AACAAATCAA 720 780 840 900丨 960 1020 1080 1089 經濟部Ψ央榣準扃貞工消伢合作社印製

序列鑑谦编號：3 序列長度：1528 序列類型：核酸 股數：雙股 形態：绨性 分子類型：其他核酸.質鳢DNA 待點： 名稱/關薄：啓動子 捶雜方法：E 序列說明： AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC CCATTTCCTA AAATTTCAAG CAGTCCTCTC AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC

CATCTTCTAC ATCACTTTTA TTTACTAAAA ACAATCACCA ATTTTGATAA TCTCGTCAGC ACCAGACTAT CAGAATCAAT ATCCTTGAAG AACTAAATTT AAAAGTCCAA

GGGGGGATTA TCTATGCTTT CGTTATTTAT TACTTACTGG ATCATACATC GGCACTCTCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC TACGACATAT TGTCTTACCT TAAAAATATA ACACTTCGAG CACTAGTAGA ACTTTGACAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT TTTTCCATTC CTCTGCACCC TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 (請先閲讀背而之注意事項#堝寫本頁) 本紙張尺度边用中B国家猱準(CHS) T4規格(210X297公*)33 81. 2. 20,000

經濟部屮央標準局员工消枰合作社印51 五、發明説明（32) AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGCACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATGCCA CTGCGAGATC ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGGAT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCCTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAGCGATGAG GAGACGATTA 1320 TTGGTATAAA AGAAGCAACC AAAATCCCTT ATTGTCCTTT TCTGATCAGC ATCAAAGAAT 1380 ATTGTCTTAA AACGGGCTTT TAACTACATT GTTCTTACAC ATTGCAAACC TCTTCCTTCT 1440 ATTTCGGATC AACTGTATTG ACTACATTGA TCTTTTTTAA. CGAAGTTTAC GACTTACTAA 1500 ATCCCCACAA ACAAATCAAC TGAGAAAA 1528 序列鑑逋編號：4 序列長度：1 5 4 7 L547 序列類型：核酸 股數：雙股 形態：線性 分子類型：其他核酸，質HDNA 待點：_ 名稱/鼷鍵：啓動子 捶雜方法：E 序列說明： AATTCTTTTT TTCAGACCAT ATGACCGGTC CATCTTCTAC GGGGGGATTA TCTATGCTTT 60 GACCTCTATC TTGATTCTTT TATGATTCAA ATCACTTTTA CGTTATTTAT TACTTACTGG 120 TTATTTACTT AGCGCCTTTT CTGAAAAACA TTTACTAAAA ATCATACATC GGC\CTCTCA 180 AACACGACAG ATTGTGATCA AGAAGCAGAG ACAATCACCA CTAAGGTTGC ACATTTGAGC 240 (請先閲讀背而之注意事項洱项寫本頁) .本紙張尺度逍用中困Η家標準(CNS)甲4規格(210x297公；¢) 81. 2. 20,000 34

經濟部屮央標準局貝工消赀合作杜印製 五、發明説明（3¾ CAGTAGGCTC CTAATAGAGG TTCGATACTT ATTTTGATAA TACGACATAT TGTCTTACCT 300 CTGAATGTGT CAATACTCTC TCGTTCTTCG TCTCGTCAGC TAAAAATATA ACACTTCGAG 360 TAAGATACGC CCAATTGAAG GCTACGAGAT ACCAGACTAT CACTAGTAGA ACTTTGACAT 420 CTGCTAAAGC AGATCAAATA TCCATTTATC CAGAATCAAT TACCTTCCTT TAGCTTGTCG 480 AAGGCATGAA AAAGCTACAT GAAAATCCCC ATCCTTGAAG TTTTGTCAGC TTAAAGGACT 540 CCATTTCCTA AAATTTCAA.G CAGTCCTCTC AACTAAATTT TTTTCCATTC CTCTGCACCC 600 AGCCCTCTTC ATCAACCGTC CAGCCTTCTC AAAAGTCCAA TGTAAGTAGC CTGCAAATTC 660 AGGTTACAAC CCCTCAATTT TCCATCCAAG GGCGATCCTT ACAAAGTTAA TATCGAACAG 720 CAGAGACTAA GCGAGTCATC ATCACCACCC AACGATGGTG AAAAACTTTA AGCATAGATT 780 GATGGAGGGT GTATGGGACT TGGCGGCTGC ATTAGAGTTT GAAACTATGG GGTAATACAT 840 CACATCCGGA ACTGATCCCA CTCCGAGATG ATATGCAAAG CACGTGATGT ACCCCGTAAA 900 CTGCTCGC-AT TATCGTTGCA ATTCATCGTC TTAAACAGTA CAAGAAACTT TATTCATGGG 960 TCATTGGACT CTGATGAGGG GCACATTTCC CCAATGATTT TTTGGGAAAG AAAGCCGTAA 1020 GAGGACAGTT AAGCGAAAGA GACAAGACAA CGAACAGCAA AAGTGACAGC TGTCAGCTAC 1080 CTAGTGGACA GTTGGGAGTT TCCAATTGGT TGGTTTTGAA TTTTTACCCA TGTTGAGTTG 1140 TCCTTGCTTC TCCTTGCAAA CAATGCAAGT TGATAAGACA TCACCTTCCA AGATGAGCTA 1200 TTTTTGTCGC ATAAATTTTT GTCTCGGAGT GAAAACCCCT TTTATGTGAA CAGATTACAG 1260 AAGCGTCCTA CCCTTCACCG GTTGAGATGG GGAGAAAATT AAG C GAT GAG GAGAAAATTA 1320 AGCGATGAGG AGACGATTAT TGGTATAAAA GAAGCAACCA AAATCCCTTA TTGTCCTTTT 1380 CTGATCAGCA TCAAAGAATA TTGTCTTAAA ACGGGCTTTT AACTACATTG TTCTTACACA 1440 TTGCAAACCT CTTCCTTCTA TTTCGGATCA ACTGTATTGA CTACATTGAT CTTTTTTAAC 1500 GAAGTTTACG ACTTACTAAA TCCCCACAAA CAAATCAACT GAGAAAA 1547 序列鑑雄结 號：5 序列長度： 序列類型： 26 核酸 ' · 股數：箪股— 形態：線性 分子類型：其他核酸，合成DNA 待貼： .本紙》尺度遑《中a國家榣毕(CNS) T4規格(210X297公*) 35 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之法意亊項洱堝寫本頁) 裝. 線， 五、發明説明（掷 名稱/關鐽：引子结合 逄識方法：E 序列説明：

