RU2357750C2

RU2357750C2 - Кристаллы человеческого гормона роста и способы их получения

Info

Publication number: RU2357750C2
Application number: RU2005124280/15A
Authority: RU
Inventors: Чандрика ГОВАРДХАН (US); Чандрика ГОВАРДХАН; Назер КХАЛАФ (US); Назер Кхалаф; Бенджамин Пол СИМЕОНЕ (US); Бенджамин Пол СИМЕОНЕ
Original assignee: Элтус Фармасьютикалз Инк.
Priority date: 2002-12-31
Filing date: 2003-12-31
Publication date: 2009-06-10
Also published as: MXPA05007181A; EP2460530A3; KR20050090430A; WO2004060310A3; EP1581251A2; JP2010209079A; DK1581251T3; AU2003303646B2; EP1581251B1; JP2006512416A; WO2004060310A2; CA2512052C; JP4686361B2; SG176314A1; BR0317888A; CA2512052A1; AU2010201961A1; US20040209804A1; WO2004060310A8; AU2003303646A1

Abstract

Изобретение относится к стабильным кристаллам человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, обладающим длительным действием, а также к композициям или препаратам, содержащим эти кристаллы. Кроме того, изобретение относится к способам получения указанных кристаллов и композиций, содержащих эти кристаллы. Изобретение также относится к способам лечения индивидуумов, страдающих расстройствами, ассоциированными с дефицитом человеческого гормона роста, или расстройствами, симптомы которых могут быть ослаблены путем лечения человеческим гормоном роста с использованием указанных кристаллов, а также композиций или препаратов, содержащих эти кристаллы. Изобретение позволяет введение лекарственной формы один раз в неделю, возможность ее использования в кристаллической суспензионной форме, обеспечивает безопасность, эффективность, чистоту и стабильность, а также обеспечивает получение улучшенных свойств кристаллов чГР и композиций, содержащих эти кристаллы. 10 н. и 60 з.п. ф-лы, 26 табл., 27 ил.

Description

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к кристаллам человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, а также к композициям или препаратам, содержащим эти кристаллы. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста. Кристаллы согласно настоящему изобретению являются особенно подходящими для использования в способах лечения млекопитающего, страдающего расстройствами, связанными с дефицитом человеческого гормона роста, или расстройством, симптомы которого могут быть ослаблены путем лечения человеческим гормоном роста.

Предшествующий уровень техники

Соматотропин, или гормон роста (ГР), представляет собой белок млекопитающего, принадлежащий к классу трофических гормонов, синтезируемых и секретируемых в головном мозге главной железой эндокринной системы, аденогипофизом. Секреция ГР и других трофических гормонов аденогипофизом регулирует активность клеток в других эндокринных железах и во всех тканях организма. Более конкретно, ГР секретируется соматотрофными клетками передней доли гипофиза и стимулирует синтез и секрецию IGF-1, белка, который регулирует деление клеток в печени и других тканях, а также регулирует метаболические процессы, и который присутствует в свободном состоянии или связывается с одним из шести других белков, обозначаемых как IGFBP-1-IGFBP-6. Сам процесс секреции модулируется противоположными по своему характеру функциями соматолиберина (стимулирующего высвобождение ГР) и саматостатина (ингибирующего высвобождение ГР).

Человеческий гормон роста (“чГР”) представляет особый интерес, поскольку он служит в качестве гормона, играющего важную роль в регуляции роста клеток и органов, а также в физиологической функции на различных этапах старения. Так, например, сверхпродуцирование чГР приводит к гигантизму у детей и к акромегалии у взрослых тогда, как его недостаточное продуцирование приводит к карликовости у детей [Mauras et al., J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 85(10), 3653-3660 (2000); Frindik et al., Hormone Research, 51(1), 15-19 (1999); Leger et al., J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 83(10), 3512-3516 (1998)], к синдрому Тернера (только у женщин) [Bramswig, Endocrine, 15(1), 5-13 (2001); Pasquino et al., Hormone Research, 46(6), 269-272 (1996)] и к хронической почечной недостаточности [Carroll et al., Trends in Endocrinology and Metabolism, 11(6), 231-238 (2000); Ueland et al., J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 87(6), 2760-2763 (2002); Simpson et al., Growth Hormone & IGF Research, 12, 1-33 (2002)]. У взрослых дефицит чГР может негативно влиять на метаболизм белков, углеводов, липидов и микроэлементов и на соединительную ткань и может приводить к атрофии мышц, костей или кожи [Mehls & Haas, Growth Hormone & IPG Research, Supplement B, S31-S37 (2000); Fine et al., J. Pediatrics, 136(3), 376-382 (2000); Motoyama et al., Clin. Exp. Nephrology, 2(2), 162-165 (1998)]. Другими расстройствами, связанными с дефицитом чГР и характеризующимися недостаточным ростом, являются синдром истощения при СПИД'е [Hirschfeld, Hormone Research, 46, 215-221 (1996); Tritos et al., Am. J. Medicine, 105(1), 44-57 (1998); Mulligan et al., J. Parenteral and Enteral Nutrition, 23(6), S202-S209 (1999); Torres and Cadman, BioDrugs, 14(2), 83-91 (2000)] и синдром Прадера-Вилли [Ritzen, Hormone Research, 56(6), 208 (2002); Eiholzer et al., Eur. J. Pediatrics, 157(5), 368-377 (1998)]. До настоящего времени схемы лечения дефицита чГР у человека предусматривали, главным образом, подкожную инъекцию очищенного чГР, полученного с использованием техники рекомбинантных ДНК. Препарат для такого терапевтического лечения представляет собой или раствор, упакованный в патрон, или лиофилизованный порошок, который необходимо разводить перед использованием. Частота инъекций варьирует в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению, и от типа используемого коммерчески доступного продукта. Так, например, карликовость подвергают лечению путем ежедневной подкожной инъекции рекомбинантного чГР.

