JP3470135B2 - 成長ホルモンの結晶体を製造する方法およびそれにより得られる結晶体 - Google Patents

成長ホルモンの結晶体を製造する方法およびそれにより得られる結晶体

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は成長ホルモン（GH）の結晶体またはその機能
的派生物を製造する方法に関する。本発明はまた成長ホ
ルモンの結晶体およびそれらを含有する組成物に関す
る。
成長ホルモンはヒト成長ホルモン（hGH）、牛成長ホ
ルモン（bGH）、魚および豚成長ホルモン（pGH）のごと
き人間および動物両方に存在し得る。
hGHは191個のアミノ酸の単一鎖からなる蛋白質であ
る。分子は２つの二硫化物ブリッジにより架橋されかつ
単量体形状は22kDaの分子量を有する。しかしながら、
下垂体ヒト成長ホルモンは同質ではない。例えば、同一
遺伝子から製造された小さい20kDahGH変異体もまた知ら
れている。妊娠中胎盤により発現される「基本hGH」変
異体（hGH−Ｖ）は別個の遺伝子の生成物であるところ
の他の類似物である。22kDahGHと同様に191個のアミノ
酸からなるが、しかし種々の位置においてそれらの13個
が異なる。例えば、ビューリー・ティーエー氏等著、19
75年、酵素学の進歩、第42巻、第73頁乃至166頁および
フランケン・エフ氏等著、臨床内分泌および新陳代謝ジ
ャーナル、1988年、第66巻、第1171頁乃至第1180頁参
照。
組換えhGH（22kDa）は数年来市場で入手可能である。
これは人間の組織から製造された製品がクロイツフェル
トーヤコブ病の病原体のごとき感染性病原体を含有する
ため下垂体派生製品より好適である。２種類の治療に有
用な組換えhGH製品が市場に存在しており、そのうちの
１つは、例えばカビ・ファーマシア・アクチボラーグ社
製のジエノトロピン（商標）およびＮ終端で追加のメチ
オニン残留物を有する類似物、例えばソマトノーム（商
標）である。
hGHは下垂体低下の矮小発育症またはターナー症候群
の患者における直線成長を刺激するのに使用されている
が、しかし他の適応症も示唆されている。
蛋白質の安定性は一般に製薬産業における問題であ
る。
この問題は冷凍乾燥のごとき種々の乾燥方法において
蛋白質を乾燥することによりしばしば解決された。蛋白
質はその後乾燥された形状において分配されかつ貯蔵さ
れた。患者は使用前に溶媒中で乾燥された蛋白質を元に
戻さねばならず、使用前に蛋白質を元に戻すことは不利
点でありかつ患者にとって不便である。
凍結乾燥方法はコストがかかりかつ時間を浪費する工
程であり、そして蛋白質の製品を大量生産するとき、こ
の工程が回避され得るならば大きな利点である。
成長ホルモン例えばhGHの毎日の注入を必要とする患
者に関して、とくに患者が子供であるとき、製品が扱い
易いこと、投与し易いこと、および注入し易いことが重
要である。凍結乾燥hGHの復元は用心と慎重さを必要と
し、好ましくは回避させねばならないが、しかし今日利
用し得るただ１つの方法である。
この問題の種々の解決策が開示されているが、いまま
でこのような製品は市場に出現していない。
ジェネテック社の国際特許出願公開第WO89/09614号公
報において、グリシン、マニトールおよび緩衝剤からな
るhGHの安定化した調合が開示されており、好適な実施
例においてポリソルベート80のごとき非イオン表面活性
剤が添加されている。燐酸ナトリウムが緩衝物質として
示唆されている。その調合は凍結乾燥調合においてかつ
復元時において増加した安定性を有する。
溶液中で成長ホルモンを投与する他の可能性はインタ
ーナショナル・ミネラルズ・アンド・ケミカル・コーポ
レーション社のヨーロッパ特許第211601号明細書によれ
ばポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンを含有す
