KR100389729B1

KR100389729B1 - 이종 단백질의 제조 방법

Info

Publication number: KR100389729B1
Application number: KR10-1999-7009057A
Authority: KR
Inventors: 오다도오오; 오야도모시; 구와에시노부; 오야마마사오; 고바야시가오루; 우에무라야히로
Original assignee: 미쯔비시 웰 파마 가부시키가이샤
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2003-07-02
Also published as: EP1004673B1; ES2255154T3; CA2286395A1; US6309864B1; WO1998044146A1; EP1004673A1; CA2286395C; NO994788D0; AU746670B2; CN1257549A; BR9808472A; PL335975A1; DE69832709D1; NO994788L; AU6522898A; DE69832709T2; EP1004673A4; KR20010005979A; ATE312195T1

Abstract

지방산 또는 그의 염, 및 계면활성제를 함유한 배지내에서 유전자 조작에 의해 제조된 이종 단백질 생산 숙주를 배양하고, 배양물로부터 이종 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 이종 단백질의 제조 방법. 이에 따라, 숙주에 의해 생산되는 이종 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다. 더욱이, 숙주에서 유래한 효소에 의해 이종 단백질의 분해를 저해할 수 있으며, 이로써 이종 단백질의 대량 생산이 가능하게 되었다.

Description

이종 단백질의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING FOREIGN PROTEINS}

혈장의 주요 단백질 성분인 인간 혈청 알부민 (이하, HSA 라 칭함) 등과 같은, 약품으로서 유용한 여러 단백질은 체액의 분획에 의해 제조되지만, 이 방법은 출발 물질의 확보에 어려움이 있고, 생산되는 제제는 바이러스 등에 감염될 가능성이 높다. 근년에 재조합 DNA 기술이 출현함에 따라 미생물 및 세포에 의해 상기 단백질을 생산할 수 있게 되었으며, 이로 인해 유전공학에 의한 이종 단백질의 대규모 생산의 연구 및 개발이 조장되고 있다. 그러나, 그 수율이 여전히 낮아, 대규모 생산은 이루어지지 않았다.

이종 단백질의 생산을 증가시키는 방법으로는, 지방산 또는 그의 염을 매질에 첨가하여 재조합 HSA (이하, rHSA 라 칭함) 의 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법 (JP-A-4-293495호), 폴리알킬렌글리콜기를 갖는 고농도의 계면활성제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법 (일본 PCT 공개출원 공표 제3-500969호) 등이 있다.

이와 같은 기술 배경의 견지에서, 본 발명은 특히 배지 조건을 개선함으로써, 이종 단백질의 생산량을 증가시키는 것을 목적으로 한다.

[발명의 개시]

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 집중적인 연구를 수행하여, 지방산 또는 그의 염, 및 계면활성제를 함유한 배지내에서 유전자 조작에 의해 제조된 이종 단백질 생산 숙주를 배양함으로써 이종 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있음을 발견하였으며, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 하기를 제공한다.

(1) 지방산 또는 그의 염, 및 계면활성제를 함유한 배지내에서 유전자 조작에 의해 제조된 이종 단백질 생산 숙주를 배양하고, 배양물로부터 이종 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 이종 단백질의 제조 방법.

(2) 지방산의 탄소수가 10 내지 26 인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 의 제조 방법.

(3) 지방산 또는 그의 염이 0.01 내지 10 w/v% 의 농도로 배지에 함유된 것을 특징으로 하는 상기 (1) 의 제조 방법.

(4) 계면활성제가 분자량 100 내지 100,000 의 비이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 의 제조 방법.

(5) 계면활성제가 0.5 g/ℓ이하의 농도로 배지에 함유된 것을 특징으로 하는 제조 방법.

본 발명은 유전자 조작에 의해 형질전환된 숙주를 배양하는 것을 특징으로 하는 이종 단백질의 제조 방법의 개선에 관한 것이다.