Необходимость подкожного введения, обеспечивающего быструю доставку чГР, продиктована природной нестабильностью белка в растворе. Такая нестабильность является результатом расщепления важных внутримолекулярных перекрестных связей в конкретных положениях аминокислотной последовательности белка, что, в свою очередь, приводит к разрушению основной трехмерной структуры, распознаваемой рецепторами клеточной поверхности и ассоциированной с этими клеточными поверхностями у пациента. Механизм расщепления или деградации чГР регулируется, главным образом, окислением метиониновых остатков или дезамидированием остатков аспарагиновой кислоты после растворения, что делает данный белок неактивным. Поэтому, принимая во внимание такую нестабильность белка, необходимо разработать чГР-содержащие композиции или препараты, которые обладали бы стабильностью и продолжительным действием и которые можно было бы вводить не только подкожно, но и другими стандартными способами введения лекарственных средств, такими как пероральное, дермальное и внутривенное введение.

Попытки решения этой проблемы привели к получению различных продуктов чГР, которые в настоящее время являются коммерчески доступными. Таким продуктом, например, является Nutropin Depot®, который представляет собой инъецируемую суспензию рекомбинантного человеческого гормона роста (рчГР), заключенную в микросферы из сополимера полилактида-гликолида (ПЛГ) (см., http://www.gene.com). Помимо рчГР и ПЛГ, указанные микросферы также содержат такие компоненты, как ацетат цинка и карбонат цинка. Перед введением твердый материал должен быть разведен водным раствором, содержащим натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, полисорбат, хлорид натрия и воду. Эту суспензию, которая, в основном, состоит из полимера, вводят один или два раза в месяц, и для ее инъекции требуется игла калибра 21. Из-за размера микросфер и вязкой консистенции продукта в месте инъекции могут наблюдаться побочные реакции, приводящие к возникновению узлов, эритемы, болей, гематомы, зуда, липоатрофии и отечности (см. http://www.genentech.com/gene/products/ information/opportunistic/nutropin-depot/index.jsp).

Другим продуктом чГР, получение которого было начато, но затем приостановлено, является Albutropin^TM, препарат пролонгированного действия, а именно генетически продуцированный гибридный белок, состоящий из человеческого альбумина и человеческого гормона роста (см. http://www.hgsi.com/products/albutropin.html). Считается, что этот продукт имеет более длительное время полужизни в кровотоке, т.е. по грубой оценке, его время полужизни на 50% превышает время полужизни растворимого нативного чГР. Albutropin^TM обычно вводят путем инъекции один раз в неделю, и считается, что он стимулирует увеличение уровней IGF-1, которые поддерживаются в течение длительного периода времени, после его выведения из организма. Биологический эффект этого продукта аналогичен эффекту, достигаемому при применении современной терапии гормонами роста.

Другим полученным продуктом является Infitropin CR^TM, препарат чГР, состоящий из молекул чГР, конъюгированных с полиэтиленгликолем. Этот конъюгированный чГР необходимо вводить один раз в неделю, при этом считается, что он высвобождается непрерывно, без каких-либо явно наблюдаемых “выбросов” [Ross et al., J. Biol. Chem., 271(36), 21696-21977 (1996)]. Однако производство этого продукта было прекращено.

В патентах США №№ 5981485 и 6448225 описаны водные препараты чГР, которые, как считается, не требуют разведения, и эти препараты вводят путем ежедневных инъекций. Такие препараты обычно содержат чГР, буфер, неионогенное поверхностно-активное вещество, и необязательно, нейтральную соль, маннит или консервант.

Для обеспечения пролонгированного высвобождения лекарственного средства, содержащего чГР, были предприняты попытки разработать другие методы доставки лекарственных средств, такие как методы с использованием гидрогелей [Katakam et al., J. Controlled Release, 49(1), 21-26 (1997)], липосом, масляных эмульсий и микросфер на основе биологически разлагаемого полимера. Однако полученные препараты дают очень резкое высвобождение лекарственного средства, то есть по типу “выброса”, и требуют соблюдения жестких условий, а некоторые из них трудно получить промышленным способом. Это, в частности, относится к технологии изготовления препаратов чГР, основанной на использовании микросфер, состоящих из сополимера DL-молочной и гликолевой кислоты (ПЛГА), поскольку технология, используемая для получения микросфер, требует выполнения определенных условий, таких как повышенная температура, присутствие поверхностно-активного вещества, органических растворителей и границы раздела водного/органического растворителя, каждое из которых приводит к разложению белка [Herberger et al., Proc. Intl. Symp. Controlled Release of Bioactive Materials, 23, 835-836 (1996); Kim et al., Intl. J. Pharmaceutics, 229(1-2), 107-116 (2001)].

Для некоторых из вышеописанных препаратов необходимо поддержание чГР в лиофилизованном состоянии, что может потребовать много времени и проведения дорогостоящих процедур. В патентах США №№ 5780599 и 6117984 описаны кристаллы чГР, содержащие двухвалентный катион, и методы получения таких содержащих двухвалентный катион кристаллов чГР, которые не требуют проведения стадии лиофилизации.