るブロック共重合体を添加することにある。この解決策
は動物に投与した時にその放出を長時間延長させること
ができる。
GHの安定性および製造の問題を迂回するための異なる
方法が本明細書に開示されている。
結晶化により成長ホルモンを製造する新たな方法が達
成され得る。
成長ホルモンの結晶体はまた、例えば種々の型の注入
可能な懸濁液、インプラントおよび局所用調合のごとき
ホルモンの種々の新規な調合に使用され得る。
成長ホルモンの結晶化は以前には工業的方法において
実施することができなかった。
クラークソン氏等は分子生物学ジャーナル、1989年、
第208巻、第719頁乃至第721頁において、前述したもの
と異なる、３つの異なる結晶化方法について報告してい
る。
以下の方法が使用れた、すなわち、 １）緩衝液中にエタノールまたはメタノールを使用し、
懸滴で、１年後に10-3mm3の大きさおよび134オングスト
ローム（0.0134ミクロン）の細胞寸法を有する四角形両
錐体が得られた。
２）緩衝液中にアセトンを使用し、懸滴で、３〜14日後
に２×10-3mm3の大きさを有する三角形プリズムが得ら
れた。
３）パラアルデヒドを使用し、バッチ方法で、数週間後
に２×10-3mm3の大きさを有する斜方晶系平行六面体が
得られた。著者は彼らが大きな単結晶を得ることに成功
しなかったと解説した。
ノヴオ・ノルディスカ・アクテセレスカベット社の国
際特許出願公開第WO92/00998号公報において、化学的に
安定で生物学的活性の成長ホルモンカチオン結晶体を製
造する方法が開示されている。この方法は、５〜８の間
のpHでGHの溶液にカチオンを添加し、０〜30℃の温度で
結晶体を生成させその結晶体を分離する工程からなって
いる。
得られた結晶体はカチオンGH結晶体である。
好適なカチオンはZn2+でありそして好ましくは有機溶
媒がカチオンとともに添加される。
得られた結晶体は常にカチオンを包含しそして小さ
い。例において亜鉛含有結晶体の長さは３〜12ミクロン
の間で変化する。
サイエンス、第253巻、第545頁乃至第548頁、1991年
のビー・シー・カニンガム氏等著の論文中に、亜鉛によ
るhGHの二量重合が開示されている。
hGHを投与するための良好な方法について市場で要望
がある。この要望に合う幾つかの方法は注入溶液を使用
するか、または例えば懸濁されたhGHの結晶体として注
入可能な沈澱調合を備えることにある。
hGHの結晶体と緩衝液とともにかつ保存料とともにま
たは保存料なしで懸濁液においてまたは水性の注入可能
な溶液において使用され得る。
それらはまた例えば油性または水性懸濁液としてまた
はインプラントとして沈澱調合において使用させること
ができ、従ってゆっくりした薬剤放出を付与する。
結晶体が十分に大きい場合に、それらは粉末として使
用することができ、表面、例えば傷上に分散させること
ができる。非常に小さい粒子はそれらが埃を形成するの
で適切でなく、直接使用に用いることができない。
薬学的観点から容認できないカチオンまたはメタノー
ル、エタノール、アセトンまたはパラアルデヒドのごと
き溶媒の添加なしに純粋な活性GH結晶体を製造するため
の新規な方法を発見した。
この新規な方法により結晶体は非常に短時間に形成さ
れ得る。有名な化合物の幾つか（例えば例22参照）を使
用するとき、結晶体は瞬時に形成され、他のものに関し
ては１時間以内で形成された。これは数週間後のみ結晶
体を製造するカールソン等により示された方法と比較さ
せることができる。GHの水性溶液に一般構造（１）を有
する化学化合物を添加することにより、GHの結晶体は容
易にかつ迅速に形成され得る。添加は好ましくは化合物
を含有する溶液による透析またはクロマトグラフィによ
る最後の純化工程において実施され得る。
この方法によれば条件および時間に依存して結晶体の
大きさを変化させることができ、それはhGHの投与のた
めに異なる調合を製造するときに大きな利点である。
結晶体中で得られたGHは80％以上の単量体GHを通常含