본 발명에서, 이종 단백질은 숙주 세포에 의해 고유하게 생산되는 것이 아니라 형질전환에 의해 생산되도록 한 이종 단백질을 의미한다.

본 발명에서 사용되는, 유전자 조작에 의해 제조된, 공지 문헌에 나타나 있는 이종 단백질 생산 숙주 및 앞으로 개발될 숙주는, 유전자 조작에 의해 제조될 수 있고, 이종 단백질을 생산할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 이의 구체적인 예로는 이종 단백질을 생산하도록 유전자 조작된, 세포 (예를 들면, 대장균, 효모, 고초균 등), 동물 세포 등이 포함된다. 특히, 본 발명에서 숙주는 효모가 바람직하고, 이는 사카로미세스(Saccharomyces)속 또는 피히아(Pichia)속일 수 있다. 또한, 상기 숙주의 항생제 감수성 균주 및 자가영양 균주를 사용할 수 있다. 바람직하게는, G418 감수성 균주인Saccharomyces cerevisiaeAH22 균주 (a, his 4, leu 2, can 1),Pichia pastorisGTS115 균주 (his 4, NRRL 기탁번호 Y-15851) 등을 사용할 수 있다.

이종 단백질 생산 숙주에 의해 생산되는 이종 단백질은 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 HSA 등을 예로 들 수 있다.

이와 같은 이종 단백질 생산 숙주는 공지된 방법 또는 그의 유사 방법에 의해 제조될 수 있다.

예를 들면, HSA 생산 숙주 (또는, HSA 생산 균주) 는 종래의 HSA 유전자를 이용한 방법 (JP-A-58-56684, JP-A-58-90515, JP-A-58-150517), 신규 HSA 유전자를 이용한 방법 (JP-A-62-29985, JP-A-1-98486), 합성 시그널 서열을 이용한 방법 (JP-A-1-240191), 혈청 알부민 시그널 서열을 이용한 방법 (JP-A-2-167095), 염색체상에 재조합 플라스미드의 삽입을 포함하는 방법 (JP-A-3-72889), 숙주의 융합을포함하는 방법 (JP-A-3-53877), 메탄올을 함유한 배지내에서 변이를 포함하는 방법, 변이 AOX2 프로모터를 이용한 방법 (JP-A-6-90768, JP-A-4-299984), 고초균에 의한 HSA 의 발현 (JP-A-62-25133), 효모에 의한 HSA 의 발현 (JP-A-60-41487, JP-A-63-39576, JP-A-63-74493), 피히아 효모에 의한 HSA 의 발현 (JP-A-2-104290) 등에 의해 제조될 수 있다.

이중, 메탄올을 함유한 배지내에서 변이를 유발하는 방법은 하기와 같이 수행된다. AOX1 프로모터의 조절하에 HSA 를 발현하는 전사 단위를 갖는 플라스미드를 통상적인 방법에 의해, 적당한 숙주, 바람직하게는, 파히아 효모, 구체적으로Pichia pastorisGTS115 균주의 AOX1 유전자 부위내에 도입하여 형질전환체를 수득한다 (참고, JP-A-2-104290). 이 형질전환체는 메탄올을 함유한 배지에서 증식 능력이 약하다. 따라서, JP-A-4-299984 호에 기재된 방법에 따라, 이 형질전환체를 메탄올 함유 배지에서 배양하여 변이를 일으킨 다음, 성장할 수 있는 균주만을 회수한다. 이 때, 메탄올의 농도는 약 0.0001 % 내지 5 % 이다. 배지는 합성 또는 천연 배지일 수 있다. 배양 조건은 15 ℃ 내지 40 ℃, 약 1 시간 내지 1000 시간이다.

