JPS61108377A - 安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法 - Google Patents
安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法Info
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- JPS61108377A JPS61108377A JP59230896A JP23089684A JPS61108377A JP S61108377 A JPS61108377 A JP S61108377A JP 59230896 A JP59230896 A JP 59230896A JP 23089684 A JP23089684 A JP 23089684A JP S61108377 A JPS61108377 A JP S61108377A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
- C12N15/04—Fungi
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造
法に関するものである。
法に関するものである。
近年、石油代替エネルギーとして、石油化学によらずに
得られる発酵アルコールが注目されている。これはさと
うきびやこれから採った糖蜜、さつまいも、じゃがいも
、とうもろこしなどのセルロース質またはでん粉質を原
料とし、これらを微生物の働きによって発酵させること
により製造される。
得られる発酵アルコールが注目されている。これはさと
うきびやこれから採った糖蜜、さつまいも、じゃがいも
、とうもろこしなどのセルロース質またはでん粉質を原
料とし、これらを微生物の働きによって発酵させること
により製造される。
一般にアルコール発酵では、アルコールの生産性は発酵
槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵槽内の菌体濃度
を高める手段として、優れた凝集−性を有する酵母を用
いることが考えられる。すなわち、酵母が優れた凝集性
を有していると、酵母の沈降速度が速くなり、そのため
固液分離が迅速かつ容易になし得る。そして例えば回分
発酵においては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈
降堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容易に
行なって菌体を再使用に供することができる。また連続
発酵においては、小径の流動部とこれの上に連設された
菌体沈降用の大径の沈降部とこれに内装された菌体沈降
部材とを主体とした基型発酵槽を用いることにより、培
地の供給量が増大しても菌体を沈降させてその流出を防
止することができる。このように凝集性を有する酵母を
用いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合に比べて
多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母が要望せら
れている。
槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵槽内の菌体濃度
を高める手段として、優れた凝集−性を有する酵母を用
いることが考えられる。すなわち、酵母が優れた凝集性
を有していると、酵母の沈降速度が速くなり、そのため
固液分離が迅速かつ容易になし得る。そして例えば回分
発酵においては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈
降堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容易に
行なって菌体を再使用に供することができる。また連続
発酵においては、小径の流動部とこれの上に連設された
菌体沈降用の大径の沈降部とこれに内装された菌体沈降
部材とを主体とした基型発酵槽を用いることにより、培
地の供給量が増大しても菌体を沈降させてその流出を防
止することができる。このように凝集性を有する酵母を
用いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合に比べて
多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母が要望せら
れている。
従来技術およびその問題点
一従来から、上記の要望にこたえるべく、凝集性酵母を
取得する試みがいくつがなされており、たとえば自然界
から野生の凝集性酵母を分離し、そのエタノール発酵能
の向上のために、この野生株をエタノール発酵能に優れ
た酵母とプロトプラスト融合させて、凝集性とエタノー
ル発酵能を兼ね備えた酵母を得る試みがなされている（
ａｒｏｔｅｃｈｎｏ＋ｏｇｙ Ｉｅｔｔｅｒｓ、第５巻
、第５号、第３５１〜３５６頁、１９８３年参照）。し
かしこの方法では得られた融合株は植え継ぎの繰り返し
の間に凝集性を低下ないし消失することがよくあり、凝
集性の不安定さが大きな問題となっていた。この原因は
、野生株や高エタノール発酵能を有する酵母には高次倍
数体のものが多く、これらの株間で得られた融合株はざ
らに倍数性を増し、そのため植え継ぎの繰り返しによっ
て凝集性が低下ないし消失するものと考えられる。
取得する試みがいくつがなされており、たとえば自然界
から野生の凝集性酵母を分離し、そのエタノール発酵能
の向上のために、この野生株をエタノール発酵能に優れ
た酵母とプロトプラスト融合させて、凝集性とエタノー
ル発酵能を兼ね備えた酵母を得る試みがなされている（
ａｒｏｔｅｃｈｎｏ＋ｏｇｙ Ｉｅｔｔｅｒｓ、第５巻
、第５号、第３５１〜３５６頁、１９８３年参照）。し
かしこの方法では得られた融合株は植え継ぎの繰り返し
の間に凝集性を低下ないし消失することがよくあり、凝
集性の不安定さが大きな問題となっていた。この原因は
、野生株や高エタノール発酵能を有する酵母には高次倍
数体のものが多く、これらの株間で得られた融合株はざ
らに倍数性を増し、そのため植え継ぎの繰り返しによっ
て凝集性が低下ないし消失するものと考えられる。
この発明は、上記のような実情に鑑みてなされたもので
あって、植え継ぎの繰り返しによっても凝集性が低下す
ることのない安定かつ優れた凝集性を有する酵母を得る
方法、ないし、ある程度の凝集性を有する酵母から安定
かつ優れた凝集性を有する酵母を得る方法を提供するこ
とを目的とする。
あって、植え継ぎの繰り返しによっても凝集性が低下す
ることのない安定かつ優れた凝集性を有する酵母を得る
方法、ないし、ある程度の凝集性を有する酵母から安定
かつ優れた凝集性を有する酵母を得る方法を提供するこ
とを目的とする。
この発明による安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製