有する材料である。
カチオンの回避により結晶体を製造するための迅速な
方法があることは、hGHの製造において大きな利点であ
る。この方法は純化および製造のための技術的な過程に
おいて使用することができる。
発明の開示 成長ホルモン（GH）またはその機能的派生物の結晶体
を製造するための新規な方法は、 ｉ）GHまたはその機能的派生物を緩衝剤と一般式
（１）、 Ar−〔−CR1R2−〕ｎ〔−CR3R4−〕ｍ−CR5R6−OH
（１） を有する化学化合物とからなる水性溶液と混合し、式
中、Arはフェニル、アルキル置換フェニル、ナフチル、
アルキル置換ナフチル、R1〜R6はH,OHまたはアルキル、
ｎおよびｍは０または１であり、 ii）定温放置し、 iii）公知の方法により結晶体を単離する構成を包含す
る。
定温放置は当業者に公知の種々のすべての型式の結晶
化方法を意味する。
実験室規模において懸滴方法が好適であるが、工業規
模において最も容易な方法は溶液をそのままにすること
による。化学物は好ましくは、ベンジルアルコール、２
−メチルベンジルアルコール、１−（１−ナフチル）エ
タノール、フェニルエタノール、１−フェニル−１−プ
ロパノール、２−フェニル−２−プロパノール、３−フ
ェニル−１−プロパノール中から選ばれる。
本発明はまた緩衝剤の溶液からGHの結晶体を製造する
ために一般式（１）を有する化学化合物の使用に関す
る。
ベンジルアルコールが使用されるとき好適な量は少な
くとも１％である。緩衝剤は例えば２ないし50mM、好ま
しくは５ないし20mMかつとくに5mMまたは10mMの濃度の
クエン酸塩にすることができる。緩衝剤はまたクエン酸
ナトリウムおよび燐酸ナトリウムの混合物にすることが
できる。水溶液はグリシン、リシン、マニトール、およ
び／またはグリセロールから構成することができる。
5.8ないし6.3かつ好ましくは6.2の初期pHが良好な結果
を付与した。結晶体の調合は時間、pHおよび温度に依存
している。20℃ないし30℃の間の温度で結晶体は通常迅
速に、時には瞬時にかつ多くは１時間以内に形成され
る。
本発明の成長ホルモンまたはその機能的な類似物の結
晶体は少なくとも20ミクロンの長さを有する針、三角形
形状、立方体または平行六面体の形状である。幾つかの
場合において得られた結晶体は同様に1mm以上であっ
た。好ましくは長さは少なくとも50〜2000ミクロンかつ
より好ましくは100〜300ミクロンである。本発明の結晶
体はかくして以前に得られた結晶体より大きい。
本発明による結晶体は種々の投与形態、例えば局所、
鼻、肺、経口、直腸およびおよび非経口の人間および家
畜用途において有用である。
本発明は本発明による結晶体からなる注入用懸濁液、
沈澱調合および乾燥調合にある。本発明はまた本発明の
調合を投与することにより成長ホルモンまたはその機能
的類似物を必要とする患者の治療方法および成長ホルモ
ンまたはその機能的類似物を必要とする患者の治療用薬
剤の製造のためのGH結晶体の使用に関する。
本発明の方法はGHの純化方法において使用され得る。
本発明の結晶体は生物学的に活性である。
成長ホルモンはヒト成長ホルモン（hGH）、牛成長ホ
ルモン（bGH）、魚および豚成長ホルモン（pGH）のごと
く人間および動物の両方に存在し得る。
成長ホルモン（GH）は自然発生および組換えGH（rG
H）の両方を意味する。機能的類似物は動物中の成長ホ
ルモンと同一の治療効果を有する化合物を意味する。組
換えGH（rGH）が好ましい。
GHの結晶体を使用することにより調合は容積当たりの
GHの量に制限を付与する使用担体／緩衝剤中のその溶解
度に依存しない。これは本発明の結晶体の明らかな利点
である。
乾燥組成物、懸濁液または沈澱調合において薬剤供給
系におけるGHの容積当たりの量は非常に高くなる。
図面の簡単な説明 第１図は形成された結晶体を示す顕微鏡検査の拡大図
である。
