JPS61108377A - 安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法 - Google Patents

安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法

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JPS61108377A
JPS61108377A JP59230896A JP23089684A JPS61108377A JP S61108377 A JPS61108377 A JP S61108377A JP 59230896 A JP59230896 A JP 59230896A JP 23089684 A JP23089684 A JP 23089684A JP S61108377 A JPS61108377 A JP S61108377A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造
法に関するものである。
近年、石油代替エネルギーとして、石油化学によらずに
得られる発酵アルコールが注目されている。これはさと
うきびやこれから採った糖蜜、さつまいも、じゃがいも
、とうもろこしなどのセルロース質またはでん粉質を原
料とし、これらを微生物の働きによって発酵させること
により製造される。
一般にアルコール発酵では、アルコールの生産性は発酵
槽内の菌体濃度に比例する。そこで発酵槽内の菌体濃度
を高める手段として、優れた凝集−性を有する酵母を用
いることが考えられる。すなわち、酵母が優れた凝集性
を有していると、酵母の沈降速度が速くなり、そのため
固液分離が迅速かつ容易になし得る。そして例えば回分
発酵においては、発酵液を単に静置するだけで菌体を沈
降堆積させることができ、発酵液と菌体の分離を容易に
行なって菌体を再使用に供することができる。また連続
発酵においては、小径の流動部とこれの上に連設された
菌体沈降用の大径の沈降部とこれに内装された菌体沈降
部材とを主体とした基型発酵槽を用いることにより、培
地の供給量が増大しても菌体を沈降させてその流出を防
止することができる。このように凝集性を有する酵母を
用いると、凝集性を有しない酵母を用いた場合に比べて
多くの利点があり、そのため新規凝集性酵母が要望せら
れている。
従来技術およびその問題点 一従来から、上記の要望にこたえるべく、凝集性酵母を
取得する試みがいくつがなされており、たとえば自然界
から野生の凝集性酵母を分離し、そのエタノール発酵能
の向上のために、この野生株をエタノール発酵能に優れ
た酵母とプロトプラスト融合させて、凝集性とエタノー
ル発酵能を兼ね備えた酵母を得る試みがなされている（
ａｒｏｔｅｃｈｎｏ＋ｏｇｙ　Ｉｅｔｔｅｒｓ、第５巻
、第５号、第３５１〜３５６頁、１９８３年参照）。し
かしこの方法では得られた融合株は植え継ぎの繰り返し
の間に凝集性を低下ないし消失することがよくあり、凝
集性の不安定さが大きな問題となっていた。この原因は
、野生株や高エタノール発酵能を有する酵母には高次倍
数体のものが多く、これらの株間で得られた融合株はざ
らに倍数性を増し、そのため植え継ぎの繰り返しによっ
て凝集性が低下ないし消失するものと考えられる。
この発明は、上記のような実情に鑑みてなされたもので
あって、植え継ぎの繰り返しによっても凝集性が低下す
ることのない安定かつ優れた凝集性を有する酵母を得る
方法、ないし、ある程度の凝集性を有する酵母から安定
かつ優れた凝集性を有する酵母を得る方法を提供するこ
とを目的とする。
この発明による安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製
造法の第１の発明は、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　）風に属するプロトプラスト融合酵母
を胞子形成処理することを特徴とするものであり、第２
の発明は、す、ツカロマイセス（ｓａｃｃｈａｒｏｎｔ
ｙｃｅｓ　＞　ｒａに属する凝集性を有しない酵母を胞
子形成処理し、得られた胞子を変異処理し、変異胞子か
ら得られた優れた凝集性を有する変異酵母と、サツカロ
マイセス＜　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　＞属に属す
る他の凝集性を有しないＩＩ母とをプロトプラスト融合
させ、得られた融合酵母を胞子形成処理することを特徴
とするものである。
この明細書において、酵母の凝集性の程度（Ｄｅａｒｅ