造法の第１の発明は、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ）風に属するプロトプラスト融合酵母
を胞子形成処理することを特徴とするものであり、第２
の発明は、す、ツカロマイセス（ｓａｃｃｈａｒｏｎｔ
ｙｃｅｓ ＞ ｒａに属する凝集性を有しない酵母を胞
子形成処理し、得られた胞子を変異処理し、変異胞子か
ら得られた優れた凝集性を有する変異酵母と、サツカロ
マイセス＜ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＞属に属す
る他の凝集性を有しないＩＩ母とをプロトプラスト融合
させ、得られた融合酵母を胞子形成処理することを特徴
とするものである。
造法の第１の発明は、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ）風に属するプロトプラスト融合酵母
を胞子形成処理することを特徴とするものであり、第２
の発明は、す、ツカロマイセス（ｓａｃｃｈａｒｏｎｔ
ｙｃｅｓ ＞ ｒａに属する凝集性を有しない酵母を胞
子形成処理し、得られた胞子を変異処理し、変異胞子か
ら得られた優れた凝集性を有する変異酵母と、サツカロ
マイセス＜ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＞属に属す
る他の凝集性を有しないＩＩ母とをプロトプラスト融合
させ、得られた融合酵母を胞子形成処理することを特徴
とするものである。
この明細書において、酵母の凝集性の程度（Ｄｅａｒｅ
ｅ ｏｆ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）は、以下に示す
ギリランド・テスト（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｔｅｓｔ
）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｙａｎｄ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏ１ｏＯＶ第７巻、第２２７−２３４頁、
１９７９年）により求められたＤＦ値で表示される。す
なわち供試菌株をＹＰＧ培地（注１）で３０℃で１６時
間振盪培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量お
よび硬さを肉眼観察により対照菌株と比較し、表１に示
すＤＰＩＦＯから５の６段階で凝集の程度を表示する。
ｅ ｏｆ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）は、以下に示す
ギリランド・テスト（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｔｅｓｔ
）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｙａｎｄ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏ１ｏＯＶ第７巻、第２２７−２３４頁、
１９７９年）により求められたＤＦ値で表示される。す
なわち供試菌株をＹＰＧ培地（注１）で３０℃で１６時
間振盪培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量お
よび硬さを肉眼観察により対照菌株と比較し、表１に示
すＤＰＩＦＯから５の６段階で凝集の程度を表示する。
（以下余白）
表 １
この発明による酵母製造法において、凝集性を有しない
酵母としては、アルコール発酵能に優れかつ胞子形成能
を有する酵母であれば、限定なく適用できる。
酵母としては、アルコール発酵能に優れかつ胞子形成能
を有する酵母であれば、限定なく適用できる。
この発明において、胞子形成処理は常法に従りてなされ
る。通常は凝集性を有しない酵母をＹＰＧ寒天培地（注
２）で培養した後、胞子形成寒天培地（注３）に塗抹す
る方法がとられる。
る。通常は凝集性を有しない酵母をＹＰＧ寒天培地（注
２）で培養した後、胞子形成寒天培地（注３）に塗抹す
る方法がとられる。
また単独胞子由来の細胞を得るには、酵母細胞壁溶解用
の溶菌酵素を用いて子のうを溶解した後、マイクロマニ
プユレータを用いて胞子を分離する方法、または同じく
溶菌酵素で子のうを溶解した後、超音波処理により胞子
を分散させ、胞子を栄養寒天培地で培養する方法がとら
れる。
の溶菌酵素を用いて子のうを溶解した後、マイクロマニ
プユレータを用いて胞子を分離する方法、または同じく
溶菌酵素で子のうを溶解した後、超音波処理により胞子
を分散させ、胞子を栄養寒天培地で培養する方法がとら
れる。
また変異処理は、胞子形成処理により得られた胞子また
は子のうに公知の突然変異処理、たとえば紫外線、Ｘ線
、γ線を照射する物理的方法、エチルメタンスルホネー
ト、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジ
ン、４−二トロキノリンーＮ−オキサイドなどの変異誘
起剤を接触した後に選択培地に生育する化学的方法のい
ずれによっても行なわれるが、エチルメタンスルホネー
トを用いる方法が特に好ましい。
は子のうに公知の突然変異処理、たとえば紫外線、Ｘ線
、γ線を照射する物理的方法、エチルメタンスルホネー
ト、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジ
ン、４−二トロキノリンーＮ−オキサイドなどの変異誘
起剤を接触した後に選択培地に生育する化学的方法のい
ずれによっても行なわれるが、エチルメタンスルホネー
トを用いる方法が特に好ましい。
プロトプラスト融合もまた常法によって行なわれる。通
常は細胞数１０７〜１０’個／ｍｌの濃度の各菌体懸濁
液、を調製し、これら懸濁液を好ましくは等量混合した
後、酵母細胞壁溶解酵素を含むプロトプラスト調製液で
混合物を処理するか、または各菌体懸濁液を同調製液で
処理した後これらを混合する。
常は細胞数１０７〜１０’個／ｍｌの濃度の各菌体懸濁
液、を調製し、これら懸濁液を好ましくは等量混合した
後、酵母細胞壁溶解酵素を含むプロトプラスト調製液で
混合物を処理するか、または各菌体懸濁液を同調製液で
処理した後これらを混合する。
この発明の製造法で用いる培地としては、炭素源、窒素
源、無機イオン、さらに必要ならば有機微量栄養素を含
有する通常の培地が使用できる。炭素源としてはグルコ
ース、ガラクトース、フラクトース、シュークロース、
スターチ加水分解物、果汁、セルロース分解物などの炭
水化物がよく用いられる。特に好適な培地は、酵母エキ
ス１Ｑ１ポリペプトン２０．グルコース２ｇ、蒸留水１
００ＩＩｌよりなる培地であり、。
源、無機イオン、さらに必要ならば有機微量栄養素を含
有する通常の培地が使用できる。炭素源としてはグルコ
ース、ガラクトース、フラクトース、シュークロース、