発明を実施するための最良の形態 例１〜20 調合研究用材料はジエノトロピン（商標）方法におけ
る薬剤物質であった。純化過程後得られた溶出液は約36
IU/mlを有する。
調合は前の純化工程において使用された塩を除去しか
つ最終調合の成分を添加する目的に役立つゲル濾過によ
り実験室規模において実施された。コラムセファデック
スＧ−25（ファーマシア製）は調合緩衝剤で平衡させら
れた。クロマトグラフィは＋７℃で実施された。
所望の蛋白質濃度が調合緩衝剤で希釈することにより
達成された。溶液は殺菌濾過されかつガラスカートリッ
ジ内に分配された。
種々の溶液における針の形成は例１〜20および22に追
随された。得られたhGH結晶体は特性を付与した。
方法 分離 結晶体は遠心分離されかつ懸濁液がピペットにより取
り去られた。残留物は水で６回、その後アセトンで３回
そして最後にジエチルエーテルで２回遠心分離された。
結晶体が乾燥された。
ポリペプチド大きさ分布（SDS−PAGE） ソマトロピン、hGHの製造において蛋白質はSDS−蛋白
質の負に帯電された分子錯体を発生するためにナトリウ
ムドデシル燐酸塩（SDS）により変性された。単離は次
いでSDSの存在においてポリアクリルアミドゲル（PAG
E）中の電気泳動により分子の大きさにしたがって得ら
れた。hGHの関連のポリペプチド大きさ分布は銀焼き付
けポリペプチド帯の濃度計走査により定量された。
薄層クロマトグラフィ（TLC） 薄層クロマトグラフィはシリカゲル板（メルクwt571
5）上で実施されかつｎ−ブタノール：酢酸：水：エチ
ルアセテート、1:1:1:1において展開された。
評価は全般的なスクリーニングに関して254nmでのUV
光、主要アミノ基および過マンガン酸カリウム試薬に関
してのニンヒドリン反応からなる３つの異なる目視技術
に基礎を置いた。
ELISA、免疫吸着剤分析評価 hGHに対して向けられた免疫吸着剤純化ラビット抗体
で被覆されたマイクメタイター板（デンマーク国所在の
ヌンク・アクチェセレスカベット社製）血清サンプル、
基準（標準）および対照標準により定温放置された。洗
浄後ファブアンチhGH−ビオチン共役が添加されかつ固
体相抗原に結合させた。固体相についてのHRPの量が次
いで、基板H2O2および3,3′,5,5′，−テトラ−メチル
ベンジジン（TMBZ）および過ホウ酸塩を使用して決定さ
れる。最終酸化生成物は450nmでその吸収より測定され
る。検出し得る最小濃度は0.4mU/Lである。0.72mU/Lで
分析評価間および分析評価内の変化率はそれぞれ2.3お
よび9.0％でありそして4.07mU/Lにおいて変化はそれぞ
れ2.2および11％である。
HPLC AshaiPac−OD550、逆相/TRIS（pH8.5）−ｎ−ブタノ
ール、イソクラティック 検出:210および280nm ゲル濾過 スーパーデックス75/0.05M燐酸塩緩衝剤pH7.4 検出:280nm 目視検査 溶液の出現がPh.Eur.第二Edにより目で検査された。
pH pHはガラスおよびカロメル電極により測定された。
例 １ ２ ３ ４ ５ ６ hGHIU/ml 20 20 20 20 20 20 Na−クエン酸mM 10 10 10 10 − ５ クエン酸−燐酸★ − − − ｘ グリシンmM 12 − 12 − − 12 リシンmM − − − − − − マニトールmM 150 150 − − − 130 グリセロール − − 150 150 130 ベンジルアルコール％ １ １ １ １ 1.25 １ 容積ml １ １ １ １ １ 3.4 出発値： pH 6.3 6.3 6.2 6.2 6.1 6.2−6.3 目視検査 静澄 静澄 静澄 静澄 静澄 静澄 30℃で３週間貯蔵後の結果 pH 6.3 6.3 − − − 6.2 目視検査 静澄 静澄 結晶 結晶 結晶 結晶 例 ７ ８ ９ 10 11 hGHIU/ml 20 20 20 20 20 Na−クエン酸mM 10 10 10 − − クエン酸−燐酸★ − − − ｘ ｘ グリシンmM 12 − − 12 − マニトールmM 150 150 − 150 150 グリセロール − − 150 − − ベンジルアルコール％ １ １ １ １ １ 容積ml １ １ １ １ １ 出発値： pH 6.2 6.2 6.2 6.2 6.2 目視検査 静澄 静澄 静澄 静澄 静澄 30℃で３週間貯蔵後の結果 pH 6.3 6.3 6.3 6.4 6.3 目視検査 結晶 結晶 結晶 結晶 結晶 例 12 13 14 15 16 hGHIU/ml 20 20 20 20 20 Na−クエン酸mM − − 10 10 10 クエン酸−燐酸★ ｘ ｘ グリシンmM 12 − − 29 − リシンmM − − 12 − 29 マニトールmM − − 130 130 130 グリセロール 150 150 − − − ベンジルアルコール％ １ １ 1.5 1.5 1.5 容積ml １ １ １ １ １ 出発値： pH 6.2 6.2 6.2 6.2 6.1 目視検査 静澄 静澄 op★★ op★★ op★★ 30℃で３週間貯蔵後の結果 pH 6.3 6.3 目視検査 結晶 結晶 ★ｘは1.7mM Naクエン酸塩および6.7mMNa燐酸塩緩衝
剤系の混合物を意味する。
★★はオパールのような光彩を放つことを意味する。
例 17 18 19 20 hGHIU/ml 20 ４ 20 20 Na−クエン酸mM − 10 ５ − クエン酸−燐酸★ ｘ − − ｘ グリシンmM 12 12 12 12 マニトールmM 250 250 250 250 ベンジルアルコール％ − − − １ 容積ml １ ３ １ １ 出発値： pH 6.3 6.3 6.1 6.3 目視検査 静澄 静澄 静澄 静澄 30℃で３週間貯蔵後の結果 pH 6.3 6.3 目視検査 静澄 静澄 ★ｘは1.7mM Naクエン酸塩および6.7mMNa燐酸塩緩衝
剤系の混合物を意味する。
討論 通常ベンジルアルコールからなる調合は6.1ないし6.3
のpH範囲において結晶体を付与しかつベンジルアルコー
ルなしの溶液はこのpH範囲内で結晶体を付与しなかっ
た。調合１および２はベンジルアルコール中の結晶体の
形成のための臨界値であると思われるpH6.3でベンジル
アルコールの添加にも拘わらず静澄であった。
結果および個性 顕微鏡検査 結晶体は異なる長さの針の形であった。最大の結晶体
は約0.3×0.03mmであった。第１図参照。
溶融点決定 溶融点はライツ−ヴエツラー顕微鏡で行われた。結晶
体は、それらが不当に色付けされ始めたとき、230℃ま
で完全であった。約290℃で結晶体は黒くなったが溶融
しなかった（熱分解）。
溶解度 結晶体はジクロロメタン、アセトニトリル、エタノー
ル、ジメチルフォルムアミド、ジエチルエーテルのごと
き有機溶媒中に不溶であった。結晶体は水および水中の
70％エタノールに溶解し難いが１％酢酸、6MHClのごと
き0.1M燐酸緩衝剤、pH8のごとき塩基に溶解可能であっ
た。
薄装クロマトグラフィ（TLC） 10％酢酸中に溶解された結晶体および緩衝剤成分、す
なわち、クエン酸、マニトール、グリシンおよびベンジ
ルアルコールが研究された。
結晶サンプルはUV光を吸収しかつ芳香族基、アミノ基
および酸化基を示す、ニンヒドリンおよび過マンガン酸
試薬により正の反応を示した。
加水分解 結晶サンプルおよびhGH基準の6MHCl1,110℃、20時間
の加水分解。TLCを使用することにより分析は同一点を
示した。
HPLG,ゲル濾過、SDS−PAGE,IEF 結晶サンプルはhGH基準とほぼ同一であった。
アミノ酸分析 結晶体について得られた実験データは理論値ならびに
hGH基準サンプルと良好に一致した。以下の表を参照。