Несмотря на то, что попытки устранения недостатков, присущих стандартным продуктам чГР, включая их нестабильность при хранении, а также после введения инъекции, непродолжительное время полужизни in vivo, импульсный характер высвобождения, недостаточную биологическую доступность, трудность и частоту введения, предпринимались и ранее, однако, необходимость получения препаратов чГР с улучшенными свойствами до сих пор остается актуальной. Для решения этой проблемы было разработано настоящее изобретение, целью которого является преимущественно получение кристаллов человеческого гормона роста, обеспечивающих стабильное и длительное время действия чГР.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к стабильным кристаллам человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, которые обладают длительным действием, а также являются пригодными и удобными для введения пациенту. Настоящее изобретение также относится к композициям кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, включая фармацевтически приемлемые композиции, содержащие эти кристаллы. Настоящее изобретение также относится к способам получения таких кристаллов, а также к композициям, содержащим эти кристаллы. Кристаллы и композиции согласно изобретению предпочтительно используются в способах лечения индивидуума, страдающего расстройством, ассоциированным с дефицитом человеческого гормона роста, или расстройством, симптомы которого могут быть ослаблены путем лечения человеческим гормоном роста.

Кристаллы человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, или композиции или препараты, содержащие эти кристаллы, имеют несколько преимуществ, включая возможность их введения один раз в неделю, возможность их использования в кристаллической суспендированной форме, безопасность, эффективность, чистоту, стабильность, ресуспендируемость и возможность введения через шприц в течение короткого периода времени. Другие цели настоящего изобретения, включая улучшение свойств кристаллов чГР и композиций или препаратов, содержащих эти кристаллы, по сравнению со стандартными чГР-препаратами, будут более понятны специалистам из нижеследующего описания изобретения.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 860 мМ фосфата аммония (рН 8,9). См. пример 1.

На фиг.2 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 390 мМ цитрата натрия. См. пример 2.

На фиг.3 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 600 мМ двухосновного фосфата натрия и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 3.

На фиг.4 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 85 мМ ацетата кальция и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6) и полученных посредством совместной кристаллизации с сульфатом протамина (1 мг/мл). См. пример 4.

На фиг.5 проиллюстрированы растворимость кристаллов чГР, выращенных в присутствии фосфата аммония, цитрата натрия, двухосновного фосфата натрия, и осадителей, ацетата кальция/протамина, в зависимости от времени, и мониторинг при 280 нм. См. пример 5.

На фиг.6 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 10% (об./об.) изопропанола, 85 мМ ацетата кальция и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 6.

На фиг.7 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 5% (об/об) изопропанола, 85 мМ хлорида кальция и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 7.

На фиг.8 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии этанола, 10% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 8.

На фиг.9 проиллюстрированы растворимость кристаллов чГР, выращенных как описано в примерах 6-8, в зависимости от времени, и мониторинг при 280 нм. См. пример 9.

На фиг.10 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 85 мМ ацетата кальция, 2% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 10.

На фиг.11 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 500 мМ ацетата натрия, 6% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 11.

На фиг.12 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 85 мМ хлорида кальция, 6% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 12.

На фиг.13 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 85 мМ ацетата кальция, 6% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6) и полученных посредством совместной кристаллизации с сульфатом протамина (1 мг/мл). См. пример 13.

На фиг.14 представлено полученное с помощью оптической микроскопии изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 125 мМ ацетата кальция, 6% (об./об.) ПЭГ-ММЕ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 14.

На фиг.15 проиллюстрированы растворимость кристаллов чГР, выращенных как описано в примерах 10-14, в зависимости от времени, и мониторинг при 280 нм. См. пример 15.

На фиг.16 показаны сывороточные уровни (нг/мл) коммерчески доступного чГР (растворимого чГР) и чГР, полученного как описано в примере 10 (кристаллического чГР) в пробах крови, взятых у самок крыс Sprague-Dawley через 24 часа после одного подкожного введения дозы 2,5 мг/кг растворимого или кристаллического чГР на крысу. Уровни чГР в сыворотке измеряли на t=0 и через 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 часа после введения. См. пример 16.

На фиг.17 проиллюстрирована способность к растворению кристаллов чГР (образованных в присутствии 85 мМ ацетата кальция, 2% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6)) после добавления различных количеств сульфата протамина. Различные композиции этих кристаллов чГР добавляли в буфер для растворения и оставляли на 1 час, после чего определяли концентрацию растворимого чГР в супернатанте с помощью ОФ-ВЭЖХ (площадь). См. пример 17.

На фиг.18А представлено полученное с помощью ПЭМ (просвечивающей оптической микроскопии) продольное изображение кристаллов чГР, выращенных в присутствии 500 мМ ацетата натрия, 6% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 18.

На фиг.18В представлено полученное с помощью ПЭМ (просвечивающей оптической микроскопии) изображение кристаллов чГР в поперечном сечении, выращенных в присутствии 500 мМ ацетата натрия, 6% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6). См. пример 18.

На фиг.19А показаны уровни (нг/мл) чГР в пробах сыворотки, взятых у самок крыс Sprague-Dawley групп 3-5 и 9 через 168 часов (приводятся данные проб крови, взятых через 0-72 часа), либо после ежедневного подкожного введения в течение 7 дней, либо после одного подкожного введения за 7 дней дозы 6,7 мг/кг чГР на крысу. См. пример 22 и таблицы 7-12.

На фиг.19В показано увеличение массы (г) самок крыс Sprague-Dawley (групп 2, 4 и 9), которым были инъецированы выбранные композиции, через 8 дней либо после ежедневного подкожного введения в течение 7 дней (группа 2), либо на день 1 после единственного за 7 дней подкожного введения (группы 4 и 9) дозы 6,7 мг/кг чГР на крысу. См. пример 22 и таблицу 13.

