NO320171B1 - Fremgangsmate for fremstilling av krystaller av veksthormon eller funksjonelle derivater derav, krystaller fremstilt ved fremgangsmaten, anvendelse av kjemisk forbindelse for fremstilling av krystallene, suspensjon for injeksjon, torrformulering og depotformulering som omfatter krystallene, anvendelse av krystallene for fremstilling av medikament og fremgangsmate for rensing av veksthormon. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av krystaller av veksthormon eller funksjonelle derivater derav. Oppfinnelsen angår også krystaller av veksthormon og preparater inneholdende disse.

Veksthormon kan både være humant og animalsk, slik som humant veksthormon, bovint veksthormon, fiske- og grise-veksthormon.

Humant veksthormon er et protein som består av en enkeltkjede av 191 aminosyrer. Molekylet er tverrbundet med to disulfidbroer og den monomere form har en molekylvekt på 22 kDa. Hypofyseveksthormon er imidlertid ikke homogent. En human veksthormonvariant mindre enn 20 kDa produsert fra det samme gen er f.eks. også kjent. Den "basiske humant veksthormon"-variant uttrykt av placenta under graviditet er en annen analog som er et produkt av et separat gen. Som det 22 kDa humane veksthormon består det av 191 aminosyrer, men i forskjellige posisjoner gjennom molekylet er 13 av aminosyrene forskjellige. Se f.eks. Bewley TA et al; Adv Enzymol; 42; 73-166; 1975 og Frankenne F et al; J Clin. Endocrin and Metabol; 66; 1171-80; 1988.

Rekombinant veksthormon (22 kDa) har vært kommersielt tilgjengelig i flere år. Det er foretrukket fremfor de hypo-fyseavledede produkter fordi produktet fremstilt fra humant vev kan inneholde infeksiøse midler, slik som for Creutzfeldt-Jacobs sykdom. To typer av terapeutisk anvendelige rekombinante humane veksthormonpreparater er tilgjengelige på markedet: Det autentiske, f.eks. "Genotropin", Kabi Pharmacia AB, og en analog med en ytterligere metioninrest ved den N-terminale ende, f.eks. "Somatonorm".

Humant veksthormon anvendes for å stimulere lineær vekst hos pasienter med hypopituiær dvergvekst eller Turners syndrom, men andre indikasjoner har også blitt foreslått.

Stabiliteten av proteiner er vanligvis et problem i den farmasøytiske industri.

Problemet er ofte løst ved å tørke proteinet i forskjellige tørkeprosesser slik som frysetørking. Proteinet er deretter fordelt og lagret i tørket form. Pasienten må nødven-digvis rekonstituere det tørkede protein i et løsningsmiddel før anvendelse, hvilket er ufordelaktig og selvsagt et besvær for pasienten.

Frysetørkingsprosessen er et kostbart og tidkrevende prosesstrinn og det ville være meget fordelaktig dersom dette trinn kunne unngås ved fremstilling av et kommersielt produkt av et protein.

For en pasient som behøver daglige injeksjoner av et veksthormon, f.eks. humant veksthormon, og spesielt når pasienten er et barn, er det viktig at produktet er lett å håndtere, dosere og injisere. Rekonstitueringen av frysetørket humant veksthormon krever forsiktighet og påpasselighet og burde fortrinnsvis unngås, men den er den eneste tilgjengelige metode i dag.

Forskjellige løsninger på dette problem er beskrevet, men inntil dags dato har noe produkt ikke kommet ut på marked.

I WO 89/09614, Genentech, beskrives en stabilisert formulering av humant veksthormon omfattende glysin, mannitol og en buffer, og i en foretrukket utførelsesform tilsettes et ikke-ionisk overflateaktivt middel, slik som polysorbat 80. Natriumfosfat foreslås som buffermateriale. Formuleringen har en økt stabilitet i en lyofilisert formulering og ved rekon-stituering.

En annen mulighet for administrering av veksthormon i en løsning er å tilsette en blokk-kopolymer inneholdende poly-oksyetylen-polyoksypropylen, ifølge EP 211 601, International Minerals and Chemical Corporation. Denne løsning tilveie-bringer en forlenget frigivelse ved administrering til dyret.