CCGAATTCGACAATATT.CTTTGATGC 號 编- 識一 适 列 序 度 長 列 序 成 合 0 -.核 酸 他 核 其 .. 股性： 型單.線型 頚·· ·.類·· 列敦態子點 序股形分待 鍵法 關方 稱識： 名鑑明 說 列 序 合 结 子

CCGGATCCACTAAGCGAGTCATCATC (請先閲讀背而之注意事項洱塥窍本頁) 裝- 經濟部屮央t %局貝工消奸合作杜印51

序列鑑識编號：7 序列長度：i9 序列類型··核酸 股數：雙股 形態：绨性 分子類型：其他核酸，額外DNA 特點·· 名稱/關鍵：插入序列 趣識方法：E 序列説明： AAATTAAGCGATGAGGAGA -線· 本紙張尺度逍用中8 B家楳準(CNS) T4規格（210x297公；it) 81. 2. 20,000 36

Claims (1)

1. A7 ο ηί 3 4 ο ii.修0 7 7 7 BCD 條 經濟部中央櫺準局R工消费合作社印製 六、申請專利範園 1. 一種經分離的突變型A0X2啓動子，其係藉由氮齡基序 列刪失，氮齡基取代或插入而由畢赤酵母_羼之酵母之天 然型AOX 2啓動子衍生而得者。 2. —種製備一包括申請專利範圍第1項之突變型AOX 2啓 動子之質體之方法，該方法包括：將一由A0X1基因之表現 無法生産AOX且在染色體上播有天然型AOX 2啓動子之微生 物種条在含甲醇培養基中培養以獲得在該培養基中充分增 殖之一突變型種条；從該突變型種条回收一突變型A0X2啓 動子而將該啓動子插入一質體。 3. —種製備一表現質臞之方法，該方法包括：申請專利 範圍第1項之突變型A0X2啓動子及一異種蛋白質之基因之 插入，俥該異種蛋白質基因能以可作業方式舆該突變型 A0X2啓動子聯结。 4. 如申請專利範園第3項之方法，其中該異種蛋白質為 人類血清白蛋白。 5. —種生産異種蛋白質之方法，該方法包括培養一包括 由申請專利範園第2〜4項中任一項之方法所製質鼸之轉形 寄主，其中該轉形寄主包括表現質體，此表現質嫌包括適 於該異種蛋白質之一基因，此基因以可作業方式與突變型 A0X2啓動子賺结。 6. 如申誚專利範函第1項之啓動子，含該啓動子酵母於 甲醇存在下之生長速率比野生型酵母於甲酵下之生長速率 快。 7. 如申請專利範園第1項之啓動子，帶有灌自序列鑑識 IJ-------.· ,1· LI-------^------裝------.ΤΓ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣紙張尺度適用中國國家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.10.000 A7 B7 C7 D7 ^043'VO 六、申請專利範園 编號：2,序列鑑識编號：3或序列鑑識编號：4中之任一 序列。 8. —種獲得撤生物種条之方法，該撖生物種糸於其染色 體上攜有可在單獨突變型A0X2啓動子控制下表現的A0X2基 因；該方法包括於含甲醇之培養基内培養一種撤生物種糸 ，此微生物種条於其染色龌上攜有處於天然型A0X2啓動子 之控制下的AOX 2基因；及分離該微生物種糸。 9. 一種生産異種蛋白質之方法，該方法包括培養由申請 專利範圔第8項之方法所得之微生物種条，其中該種条包 括一表現質體.此質醱包括適於該異種蛋白質之一基因， 此基因以可作業方式舆一啓動子聯結。 10. 如申請專利範圔第9項之方法.，其中之微生物種糸為 畢赤酵母菌靥之酵母。 • _J------— — I.------f------裝------tr (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) «濟部中央標準屬工消費合作杜印製 木紙張又度適用中國因家櫺準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 2 81.9,10,000