На фиг.20А представлены концентрации чГР в сыворотке крови в зависимости от времени для молодых самок собакоподобных обезьян после подкожного введения стандартного (для ежедневного введения) растворимого чГР (группа 1), натрийсодержащих кристаллов чГР, образующих комплекс с полиаргинином (группа 2), и натрийсодержащих кристаллов чГР, образующих комплекс с протамином (группа 3), как показано в таблице 16. См. пример 23.

На фиг.20В представлены концентрации IGF-1 в сыворотке крови в зависимости от времени для молодых самок собакоподобных обезьян после подкожного введения стандартного (для ежедневного введения) растворимого чГР (группа 1), натрийсодержащих кристаллов чГР, образующих комплекс с полиаргинином (группа 2), и натрийсодержащих кристаллов чГР, образующих комплекс с протамином (группа 3), как показано в таблице 16. См. пример 23.

На фиг.21А представлены концентрации чГР в сыворотке крови в зависимости от времени для молодых самок собакоподобных обезьян после подкожного введения стандартного (для ежедневного введения) растворимого чГР (группа 1), натрийсодержащих кристаллов чГР, образующих комплекс с протамином (отношение чГР:протамин = 3:1) (группа 2), и натрийсодержащих кристаллов чГР, образующих комплекс с протамином (отношение чГР:протамин = 2:1) (группа 3), как показано в таблице 20. См. пример 24.

На фиг.21В представлены концентрации IGF-1 в сыворотке крови в зависимости от времени для молодых самок собакоподобных обезьян после подкожного введения стандартного (для ежедневного введения) растворимого чГР (группа 1), натрийсодержащих кристаллов чГР, образующих комплекс с протамином (отношение чГР:протамин = 3:1) (группа 2), и натрийсодержащих кристаллов чГР, образующих комплекс с протамином (отношение чГР:протамин = 2:1) (группа 3), как показано в таблице 22. См. пример 24.

На фиг.22 проиллюстрирован семидневный рост самцов крыс Wistar, которым подкожно вводили контроль (группа 1, один раз в день в течение семи дней) растворимый чГР (группы 4 и 5, один раз в день в течение семи дней) и кристаллический чГР (группы 6, 7, 9 и 10, один раз за семь дней) как показано в таблице 25. См. пример 25.

На фиг.23 проиллюстрирован ежедневный прирост массы (в граммах) в течение семидневного периода времени для самцов крыс Wistar, которым подкожно вводили контроль (группа 1, один раз в день в течение семи дней) растворимый чГР (группы 4 и 5, один раз в день в течение семи дней) и кристаллический чГР (группы 6, 7, 9 и 10, один раз за семь дней), как показано в таблице 26. См. пример 25.

Подробное описание изобретения

Определения

Если не указано иное, то все научные и технические термины, используемые в настоящем изобретении, имеют общепринятые значения, известные специалистам в данной области. Кроме того, если это не требуется в данном контексте, то употребление терминов в единственном числе может подразумевать формы множественного числа, а употребление терминов во множественном числе может подразумевать формы единственного числа. Обычно используемая здесь номенклатура и описанные здесь методы колоночной хроматографии, оптической микроскопии и спектроскопии в УФ- и визуальной области спектра (UV-VIS-спектроскопии), а также методы проведения фармакокинетических анализов, методы рекомбинантных ДНК, методы химического синтеза пептидов и белков, методы химического синтеза нуклеиновых кислот и методы, применяемые в молекулярной биологии, являются хорошо известными и широко используются специалистами.

Описанные ниже термины, если не указано иное, имеют следующие значения.

Термин “гормон роста (ГР)”, в общих чертах, означает гормоны роста, секретируемые гипофизом млекопитающих. Примерами таких млекопитающих являются, но не ограничиваются ими, человек, человекообразные обезьяны, мартышки, крысы, свиньи, собаки, кролики, кошки, коровы, лошади, мыши и козы. В соответствии с предпочтительным вариантом настоящего изобретения указанным млекопитающим является человек.

Термин “человеческий гормон роста (чГР)” означает белок, имеющий аминокислотную последовательность, структуру и функции, присущие нативному человеческому гормону роста. Используемый здесь термин “человеческий гормон роста (чГР)” также означает любую изоформу нативного человеческого гормона роста, включая, но не ограничиваясь ими, изоформы с молекулярными массами 5, 17, 20, 22, 24, 36 и 45 кДа [Haro et al., J. Chromatography B, 720, 39-47 (1998)]. Так, например, термин “чГР” включает последовательность нативного чГР из 191 аминокислоты, соматотропина; последовательность из 192 аминокислот, содержащую N-концевой метионин (Met-чГР), и соматрем [патенты США №№ 4342832 и 5633352]. чГР может быть получен путем выделения и очистки из биологического источника или методами рекомбинантных ДНК. Если чГР был получен методами рекомбинантных ДНК, то такой чГР называется рекомбинантным человеческим гормоном роста (рчГР). Met-чГР обычно получают с использованием техники рекомбинантных ДНК.