ｅ　ｏｆ　ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）は、以下に示す
ギリランド・テスト（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ　　ｔｅｓｔ
）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｙａｎｄ　　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏ１ｏＯＶ第７巻、第２２７−２３４頁、
１９７９年）により求められたＤＦ値で表示される。す
なわち供試菌株をＹＰＧ培地（注１）で３０℃で１６時
間振盪培養した後、菌体の沈降速度、沈降菌体の容量お
よび硬さを肉眼観察により対照菌株と比較し、表１に示
すＤＰＩＦＯから５の６段階で凝集の程度を表示する。
（以下余白） 表　　１ この発明による酵母製造法において、凝集性を有しない
酵母としては、アルコール発酵能に優れかつ胞子形成能
を有する酵母であれば、限定なく適用できる。
この発明において、胞子形成処理は常法に従りてなされ
る。通常は凝集性を有しない酵母をＹＰＧ寒天培地（注
２）で培養した後、胞子形成寒天培地（注３）に塗抹す
る方法がとられる。
また単独胞子由来の細胞を得るには、酵母細胞壁溶解用
の溶菌酵素を用いて子のうを溶解した後、マイクロマニ
プユレータを用いて胞子を分離する方法、または同じく
溶菌酵素で子のうを溶解した後、超音波処理により胞子
を分散させ、胞子を栄養寒天培地で培養する方法がとら
れる。
また変異処理は、胞子形成処理により得られた胞子また
は子のうに公知の突然変異処理、たとえば紫外線、Ｘ線
、γ線を照射する物理的方法、エチルメタンスルホネー
ト、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジ
ン、４−二トロキノリンーＮ−オキサイドなどの変異誘
起剤を接触した後に選択培地に生育する化学的方法のい
ずれによっても行なわれるが、エチルメタンスルホネー
トを用いる方法が特に好ましい。
プロトプラスト融合もまた常法によって行なわれる。通
常は細胞数１０７〜１０’個／ｍｌの濃度の各菌体懸濁
液、を調製し、これら懸濁液を好ましくは等量混合した
後、酵母細胞壁溶解酵素を含むプロトプラスト調製液で
混合物を処理するか、または各菌体懸濁液を同調製液で
処理した後これらを混合する。
この発明の製造法で用いる培地としては、炭素源、窒素
源、無機イオン、さらに必要ならば有機微量栄養素を含
有する通常の培地が使用できる。炭素源としてはグルコ
ース、ガラクトース、フラクトース、シュークロース、
スターチ加水分解物、果汁、セルロース分解物などの炭
水化物がよく用いられる。特に好適な培地は、酵母エキ
ス１Ｑ１ポリペプトン２０．グルコース２ｇ、蒸留水１
００ＩＩｌよりなる培地であり、。
この培地のｐＨは無調整で５．５である。
培養は温度２５〜４０℃好ましくは３０〜３７℃で、ｐ
Ｈ３，０〜７゜０好ましくはｐＨ３，５〜６．０で行な
われる。
この発明の好ましい実施態様においては、財団法人発酵
研究所の保存菌であるＤＦ値０の酵母サッカロマイセス
・セルビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｏ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ−０２２４（以下、単にＩＦＯ−０２
２４と記ｔ）をＪａ子影形成処理、得られた胞子を変異
処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サツカロ
マイセス◆セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　ＲＭ　−１７（微工研菌寄第
７７７０号）　（以下、単にＲＭ−１７と記す）と、Ｄ
ＦｉｉＯの酵母サッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｖ　
Ｍ　−２（微工研菌寄第７７８８号）（以下、単にＶＭ
−２と記す）とをプロトプラスト融合させ、融合酵母か
ら得られたＤＦ値５の酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　Ｆ　ＲＭ１７ＶＭ２−２　（
機工研菌寄第７８８９号）を胞子形成処理し、得られた
胞子を培養することにより、安定かつ優れた凝集性（Ｄ
Ｆ値＝５）を有する酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　）　　（Ｆ　ＲＶＭ１７　　Ｍ２ −２）８１　（機工研菌奇第７７９４号）を得る。