En annerledes måte for å omgå stabilitets- og produksjonsproblemene med veksthormon er presentert i foreliggende patentsøknad.

Ved krystallisering kan det oppnås en ny produksjons-måte for veksthormon.

Krystaller av veksthormon kan også anvendes i forskjellige nye formuleringer av hormonet, som f.eks. injiser-bare suspensjoner, implantater og topiske formuleringer av forskjellige typer.

Krystallisering av veksthormon har ikke tidligere vært mulig å utføre på en industriell måte.

Clarkson^et al rapporterer i J Mol Biol (1989), 208, 719-721 om tre forskjellige krystalleringsmetoder, forskjellige fra de tidligere beskrevne.

De følgende fremgangsmåter ble anvendt:

1. Hengende dråpe-krystallisering og anvendelse av etanol eller metanol i bufferen hvori tetragonale bipyramider ble erholdt med en størrelse på 10~<3> mm<3> og en celledimensjon på 134 Å (0,0134 pm) etter opp til ett år. 2. Hengende dråpe-krystallisering ved anvendelse av aceton i bufferen hvori trigonale prismer ble erholdt med en størrelse på 2 x 10~<3> mm<3> etter 3 til 14 dager. 3. Satsvis krystallisering ved anvendelse av par-aldehyd og oppnåelse av ortorombiske parallellepipeder med en størrelse på 2 x 10"<3> mm<3> etter flere uker. Forfatterne kommen-terte at de ikke lyktes å erholde store enkle krystaller.

I WO 92/00998, Novo Nordiska A/S, er det beskrevet en metode for fremstilling av kjemisk stabile og biologisk aktive veksthormon-kationkrystaller. Metoden omfatter trinnene: tilsetning av kationer til en løsning av veksthormon ved en pH mellom 5 og 8, krystallvekst ved en temperatur på 0-30 °C og isolering av krystallen. Den erholdte krystall er en kation-veksthormonkrystall.

Det foretrukne kation er Zn<2+> og fortrinnsvis tilsettes et organisk løsningsmiddel sammen med kationet.

De erholdte krystaller inkluderer bestandig et kation og er små. I eksemplene varierer lengden av de sinkinnehold-ende krystaller mellom 3 og 12 mikron.

I en artikkel av B C Cunningham et al in Science, vol 253, 545-548, 1991, beskrives dimerisering av humant veksthormon ved hjelp av sink.

Det foreligger et behov på markedet for bedre måter for administrering av humant veksthormon. Noen måter for å møte dette behov er enten å tilveiebringe injeksjonsløsninger ferdige til bruk eller en injiserbar depotformulering, f.eks. i form av suspenderte krystaller av humant veksthormon.

Krystaller av humant veksthormon kan anvendes i en suspensjon eller i en vandig injiserbar løsning sammen med

buffere og med eller uten konserveringsmidler.

De kan også anvendes i depotformuleringer, som f.eks. en oljesuspensjon eller en vandig suspensjon, eller som et implantat, og således gi en langsom frigivelse av medika-mentet .

Dersom krystallene er store nok kan de anvendes som pulver og utspres på en overflate, f.eks. på et sår. For små partikler er ikke egnede fordi de danner støv og ikke kan anvendes direkte.

Ved foreliggende oppfinnelse er det meget overrask-ende funnet en ny fremgangsmåte for fremstilling av rene, aktive veksthormonkrystaller uten tilsetning av kationer eller løsningsmidler, slik som metanol, etanol, aceton eller par-aldehyd, hvilke ikke er akseptable fra et terapeutisk syns-punkt .

Ved denne nye fremgangsmåte kunne krystallene dannes innen et meget kort tidsrom. Ved anvendelse av noen av de nevnte forbindelser, se eksempel 22, ble krystallene dannet umiddelbart og noen andre innen én time. Dette kan sammen-lignes med fremgangsmåten presentert av Carlsson et al. som kun produserer krystaller etter flere uker. Ved tilsetning av en kjemisk forbindelse med den generelle struktur (I) til en vandig løsning av veksthormon, kan krystaller av veksthormon lett og hurtig dannes. Tilsetningen kan fortrinnsvis utføres i det siste rensingstrinn ved dialyse eller kromatografi med løsningen inneholdende forbindelsen.