Термин “производное человеческого гормона роста” означает белок, имеющий аминокислотную последовательность, сравнимую с аминокислотной последовательностью природного человеческого гормона роста. Термин “сравнимый” относится к аминокислотной последовательности, которая имеет 2-100%-ную гомологию с последовательностью чГР, состоящей из 191 аминокислоты, или с последовательностью Met-чГР, состоящей из 192 аминокислот. В различных вариантах настоящего изобретения производные человеческого гормона роста включают органические катионы чГР или Met-чГР, варианты биологически синтезированных белков чГР или Met-чГР, полученные в результате замены, делеции и инсерции; посттрансляционно модифицированные белки чГР и Met-чГР, включая белки, полученные посредством реакций дезамидирования, фосфорилирования, гликозилирования, ацетилирования, агрегации и ферментативного расщепления [Haro et al., J. Chromatography B, 720, 39-47 (1998)]; химически модифицированные белки чГР или Met-чГР, полученные из биологических источников; полипептидные аналоги и химически синтезированные пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, аналогичные аминокислотным последовательностям чГР или Met-чГР.

Методы, используемые для получения чГР или Met-чГР, включают выделение из биологического источника, осуществление техники рекомбинантных ДНК, химический синтез или их комбинацию. До настоящего времени считалось, что генами, которые кодируют различные ДНК-последовательности чГР, являются гены hGH-N и hGH-V [Haro et al., J. Chromatography B, 720, 39-47 (1998); Bennani-Baiti et al., Genomics, 29, 647-652 (1995)].

Термин “валентность” определяется как способность элемента связываться с другими элементами, и такая способность определяется числом электронов внешней оболочки атома и выражается числом атомов водорода (или любого другого стандартного одновалентного элемента), которые могут присоединять (или замещать) атомы данного элемента [Webster's New World Dictionary of Science, Lindley D. and Moore T.H., Eds., Macmillan, New York, New York, 1998]. Термины “одновалентный катион” и “двухвалентный катион” означают ионы, несущие положительный заряд, который имеет валентность 1 или 2 соответственно. Катионы, имеющие различные валентности, по своей природе могут быть органическими или неорганическими. Примерами одновалентных неорганических катионов являются аммоний (NH₄ ⁺) и элементы группы I Периодической таблицы элементов (Н⁺, Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺, Cs⁺ и Fr⁺), а примерами двухвалентных неорганических катионов являются элементы группы II (Ве²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Mo²⁺ и Ra²⁺).

Термин “кальцийсодержащий кристалл человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста” означает человеческий гормон роста или его производное, которые были кристаллизованы в присутствии двухвалентного иона кальция. Двухвалентный ион кальция вводят в раствор для кристаллизации в виде кальциевой соли. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кальцийсодержащий кристалл человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста содержит от примерно 1 до примерно 500 молекул кальция на мономер или мономерное звено человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста. В более предпочтительном варианте изобретения кальцийсодержащий кристалл человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста содержит примерно от 1 до 140 молекул кальция на мономер или мономерное звено человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста.

Термин “соль кальция” включает неорганические и органические противоионы или молекулы, образующие ионную связь с ионом (ионами) кальция. Примерами различных солей кальция являются гидрат ацетата кальция, моногидрат ацетата кальция, гидрат ацетилацетоната кальция, дигидрат L-аскорбата кальция, бис(6,6,7,7,8,8,8-гептафтор-2,2-диметил-3,5-октандионат) кальция, бис(2,2,6,6-тетраметил-3,5-гептандионат) кальция, бромид кальция, карбонат кальция, хлорид кальция, дигидрат хлорида кальция, гексагидрат хлорида кальция, гидрат хлорида кальция, тетрагидрат цитрата кальция, дигидрофосфат кальция, 2-этилгексаноат кальция, фторид кальция, глюконат кальция, гидроксид кальция, гипохлорит кальция, иодат кальция, иодид кальция, гидрат иодида кальция, кальцийсодержащий ионофор 1, молибдат кальция, нитрат кальция, оксалат кальция, гидрат оксалата кальция, оксид кальция, пантотенат кальция, пропионат кальция, пирофосфат кальция и сульфат кальция. В предпочтительном варианте настоящего изобретения соль кальция выбрана из группы, состоящей из ацетата кальция, хлорида кальция, сульфата кальция и глюконата кальция. В более предпочтительном варианте изобретения солью кальция является ацетат кальция.

Термин “кристалл человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащий органический катион”, означает человеческий гормон роста, который был кристаллизован в присутствии органического катиона. Термин “органический катион” означает положительно заряженный атом или группу атомов, содержащих углерод. Примерами органических катионов являются четвертичные катионы аммония, тетраэтиламмоний (ТЕА), трибутилметиламмоний (TBuMA), этобромид прокаинамида (РАЕВ), метоиодид азидопрокаинамида (АРМ), d-тубокурарин, метокурин-векуроний, рокуроний, 1-метил-4-фенилпиридиний, холин и N-(4,4-аксо-н-пентил)-21-дезоксиаймалиний (APDA).

чГР является коммерчески доступным продуктом, поставляемым в лиофилизованной форме, и обычно его получают методами рекомбинантных ДНК. В соответствии с настоящим изобретением кристаллизацию чГР обычно осуществляют путем приготовления буферного раствора чГР, очистки и/или обессоливания, диализа и концентрирования такого раствора и добавления к этому раствору одновалентного или двухвалентного катиона или соли. В последней стадии образуется органический или неорганический катион, связанный с чГР.

В одном из своих предпочтительных вариантов настоящее изобретение относится к кристаллам чГР или производного чГР, содержащим одновалентный катион. В более предпочтительном варианте изобретения одновалентный катион выбран из группы, состоящей из лития, натрия, калия и аммония. В более предпочтительном варианте изобретения одновалентным катионом является натрий. В наиболее предпочтительном варианте изобретения человеческий гормон роста или производное человеческого гормона роста содержит от примерно 1 до примерно 500 молекул одновалентного катиона на мономер или мономерное звено человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста.