こうして得られたＤＦ値５の凝集性酵母（ＦＲＭ１７■
Ｍ２−２）Ｓｌは、植え継ぎの繰り返しによってもＤＦ
値を全く低下しないものである。
またこの発明のもう一つの好ましい実施態様においては
、上記実施態様と同じ操作によってプロトプラスト融合
を行ない、得られたある程度の凝集性を有する融合酵母
サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ　）
　Ｆ　ＲＶ　　　−３（機工Ｍ１７　　Ｍ２ 研菌寄第７７８９号、ＤＦ値−３）およびサツカロマイ
セス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　Ｆ　ＲＶＭ１
７　　Ｍ ２−４（機工研菌寄第７７９５号、ＤＦ値＝４）をそれ
ぞれ胞子形成処理し、得られた胞子を培養することによ
り、安定かつ優れた凝集性を有する酵母サッカＣＩ’？
イセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）（ＦＲＶ　　
　−３）Ｓｌ　（機工研菌寄第７Ｍ１７　　Ｍ２ ８００号、ＤＦ値＝５）および酵母サツカロマイセス（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　（Ｆ　ＲＭ１７ＶＭ
２−４）Ｓｌ　（機工研菌寄第７７９９号、ＤＦ値＝５
）をそれぞれ得る。
この実施態様ではプロトプラスト融合酵母の胞子形成処
理の結果、処理後の酵母の凝集性は処理前の酵母のそれ
に比べて大幅に向上させられている。
上記２つの実Ｍ態様において、出発酵母ＩＦＯ−０２２
４は下記表２に示すごとき諸性質（発酵性および資化性
の有無、生理的性質）を有する。
（以下余白） 表　　２ 表２中、ラフィノースの発酵性は、結合部が切断されて
生じる構成単糖フラクトース、グルコースおよびガラク
トースのうちいくつの糖を発酵できるかにより表示され
る。すなわち、発酵性１／３とはフラクトースのみを発
酵する場合を、発酵性２／３とはフラクトースおよびグ
ルコースを発酵する場合を、および発酵性３／３とはす
べての構成単糖を発酵する場合をそれぞれ意味する。
また上記実施態様でそれぞれ得られた安定かつ優れた凝
集性を有する胞子形成処理酵母は、下記の菌学的性質を
有する。すなわちこれら酵母はいずれも、 ・ＤＦ値５なる凝集性を有し、液体培養では著しい沈降
性を示す。
・廃糖蜜（たとえば１５％の全糖分を含む廃糖蜜）を発
酵し、７〜９ｖ０１％のエタノールを生成する。
・寒天平板上で多少硬い集落を形成する。
・胞子形成能を有する。
またＲＭ−１７は生育にアデニンおよびヒスチジンを要
求し、ＶＭ−２はイソロイシンおよびバリンを要求する
。
なお、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）属に属する酵母は下記のような菌学的性質を有するこ
とが知られている（　Ｊ、　Ｌｏｄｄｅｒ著ｒ　Ｔｈｅ
Ｙｅａｓｔｓ’、　Ａ　Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　５ｔｕｄ
ｙ　Ｊ第２版１．ＮＯｆ’ｔｔｌ−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社発行、１９７０年）。
すなわち、この属に属する酵母は、 ・多極出芽によって増殖する。
・子のう胞子を形成する。
・硝酸塩を資化しない。
・真菌糸を欠くかまたはわずかじか形成しない。
・成熟子のうは容易に開裂しない。
・胞子の形状は球形ないし卵形である。
・グルコースをよく発酵する。
・麦芽汁培地に皮膜を形成しない。
発明の効果 この発明は以上のとおり構成されているので、植え継ぎ
の繰り返しによっても凝集性が低下することのない安定
した酵母を得ることができ、またＯＦ値が５には達しな
いが凝集性を有する酵母から優れた凝集性（ＯＦ値＝５
）を有する酵母を得ることができる。したがってこうし
て得られた凝集性酵母を用いてアルコール発酵を行なう
ことにより、冒頭で説明したように回分発酵においても
連続発酵においてもアルコール発酵槽内の菌体濃度を高
く維持して、エタノールの生産性を大幅に向上すること
かで きる。
実　　施　　例 つぎにこの発明の実施例を示し、上記効果を実証する。
実施例１ （ａ）　　ＲＭ−１７の調製 凝集性を有しない酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
　　Ｉ　Ｆ　０−０２２４をＹＰＧ寒天培地（注２　）
　テ３０’Ｃで２４時間培養し、ついで胞子形成寒天培
地（注３）に塗抹し、３０℃で３〜５日間培養を行なっ
た。こうして胞子を形成させた。
ついで胞子数が１０７個／層になるように、子のうを無