Ved denne fremgangsmåte er det mulig å variere størr-elsen av krystallene avhengig av betingelsene og tid, hvilket er en stor fordel ved fremstilling av forskjellige formuleringer for administrering av humant veksthormon.

Erholdte veksthormoner som krystaller er et materiale som vanligvis inneholder mer enn 80 % monomert veksthormon.

Det kan være en stor fordel ved fremstilling av hGH at det foreligger en hurtig metode for fremstilling av krystaller og med unngåelse av kationer.

Denne fremgangsmåte kan også anvendes i den tekniske prosess for rensing og produksjon.

Den nye fremgangsmåte for fremstilling av krystaller av veksthormon eller funksjonelle derivater derav inkluderer således trinnene:

i) blanding av veksthormon eller funksjonelle derivater derav med en vandig løsning omfattende en buffer og en kjemisk forbindelse med den generelle formel (I):

hvori

Ar er fenyl, alkylsubstituert fenyl, naftyl, alkylsubstituert naftyl,

Ri-R6 er H, OH eller aikyl,

n og m er 0 eller 1,

ii) inkubasjon,

iii) isolering av krystallene ved kjente metoder.

Ved inkubasjon er ment alle forskjellige typer krys-talliseringsprosesser kjent for fagmannen. I laboratorieskala er den hengende dråpemetode foretrukket, men i en industriell skala er den letteste måte å la løsningen henstå. Forbindelsen er fortrinnsvis valgt blant benzylalkohol, 2-metylbenzylalkohol, 1-(1-naftyl)etanol, fenyletanol, 1-fenyl-l-propanol, 2-fenyl-2-propanol og 3-fenyl-l-propanol.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av en kjemisk forbindelse med den generelle formel (I):

hvori

Ar er fenyl, alkylsubstituert fenyl, naftyl, alkylsubstituert naftyl,

Ri-R6 er H, OH eller alkyl,

n og m er 0 eller 1,

for fremstilling av krystaller av GH, ifølge ethvert av kravene 6-9, fra en bufferløsning.

Når benzylalkohol anvendes er den foretrukne mengde minst 1 %. Bufferen kan f.eks. være citrat i en konsentrasjon fra 2 til 50 mM, fortrinnsvis 5 til 20 mM og spesielt 5 mM eller 10 mM. Bufferen kan også være en blanding av natriumcitrat og natriumfosfater. Den vandige løsning kan omfatte glysin, lysin, mannitol og/eller glyserol.

En innledende pH på 5,8-6,3 og fortrinnsvis 6,2 har gitt gode resultater. Dannelsen av krystallene er avhengig av tiden, pH og temperatur. Ved en temperatur mellom 20 og 30 °C dannes krystallene vanligvis hurtig, noen ganger umiddelbart og de fleste ganger innen én time.

Foreliggende oppfinnelse angår også krystaller av veksthormon eller enhver funksjonell analog derav i form av nåler, trigonale former, terninger eller parallellepipeder, med en lengde på minst 20 mikron. I noen tilfeller var de erholdte krystaller til og med større enn 1 mm. Fortrinnsvis er lengden minst 50 til 2000 mikron og helst 100 til 300 mikron. Krystallene ifølge foreliggende oppfinnelse er således større enn de tidligere erholdte krystaller.

Krystallene ifølge oppfinnelsen kan være nyttige for anvendelse på mennesker og dyr i forskjellige administrerings-former, f.eks. topiske, nasale, pulmonale, orale, rektale og parenterale.

Foreliggende oppfinnelse angår også suspensjoner for injeksjon, depotformuleringer og tørrformuleringer omfattende krystaller ifølge foreliggende oppfinnelse. Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av veksthormonkrystaller for fremstilling av et medikament for behandling av en pasient i behov av veksthormon eller enhver funksjonell analog derav.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i en rensingsprosess for veksthormon.