Термин “соль одновалентного катиона” включает как неорганические, так и органические противоионы или молекулы, образующие ионную связь с одновалентным ионом. В предпочтительном варианте изобретения солью одновалентного катиона является соль натрия. В более предпочтительном варианте изобретения соль натрия выбрана из группы, состоящей из цитрата натрия, фосфата натрия и ацетата натрия. В наиболее предпочтительном варианте изобретения солью натрия является ацетат натрия.

В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к протаминсодержащему кристаллу чГР или производного чГР. Аналогичным образом, в еще одном своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к полиаргининсодержащему кристаллу чГР или производного чГР.

В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к кристаллам чГР или производного чГР, содержащим одновалентный или двухвалентный катион и образующим комплекс или совместно кристаллизующимся с протамином или полиаргинином. Более предпочтительно указанными кристаллами являются натрийсодержащие кристаллы, образующие комплекс или совместно кристаллизующиеся с протамином или полиаргинином.

Растворимая форма чГР может быть охарактеризована различными методами, включая обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ-ВЭЖХ), эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию (Э-ВЭЖХ) и гидрофобную хроматографию (ГФХ) [Wu et al., J. Chromatography, 500, 595-606 (1990); “Hormone Drugs”, FDA publication, (1982)]. С другой стороны, кристаллическая форма чГР может быть охарактеризована с помощью оптической микроскопии и рентгенографии. В общих чертах, условия кристаллизации определяются формой кристаллов белка, то есть формой, выбранной из группы, состоящей из сфер, игл, стержней, пластин (гексагональных и квадратных), ромбов, кубов, бипирамид и призм.

Кристаллы чГР или производного чГР согласно настоящему изобретению образуют стержневидные или иглообразные морфологические структуры, наблюдаемые при оптической микроскопии. В одном из вариантов осуществления изобретения чГР или производное чГР образуют кристаллы в виде стержней или игл, имеющие длину от примерно 0,1 до примерно 200 мкм. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кристаллы чГР или производного чГР имеют форму стержней или игл длиной примерно 3-100 мкм. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения кристаллы чГР или производного чГР имеют форму стержней или игл длиной примерно 10-25 мкм.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим кристаллы чГР или производного чГР, полученные путем кристаллизации в присутствии кальция, одновалентного катиона, протамина или полиаргинина, и фармацевтически приемлемый наполнитель. В еще одном предпочтительном варианте изобретения кристаллы чГР или производного чГР и наполнитель присутствуют в указанных композициях в молярном отношении чГР:наполнитель, составляющем от примерно 1:250 до примерно 1:20. В альтернативном предпочтительном варианте изобретения кристаллы чГР или производного чГР и наполнитель присутствуют в молярном отношении чГР:наполнитель, составляющем от примерно 3:1 до примерно 1:10. В еще одном предпочтительном варианте изобретения кристаллы чГР или производного чГР и наполнитель присутствуют в молярном отношении чГР:наполнитель, составляющем от примерно 1:10 до примерно 1:0,125. В предпочтительном варианте изобретения кристаллы чГР или производного чГР выращивают в присутствии ацетата натрия, и эти кристаллы могут быть кристаллизованы вместе с полиагринином или протамином или покрыты полиагринином или протамином.

Кристаллы человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста могут быть объединены с любым фармацевтически приемлемым эксципиентом. В соответствии с настоящим изобретением термин “фармацевтически приемлемый эксципиент” означает эксципиент, который действует как наполнитель или как комбинация наполнителей, обычно используемых в фармацевтических композициях. Предпочтительными эксципиентами, которые могут быть включены в эту категорию, являются: 1) аминокислоты, такие как глицин, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аспарагин, глутамин, пролин; 2) углеводы, например моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза, арабиноза, ксилоза, рибоза; 3) дисахариды, такие как лактоза, трегалоза, мальтоза, сахароза; 4) полисахариды, такие как мальтодекстрины, декстраны, крахмал, гликоген; 5) альдиты, такие как маннит, ксилит, лактит, сорбит; 6) глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота; 7) циклодекстрины, такие как метилциклодекстрин, гидроксипропил-β-циклодекстрин и т.п.; 8) неорганические молекулы, такие как хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, фосфаты натрия и калия, борная кислота, карбонат аммония и фосфат аммония; 9) органические молекулы, такие как ацетат, цитрат, аскорбат, лактат; 10) эмульгирующие или солюбилизирующие/стабилизирующие агенты, такие как аравийская камедь, диэтаноламин, глицерилмоностеарат, лецитин, моноэтаноламин, олеиновая кислота, олеиловый спирт, полоксамер, полисорбаты, лаурилсульфат натрия, стеариновая кислота, монолаурат сорбитана, моностеарат сорбитана и другие производные сорбитана, полиоксиловые производные, воск, производные полиоксиэтилена, производные сорбитана; и 11) реагенты, повышающие вязкость, такие как агар, альгиновая кислота и ее соли, гуаровая камедь, пектин, поливиниловый спирт, полиэтиленоксид, целлюлоза и ее производные, пропиленкарбонат, полиэтиленгликоль, гексиленгликоль, тилоксапол. Могут быть также использованы соли указанных соединений. Другой предпочтительной группой эксципиентов являются сахароза, трегалоза, лактоза, сорбит, лактит, маннит, инозит, соли натрия и калия, такие как ацетат, фосфаты, цитраты и борат, глицин, аргинин, полиэтиленоксид, поливиниловый спирт, полиэтиленгликоль, гексиленгликоль, метоксиполиэтиленгликоль, желатин, гидроксипропил-β-циклодекстрин, полилизин и полиаргинин.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанный эксципиент выбирают из группы, состоящей из аминокислот, солей, спиртов, углеводов, белков, липидов, поверхностно-активных веществ, полимеров, полиаминокислот и их смесей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный эксципиент выбран из группы, состоящей из протамина; поливинилового спирта; циклодекстринов; декстранов; глюконата кальция; полиаминокислот, таких как полиаргинин, полилизин и полиглутамат; полиэтиленгликоля; дендримеров; полиорнитина; полиэтиленимина; хитозана и их смесей. В более предпочтительном варианте изобретения указанный эксципиент выбран из группы, состоящей из протамина, полиаргинина, полиэтиленгликоля и их смесей.