スターチ加水分解物、果汁、セルロース分解物などの炭
水化物がよく用いられる。特に好適な培地は、酵母エキ
ス１Ｑ１ポリペプトン２０．グルコース２ｇ、蒸留水１
００ＩＩｌよりなる培地であり、。
この培地のｐＨは無調整で５．５である。
培養は温度２５〜４０℃好ましくは３０〜３７℃で、ｐ
Ｈ３，０〜７゜０好ましくはｐＨ３，５〜６．０で行な
われる。
Ｈ３，０〜７゜０好ましくはｐＨ３，５〜６．０で行な
われる。
この発明の好ましい実施態様においては、財団法人発酵
研究所の保存菌であるＤＦ値０の酵母サッカロマイセス
・セルビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｏ＋ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） Ｉ Ｆ Ｏ−０２２４（以下、単にＩＦＯ−０２
２４と記ｔ）をＪａ子影形成処理、得られた胞子を変異
処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サツカロ
マイセス◆セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＲＭ −１７（微工研菌寄第
７７７０号） （以下、単にＲＭ−１７と記す）と、Ｄ
ＦｉｉＯの酵母サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｖ
Ｍ −２（微工研菌寄第７７８８号）（以下、単にＶＭ
−２と記す）とをプロトプラスト融合させ、融合酵母か
ら得られたＤＦ値５の酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ） Ｆ ＲＭ１７ＶＭ２−２ （
機工研菌寄第７８８９号）を胞子形成処理し、得られた
胞子を培養することにより、安定かつ優れた凝集性（Ｄ
Ｆ値＝５）を有する酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ） （Ｆ ＲＶＭ１７ Ｍ２ −２）８１ （機工研菌奇第７７９４号）を得る。
研究所の保存菌であるＤＦ値０の酵母サッカロマイセス
・セルビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｏ＋ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ） Ｉ Ｆ Ｏ−０２２４（以下、単にＩＦＯ−０２
２４と記ｔ）をＪａ子影形成処理、得られた胞子を変異
処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サツカロ
マイセス◆セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＲＭ −１７（微工研菌寄第
７７７０号） （以下、単にＲＭ−１７と記す）と、Ｄ
ＦｉｉＯの酵母サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｖ
Ｍ −２（微工研菌寄第７７８８号）（以下、単にＶＭ
−２と記す）とをプロトプラスト融合させ、融合酵母か
ら得られたＤＦ値５の酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ） Ｆ ＲＭ１７ＶＭ２−２ （
機工研菌寄第７８８９号）を胞子形成処理し、得られた
胞子を培養することにより、安定かつ優れた凝集性（Ｄ
Ｆ値＝５）を有する酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ） （Ｆ ＲＶＭ１７ Ｍ２ −２）８１ （機工研菌奇第７７９４号）を得る。
こうして得られたＤＦ値５の凝集性酵母（ＦＲＭ１７■
Ｍ２−２）Ｓｌは、植え継ぎの繰り返しによってもＤＦ
値を全く低下しないものである。
Ｍ２−２）Ｓｌは、植え継ぎの繰り返しによってもＤＦ
値を全く低下しないものである。
またこの発明のもう一つの好ましい実施態様においては
、上記実施態様と同じ操作によってプロトプラスト融合
を行ない、得られたある程度の凝集性を有する融合酵母
サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ ）
Ｆ ＲＶ −３（機工Ｍ１７ Ｍ２ 研菌寄第７７８９号、ＤＦ値−３）およびサツカロマイ
セス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ） Ｆ ＲＶＭ１
７ Ｍ ２−４（機工研菌寄第７７９５号、ＤＦ値＝４）をそれ
ぞれ胞子形成処理し、得られた胞子を培養することによ
り、安定かつ優れた凝集性を有する酵母サッカＣＩ’？
イセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）（ＦＲＶ
−３）Ｓｌ （機工研菌寄第７Ｍ１７ Ｍ２ ８００号、ＤＦ値＝５）および酵母サツカロマイセス（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ） （Ｆ ＲＭ１７ＶＭ
２−４）Ｓｌ （機工研菌寄第７７９９号、ＤＦ値＝５
）をそれぞれ得る。
、上記実施態様と同じ操作によってプロトプラスト融合
を行ない、得られたある程度の凝集性を有する融合酵母
サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ ）
Ｆ ＲＶ −３（機工Ｍ１７ Ｍ２ 研菌寄第７７８９号、ＤＦ値−３）およびサツカロマイ
セス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ） Ｆ ＲＶＭ１
７ Ｍ ２−４（機工研菌寄第７７９５号、ＤＦ値＝４）をそれ
ぞれ胞子形成処理し、得られた胞子を培養することによ
り、安定かつ優れた凝集性を有する酵母サッカＣＩ’？
イセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ）（ＦＲＶ
−３）Ｓｌ （機工研菌寄第７Ｍ１７ Ｍ２ ８００号、ＤＦ値＝５）および酵母サツカロマイセス（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ） （Ｆ ＲＭ１７ＶＭ
２−４）Ｓｌ （機工研菌寄第７７９９号、ＤＦ値＝５
）をそれぞれ得る。
この実施態様ではプロトプラスト融合酵母の胞子形成処
理の結果、処理後の酵母の凝集性は処理前の酵母のそれ
に比べて大幅に向上させられている。
理の結果、処理後の酵母の凝集性は処理前の酵母のそれ
に比べて大幅に向上させられている。
上記２つの実Ｍ態様において、出発酵母ＩＦＯ−０２２
４は下記表２に示すごとき諸性質（発酵性および資化性
の有無、生理的性質）を有する。
４は下記表２に示すごとき諸性質（発酵性および資化性
の有無、生理的性質）を有する。
（以下余白）
表 ２
表２中、ラフィノースの発酵性は、結合部が切断されて
生じる構成単糖フラクトース、グルコースおよびガラク