Krystallene ifølge foreliggende oppfinnelse er vist å være biologisk aktive.

Veksthormon kan være både humant og animalsk, slik som humant veksthormon, bovint veksthormon, fiske- og grise-veksthormon.

Ved veksthormon er ment både naturlig forekommende og rekombinant veksthormon. Ved funksjonelle analoger er ment forbindelser med den samme terapeutiske effekt som veksthormonet i dyret. Det rekombinante humane veksthormon er foretrukket.

Ved anvendelse av krystaller av veksthormon er formuleringen ikke avhengig av dens løselighet i den anvendte bærer/buffer som gir en begrensning av mengden av veksthormon pr. volum. Dette er en klar fordel ved krystallene ifølge foreliggende oppfinnelse.

I et tørrpreparat, en suspensjon eller en depotformulering kan mengden av veksthormon pr. volum i legemiddel-utleveringssystemet være meget høy.

Dannede krystaller er vist i figur 1: mikroskopi av dannede krystaller.

Eksempler 1- 20

Materiale anvendt for formuleringsundersøkelser var legemidlet i den vanlige "Genotropin"-prosess. Eluatet erholdt etter rensingsprosessen inneholdt ca. 36 IU/ml.

Formuleringen ble utført i laboratorieskala ved gelfiltrering som har formålene å fjerne salter anvendt i de tidligere rensingstrinn og tilføre bestanddelene i den endelige formulering. Kolonnen, Sephadex G-25 (Pharmacia), ble ekvili-brert med formuleringsbufferen. Kromatograferingen ble utført ved +7 °C.

Den ønskede proteinkonsentrasjon ble oppnådd ved for-tynning med formuleringsbufferen. Løsningen ble sterilfiltrert og anbrakt i glasspatroner. Dannelsen av nåler i forskjellige løsninger ble fulgt i eksempler 1-20 og 22. De dannede hGH-krystaller ble karakterisert.

Metoder

Isolering

Krystallene ble sentrifugert og supernatanten ble fjernet med en pipette. Krystallene ble vasket og sentrifugert 6 ganger med vann, deretter 3 ganger med acetonitril og til slutt to ganger med dietyleter. Krystallene ble tørket.

Størrelsesfordeling av polypeptider ( SDS- PAGE)

Proteiner i preparater av somatropin, hGH, ble denaturert med natriumdodecylsulfat (SDS) for gi negativt ladete molekylkomplekser av SDS-protein. Atskillelse etter molekylstørrelse ble deretter oppnådd ved hjelp av elektro-forese i polyakrylamidgeler (PAGE) i nærvær av SDS. Den relative polypeptidstørrelsesfordeling av hGH ble kvantifisert ved densitometrisk skanning av sølvfargede polypeptidbånd.

Tynnsjiktskromatografi ( TLC)

Tynnsjiktskromatografi ble utført på kiselgelplater (Merck wt 5715) og utviklet i n-butanol:eddiksyre:vann:etyl-acetat, 1:1:1:1.

Evaluering ble basert på tre forskjellige visualiser-ingsteknikker, omfattende UV-lys ved 254 nm for generell screening, ninhydrinreaksjon for primære aminogrupper kalium-permanganatreagenser.

ELISA, immunsorbentanalyse

Mikrotiterplater (Nunc a/s, Danmark) belagt med immunsorbentrensede kaninantistoffer mot hGH ble inkubert med serumprøver, referanser (standarder) og kontroll. Etter vask tilsettes Fab'-anti-hGH-biotinkonjugat som tillates å bindes til fastfaseantigenene. Etter et ytterligere vasketrinn tilsettes et streptavidin-HRP-konjugat som tillates å bindes til fastfasebiotinet. Mengden av HRP på den faste fase bestemmes deretter ved anvendelse av substratene H2O2 og 3,3',5,5',-tetrametylbenzidin (TMBZ) og perborat. Det endelige oksiderte produkt måles ved hjelp av dets absorbans ved 450 nm. Den minimale påviselige konsentrasjon er 0,4 mU/1. Ved 0,72 mU/1 er intra- og inter-analysevariasjonskoeffisientene henholdsvis 2,3 og 9,0 % og ved 4,07 mU/1 er variasjonene henholdsvis 2,2 og 11 %.