형질전환된 숙주를 배양하기 위해 사용되는 배지에 지방산 또는 그의 염, 및 계면활성제가 함유된다면, 다른 성분들에 대해서는 특별히 한정되지 않으며, 이 분야에서 공지된 배지가 통상 사용된다. 지방산 또는 그의 염, 및 계면활성제를 함유한 배지에서 형질전환 숙주를 배양함으로써 이종 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있다. 더욱이, 숙주 자체가 분비하는 효소는 이종 단백질의 분해를 억제하는 것으로 추측된다.

지방산의 예로는, 바람직하게는 탄소수가 10 내지 26 인 것이 포함된다.

상기 지방산의 예로는 포화 및 불포화 지방산, 예를 들면, 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 올레산, t-바센산(t-vaccenic acid), 리놀레산, 리놀렌산, 리놀레산, 아라키돈산 등이 포함된다. 상기 지방산의 염은 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등과 같은 알칼리금속염, 알칼리토금속염 및 유기 아민염이며, 올레산 또는 그의 염을 함유한 배지가 바람직하다.

배지중 지방산의 함량은 약 0.01 내지 10 w/v%, 바람직하게는 약 0.2 내지 5 w/v% 이다.

본 발명에서 사용되는 계면활성제는, 바람직하게는 100 내지 100,000 의 고분자량을 갖는 비이온성 계면활성제이다.

상기 비이온성 계면활성제의 예로는 폴리알킬렌 글리콜 (예를 들면, 1,000 내지 10,000, 바람직하게는 2,000 내지 6,000 의 평균분자량을 갖는 폴리프로필렌 글리콜), 폴리옥시-알킬렌 공중합체 (예를 들면, 100 내지 100,000, 바람직하게는 1,000 내지 30,000 의 평균분자량을 갖는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 수소화 피마자유 폴리옥시알킬렌 유도체 [예를 들면, 수소화 피마자유 폴리옥시에틸렌-(20)-에테르, 수소화 피마자유 폴리옥시에틸렌-(40)-에테르, 수소화 피마자유 폴리옥시에틸렌-(100)-에테르 등], 피마자유 폴리옥시알킬렌 유도체 [예를 들면, 피마자유 폴리옥시에틸렌-(20)-에테르, 피마자유 폴리옥시에틸렌-(40)-에테르, 피마자유 폴리옥시에틸렌-(100)-에테르 등], 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르 (예를 들면, 폴리옥시에틸렌소르비탄 일올레산염, 폴리옥시에틸렌소르비탄 일스테아르산염, 폴리옥시에틸렌소르비탄 일팔미트산염, 폴리옥시에틸렌소르비탄 일라우르산염 등), 소르비탄 지방산 에스테르, 알킬페놀폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌소르비트 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유, 폴리글리세린 지방산 에스테르 등이 포함된다. 특히, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 공중합체 (상품명 'Pluronic' 등), 또는 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르 (상품명 'Tween' 등) 이 함유된 배지가 바람직하다.

배지중 계면활성제의 함량은, 바람직하게는 0.5 g/ℓ이하이다.

배지는 합성 배지 또는 천연 배지일 수 있고, 바람직하게는 합성 배지이다. 이는 고체 배지 또는 액체 배지일 수 있고, 바람직하게는 액체 배지이다. 예를 들면, 합성 배지에는 일반적으로, 탄소원으로서 각종 다당류, 질소원으로서 우레아, 암모늄염, 질산염 등, 미량 영양소로서 각종 비타민, 뉴클레오타이드 등, 및 무기염 (예를 들면, Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn, Co, Cu 등) 이 함유된다. 배지의예로는 YNB 액체 배지 [0.7% 효모 질소 염기 (Difco 사 제조), 2% 글루코스] 등이 포함된다. 천연 배지의 예로는 YPD 액체 배지 [1% 효모추출물 (Difco 사 제조), 2% 박토펩톤 (Difco 사 제조), 2% 글루코스] 등이 포함된다. 메탄올을 이용하는 숙주를 사용할 때에는, 메탄올을 함유한 배지를 사용할 수 있다. 이 경우, 메탄올의 농도는, 바람직하게는 약 0.01 내지 5 % 이다.