菌水１Ｎに懸濁させ、東国後リン酸緩衝液（注４）で洗
浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶液（注５）２ＩＩＩ
ｌ中で３０’Ｃで１時間振盪して、子のうを溶解させた
。ついで集菌後、遊離した胞子を無菌水１１１１１で洗
浄してリン酸緩衝液３ＩＩｔｌに懸濁させた。
この懸濁液に変異誘起剤としてエチルメタンスルホネー
トを０．　ＩＮ添加し、懸濁液を３０℃で２時間振盪し
た。こうして胞子を変異処理した。ついで集菌後、変異
胞子をリン酸緩衝液０．２暦に懸濁させ、懸濁液に５％
チオ硫酸ナトリウム水溶液３２／を添加して、懸濁液を
３０℃で１０分間振盪した。こうして変異誘起剤を中和
した。
集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１１Ｉｌで２回洗浄し
て同緩衝液５層に懸濁させ、懸濁液を水冷下に３分間超
音波処理することにより変異胞子を懸濁液中に分散させ
た。ついで集菌後１、懸濁液を無菌水で濃度１／１０’
〜１／１０８に希釈し、希釈懸濁液０゜１７ｍをＹＰＧ
寒天培地（注２）に塗抹して３０℃で４８時間培養し、
単独胞子由来の集落を得た。
こうして得られた集落のプレートをマスタープレートと
してレプリカ法により変異株の検出を行なった。すなわ
ち、殺菌したベルベット布地を用いて、前記マスタープ
レートの集落を最小培地（注６）にレプリカし、同培地
で３０”Ｃで４日間培養し、最小培地で増殖できない菌
株を栄養要求性変異株としてマスタープレートから釣菌
した。
その結果マスタープレートの菌株２５株のうち凝集性に
優れたサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＲＭ　−１７
（微工研菌寄第７７７０号）を得た。この株はアデニン
およびヒスチジン要求性の菌株であった。
（ｂ）　　ＶＭ−２の調製 工業技術院微生物工業技術研究所応用技術部生物化学工
学研究室から分譲を受けた凝集性を有しない酵母サッカ
ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｅ　Ｙ　−１（機工研菌寄
第７７９３号）をＲＭ−１７の調製と同じ操作で変異処
理し、レプリカ法によりイソロイシンおよびバリン要求
性の栄養要求性変異株として酵母サッカロマイセス・セ
ルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）　ＶＭ　−２（微工研菌寄第７７８８号）を
得た。
（ｃ）　　ＲＭ−１７とＶＭ−２のプロトプラスト融合 ＲＭ−１７をＹＰＤ培地１０．ｍｒ３０℃で１６時間振
盪培養し、集菌後混合物１ｗで洗浄した。ついでこれを
プロトプラスト調製液（注７）約２ｗに懸濁させ、懸濁
液を３０℃で１時間振盪し、東国後等張液（注８）１ｗ
で２回洗浄を行なった。
、　　ＶＭ−２についても上記と同じ操作で処理を行な
った。
ついでこうして得られたＲＭ−１７の処理菌体とＶＭ−
２の処理菌体とを同量（ｉｌｌ胞数１０８個／ｗずつ）
とって混合し、集菌後混合物を等張渡０．　Ｉｍに懸濁
させ、懸濁液にポリエチレングリコール水溶液（注９）
２ｗを添加した。この懸濁液を３０℃で１５分間静置し
てプロトプラスト融合を完結した。ついで集菌後、菌体
を等張渡１ｍに懸濁し、懸濁液を２０℃で１５分間静置
した。ついで懸濁液を等張渡で濃度１／１０〜１／１０
２に希釈し、希釈懸濁液を珊小培地（注６）に塗抹し、
重層用培地（注１０）を重層した。この状態で３０℃で
４日間培養を行ない、優れた凝集性を有する融合株を２
２株分離し、そのうちの１株を酵母サツカロマイセス（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）　Ｆ　ＲＶ　　　−２
＜微Ｍ１７　　Ｍ２ 工研菌奇第７８８９号）とした。
なお、プロトプラスト融合に用いた両親株（ＲＭ−１７
とＶＭ−２）は上記最小培地に生育できなかった。
（ｄ）　　　（ＦＲＶ　　　−２）Ｓｌの調製Ｍ１７　
　Ｍ２ プロトプラスト融合酵母である上記ＦＲＭ１□Ｖ　　　
−２を植え継ぎにより凝集性が低下する前にＹＰＧ寒天
培地（注２）で３０℃で２４時間培養し、ついで胞子形
成寒天培地（注３）に塗抹し、３０℃で３〜５日間培養
を行なった。
こうして胞子を形成させた。
ついで胞子数が１０７個／ＩＩＩになるように、子のう
を無菌水１ｗに懸濁させ、集菌後リン酸緩衝液（注４）
で洗浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶液（注５）２ｗ
ｌ中で３０℃で１時間振盪して、子のうを溶解させた。