成分 理論値 結晶体 Asp 20 19.9 Thr 10 9.7 Ser 18 17.8 Glu 27 26.8 Pro 8 8.2 Gly 8 8.2 Ala 7 7.0 Half−cys 4 3.2 Val 7 7.2 Met 3 3.0 Ile 8 8.2 Leu 26 26.2 Tyr 8 8.2 Phe 13 13.0 His 3 3.1 Lys 9 9.3 Trp 1 ★ Arg 11 11.1 ★定量されない 0.22mgの量に基づいて、結晶サンプルの蛋白質含量は
84％であった。基準材料（0.45mg）中の含量は91％であ
った。
例21 結晶体は、 20IU/ml hGH 5mM Na−クエン酸 12mM グリシン 250mM マニトールおよび １％ベンジルアルコール を6.4のpHにおいて含有する溶液中に形成されなかっ
た。
より多くのベンジルアルコール（すなわち＞１％）の
添加により結晶体は迅速に形成された。
６近くにまたは６以下にpHを低減することによっても
結晶体が製造された。
結晶体の形態はpHおよび成長率により変化され得る。
pHが6.3に近いとき結晶体は針および平行六面体のよう
である。
24時間以内で結晶体は0.1ないし0.3mmの長さで約0.00
1ないし0.005mmの厚さに形成される。
pHを変化させることにより結晶体の大きさはかくして
変化され得る。
小さい結晶体が短い時間内に形成される。
例22 他の化学化合物が成長ホルモンの結晶体を形成する可
能性に関して研究された。
調合研究用材料は通常のジエノトロン（商標）方法に
おける薬剤物質であった。純化過程後得られた溶出液は
調合前に約36IU/mlを含有する。
調合は使用された緩衝剤に対して透析により実験室規
模において行われた。
「懸滴」方法が成長ホルモンの結晶用の有用な薬品の
研究のために使用された。
「懸滴」方法は、1991年、オックスフォードに所在の
アイ アール エル新聞社発行、エー・デュクルイック
ス氏およびアール・ジージエ氏著の核酸および蛋白質の
結晶化の実用的アプローチに記載されている。
滴剤の初期容積は５μｌ＋５μｌおよび良好な容積は
1mlであった。実験中使用された緩衝剤は以下の成分を
含んでいた。
以下に示されるような化合物 200mM Na−クエン酸 pH6.2 結果は異なる結晶化薬品により以下のごとくであっ
た。
化合物 結晶体 ベンジルアルコール 大きな単結晶 ±１−（１−ナフチル）エタノール 大きな単結晶 （±）フェニルエタノール 大きな単結晶 ＋フェニルエタノール 大きな単結晶 −フェニルエタノール 大きな単結晶 １−フェニル−１−プロパノール 大きな単結晶 （±）１−フェニル−プロパノール 大きな単結晶 ２−フェニル−２−プロパノール 大きな単結晶 ３−フェニル−１−プロパノール 大きな単結晶 ２−メチルベンジルアルコール 単結晶 使用した結晶化薬品の幾つかに関して結晶体はゆっく
り形成された。±１−（１−ナフチル）エタノールを使
用するとき結晶体は２週間後形成され、そして大きさは
200ないし500ミクロンであった。Na−クエン酸を使用す
る代わりに、またMES−緩衝剤が使用された。結果はNa
−クエン酸を使用するときと同一であった。
しかしながら、より高い濃度の結晶化薬品がクエン酸
が存在しないとき必要とされた。
一般式（１）の範囲外になる他の結晶化薬品が上記と
同一方法において試験されたとき、結晶体は形成されな
かった。
化合物 結晶体 ３−メチル−４−ニトロベンジルアルコール ナシ ２−ニトロベンジルアルコール ナシ ４−ニトロベンジルアルコール ナシ １−ナフトール ナシ ２−ナフトール ナシ フェノール ナシ ベンズアルデヒド ナシ ベンジルアミン ナシ （−）１−フェニル−１−ブタノール ナシ Ｌ−フェニルグリシノール ナシ 例23 結晶体の免疫学的分析が行われた。
結晶体は例１〜例20にしたがって、 20IU/ml成長ホルモン ５ ｍモル Na−クエン酸 12 ｍモル グリシン 130 ｍモル マニトール １％ベンジルアルコール を含有する緩衝剤中で形成された。
形成された結晶体の0.17mgが0.05％ツイーン20を含有
する0.34ml0.05M燐酸塩緩衝塩水、pH7.5中に溶解され