Кристаллы человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста согласно изобретению могут быть также объединены с носителем или эксципиентом, т.е. веществом, которое при его введении в терапевтический препарат ускоряет или улучшает его действие [The On-Line Medical Dictionary, http://cancerweb.ncl.ac.uk/omd/index.html]. Примерами носителей или эксципиентов являются, например, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, вода, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, динатрийбифосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидальная двуокись кремния, магний, трисиликат, вещества на основе целлюлозы и полиэтиленгликоль. Носителями или эксципиентами для гелевых основ могут быть, например, натрийсодержащая карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, блоксополимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и спирты из древесного воска.

В еще более предпочтительном варианте изобретения указанным эксципиентом является протамин. Кроме того, кристаллы чГР или производного чГР и протамин присутствуют в отношении чГР:протамин, равном от примерно 5:1 до примерно 1:10 (мас./мас.). Это отношение может также варьировать в пределах примерно 10:1-20:1 (мас./мас.). Наиболее предпочтительно, это отношение составляет в пределах примерно 12:1-15:1 (мас./мас.). В соответствии с альтернативным вариантом осуществления изобретения это отношение составляет примерно 3:1-1:10 (мас./мас.). В другом варианте осуществления изобретения это отношение составляет примерно 5:1-40:1 (мас./мас.). А в еще одном варианте изобретения это отношение составляет примерно 5:1 (мас./мас.).

В другом аспекте изобретения фармацевтически приемлемый эксципиент выбран из группы, состоящей из полиаминокислот, включая полилизин, полиаргинин и полиглутамат. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным эксципиентом является полилизин. В более предпочтительном варианте изобретения полилизин имеет молекулярную массу примерно от 1500 до 8000 кДа. В другом варианте изобретения кристаллы чГР или производного чГР и полилизин присутствуют в отношении чГР:полилизин, составляющем от примерно 5:1 до примерно 40:1 (мас./мас.). Это отношение может также варьировать в пределах примерно 10:1-20:1 (мас./мас.). Наиболее предпочтительно это отношение находится в пределах примерно 12:1-15:1 (мас./мас.). В соответствии с альтернативным вариантом осуществления изобретения это отношение составляет от примерно 5:1 до примерно 1:50 (мас./мас.). А еще в одном варианте изобретения это отношение составляет примерно 5:1 (мас./мас.).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным эксципиентом является полиаргинин. В более предпочтительном варианте изобретения полиаргинин имеет молекулярную массу примерно 15000-60000 кДа. В другом варианте изобретения кристаллы чГР или производного чГР и полиаргинин присутствуют в отношении чГР:полиаргинин, составляющем от примерно 5:1 до примерно 40:1 (мас./мас.). Это отношение может также варьировать в пределах примерно 10:1-20:1 (мас./мас.). Наиболее предпочтительно это отношение находится в пределах примерно 12:1-3:1 (мас./мас.). В соответствии с альтернативным вариантом осуществления изобретения это отношение составляет от примерно 5:1 до примерно 1:50 (мас./мас.). В другом варианте осуществления изобретения такое отношение составляет примерно 12:1-15:1 (масс/масс). А в еще одном варианте изобретения это отношение составляет примерно 5:1 (мас./мас.).

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к инъецируемой кристаллической суспензии, содержащей примерно 20 мг/мл кристаллов чГР или производного чГР. Эта суспензия характеризуется тем, что она легко ресуспендируется, медленно осаждается и продолжительность ее действия составляет примерно 7 дней. Указанная суспензия может быть инъецирована один раз в неделю шприцем с использованием иглы калибра 30, в результате чего достигается 80%-ная эффективная загрузка. Эта суспензия является чистой, на что указывают такие параметры, как 0,02%-ная агрегация (Э-ВЭЖХ) и 2,3% связанных белков (ОФ-ВЭЖХ). Указанная чистота поддерживается, по крайней мере, в течение примерно 4 месяцев в условиях охлаждения.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к кристаллам чГР или производного чГР, которые, по сравнению со стандартным растворимым чГР или с препаратами, содержащими чГР, характеризуются замедленным растворением при их введении индивидууму. В соответствии с настоящим изобретением растворение кристаллов чГР или производного чГР характеризуется либо in vitro, либо in vivo параметрами растворения. Так, например, in vitro растворение определяется как концентрация растворимого чГР (выражаемая в процентах или в мг всех первоначально присутствующих кристаллов чГР или производного чГР), полученного за 15 минут или за одну стадию промывки в последовательном процессе растворения (см. пример 5). В одном из вариантов осуществления изобретения кристаллы чГР или производного чГР характеризуются скоростью in vitro растворения примерно 2-16% указанных кристаллов за одну стадию промывки после обработки буфером для растворения (50 мМ HEPES (рН 7,2), 140 мМ NaCl, 10 мМ KCl и 0,02% (об./об.) NaN₃) при температуре 37°С, где концентрация чГР или производного чГР в растворе составляет примерно 2 мг/мл. В другом варианте осуществления изобретения кристаллы чГР или производного чГР характеризуются скоростью растворения in vitro примерно 0,04-0,32 мг указанных кристаллов за одну стадию промывки в последовательном процессе растворения (см. пример 5). С другой стороны, растворение in vivo определяется уровнями чГР в сыворотке млекопитающего в течение всего периода времени после одной инъекции чГР млекопитающему.