본 발명에서 사용되는 배지는 지방산 또는 그의 염, 및 계면활성제를 종래의 공지된 배지에 첨가함으로써 용이하게 제조할 수 있다.

다른 배양 조건은 종래의 방법에서 사용하는 것과 유사하다.

배양 온도는 예를 들면, 15 ℃ 내지 40 ℃, 일반적으로 20 ℃ 내지 37 ℃ 이다. 숙주가 효모일 때에는 20 ℃ 내지 30 ℃ 가 바람직하고, 숙주가 박테리아일 때에는 30 ℃ 내지 37 ℃ 가 바람직하다. 배양 시간은 일반적으로 약 1 시간 내지 1000 시간이다.

배양은 정치 또는 진탕, 교반 또는 통기와 함께, 회분(回分)배양 또는 유가(流加)배양 또는 연속배양에 의해 수행되며, 퍼멘터(fermenter)를 사용한 회분배양이 바람직하다. 예를 들면, 고농도의 글루코스를 유가배지에 나누어 첨가하여, 생성되는 세포에 대해 고농도의 기질 저해를 방지함으로써, 고농도의 세포 및 산물을 수득하는 방법 (JP-A-3-83595) 등이 있다.

상기 배양에 앞서 전배양을 수행하는 것이 바람직하다. 전배양을 위한 배지는 예를 들면, YNB 액체 배지 또는 YPD 액체 배지일 수 있다. 전배양의 조건은 바람직하게는, 10 시간 내지 100 시간의 배양시간, 효모의 경우 약 30 ℃, 박테리아의 경우 약 37 ℃ 의 온도이다.

배양 종결후, 이종 단백질을 배양물부터 분리 및 정제하는 공지된 방법에 의해 회수한다. 여기서, 배양물은 이종 단백질을 함유할 수 있는 임의의 물질, 예를 들면, 배양 배지, 이종 단백질 생산 숙주 등, 숙주의 배양에 의해 수득되는 기타 물질, 구체적으로 배양상청액, 배양여액, 박테리아 세포, 세포 등을 의미한다.

본 발명은 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명되며, 이에 한정되지는 않는다.

실시예 1

(1) 사용되는 박테리아 균주의 제조

돌연변이 AOX2 프로모터 [개시 코돈의 상류 255번째 뉴클레오타이드가 T 에서 C 로 바뀐 천연 AOX2 프로모터 (YEAST, 5, 167-177 (1988), 또는 Mol. Cell Biol., 9, 1316-1323 (1989))] 를 이용하여, HSA 발현을 위한 플라스미드 pMM042 를 만들고,Pichia pastorisGTS115 균주내에 도입하여 형질전환 UHG42-3 균주를 수득한다 (JP-A-4-29984).

(2) 배지의 조성

전배양을 위해 YPD 배지 (2% 박토펩톤, 1% 효모추출물, 2% 글루코스) 를 사용한다. 주배양에 사용되는 회분배지의 조성은 표 1 에, 유가배지의 조성은 표 2 에 나타내었다. 표 1 및 표 2 의^*2 의 용액의 조성은 표 3 에 나타내었다. 표 1 및 표 2 에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 사용되는 회분배지 및 유가배지의 올레산 함량은 0.5 w/v% 로 조정하였다.