HPLC

AshaiPac-OD 550, reversert fase/TRIS (pH 8,5) - n-propanol, isokratisk.

Påvisning: 210 og 280 nm.

Gelfiltrering

Superdex 75/0,05 M fosfatbuffer pH 7,4.

Påvisning: 280 nm.

Visuell inspeksjon

Utseende av løsningene ble inspisert visuelt i overensstemmelse med Ph. Eur. 2. utgave.

pH

pH ble målt med glasselektroder og calomelelektroder.

Diskusjon

Vanligvis ga formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter benzylalkohol krystaller i pH-området 6,1-6,3, og løsningene uten benzylalkohol ga ingen krystaller innen dette pH-området. Formuleringer 1 og 2 var klare til tross for tilsetningen av benzylalkohol ved pH 6,3, hvilket synes å være en kritisk verdi for dannelsen av krystaller i benzylalkohol.

Resultater og identifisering

Mikroskopi

Krystallene forelå i form av nåler i forskjellig lengde. De største var ca. 0,3 x 0,03 mm, se figur 1.

Smeltepunktsbestemmelse

Smeltepunktsbestemmelsen ble utført på et Leitz-Wetzlar-mikroskop. Ingen smeltepunkt kunne observeres. Krystallene var intakte opp til 230 °C hvor de begynte å bli mis-fargede. Ved ca. 290 °C var krystallene svarte, men ikke smeltet (pyrolyse).

Oppløselighet

Krystallene var uoppløselige i organiske løsnings-midler, slik som diklormetan, acetonitril, etanol, dimetyl-formamid og dietyleter. De var vanskelige å oppløse i vann og 70 % etanol i vann, men oppløselige i syrer som 1 % eddiksyre, 6 M HC1, og i en base som 0,1 M fosfatbuffer, pH 8.

Tynnsjiktskromatografi ( TLC)

Krystallene, oppløst i 10 % eddiksyre og bufferkomponentene, dvs. sitronsyre, mannitol, glysin og benzylalkohol, ble undersøkt.

Krystallprøven vandret ikke i dette system, i motset-ning til alle bufferkomponentene.

Krystallprøven absorberte UV-lys og viste positiv reaksjon med ninhydrin og permanganatreagenser, hvilket indikerte tilstedeværelsen av aromatiske grupper, aminogrupper og oksiderbare grupper.

Hydrolyse

Hydrolyse i 6 M HC1, 110 °C, 20 timer, av krystall-prøven og hGH-referansen. Analyse ved anvendelse av TLC viste identiske flekker.

HPLC, gelfiltrering, SDS- PAGE, IEF

Krystallprøven var nesten identisk med hGH-ref eransen .

Aminosyreanalyse

Eksperimentelle data erholdt for krystallene var i god overensstemmelse med den teoretiske verdi, så vel som med hGH-referanseprøven. Se tabellen nedenfor:

Proteininnholdet i krystallprøven, basert på en mengde på 0,22 mg, var 84 %. Innholdet i referansematerialet (0,45 mg) var 91 %.

Eksempel 21

Ingen krystaller ble dannet i en løsning inneholdende :

20 IU/ml

5 mM Na-citrat

12 mM glysin

250 mM mannitol og

1 % benzylalkohol

ved en pH på 6,4.

Med tilsetning av mer benzylalkohol (dvs. > 1 %) ble imidlertid krystallene hurtig dannet.

Krystaller ble også dannet ved å senke pH til nærmere 6 eller under 6.

Krystallenes morfologi kunne varieres ved hjelp av pH og veksthastighet. Når pH er nærmere 6,3 er krystallene nåler og parallellepipeder.

Innen 24 timer dannes krystaller med en lengde på 0,1 til 0,3 mm og en tykkelse på ca. 0,001 til 0,005 mm.

Ved å variere pH kunne størrelsen av krystallene således endres.