た。溶液は同一緩衝剤中で10段階においてさらに希釈さ
れた。すべての個々の希釈段階が同じもの４通に分析さ
れた。
酵素結合免疫吸収剤分析評価、ELISA、免疫吸収剤分
析評価が溶解された結晶中のrhGHを測定するのに使用さ
れた。ガラス瓶中のrhGHの量は0.15mgであると認められ
た。
例24 生物学的定量 結晶体は上記の例６による溶液から成長させられかつ
ガラス容器中に0.5mlサンプルとして分配された。製造
後溶液は成長すべき結晶体のために１週間５℃で貯蔵さ
れた。それらはさらに結晶体を採取する前に３ヵ月間５
℃で貯蔵された。結晶体が採取された後結晶体を取り囲
む上清は吸い込まれた。結晶体は例６（すなわち、成長
ホルモン以外の例６による組成物）による緩衝剤0.25ml
により２度濯ぎ洗いされた。第２の濯ぎ洗い工程は濯ぎ
緩衝剤を放棄する前に結晶体の遠心分離により終了され
た。残りの結晶体は0.5mlの5mMクエン酸ナトリウム、12
mMグリシンおよび130mMマニトール、pH6.1からなる緩衝
剤中に溶解された。幾つかのサンプルが生物学的定量分
析に使用されるべくプールされた。
ゲル濾過クロマトグラフィは上記手順により製造され
たサンプルについて行われた。成長ホルモンは結晶化か
つその後の溶解度100％単量体であることを示した。
溶解された成長ホルモン（GH）の生物学的定量： 得られたGH結晶体が生物学的に活性であるかどうかを
調べるために下垂体切除されたラットの重量増加評価分
析が行われた。
ラットはデンマーク国に所在のミューレガールト・ア
クテセレスカベット社から購入された。ラットは到着前
の週に下垂体切除されかつそれゆえ内因性の成長ホルモ
ンおよび他の下垂体ホルモンが不足しており、妨げられ
た成長を生じた。ラットは研究室においてかつ評価分析
前に到着時計量された。重量の変化が＜10％のラットが
研究に参入するために受け入れられた。
ラットは次いで任意に15のグループに分割された。そ
れらのラットは４日間毎日２度ヒト組換えGH（4.5IU/ガ
ラス瓶の生物学的潜在力を有するようにWHO80/505に対
して較正された）の集団内標準プレパレートかまたは２
回の投与量でGH結晶から作られた溶液により処置され
た。標準投与量は0.04IU/日および0.16IU/mlであった。
グループは最初の注入（第１日）前にかつ最後の注入
（第５日）後約16時間に計量された。これらの重量間の
差異が計算されかつ潜在力が標準処置グループの動物と
結晶溶液処置の動物の結果を比較することにより決定さ
れた。
結果は以下に示されている（重量増加、g,SD） 投与量 0.04IU/日 0.16IU/日 標準 12.2 8.9 17.7 8.7 GH結晶体 17.3 8.0 21.3 1.7 溶解されたGh結晶体の生物学的潜在力は7.1IU/mlであ
るように認められた。
かくして、溶解GH結晶体はヒト成長ホルモンが生物学
的に生体内で活性であることを立証した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルンデン ロンニー スウェーデン国，エス―178 32 エケ ロ，ロボバーゲン ３ (72)発明者 トム シルッカ スウェーデン国，エス―115 36 スト ックホルム，リンドガータン 15，アイ アイ (72)発明者 ウエスチン ソダール ゲルトラド スウェーデン国，エス―152 57 ソテ ルタルエ，アルプバーゲン 22 (72)発明者 リンドクビスト トマス スウェーデン国，エス―752 31ウプサ ラ，ルサグセスプラナデン34エー (56)参考文献 国際公開92／000998（ＷＯ，Ａ１) Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，1987 年，５，499−500 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，1989年208 （４），719−721 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/61 A61K 38/27 A61P 5/06 C07K 1/02

