JPH0115278B2 - - Google Patents

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JPH0115278B2
JPH0115278B2 JP57035858A JP3585882A JPH0115278B2 JP H0115278 B2 JPH0115278 B2 JP H0115278B2 JP 57035858 A JP57035858 A JP 57035858A JP 3585882 A JP3585882 A JP 3585882A JP H0115278 B2 JPH0115278 B2 JP H0115278B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
strain
rosei
satucharomyces
fusion
cells
Prior art date
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Expired
Application number
JP57035858A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS58155083A (ja
Inventor
Yasuo Nakatomi
Hiroshi Saito
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oriental Yeast Co Ltd
Original Assignee
Oriental Yeast Co Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Oriental Yeast Co Ltd filed Critical Oriental Yeast Co Ltd
Priority to JP57035858A priority Critical patent/JPS58155083A/ja
Publication of JPS58155083A publication Critical patent/JPS58155083A/ja
Publication of JPH0115278B2 publication Critical patent/JPH0115278B2/ja
Granted legal-status Critical Current

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/04Fungi

Description

【発明の詳細な説明】
本発明はサツカロミセス・ロゼイ
(Saccharomycesrosei)の融合株に関するもので
ある。 更に詳細には、本発明は、冷凍耐性を有し、か
つ分離、洗滌、脱水等の工業的操作のきわめて容
易なサツカロミセス・ロゼイの融合株に関するも
のである。 一般に、サツカロミセス・ロゼイは耐糖性及び
冷凍耐性にすぐれた製パン用酵母として注目さ
れ、一部市販されるに至つている。 しかしながら、サツカロミセス・ロゼイの細胞
はかなり小型であるため、大量に培養した菌体を
分離、洗滌、脱水する工程にきわめて長時間かか
り、この点が大きな欠点となつていた。 本発明者は、サツカロミセス・ロゼイの耐糖性
及び冷凍耐性をそのままにして、小型細胞である
という欠点を克服するために研究を行い、プロト
プラスト融合によつて大型栄養細胞のサツカロミ
セス・ロゼイの安定な倍数体を造成するに至つた
のである。 即ち、本発明は、いずれもサツカロミセス・ロ
ゼイに属する菌株をプロトプラスト融合し造成し
てなる球形もしくは卵形の大型栄養細胞の倍数体
で冷凍耐性を有するサツカロミセス・ロゼイ酵母
融合株に関するものである。 本発明の酵母融合株は、その栄養細胞の主径6
〜9μで、従来のサツカロミセス・ロゼイの栄養
細胞の主径2〜7μに比較してかなり大型であり
そのために、菌体分離、洗滌、脱水等の処理に要
する時間が、従来のサツカロミセス・ロゼイの場
合に比べ、1/2〜1/4と著じるしく短縮され、パン
酵母として大量生産する場合はきわめてすぐれた
効果を発揮するものである。 一般に、従来サツカロミセス属の中でサツカロ
ミセス・セレビシエとその近縁種、さらにサツカ
ロミセス・ルキシイとその近縁種については交配
或いはプロトプラスト融合によつて倍数体を作る
ことが行われている。しかしサツカロミセス・ロ
ゼイについては同じサツカロミセス属ではある
が、栄養細胞が一般に小型細胞の半数体が優勢で
あり、接合能は認められないので交配による倍数
体の造成は不可能であつて、安定な倍数体の存在
が確認されていない。 本発明の酵母融合株は従来全く得られたことの
ないサツカロミセス・ロゼイの倍数体であつて、