ついで集菌後、遊離した胞子を無菌水１ｗで洗浄してリ
ン酸緩衝液５ｗに懸濁させ、懸濁液を水冷下に３分間超
音波処理することにより胞子を懸濁液中に分散させた。
ついで集菌後、懸濁液を無菌水で濃度１／１０５〜１／
１．０”に希釈し、希釈懸濁液０．１ｗをＹＰＧ寒天培
地（注２）に塗抹して３０℃で４８時間培養し、単独胞
子由来の集落を得た。
こうして得られた菌株１３株のうちの１株を酵母サッカ
Ｏ？イセス（５ａｃｃｈａｒｏｎ＋ｙｃｅｓ）　（Ｆ　
ＲＭ１□ｖＭ２−２）Ｓｌ（機工研菌寄第７７９４号）
とした。
実施例２ 実施例１の工程（ａ）（ｂ）（ｃ）と同じ操作を繰り返
して、ＤＦ値−３の凝集性を有する融合株を分離し、こ
の株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）　Ｆ　ＲＶ　　　−３（機工Ｍ１７　　Ｍ２ 研菌奇第７７８９号）とした。
ついで実施例１の工程（ｄ）と同じ操作を繰り返して上
記酵母を胞子形成処理した。
こうして得られた菌株２０株のうち優れた凝集性を有す
るもの１２株を得（頻度６０％）、これら１２株のうち
の１株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）　（Ｆ　ＲＶ　　　−３）Ｍ１７　　Ｍ２ ８１（機工研菌寄第７８０ｏ号）とした。
実施例３ 実施例１の工程（ａ）（ｂ＞（ｃ）と同じ操作を繰り返
して、ＤＦ値＝４の凝集性を有する融合株を分離し、こ
の株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ）　Ｆ　ＲＶ　　　−４（機工Ｍ１７　　Ｍ２ 研菌寄第７７９５号）とした。
ついで実施例１の工程（ｄ）と同じ操作を繰り返して上
記酵母を胞子形成処理した。
こうして得られた菌株３０株のうち優れた凝集性を有す
るもの２４株を得（頻度８０％）、これら２４株のうち
の１株を酵母サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）　（Ｆ　ＲＶ　　　−４）Ｍ１７　　Ｍ２ ３１（機工研菌寄第７７９９号）とした。
凝集性およびアルコール発酵能の測定 実施例１において中間的に得た融合酵母ＦＲＶ　　　−
２およびこれを上記の如く胞Ｍ１７　　Ｍ２ 予形成処理して得た処理酵母 （ＦＲｖ　　−２）Ｓｌについてそれ、ぞれＭ１７　　
Ｍ２ これら菌株の植え継ぎを６回繰り返し、菌株の凝集性の
程度を示すＤＦ値を各回ごとに測定した。ＤＦ値は前述
の方法で求めた。
測定結果は図面に示すとおりである。
図面から明らかなように、６回の植え継ぎの結果、ＦＲ
Ｖ　　　−２は凝集性を消失したＭ１７　　Ｍ２ が、（ＦＲＶ　　　−２）８１株は優れた凝Ｍ１７　　
Ｍ２ 集性を全く低下することなく安定に維持した。
また実施例１で中間的に得られたプロトプラスト融合株
２２株のうち、ＦＲＶ　　　−２Ｍ１７　　Ｍ２ のように植え継ぎにより凝集性を消失ないし低下したも
のは６株あった。他方、実施例１で胞子形成処理により
最終的に得られた（ＦＲＭ１７Ｖ　　　−２）３１のよ
うな株１３株には、植え継ぎによる凝集性の消失ないし
低下は全く認められなかった。
また各種の野生株、栄養要求性株および各実施例におけ
る胞子形成処理の処理前および処理後の各酵母について
、それぞれＤＦ値およびアルコール発酵能を測定した。
ＤＦ値は前述した方法で求めた。
アルコール発酵能は下記の方法で求めた。すなわち沖縄
産の廃糖蜜３４０ｇ／ｌに硫酸アンモニウム３．４Ｑ　
／　ＩとピＯ亜硫酸カリウム０．２ｇ／ｌとを混合溶解
した後、硫酸でｐＨを４．５に調整し、混合液を３００
０回転／分で１０分間遠心分離機にかけた。こうして得
られた上澄液を７０１１１ずつとり、各法にそれぞれ菌
株の前培養液を７層加え、これらを３０℃で間欠撹拌（
３０秒間撹拌と１０分分間置の反復）して回分培養を行
ない、２４時間後および４８時間後の各培養液について
それぞれエタノール生成量をガスクロマトグラフィーに
より測定した。
測定結果は下記表３のとおりである。
（以下余白） 表３ 表３から明らかなように、ＲＭ−１７およびＶＭ−２は
変異株である、ため、アルコール発酵能は野生型の親株
の発酵能より劣るが、融合株であるＦＲＶ　　　−２は
優れた凝集性を有Ｍ１７　　Ｍ２ しかつアルコール発酵能においても野生株と比べて遜色
がない。
またＤＦ値が５であるＦＲＭ１□■Ｍ２−２とＤＦ値が
５に達しないが凝集性を有する融合酵母ＦＲＶ　　　−
３およびＦＲＭ１□ＶＭ２−Ｍ１７　　Ｍ２ ４とをそれぞれ胞子形成処理することにより、優れた凝
集性（ＤＦ値＝５）および優れたアルコール発酵能を有
する酵母（ＦＲＭ１□■Ｍ２−２）Ｓｌ、（ＦＲＶ　　