トースのうちいくつの糖を発酵できるかにより表示され
る。すなわち、発酵性１／３とはフラクトースのみを発
酵する場合を、発酵性２／３とはフラクトースおよびグ
ルコースを発酵する場合を、および発酵性３／３とはす
べての構成単糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。
生じる構成単糖フラクトース、グルコースおよびガラク
トースのうちいくつの糖を発酵できるかにより表示され
る。すなわち、発酵性１／３とはフラクトースのみを発
酵する場合を、発酵性２／３とはフラクトースおよびグ
ルコースを発酵する場合を、および発酵性３／３とはす
べての構成単糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。
また上記実施態様でそれぞれ得られた安定かつ優れた凝
集性を有する胞子形成処理酵母は、下記の菌学的性質を
有する。すなわちこれら酵母はいずれも、 ・ＤＦ値５なる凝集性を有し、液体培養では著しい沈降
性を示す。
集性を有する胞子形成処理酵母は、下記の菌学的性質を
有する。すなわちこれら酵母はいずれも、 ・ＤＦ値５なる凝集性を有し、液体培養では著しい沈降
性を示す。
・廃糖蜜（たとえば１５％の全糖分を含む廃糖蜜）を発
酵し、７〜９ｖ０１％のエタノールを生成する。
酵し、７〜９ｖ０１％のエタノールを生成する。
・寒天平板上で多少硬い集落を形成する。
・胞子形成能を有する。
またＲＭ−１７は生育にアデニンおよびヒスチジンを要
求し、ＶＭ−２はイソロイシンおよびバリンを要求する
。
求し、ＶＭ−２はイソロイシンおよびバリンを要求する
。
なお、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有するこ
とが知られている（ Ｊ、 Ｌｏｄｄｅｒ著ｒ Ｔｈｅ
Ｙｅａｓｔｓ’、 Ａ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ５ｔｕｄ
ｙ Ｊ第２版１．ＮＯｆ’ｔｔｌ−Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社発行、１９７０年）。
）属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有するこ
とが知られている（ Ｊ、 Ｌｏｄｄｅｒ著ｒ Ｔｈｅ
Ｙｅａｓｔｓ’、 Ａ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ５ｔｕｄ
ｙ Ｊ第２版１．ＮＯｆ’ｔｔｌ−Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社発行、１９７０年）。
すなわち、この属に属する酵母は、
・多極出芽によって増殖する。
・子のう胞子を形成する。
・硝酸塩を資化しない。
・真菌糸を欠くかまたはわずかじか形成しない。
・成熟子のうは容易に開裂しない。
・胞子の形状は球形ないし卵形である。
・グルコースをよく発酵する。
・麦芽汁培地に皮膜を形成しない。
発明の効果
この発明は以上のとおり構成されているので、植え継ぎ
の繰り返しによっても凝集性が低下することのない安定
した酵母を得ることができ、またＯＦ値が５には達しな
いが凝集性を有する酵母から優れた凝集性（ＯＦ値＝５
）を有する酵母を得ることができる。したがってこうし
て得られた凝集性酵母を用いてアルコール発酵を行なう
ことにより、冒頭で説明したように回分発酵においても
連続発酵においてもアルコール発酵槽内の菌体濃度を高
く維持して、エタノールの生産性を大幅に向上すること
かで きる。
の繰り返しによっても凝集性が低下することのない安定
した酵母を得ることができ、またＯＦ値が５には達しな
いが凝集性を有する酵母から優れた凝集性（ＯＦ値＝５
）を有する酵母を得ることができる。したがってこうし
て得られた凝集性酵母を用いてアルコール発酵を行なう
ことにより、冒頭で説明したように回分発酵においても
連続発酵においてもアルコール発酵槽内の菌体濃度を高
く維持して、エタノールの生産性を大幅に向上すること
かで きる。
実 施 例
つぎにこの発明の実施例を示し、上記効果を実証する。
実施例１
（ａ） ＲＭ−１７の調製
凝集性を有しない酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
Ｉ Ｆ ０−０２２４をＹＰＧ寒天培地（注２ ）
テ３０’Ｃで２４時間培養し、ついで胞子形成寒天培
地（注３）に塗抹し、３０℃で３〜５日間培養を行なっ
た。こうして胞子を形成させた。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
Ｉ Ｆ ０−０２２４をＹＰＧ寒天培地（注２ ）
テ３０’Ｃで２４時間培養し、ついで胞子形成寒天培
地（注３）に塗抹し、３０℃で３〜５日間培養を行なっ
た。こうして胞子を形成させた。
ついで胞子数が１０７個／層になるように、子のうを無
菌水１Ｎに懸濁させ、東国後リン酸緩衝液（注４）で洗
浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶液（注５）２ＩＩＩ
ｌ中で３０’Ｃで１時間振盪して、子のうを溶解させた
。ついで集菌後、遊離した胞子を無菌水１１１１１で洗
浄してリン酸緩衝液３ＩＩｔｌに懸濁させた。
菌水１Ｎに懸濁させ、東国後リン酸緩衝液（注４）で洗
浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶液（注５）２ＩＩＩ
ｌ中で３０’Ｃで１時間振盪して、子のうを溶解させた
。ついで集菌後、遊離した胞子を無菌水１１１１１で洗
浄してリン酸緩衝液３ＩＩｔｌに懸濁させた。
この懸濁液に変異誘起剤としてエチルメタンスルホネー
トを０． ＩＮ添加し、懸濁液を３０℃で２時間振盪し
た。こうして胞子を変異処理した。ついで集菌後、変異
胞子をリン酸緩衝液０．２暦に懸濁させ、懸濁液に５％
チオ硫酸ナトリウム水溶液３２／を添加して、懸濁液を
３０℃で１０分間振盪した。こうして変異誘起剤を中和
した。
トを０． ＩＮ添加し、懸濁液を３０℃で２時間振盪し
た。こうして胞子を変異処理した。ついで集菌後、変異
胞子をリン酸緩衝液０．２暦に懸濁させ、懸濁液に５％
チオ硫酸ナトリウム水溶液３２／を添加して、懸濁液を
３０℃で１０分間振盪した。こうして変異誘起剤を中和
した。
集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１１Ｉｌで２回洗浄し
て同緩衝液５層に懸濁させ、懸濁液を水冷下に３分間超
音波処理することにより変異胞子を懸濁液中に分散させ
た。ついで集菌後１、懸濁液を無菌水で濃度１／１０’
〜１／１０８に希釈し、希釈懸濁液０゜１７ｍをＹＰＧ
寒天培地（注２）に塗抹して３０℃で４８時間培養し、
単独胞子由来の集落を得た。
て同緩衝液５層に懸濁させ、懸濁液を水冷下に３分間超
音波処理することにより変異胞子を懸濁液中に分散させ