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】成長ホルモン（GH）の結晶体を製造する方
    法であって、 ｉ）GHを緩衝剤と一般式（１） Ar−〔−CR1R2−〕ｎ−〔−CR3R4−〕ｍ−CR5R6−OH
    （１） を有する化学化合物とからなる水性溶液と混合させ［式
    （１）中、Arはフェニル、アルキル置換フェニル、ナフ
    チル、アルキル置換ナフチル、R1〜R6はH,OHまたはアル
    キル、ｎおよびｍは０または１である。］、 ii）定温放置し、 iii）公知の方法により結晶体を単離することを特徴と
    する成長ホルモンの結晶体の製造方法。
  2. 【請求項２】GHがヒトGHであることを特徴とする請求項
    １に記載の成長ホルモンの結晶体の製造方法。
  3. 【請求項３】GHが組換えヒトGH（rhGH）であることを特
    徴とする請求項２に記載の成長ホルモンの結晶体の製造
    方法。
  4. 【請求項４】化合物がベンジルアルコール、２−メチル
    ベンジルアルコール、１−（１−ナフチル）エタノー
    ル、フェニルエタノール、１−フェニル−１−プロパノ
    ール、２−フェニル−２−プロパノール、３−フェニル
    −１−プロパノール中から選ばれることを特徴とする請
    求項１ないし３のいずれか１項に記載の成長ホルモンの
    結晶体の製造方法。
  5. 【請求項５】化合物がベンジルアルコールであることを
    特徴とする請求項４に記載の成長ホルモンの結晶体の製
    造方法。
  6. 【請求項６】成長ホルモン（GH）を緩衝剤と一般式
    （１） Ar−〔−CR1R2−〕ｎ−〔−CR3R4−〕ｍ−CR5R6−OH
    （１） を有する化学化合物とからなる水性溶液と混合させ［式
    （１）中、Arはフェニル、アルキル置換フェニル、ナフ
    チル、アルキル置換ナフチル、R1R6はH,OHまたはアルキ
    ル、ｎおよびｍは０または１である。］、該混合水溶液
    を定温放置し、そして公知の方法により結晶体を単離す
    ることにより得られた少なくとも20ミクロンの長さを有
    する針、三角形形状、立方体または平行六面形の形状を
    有する成長ホルモンの結晶体。
  7. 【請求項７】GHがヒトGHであることを特徴とする請求項
    ６に記載の成長ホルモンの結晶体。
  8. 【請求項８】GHが組換えヒトGH（rhGH）であることを特
    徴とする請求項７に記載の成長ホルモンの結晶体。
  9. 【請求項９】針が少なくとも50〜2000ミクロン、好まし
    くは100から300ミクロンの長さを有することを特徴とす
    る請求項６に記載の成長ホルモンの結晶体。
  10. 【請求項１０】請求項６ないし９のいずれか１項に記載
    の成長ホルモンの結晶体からなる注射用懸濁液。
  11. 【請求項１１】請求項６ないし９のいずれか１項に記載
    の成長ホルモンの結晶体からなるデポー調合剤。
  12. 【請求項１２】請求項６ないし９のいずれか１項に記載
    の成長ホルモンの結晶体からなる乾燥調合剤。
  13. 【請求項１３】成長ホルモンを必要とする患者の治療用
    の薬剤を製造するために請求項６ないし９のいずれか１
    項に記載の成長ホルモンの結晶体を使用する成長ホルモ
    ンの結晶体の使用方法。
  14. 【請求項１４】請求項１に記載の結晶化方法を特徴とす
    るGHを純化する成長ホルモンの純化方法
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