　−３）８１およびＭ１７　　Ｍ２ （ＦＲＶ　　　−４）Ｓｌを得ルコとができＭ１７　　
Ｍ２ る。
■　培地および試薬 培地および試薬はそれぞれつきのとおりである。
（注１）　　　ＹＰＧ培地 酵母エキス　　　　　　　　１０Ｑ　／　／ポリペプト
ン　　　　　　　２０Ｑ／１グルコース　　　　　　　
　２０Ｑ／ｌ（注２）　　　ＹＰＧ寒天培地 酵母エキス　　　　　　　　１０にｌ／／ｌ／へプトン
　　　　　　　２０ａ／／グルコース　　　　　　　　
２０Ｑ／／寒天　　　　　　　　　　　２０Ｑ／１（注
３）　　胞子形成培地 酢酸ナトリウム　　　　　　５０／ｌ 寒天　　　　　　　　　　　２０Ｑ／／（注４）　　リ
ン酸緩衝液 ０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ＝７．５ （注５）　　溶菌酵素溶液 ０．１Ｍリン酸緩衝液（１）８７．５）にザイモリアー
ゼ２０Ｔ（生化学工業社製）を０．０５％溶かした溶液
２１１１と、２−メルカプトエタノール 合液 （注６）　　最小培地 Ｄｉｒｃｏ−Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ
　ＷｌｏＡｍｉｎｏ　ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）　　
　６．７ｏ／／グルコース　　　　　　　　２０Ｑ／／
寒天　　　　　　　　　　　２０Ｑ／／（注７）　　プ
ロトプラスト調製液 １、５Ｍ塩化カリウム０．８ＩＩｌｌと、２／１５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ　１．５）　　１．０７１２／と、２
−メルカプトエタノール１．４μｌと、サイモリアーゼ
２０丁（生化学工業社製）を０．１Ｍリン緩衝液（ｐＨ
　７．５）に０、２５％溶かした溶液０．２麿との混合
液（注８）　　等張渡 ０、６Ｍ塩化カリウム水溶液 （注９）　　ポリエチレングリコール水溶液塩化カルシ
ウム　　　　　５．６Ｇ／／ポリエチレングリコール （　Ｐ　Ｅ　Ｇ　−　６０００）　　　　　　３００に
ｌ　／　ｌ（注１０）　　　重層用培地 グルコース　　　　　　　　２０ｇ／／Ｄｉｆｃｏ−Ｙ
ｅａｓｔ旧ｔｒＯＱｅｎ　Ｂａｓｅ　ＷｌｏＡｍｉｎｏ
　ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）　　　６．７ｇ／ｌＯｉ
ｒｃｏ−Ｂａｃｔ　Ａｇａｒ（Ｄｉｒｃｏ社製）３０Ｇ
／／
【図面の簡単な説明】
図面は植え継ぎ回数と凝集性の関係を示すグラフである
。 以上 特許出願人　　　日立造船　株式会社 外４名 施え昶きの回板 手続補正口 １．事件の表示　　昭和５９年特許願２３０８９６号２
、発明の名称 安定かつ優れた凝集性を有する酵母の製造法３、補正を
する者 事件との関係　　　特許出願人 住　所　　　　大阪市西区江戸堀１丁目６番１４号名　
称　　　　（５１１）日立造船株式会社外１名 ４、代理人 住　所　　大阪市南区鰻谷西之町５７番地の６外４名 ５、補正命令の日付 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象　　　明ａｍの発明の詳細な説明の項８
、補正の内容 明細書３６頁表３全体を別紙のとおりに訂正する。 表３

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    ）属に属するプロトプラスト融合酵母を胞子形成処理す
    ることを特徴とする、安定かつ優れた凝集性を有する酵
    母の製造法。
  2. （２）サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    ）属に属する凝集性を有しない酵母を胞子形成処理し、
    得られた胞子を変異処理し、変異胞子から得られた優れ
    た凝集性を有する変異酵母と、サッカロマイセス（Ｓａ
    ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する他の凝集性を有し
    ない酵母とをプロトプラスト融合させ、得られた融合酵
    母を胞子形成処理することを特徴とする、安定かつ優れ
    た凝集性を有する酵母の製造法。
  3. （３）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
    Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
    ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