た。ついで集菌後１、懸濁液を無菌水で濃度１／１０’
〜１／１０８に希釈し、希釈懸濁液０゜１７ｍをＹＰＧ
寒天培地（注２）に塗抹して３０℃で４８時間培養し、
単独胞子由来の集落を得た。
こうして得られた集落のプレートをマスタープレートと
してレプリカ法により変異株の検出を行なった。すなわ
ち、殺菌したベルベット布地を用いて、前記マスタープ
レートの集落を最小培地（注６）にレプリカし、同培地
で３０”Ｃで４日間培養し、最小培地で増殖できない菌
株を栄養要求性変異株としてマスタープレートから釣菌
した。
してレプリカ法により変異株の検出を行なった。すなわ
ち、殺菌したベルベット布地を用いて、前記マスタープ
レートの集落を最小培地（注６）にレプリカし、同培地
で３０”Ｃで４日間培養し、最小培地で増殖できない菌
株を栄養要求性変異株としてマスタープレートから釣菌
した。
その結果マスタープレートの菌株２５株のうち凝集性に
優れたサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＲＭ −１７
（微工研菌寄第７７７０号）を得た。この株はアデニン
およびヒスチジン要求性の菌株であった。
優れたサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＲＭ −１７
（微工研菌寄第７７７０号）を得た。この株はアデニン
およびヒスチジン要求性の菌株であった。
（ｂ） ＶＭ−２の調製
工業技術院微生物工業技術研究所応用技術部生物化学工
学研究室から分譲を受けた凝集性を有しない酵母サッカ
ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｅ Ｙ −１（機工研菌寄
第７７９３号）をＲＭ−１７の調製と同じ操作で変異処
理し、レプリカ法によりイソロイシンおよびバリン要求
性の栄養要求性変異株として酵母サッカロマイセス・セ
ルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ） ＶＭ −２（微工研菌寄第７７８８号）を
得た。
学研究室から分譲を受けた凝集性を有しない酵母サッカ
ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｅ Ｙ −１（機工研菌寄
第７７９３号）をＲＭ−１７の調製と同じ操作で変異処
理し、レプリカ法によりイソロイシンおよびバリン要求
性の栄養要求性変異株として酵母サッカロマイセス・セ
ルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ） ＶＭ −２（微工研菌寄第７７８８号）を
得た。
（ｃ） ＲＭ−１７とＶＭ−２のプロトプラスト融合
ＲＭ−１７をＹＰＤ培地１０．ｍｒ３０℃で１６時間振
盪培養し、集菌後混合物１ｗで洗浄した。ついでこれを
プロトプラスト調製液（注７）約２ｗに懸濁させ、懸濁
液を３０℃で１時間振盪し、東国後等張液（注８）１ｗ
で２回洗浄を行なった。
盪培養し、集菌後混合物１ｗで洗浄した。ついでこれを
プロトプラスト調製液（注７）約２ｗに懸濁させ、懸濁
液を３０℃で１時間振盪し、東国後等張液（注８）１ｗ
で２回洗浄を行なった。
、 ＶＭ−２についても上記と同じ操作で処理を行な
った。
った。
ついでこうして得られたＲＭ−１７の処理菌体とＶＭ−
２の処理菌体とを同量（ｉｌｌ胞数１０８個／ｗずつ）
とって混合し、集菌後混合物を等張渡０． Ｉｍに懸濁
させ、懸濁液にポリエチレングリコール水溶液（注９）
２ｗを添加した。この懸濁液を３０℃で１５分間静置し
てプロトプラスト融合を完結した。ついで集菌後、菌体
を等張渡１ｍに懸濁し、懸濁液を２０℃で１５分間静置
した。ついで懸濁液を等張渡で濃度１／１０〜１／１０
２に希釈し、希釈懸濁液を珊小培地（注６）に塗抹し、
重層用培地（注１０）を重層した。この状態で３０℃で
４日間培養を行ない、優れた凝集性を有する融合株を２
２株分離し、そのうちの１株を酵母サツカロマイセス（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ） Ｆ ＲＶ −２
＜微Ｍ１７ Ｍ２ 工研菌奇第７８８９号）とした。
２の処理菌体とを同量（ｉｌｌ胞数１０８個／ｗずつ）
とって混合し、集菌後混合物を等張渡０． Ｉｍに懸濁
させ、懸濁液にポリエチレングリコール水溶液（注９）
２ｗを添加した。この懸濁液を３０℃で１５分間静置し
てプロトプラスト融合を完結した。ついで集菌後、菌体
を等張渡１ｍに懸濁し、懸濁液を２０℃で１５分間静置
した。ついで懸濁液を等張渡で濃度１／１０〜１／１０
２に希釈し、希釈懸濁液を珊小培地（注６）に塗抹し、
重層用培地（注１０）を重層した。この状態で３０℃で
４日間培養を行ない、優れた凝集性を有する融合株を２
２株分離し、そのうちの１株を酵母サツカロマイセス（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ） Ｆ ＲＶ −２
＜微Ｍ１７ Ｍ２ 工研菌奇第７８８９号）とした。
なお、プロトプラスト融合に用いた両親株（ＲＭ−１７
とＶＭ−２）は上記最小培地に生育できなかった。
とＶＭ−２）は上記最小培地に生育できなかった。
（ｄ） （ＦＲＶ −２）Ｓｌの調製Ｍ１７
Ｍ２ プロトプラスト融合酵母である上記ＦＲＭ１□Ｖ
−２を植え継ぎにより凝集性が低下する前にＹＰＧ寒天
培地（注２）で３０℃で２４時間培養し、ついで胞子形
成寒天培地（注３）に塗抹し、３０℃で３〜５日間培養
を行なった。
Ｍ２ プロトプラスト融合酵母である上記ＦＲＭ１□Ｖ
−２を植え継ぎにより凝集性が低下する前にＹＰＧ寒天
培地（注２）で３０℃で２４時間培養し、ついで胞子形
成寒天培地（注３）に塗抹し、３０℃で３〜５日間培養
を行なった。
こうして胞子を形成させた。
ついで胞子数が１０７個／ＩＩＩになるように、子のう
を無菌水１ｗに懸濁させ、集菌後リン酸緩衝液（注４）
で洗浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶液（注５）２ｗ
ｌ中で３０℃で１時間振盪して、子のうを溶解させた。
を無菌水１ｗに懸濁させ、集菌後リン酸緩衝液（注４）
で洗浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶液（注５）２ｗ
ｌ中で３０℃で１時間振盪して、子のうを溶解させた。
ついで集菌後、遊離した胞子を無菌水１ｗで洗浄してリ
ン酸緩衝液５ｗに懸濁させ、懸濁液を水冷下に３分間超
音波処理することにより胞子を懸濁液中に分散させた。
ン酸緩衝液５ｗに懸濁させ、懸濁液を水冷下に３分間超
音波処理することにより胞子を懸濁液中に分散させた。
ついで集菌後、懸濁液を無菌水で濃度１／１０５〜１／
１．０”に希釈し、希釈懸濁液０．１ｗをＹＰＧ寒天培
地（注２）に塗抹して３０℃で４８時間培養し、単独胞
子由来の集落を得た。
１．０”に希釈し、希釈懸濁液０．１ｗをＹＰＧ寒天培
地（注２）に塗抹して３０℃で４８時間培養し、単独胞
子由来の集落を得た。