プロトプラスト融合により造成された株を包含し
ている。本発明において確立された酵母融合株
は、例えば微工研にFERM P−6349として寄託
されるサツカロミセス・ロゼイFRR−1をあげ
ることができる。 次にサツカロミセス・ロゼイFRR−1
(FERMP−6349)の菌学的性質を示す。 1 YM寒天培地でクリーム色のコロニーを形成
する。栄養細胞は主径6〜9μの球形もしくは
卵形で出芽で増殖する。 2 胞子形成はMillerらの培地(J.Bact.85725−
731(1963))でよく形成する。1子嚢について
2〜3個稀に4個の胞子がみられる。従来のサ
ツカロミセス・ロゼイでは多くの場合偽接合管
を作つて1子嚢当り1〜3個の胞子を形成し、
直接細胞から子嚢に転換するものは稀である
が、本融合株では子嚢の多くは直接細胞から転
換したもので、形成頻度は高い。 3 バレイシヨ抽出液寒天培地で偽菌糸の形成な
し。 4 硝酸塩の資化性なし。 5 生理的性質 15〜33℃で生育、25〜30℃最適温度度、PH3
〜7でよく生育、4.5〜6が最適PH、ビタミン
要求性なし。 6 炭素源の発酵性及び資化性
【表】
【表】 エタノール − +
7 栄養増殖 倍数体で栄養増殖する細胞 以上の菌学的性質から、一般のサツカロミセ
ス・ロゼイとは異なり、本発明の酵母融合株は倍
数体の大型栄養細胞である点において特徴性であ
る。 本発明のプロトプラスト融合にはサツカロミセ
ス・ロゼイに属する菌株であればいかなる菌株で
も使用することができる。しかし、酵母融合株の
検出のために相補する栄養要求性の変異株を使用
するのが好ましい。例えば、リジン要求性株とメ
チオニン要求性株を用いるのが好ましい。 このような人工栄養要求変異株を得るには常法
の人工変異処理が用いられ、例えば親株サツカロ
ミセス・ロゼイ(AHU3975)にUV照射、エチ
ルメタンサルフオネート等の化学変異剤処理を施
し、生じた変異株を菌株識別用の色素培地(特願
昭53−124367号)を用いて比較的容易に分離でき
る。 上記変異株を得るための具体的手法の一例を示
す。 サツカロミセス・ロゼイ(AHU3975)を30
℃、48時間YMPG寒天培地で培養した菌体を1
白金耳量とり、0.2Mリン酸緩衝液(PH8.0)9.2
ml、4%ぶどう糖0.5ml、EMS(エチルメタンサ
ルフオネート)0.3mlを加えた溶液に、懸濁し、
30℃に保つ。30〜90分間放置後、その0.2mlをと
り、9.8mlの6%次亜硫酸ナトリウム液に加え、
EMSを中和する。この処理サンプルをM/15リ
ン酸緩衝液(PH4.5)で稀釈し、その0.1mlを色素
培地に加えて、ガラス棒で拡げ、30℃で3〜5日
間培養し、平板上に生じたコロニーの内、親株と
明らかに色調の異なるものについて最少培地で増
殖の有無をしらべる。最少培地で増殖しない株に
ついて栄養要求性を調べるとメチオニン要求、リ
ジン要求など様々な要求性の株が得られる。 プロトプラストの調整、融合、再生は一般にサ
ツカロミセス・セレビシエにおいて用いられてい
る方法で行なうことができる。たとえば、サツカ
ロミセス・ロゼイのリジン要求性株とメチオニン
要求性株をそれぞれYPG培地で16時間30℃で振
盪培養した菌株を用いる。約107個の細胞を
1.2MKCl、0.2%のメルカプトエタノール、3u/
mlのZymolyase5000を含むリン酸緩衝液に懸濁
し、約4時間、30℃で処理し、プロトプラスト化
した。プロトプラストを1.2MKCl液で洗滌後、
両方のプロトプラストをほゞ等量となるように混
合し、これに30%PEG6000(10〜50mMのCaCl2
を含む)を加え約30分間室温で融合させた後
1.2MKClで洗滌し、配合したプロトプラストを
含むプロトプラスト混合液を高張最少寒天培地
(0.6MKClを含む)上に広げ同一培地を重層し、
約1週間30℃で培養する。生じたコロニーは互い
の栄養要求性が補い合つた融合株である。これが
本発明の酵母融合株であることは細胞の大きさが
親に比べ大きいことと、さらに胞子を分離しその
違伝解析を行うことによつて証明できる。融合株
は継代培養しても単担体化(mitotic
segregation)は起らず安定である。 ここに得られる酵母融合株は菌体の大きさが親
株のサツカロミセス・ロゼイに比べ明らかに大き
く菌体の分離、洗滌、脱水の全工程の処理時間を
みると、親株のサツカロミセス・ロゼイのおよそ
1/3に短縮されるもので、酵母工業上益するとこ
ろきわめて大なるものがある。 次に本発明の実施例及び試験例を示す。 実施例 親株サツカロミセス・ロゼイ(AHU3975)を
30℃、48時間YMPG寒天培地で培養し、その菌
体を1白金耳量とり0.2Mリン酸緩衝液(PH8.0)
9.2ml、4%ぶどう糖0.5ml、EMS(エチルメタン
サルフオネート)0.3mlを加えた溶液に懸濁し、