Mindre krystaller dannes innen et kortere tidsrom.

Eksempel 22

Andre kjemiske forbindelser ble undersøkt for mulig-heten av å danne krystaller av veksthormon.

Materiale for formuleringsundersøkelser var legemidlet i den vanlige "Genotropin"-prosess. Eluatet erholdt etter rensingsprosessen inneholder ca. 36 IU/ml før formulering .

Formuleringen ble utført i laboratorieskala ved dialyse mot den anvendte buffer.

Metoden "hengende dråpe" ble anvendt for undersøkelse av anvendelige midler for krystallisering av veksthormon.

"Hengende dråpe"-metoden er beskrevet i Crystalli-sation of Nucleic Acids and Proteins, A practical approach, av A Ducruix and R Griegé, IRL Press, Oxford, 1991, s. 82-86.

Dråpens startvolum var 5 ul + 5 ul og brønnvolumet var 1 ml. Den anvendte buffer under eksperimentene omfattet de følgende bestanddeler:

Forbindelse som oppført nedenfor

200 mM natriumsitrat

pH 6,2.

Resultatene var som følger med de forskjellige krystalliseringsmidler:

For noen av de anvendte krystalliseringsmidler ble krystallene dannet mer langsomt. Ved anvendelse av ±1-(1-naftyl)etanol ble krystallene dannet etter et par uker og størrelsen var 200 til 500 mikron. I stedet for anvendelse av Na-citrat ble også MES-buffer anvendt. Resultatene var de samme som ved anvendelse av Na-citrat.

En høyere konsentrasjon av krystalliseringsmidlet var imidlertid nødvendig når citrat ikke var til stede.

Når andre krystalliseringsmidler med struktur som faller utenfor den generelle formel (I) ble testet på samme måte som beskrevet ovenfor ble ingen krystaller dannet:

Eksempel 23

Immunologisk analyse av krystallene ble utført. Krystallene ble dannet i overensstemmelse med eksempler 1-20 i en buffer inneholdende:

20 IU/ml veksthormon

5 mmol Na-citrat

12 mmol glysin

130 mmol mannitol

1 % benzylalkohol.

0,17 mg av de dannede krystaller ble oppløst i

0,340 ml 0,05 M fosfatbufret saltløsning, pH 7,5, inneholdende 0,05 % Tween 20. Oppløsningen ble ytterligere fortynnet i 10 trinn i den samme buffer. Alle individuelle fortynningstrinn ble analysert i fire paralleller.

En enzymbundet immunsorbentanalyse, ELISA, ble anvendt for å måle rhGH i de oppløste krystaller.

Mengden av rhGH i ampullen ble funnet å være 0,15 mg.

Eksempel 24, bioanalyse

Krystaller er blitt utviklet fra en løsning i overensstemmelse med eksempel 6 ovenfor og anbrakt som 0,5 ml prøver i glassbeholdere. Etter preparering ble løsningen lagret ved 25 °C i én uke for å utvikle krystallene. De ble ytterligere lagret ved 5 °C i 3 måneder før innhøsting av krystallene. Når krystallene ble innhøstet ble supernatanten rundt krystallene avsugd. Krystallene ble skyllet to ganger med 0,5 ml buffer i overensstemmelse med eksempel 6 (dvs. preparatet ifølge eksempel 6, med unntak av veksthormonet). Det andre skylletrinn ble avsluttet ved sentrifugering av krystallene før skyllebufferen ble fjernet. De resterende krystaller ble oppløst i 0,5 ml av bufferen bestående av 5 mM natriumcitrat, 12 mM glysin og 130 mM mannitol, pH 6,1. Flere prøver ble sammenslått for å anvendes i bioanalysen.

Gelfiltreringskromatografien ble utført med en prøve fremstilt i overensstemmelse med prosedyren beskrevet ovenfor. Veksthormonet viste seg å være 100 % monomert etter krystallisering og etterfølgende oppløsning.

Bioanalyse av oppløste veksthormon(GH)krystaller: For å undersøke hvorvidt de erholdte GH-krystaller var biologisk aktive ble det utført en vektøkningsanalyse på hypofysektomerte rotter.