こうして得られた菌株１３株のうちの１株を酵母サッカ
Ｏ？イセス（５ａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃｅｓ） （Ｆ
ＲＭ１□ｖＭ２−２）Ｓｌ（機工研菌寄第７７９４号）
とした。
Ｏ？イセス（５ａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃｅｓ） （Ｆ
ＲＭ１□ｖＭ２−２）Ｓｌ（機工研菌寄第７７９４号）
とした。
実施例２
実施例１の工程（ａ）（ｂ）（ｃ）と同じ操作を繰り返
して、ＤＦ値−３の凝集性を有する融合株を分離し、こ
の株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ） Ｆ ＲＶ −３（機工Ｍ１７ Ｍ２ 研菌奇第７７８９号）とした。
して、ＤＦ値−３の凝集性を有する融合株を分離し、こ
の株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ） Ｆ ＲＶ −３（機工Ｍ１７ Ｍ２ 研菌奇第７７８９号）とした。
ついで実施例１の工程（ｄ）と同じ操作を繰り返して上
記酵母を胞子形成処理した。
記酵母を胞子形成処理した。
こうして得られた菌株２０株のうち優れた凝集性を有す
るもの１２株を得（頻度６０％）、これら１２株のうち
の１株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ） （Ｆ ＲＶ −３）Ｍ１７ Ｍ２ ８１（機工研菌寄第７８０ｏ号）とした。
るもの１２株を得（頻度６０％）、これら１２株のうち
の１株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ） （Ｆ ＲＶ −３）Ｍ１７ Ｍ２ ８１（機工研菌寄第７８０ｏ号）とした。
実施例３
実施例１の工程（ａ）（ｂ＞（ｃ）と同じ操作を繰り返
して、ＤＦ値＝４の凝集性を有する融合株を分離し、こ
の株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ） Ｆ ＲＶ −４（機工Ｍ１７ Ｍ２ 研菌寄第７７９５号）とした。
して、ＤＦ値＝４の凝集性を有する融合株を分離し、こ
の株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ） Ｆ ＲＶ −４（機工Ｍ１７ Ｍ２ 研菌寄第７７９５号）とした。
ついで実施例１の工程（ｄ）と同じ操作を繰り返して上
記酵母を胞子形成処理した。
記酵母を胞子形成処理した。
こうして得られた菌株３０株のうち優れた凝集性を有す
るもの２４株を得（頻度８０％）、これら２４株のうち
の１株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ） （Ｆ ＲＶ −４）Ｍ１７ Ｍ２ ３１（機工研菌寄第７７９９号）とした。
るもの２４株を得（頻度８０％）、これら２４株のうち
の１株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ） （Ｆ ＲＶ −４）Ｍ１７ Ｍ２ ３１（機工研菌寄第７７９９号）とした。
凝集性およびアルコール発酵能の測定
実施例１において中間的に得た融合酵母ＦＲＶ −
２およびこれを上記の如く胞Ｍ１７ Ｍ２ 予形成処理して得た処理酵母 （ＦＲｖ −２）Ｓｌについてそれ、ぞれＭ１７
Ｍ２ これら菌株の植え継ぎを６回繰り返し、菌株の凝集性の
程度を示すＤＦ値を各回ごとに測定した。ＤＦ値は前述
の方法で求めた。
２およびこれを上記の如く胞Ｍ１７ Ｍ２ 予形成処理して得た処理酵母 （ＦＲｖ −２）Ｓｌについてそれ、ぞれＭ１７
Ｍ２ これら菌株の植え継ぎを６回繰り返し、菌株の凝集性の
程度を示すＤＦ値を各回ごとに測定した。ＤＦ値は前述
の方法で求めた。
測定結果は図面に示すとおりである。
図面から明らかなように、６回の植え継ぎの結果、ＦＲ
Ｖ −２は凝集性を消失したＭ１７ Ｍ２ が、（ＦＲＶ −２）８１株は優れた凝Ｍ１７
Ｍ２ 集性を全く低下することなく安定に維持した。
Ｖ −２は凝集性を消失したＭ１７ Ｍ２ が、（ＦＲＶ −２）８１株は優れた凝Ｍ１７
Ｍ２ 集性を全く低下することなく安定に維持した。
また実施例１で中間的に得られたプロトプラスト融合株
２２株のうち、ＦＲＶ −２Ｍ１７ Ｍ２ のように植え継ぎにより凝集性を消失ないし低下したも
のは６株あった。他方、実施例１で胞子形成処理により
最終的に得られた（ＦＲＭ１７Ｖ −２）３１のよ
うな株１３株には、植え継ぎによる凝集性の消失ないし
低下は全く認められなかった。
２２株のうち、ＦＲＶ −２Ｍ１７ Ｍ２ のように植え継ぎにより凝集性を消失ないし低下したも
のは６株あった。他方、実施例１で胞子形成処理により
最終的に得られた（ＦＲＭ１７Ｖ −２）３１のよ
うな株１３株には、植え継ぎによる凝集性の消失ないし
低下は全く認められなかった。
また各種の野生株、栄養要求性株および各実施例におけ
る胞子形成処理の処理前および処理後の各酵母について
、それぞれＤＦ値およびアルコール発酵能を測定した。
る胞子形成処理の処理前および処理後の各酵母について
、それぞれＤＦ値およびアルコール発酵能を測定した。
ＤＦ値は前述した方法で求めた。
アルコール発酵能は下記の方法で求めた。すなわち沖縄
産の廃糖蜜３４０ｇ／ｌに硫酸アンモニウム３．４Ｑ
／ ＩとピＯ亜硫酸カリウム０．２ｇ／ｌとを混合溶解
した後、硫酸でｐＨを４．５に調整し、混合液を３００
０回転／分で１０分間遠心分離機にかけた。こうして得
られた上澄液を７０１１１ずつとり、各法にそれぞれ菌
株の前培養液を７層加え、これらを３０℃で間欠撹拌（
３０秒間撹拌と１０分分間置の反復）して回分培養を行
ない、２４時間後および４８時間後の各培養液について
それぞれエタノール生成量をガスクロマトグラフィーに
より測定した。
産の廃糖蜜３４０ｇ／ｌに硫酸アンモニウム３．４Ｑ
／ ＩとピＯ亜硫酸カリウム０．２ｇ／ｌとを混合溶解
した後、硫酸でｐＨを４．５に調整し、混合液を３００
０回転／分で１０分間遠心分離機にかけた。こうして得
られた上澄液を７０１１１ずつとり、各法にそれぞれ菌
株の前培養液を７層加え、これらを３０℃で間欠撹拌（
３０秒間撹拌と１０分分間置の反復）して回分培養を行
ない、２４時間後および４８時間後の各培養液について
それぞれエタノール生成量をガスクロマトグラフィーに
より測定した。
測定結果は下記表３のとおりである。
（以下余白）
表３
表３から明らかなように、ＲＭ−１７およびＶＭ−２は
変異株である、ため、アルコール発酵能は野生型の親株
の発酵能より劣るが、融合株であるＦＲＶ −２は
優れた凝集性を有Ｍ１７ Ｍ２ しかつアルコール発酵能においても野生株と比べて遜色
がない。
変異株である、ため、アルコール発酵能は野生型の親株
の発酵能より劣るが、融合株であるＦＲＶ −２は
優れた凝集性を有Ｍ１７ Ｍ２ しかつアルコール発酵能においても野生株と比べて遜色
がない。
またＤＦ値が５であるＦＲＭ１□■Ｍ２−２とＤＦ値が