30℃に保ちながら30〜90分間放置した後、その
0.2mlをとり、9.8mlの6%次亜硫酸ナトリウム液
に加え、EMSを中和した。この処理サンプルを
M/15リン酸緩衝液(PH4.5)で稀釈し、その0.1
mlを色素培地に加えて、ガラス棒で拡げ、30℃で
3〜5日間培養し、平板上に生じたコロニーのう
ち、親株と明らかに色調の異なるものについて最
少培地での増殖の有無をしらべた、最少培地で増
殖しない株について栄養要求性を調べたところ、
メチオニン要求、リジン要求など様々な要求性の
株が得られた。 次いでサツカロミセス・ロゼイのリジン要求性
株とメチオニン要求性株をそれぞれYPG培地で
16時間30℃で振盪培養した菌体を得た。約107
の細胞を1.2MKCl、0.2%のメルカプトエタノー
ル、3u/mlのZymolyase5000を含むリン酸緩衝
液に懸濁し、4時間、30℃で処理し、プロトプラ
スト化した。プロトプラストを1.2MKCl液で洗
滌後、両方のプロトプラストをほぼ等量となるよ
うに混合し、これに30%PEG6000(20mMの
CaCl2を含む)を加え約30分間室温で融合させた
後、1.2MKClで洗滌し、融合したプロトプラス
トを含むプロトプラスト混合液を高張最少寒天培
地(0.6MKClを含む)上に広げ同一の培地を重
層し、約1週間30℃で培養した。生じたコロニー
は互いの栄養要求性が補い合つた融合株であつ
た。融合株であることは細胞の大きさが親に比べ
大きいことと、さらに胞子を分離しその違伝解析
を行うことによつて証明できた。 例えば半数体のリジン要求性株と半数体のメチ
オニン要求性株を細胞融合して造成した融合株は
リジン要求性とメチオニン要求性がお互いに相補
され、要求性はなくなるが、違伝子型はリジン要
求性とメチオニン要求性に関して、ヘテロ
(MEH/met、LYS/lys)である。 胞子を形成するそれぞれの栄養要求性の形質が
分離すると同時に遺伝子組換がおきて次の様な胞
子発芽株が得られる。
【表】 であり、融合に用いた栄養要求性株の形質の分離
がみられ、融合株であることが明らかとなつた。
酵母融合株はいずれも安定な倍数体であり、栄養
細胞の主径6〜9μの球形で親株に比して大型で
あつた。更に、その他親株と本発明の酵母融合株
との相違について調べたところ以下の通り特性が
見られた。
【表】 そのうち発酵力の高くかつ耐冷凍性のある株に
サツカロミセス・ロゼイFRR−1と命名し、微
工研にFERMP−6349として寄託した。 試験例 1 サツカロミセス・ロゼイFRR−1、FERMP−
6349種量30gを次の組成の培地及び条件で30℃14
時間通気撹拌流加培養を行つた。 培地:糖密(全使用量) 93.4g 尿素 6.4g 第1リン酸ソーダ 1.7g 条件:PH 4.5〜5.0 通気量 3/min 撹拌数 900rpm 得られた醪約1.4を3000rpmで遠心分離しさ
らに2回水洗・遠心分離してのち、吸引過し、
引続き加圧過して、水分約70%の生菌体約140
gを得た。 この間、最初の遠心分離から最後の加圧過が
終了するまでの時間は、全く休むことなく作業し
て35分であつた。 一方、サツカロミセス・ロゼイY−135−5、
FERM P−905を試験例1と全く同様に培養し、
得られた醪約1.4を遠心分離、2回水洗、吸引
過、加圧過して水分約70%の生菌体約140g
を得た。この間、最初の遠心分離から最後の加圧
過が終了するまでの時間は、全く休むことなく
作業して70分であつた。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 いずれもサツカロミセス・ロゼイに属する菌
    株をプロトプラスト融合し造成してなる球形もし
    くは卵形の大型栄養細胞の倍数体で冷凍耐性を有
    するサツカロミセス・ロゼイ酵母融合株。
JP57035858A 1982-03-09 1982-03-09 酵母融合株 Granted JPS58155083A (ja)

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JP57035858A JPS58155083A (ja) 1982-03-09 1982-03-09 酵母融合株

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JPH0646940B2 (ja) * 1984-10-18 1994-06-22 三共株式会社 トルラスポラ属大型細胞酵母
BRPI0905928A2 (pt) * 2008-02-04 2015-08-04 Toray Industries "método de produção de ácido lático"

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