회분배지의 조성

성분	함량 (1/ℓ)
글리세롤	50.0 g
H₃PO₄(85%)	14.0 ㎖
CaSO₄·2H₂O	0.6 g
K₂SO₄	9.5 g
MgSO₄·7H₂O	7.8 g
KOH	2.6 g
바이오틴 용액 (^*1)	1.6 ㎖
YTM 용액 (^*2)	4.4 ㎖
올레산	5.0 g
^1: 바이오틴 0.2 g/ℓ,^2: 표 3 참조

유가배지의 조성

성분	함량 (1/ℓ)
YTM 용액 (^*2)	2.0 ㎖
올레산	5.0 g
메탄올	1000.0 ㎖
^*2: 표 3 참조

YTM 용액의 조성

성분	함량 (1/ℓ)
FeSO₄·7H₂O	65.0 g
CuSO₄·5H₂O	6.0 g
ZnSO₄·7H₂O	20.0 g
MnSO₄·4.5H₂O	3.0 g
H₂SO₄	5.0 ㎖

(3) 퍼멘터를 이용한 배양 방법

① 전배양

박테리아 세포 현탁액 (1 ㎖, 약 OD₅₄₀≒ 약 10) 을 YPD 배지 (50 ㎖) 에 접종하고, 30 ℃ 에서 24 시간 동안 진탕 배양한다.

② 주배양

전배양물 (14 ㎖) 을 회분배지 (700 ㎖) 에 접종하고, 미니자퍼멘터(mini-jar fermenter)에서 통기 교반 배양한다. 배양 온도는 25 ℃, pH 는 5.8 로 한다. 폴리옥시알킬렌 계면활성제인 Adekanol LG-109 (Asahi Denka Kogyo 제조) 을 배지에 0.4 g/ℓ 의 농도로 첨가한다.

회분배양에서, 효모가 충분히 높은 밀도로 증식하고, 배지중의 글리세롤이소비되면, 유가배지를 첨가하고 360 시간 배양하여 HSA 를 생산하도록 한다.

배양 종결후, 배양물을 견본으로 만든 다음, HSA 의 생산량을 하기 실시예에 기재된 방법에 의해 측정한다. 그 결과, 함량은 올레산을 첨가하지 않았을 때의 생산량을 100 % 로 하였을 때 114 % 이었다.

실시예 2

유가배지의 올레산 농도를 1 w/v% 으로 조정한 것을 제외하고 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 배양한다. HSA 생산량은 125 % 이었다.

실시예 3

유가배지의 올레산 농도를 5 w/v% 으로 조정한 것을 제외하고 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 배양한다. HSA 생산량은 127 % 이었다.

실시예 4

유가배지의 계면활성제를 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체인 Pluronic L-61 (평균분자량 2,000, 에틸렌옥시드:프로필렌옥시드=10:90, Asahi Denka Kogyo 제조) 로 한 것만 제외하고 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 배양한다.

참고예HSA 농도의 정량분석

회수한 배양물의 일부를 원심분리하여 투명해진 후 상청액을 여과하고, HPLC 에 의한 젤 여과 분석에 의해 정량 분석한다.

본 발명에 따라, 이종 단백질 생산 숙주가 생산하는 이종 단백질의 양을 증가시킬 수 있고, 숙주 자체가 분비하는 효소에 의해 이종 단백질의 분해를 저해할 수 있으며, 이로써 회수한 이종 단백질의 양을 증가시킬 수 있다. 본 발명은 지방산 또는 그의 염, 및 계면활성제를 함유한 배지중에서 이종 단백질 생산 숙주를 배양하는 것을 특징으로 하며, 용이하고 간단한 방법이다.

본 발명은 일본 특허 출원 9-85064 호를 토대로 하였으며, 그 내용을 참고로 첨부하였다.

Claims

탄소수가 10 내지 26 인 지방산 또는 그의 염, 및 분자량 100 내지 100,000 의 비이온성 계면활성제를 함유한 배지내에서 유전자 조작에 의해 제조된 효모를 배양하고, 배양물로부터 HSA (Human Serum Albumin)를 회수하는 것을 특징으로 하는 이종 단백질의 제조 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 지방산 또는 그의 염이 0.01 내지 10 w/v% 의 농도로 배지에 함유된 것을 특징으로 하는 제조 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 계면활성제가 0.5 g/ℓ이하의 농도로 배지에 함유된 것을 특징으로 하는 제조 방법.