５に達しないが凝集性を有する融合酵母ＦＲＶ −
３およびＦＲＭ１□ＶＭ２−Ｍ１７ Ｍ２ ４とをそれぞれ胞子形成処理することにより、優れた凝
集性（ＤＦ値＝５）および優れたアルコール発酵能を有
する酵母（ＦＲＭ１□■Ｍ２−２）Ｓｌ、（ＦＲＶ
−３）８１およびＭ１７ Ｍ２ （ＦＲＶ −４）Ｓｌを得ルコとができＭ１７
Ｍ２ る。
５に達しないが凝集性を有する融合酵母ＦＲＶ −
３およびＦＲＭ１□ＶＭ２−Ｍ１７ Ｍ２ ４とをそれぞれ胞子形成処理することにより、優れた凝
集性（ＤＦ値＝５）および優れたアルコール発酵能を有
する酵母（ＦＲＭ１□■Ｍ２−２）Ｓｌ、（ＦＲＶ
−３）８１およびＭ１７ Ｍ２ （ＦＲＶ −４）Ｓｌを得ルコとができＭ１７
Ｍ２ る。
■ 培地および試薬
培地および試薬はそれぞれつきのとおりである。
（注１） ＹＰＧ培地
酵母エキス １０Ｑ ／ ／ポリペプト
ン ２０Ｑ／１グルコース
２０Ｑ／ｌ（注２） ＹＰＧ寒天培地 酵母エキス １０にｌ／／ｌ／へプトン
２０ａ／／グルコース
２０Ｑ／／寒天 ２０Ｑ／１（注
３） 胞子形成培地 酢酸ナトリウム ５０／ｌ 寒天 ２０Ｑ／／（注４） リ
ン酸緩衝液 ０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ＝７．５ （注５） 溶菌酵素溶液 ０．１Ｍリン酸緩衝液（１）８７．５）にザイモリアー
ゼ２０Ｔ（生化学工業社製）を０．０５％溶かした溶液
２１１１と、２−メルカプトエタノール 合液 （注６） 最小培地 Ｄｉｒｃｏ−Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ
ＷｌｏＡｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）
６．７ｏ／／グルコース ２０Ｑ／／
寒天 ２０Ｑ／／（注７） プ
ロトプラスト調製液 １、５Ｍ塩化カリウム０．８ＩＩｌｌと、２／１５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ １．５） １．０７１２／と、２
−メルカプトエタノール１．４μｌと、サイモリアーゼ
２０丁（生化学工業社製）を０．１Ｍリン緩衝液（ｐＨ
７．５）に０、２５％溶かした溶液０．２麿との混合
液（注８） 等張渡 ０、６Ｍ塩化カリウム水溶液 （注９） ポリエチレングリコール水溶液塩化カルシ
ウム ５．６Ｇ／／ポリエチレングリコール （ Ｐ Ｅ Ｇ − ６０００） ３００に
ｌ ／ ｌ（注１０） 重層用培地 グルコース ２０ｇ／／Ｄｉｆｃｏ−Ｙ
ｅａｓｔ旧ｔｒＯＱｅｎ Ｂａｓｅ ＷｌｏＡｍｉｎｏ
ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製） ６．７ｇ／ｌＯｉ
ｒｃｏ−Ｂａｃｔ Ａｇａｒ（Ｄｉｒｃｏ社製）３０Ｇ
／／
ン ２０Ｑ／１グルコース
２０Ｑ／ｌ（注２） ＹＰＧ寒天培地 酵母エキス １０にｌ／／ｌ／へプトン
２０ａ／／グルコース
２０Ｑ／／寒天 ２０Ｑ／１（注
３） 胞子形成培地 酢酸ナトリウム ５０／ｌ 寒天 ２０Ｑ／／（注４） リ
ン酸緩衝液 ０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ＝７．５ （注５） 溶菌酵素溶液 ０．１Ｍリン酸緩衝液（１）８７．５）にザイモリアー
ゼ２０Ｔ（生化学工業社製）を０．０５％溶かした溶液
２１１１と、２−メルカプトエタノール 合液 （注６） 最小培地 Ｄｉｒｃｏ−Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ
ＷｌｏＡｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）
６．７ｏ／／グルコース ２０Ｑ／／
寒天 ２０Ｑ／／（注７） プ
ロトプラスト調製液 １、５Ｍ塩化カリウム０．８ＩＩｌｌと、２／１５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ １．５） １．０７１２／と、２
−メルカプトエタノール１．４μｌと、サイモリアーゼ
２０丁（生化学工業社製）を０．１Ｍリン緩衝液（ｐＨ
７．５）に０、２５％溶かした溶液０．２麿との混合
液（注８） 等張渡 ０、６Ｍ塩化カリウム水溶液 （注９） ポリエチレングリコール水溶液塩化カルシ
ウム ５．６Ｇ／／ポリエチレングリコール （ Ｐ Ｅ Ｇ − ６０００） ３００に
ｌ ／ ｌ（注１０） 重層用培地 グルコース ２０ｇ／／Ｄｉｆｃｏ−Ｙ
ｅａｓｔ旧ｔｒＯＱｅｎ Ｂａｓｅ ＷｌｏＡｍｉｎｏ
ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製） ６．７ｇ／ｌＯｉ
ｒｃｏ−Ｂａｃｔ Ａｇａｒ（Ｄｉｒｃｏ社製）３０Ｇ
／／
図面は植え継ぎ回数と凝集性の関係を示すグラフである
。 以上 特許出願人 日立造船 株式会社 外４名 施え昶きの回板 手続補正口 １．事件の表示 昭和５９年特許願２３０８９６号２
、発明の名称 安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住 所 大阪市西区江戸堀１丁目６番１４号名
称 （５１１）日立造船株式会社外１名 ４、代理人 住 所 大阪市南区鰻谷西之町５７番地の６外４名 ５、補正命令の日付 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明ａｍの発明の詳細な説明の項８
、補正の内容 明細書３６頁表３全体を別紙のとおりに訂正する。 表３
。 以上 特許出願人 日立造船 株式会社 外４名 施え昶きの回板 手続補正口 １．事件の表示 昭和５９年特許願２３０８９６号２
、発明の名称 安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住 所 大阪市西区江戸堀１丁目６番１４号名
称 （５１１）日立造船株式会社外１名 ４、代理人 住 所 大阪市南区鰻谷西之町５７番地の６外４名 ５、補正命令の日付 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明ａｍの発明の詳細な説明の項８
、補正の内容 明細書３６頁表３全体を別紙のとおりに訂正する。 表３
Claims (8)
- （１）サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属に属するプロトプラスト融合酵母を胞子形成処理す
ることを特徴とする、安定かつ優れた凝集性を有する酵
母の製造法。 - （２）サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属に属する凝集性を有しない酵母を胞子形成処理し、
得られた胞子を変異処理し、変異胞子から得られた優れ
た凝集性を有する変異酵母と、サッカロマイセス（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する他の凝集性を有し