    異処理し、変異胞子から得られた優れた凝集性を有する
    変異酵母と、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
    ｃｅｓ）属に属する他の凝集性を有しない酵母とをプロ
    トプラスト融合させ、得られた融合酵母を胞子形成処理
    し、安定かつ優れた凝集性を有する酵母を得る、特許請
    求の範囲第２項記載の製造法。
  4. （４）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
    Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
    ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
    異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
    ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
    ７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
    ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
    ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
    トプラスト融合させ、得られたＤＦ値５の酵母サッカロ
    マイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＦＲ＿Ｍ＿Ｉ
    ＿７Ｖ＿Ｍ＿２−２（微工研菌寄第７８８９号）を胞子
    形成処理し、安定かつ優れた凝集性（ＤＦ値＝５）を有
    する酵母を得る、特許請求の範囲第２項記載の製造法。
  5. （５）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
    Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
    ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
    異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
    ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
    ７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
    ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
    ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
    トプラスト融合させ、得られたＤＦ値５の酵母サッカロ
    マイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＦＲ＿Ｍ＿１
    ＿７Ｖ＿Ｍ＿２−２（微工研菌寄第７８８９号）を胞子
    形成処理し、安定かつ優れた凝集性（ＤＦ値＝５）を有
    する酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
    ｓ）（ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−２）Ｓ１（微工研
    菌寄第７７９４号）を得る、特許請求の範囲第２項記載
    の製造法。
  6. （６）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
    Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
    ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
    異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
    ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
    ７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
    ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
    ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
    トプラスト融合させ、得られたＤＦ値が５には達しない
    が凝集性を有する酵母を胞子形成処理し、安定かつ優れ
    た凝集性（ＤＦ値＝５）を有する酵母を得る、特許請求
    の範囲第２項記載の製造法。
  7. （７）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
    Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
    ＩＦＯ−Ｏ２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
    異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
    ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
    ７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
    ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
    ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
    トプラスト融合させ、得られたＤＦ値３の凝集性を有す
    る酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    ）ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−３（微工研菌寄第７７
    ８９号）を胞子形成処理し、安定かつ優れた凝集性（Ｄ
    Ｆ値＝５）を有する酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈ
    ａｒｏｍｙｃｅｓ）（ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−３
    ）Ｓ１（微工研菌寄第７８００号）を得る、特許請求の
    範囲第２項記載の製造法。
  8. （８）ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セルビシエ（
    Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
    ＩＦＯ−０２２４を胞子形成処理し、得られた胞子を変
    異処理し、変異胞子から得られたＤＦ値４の酵母サッカ
    ロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＭ−１７（微工研菌寄第７
    ７７０号）と、ＤＦ値０の酵母サッカロマイセス・セル
    ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
    ｉａｅ）ＶＭ−２（微工研菌寄第７７８８号）とをプロ
    トプラスト融合させ、得られたＤＦ値４の凝集性を有す
    る酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
    ）ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−４（微工研菌奇第７７
    ９５号）を胞子形成処理し、安定かつ優れた凝集性（Ｄ
    Ｆ値＝５）を有する酵母サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈ
    ａｒｏｍｙｃｅｓ）（ＦＲ＿Ｍ＿１＿７Ｖ＿Ｍ＿２−４
    ）Ｓ１（微工研菌寄第７７９９号）を得る、特許請求の
    範囲第２項記載の製造法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6344880A (ja) * 1986-08-12 1988-02-25 Hitachi Zosen Corp 新規凝集性酵母、その製造法およびこれを用いるアルコ−ル発酵法
CN108148829A (zh) * 2018-03-09 2018-06-12 青岛啤酒股份有限公司 利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法及所得新型酿酒酵母

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