Rotter ble innkjøpt fra Mollegaard A/S, Danmark. Rottene ble hypofysektomert uken før ankomst og de manglet derfor endogent veksthormon og andre hypofysehormoner, hvilket førte til hemmet vekst. Rottene ble veid ved ankomst til laboratoriet og før undersøkelsen. Rotter med < 10 % vekts-endring ble akseptert for undersøkelsen.

Rottene ble deretter vilkårlig delt i grupper på 15. De ble behandlet to ganger daglig i 4 dager med enten et standardpreparat av humant rekombinant GH (kalibrert mot WHO 80/505 til å ha en biologisk potens på 4,5 IU/ampulle) eller løsningen fremstilt fra GH-krystaller i to doser. Standard-doser var 0,04 IU/dag og 0,16 IU/ml.

Gruppene ble veid før den første injeksjon (dag 1) og ca. 16 timer etter den siste injeksjon (dag 5). Differansen mellom disse vekter ble beregnet og potensen ble bestemt ved å sammenligne resultatene fra de krystalloppløsningsbehandlede dyr med resultatene fra de standardbehandlede grupper.

Resultatene er vist nedenfor (vektøkning, gram SD):

Den biologiske potens av de oppløste GH-krystaller ble funnet å være 7,1 IU/ml.

Ved foreliggende oppfinnelse er det således demon-strert at det humane veksthormon i oppløste GH-krystaller er biologisk aktivt in vivo.

Claims (15)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av krystaller av veksthormon (GH) eller funksjonelle derivater derav, karakterisert ved trinnene: i) blanding av GH eller funksjonelle derivater derav med en vandig oppløsning omfattende en buffer og en kjemisk forbindelse med den generelle formel (I): hvori Ar er fenyl, alkylsubstituert fenyl, naftyl, alkylsubstituert naftyl, Ri-R6 er H, OH eller alkyl, n og m er 0 eller 1, ii) inkubasjon, iii) isolering av krystallene ved hjelp av kjente metoder.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at GH er humant GH.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at GH er rekombinant humant GH (rhGH).

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at forbindelsen er valgt blant benzylalkohol, 2-metylbenzylalkohol, 1-(1-naftyl)etanol, fenyletanol, 1-fenyl-l-propanol, 2-fenyl-2-propanol, 3-fenyl-1-propanol.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at forbindelsen er benzylalkohol .

6. Krystaller av veksthormon eller enhver funksjonell analog derav, karakterisert ved at de foreligger i form av nåler, trigonale former, terninger eller parallellepipeder med en lengde på minst 20 mikron, som har blitt tilveiebrakt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1-5.

7. Krystaller ifølge krav 6, karakterisert ved at GH er humant GH.

8. Krystaller ifølge krav 7, karakterisert ved at GH er rekombinant humant GH (rhGH).

9. Krystaller ifølge krav 5, karakterisert ved at nålene har en lengde på minst 50, fortrinnsvis 50 til 2000 og helst 100 til 300 mikron.

10. Anvendelse av en kjemisk forbindelse med den generelle formel (I): hvori Ar er fenyl, alkylsubstituert fenyl, naftyl, alkylsubstituert naftyl, Ri-R6 er H, OH eller alkyl, n og m er 0 eller 1, for fremstilling av krystaller av GH, ifølge ethvert av kravene 6-9, fra en bufferløsning.

11. Suspensjon for injeksjon, karakterisert ved at den omfatter krystaller ifølge ethvert av kravene 6-9.

12. Depotformulering, karakterisert ved at den omfatter krystaller ifølge ethvert av kravene 1-6.

13. Tørrformulering, karakterisert ved at den omfatter krystaller ifølge ethvert av kravene 6-9.

14. Anvendelse av GH-krystaller ifølge ethvert av kravene 6-9 for fremstilling av et medikament til behandling av en pasient med behov for veksthormon eller enhver funksjonell analog derav.

15. Fremgangsmåte for rensing av GH, karakterisert ved at fremgangsmåten er krys-talliseringfremgangsmåten ifølge krav 1.