ない酵母とをプロトプラスト融合させ、得られた融合酵
母を胞子形成処理することを特徴とする、安定かつ優れ
た凝集性を有する酵母の製造法。 - （３）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
異処理し、変異胞子から得られた優れた凝集性を有する
変異酵母と、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）属に属する他の凝集性を有しない酵母とをプロ
トプラスト融合させ、得られた融合酵母を胞子形成処理
し、安定かつ優れた凝集性を有する酵母を得る、特許請
求の範囲第２項記載の製造法。 - （４）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
トプラスト融合させ、得られたＤＦ値５の酵母サッカロ
マイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＦＲ＿Ｍ＿Ｉ
＿７Ｖ＿Ｍ＿２−２（微工研菌寄第７８８９号）を胞子
形成処理し、安定かつ優れた凝集性（ＤＦ値＝５）を有
する酵母を得る、特許請求の範囲第２項記載の製造法。 - （５）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
トプラスト融合させ、得られたＤＦ値５の酵母サッカロ
マイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＦＲ＿Ｍ＿１
＿７Ｖ＿Ｍ＿２−２（微工研菌寄第７８８９号）を胞子
形成処理し、安定かつ優れた凝集性（ＤＦ値＝５）を有
する酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ）（ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−２）Ｓ１（微工研
菌寄第７７９４号）を得る、特許請求の範囲第２項記載
の製造法。 - （６）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
トプラスト融合させ、得られたＤＦ値が５には達しない
が凝集性を有する酵母を胞子形成処理し、安定かつ優れ
た凝集性（ＤＦ値＝５）を有する酵母を得る、特許請求
の範囲第２項記載の製造法。 - （７）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＩＦＯ−Ｏ２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
トプラスト融合させ、得られたＤＦ値３の凝集性を有す
る酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−３（微工研菌寄第７７
８９号）を胞子形成処理し、安定かつ優れた凝集性（Ｄ
Ｆ値＝５）を有する酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）（ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−３
）Ｓ１（微工研菌寄第７８００号）を得る、特許請求の
範囲第２項記載の製造法。 - （８）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
トプラスト融合させ、得られたＤＦ値４の凝集性を有す
る酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−４（微工研菌奇第７７
９５号）を胞子形成処理し、安定かつ優れた凝集性（Ｄ
Ｆ値＝５）を有する酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）（ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−４
）Ｓ１（微工研菌寄第７７９９号）を得る、特許請求の
範囲第２項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59230896A JPS61108377A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59230896A JPS61108377A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61108377A true JPS61108377A (ja) | 1986-05-27 |
| JPH0259717B2 JPH0259717B2 (ja) | 1990-12-13 |
Family
ID=16914993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59230896A Granted JPS61108377A (ja) | 1984-10-31 | 1984-10-31 | 安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61108377A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6344880A (ja) * | 1986-08-12 | 1988-02-25 | Hitachi Zosen Corp | 新規凝集性酵母、その製造法およびこれを用いるアルコ−ル発酵法 |
| CN108148829A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-06-12 | 青岛啤酒股份有限公司 | 利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法及所得新型酿酒酵母 |
-
1984
- 1984-10-31 JP JP59230896A patent/JPS61108377A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6344880A (ja) * | 1986-08-12 | 1988-02-25 | Hitachi Zosen Corp | 新規凝集性酵母、その製造法およびこれを用いるアルコ−ル発酵法 |
| CN108148829A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-06-12 | 青岛啤酒股份有限公司 | 利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法及所得新型酿酒酵母 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0259717B2 (ja) | 1990-12-13 |
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