У млекопитающих ГР стимулирует синтез и секрецию в тканях белка IGF-1, то есть белка, который, в свою очередь, играет определенную роль в делении клеток и в процессах метаболизма. Специалисту известно, что уровни чГР и IGF-1 в сыворотке зависят от многих факторов, включая физиологические факторы и фармакологические факторы. Такими факторами являются, но не ограничиваются ими, физиологические факторы, такие как возраст и костный возраст, пол, масса тела, возрастная стадия (например, акселерация при половом созревании), и фармакологические факторы, такие как доза, уровень дозы (кинетика) и способ введения. Кроме того, специалисту известно, что для различных групп пациентов могут оказаться предпочтительными различные уровни чГР и IGF-1, как с точки зрения их безопасности, так и эффективности.

Взрослые и дети, страдающие недостаточностью чГР, патологическими состояниями или синдромами различной степени, могут проходить различные курсы лечения, предусматривающие введение экзогенного чГР в форме кристаллов чГР или кристаллов производного чГР согласно изобретению. Так, например, эндокринолог может начать курс лечения с дозы примерно 0,2 мг/кг в неделю для ребенка, а затем через несколько недель или месяцев проведения лечения он может увеличивать дозу примерно до 0,3 мг/кг в неделю, после чего эта доза может быть увеличена примерно до 0,7 мг/кг в неделю до достижения ребенком возраста половой зрелости. Как будет очевидно для специалиста, уровень экзогенного введения чГР взрослым или детям, которые нуждаются в таком введении, также зависит от уже имеющихся у них физиологических уровней или концентраций чГР.

Дозы чГР, вводимые взрослым или детям, часто выражают в мг/кг или в Международных единицах (МЕ/кг). Схемы введения таких доз обычно предусматривают введение дозы один раз в день или в неделю, то есть мг/кг/день или мг/кг/неделю. Исходя из этих соображений, в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, например введение одной еженедельной дозы примерно 9 мг ребенку весом 30 кг обеспечивает in vivo концентрацию чГР в сыворотке примерно более чем 10 нг/мл в дни 1 и 2 после введения; примерно более чем 5 нг/мл в дни 3 и 4 после введения; и примерно 0,3 нг/мл в дни 5-7 после введения. Альтернативно, одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, обеспечивает in vivo концентрацию чГР в сыворотке от примерно 0,3 нг/мл до примерно 2500 нг/мл чГР, предпочтительно, от примерно 0,5 нг/мл до примерно 1000 нг/мл чГР, а наиболее предпочтительно от примерно 1 нг/мл до примерно 100 нг/мл чГР, за любой один из периодов времени, составляющий в пределах от примерно 0,5 часа до примерно 40 дней после введения указанному млекопитающему, предпочтительно, в течение периода времени от примерно 0,5 часа и до примерно 10 дней, 7 дней или 1 дня после введения. Аналогичным образом, одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, обеспечивает in vivo концентрацию в сыворотке примерно более 2 нг/мл чГР, предпочтительно, примерно более 5 нг/мл чГР, наиболее предпочтительно, примерно более 10 нг/мл чГР, за период времени, составляющий в пределах от примерно 0,5 часа до примерно 40 дней после введения указанному млекопитающему, предпочтительно, за любой один из периодов времени, составляющий примерно 10, 7 или 1 день после введения. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, обеспечивает in vivo концентрацию в сыворотке примерно более чем 0,3 нг/мл чГР, за период времени, составляющий в пределах от примерно 0,5 часа до примерно 40 дней после введения указанному млекопитающему, предпочтительно, в течение любого одного из периодов времени примерно 10 дней, 7 дней или 1 дня после введения. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, один раз в неделю обеспечивает in vivo концентрацию чГР в сыворотке примерно более 10 нг/мл чГР на 1 и 2 день после введения, примерно более 5 нг/мл чГР на 3 и 4 день после введения и примерно более 0,3 нг/мл чГР на 5-7 день после введения. В другом варианте осуществления изобретения одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, обеспечивает in vivo концентрацию в сыворотке примерно более 0,3 нг/мл чГР за период времени, составляющий в пределах от примерно 0,5 часа до примерно 10 дней после введения.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, приводит к увеличению in vivo уровня IGF-1 в сыворотке по сравнению с фоновым уровнем IGF-1, имеющимся до указанного введения, до более 50 нг/мл за период времени, составляющий от примерно 10 часов до примерно 72 часов после введения, и примерно до 0,5-50 нг/мл за период времени, составляющий от примерно 72 часов до примерно 15 дней после введения, а предпочтительно, примерно в течение 10 дней после введения. Альтернативно, одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, приводит к увеличению in vivo уровня IGF-1 в сыворотке примерно до 5-2500 нг/мл, предпочтительно, примерно до 100-1000 нг/мл чГР, в течение от примерно 0,5 часа до примерно 40 дней после введения, предпочтительно, в течение примерно 7 дней после введения. Альтернативно, в соответствии с настоящим изобретением одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, приводит к увеличению in vivo концентрации IGF-1 в сыворотке примерно до более 50 нг/мл, предпочтительно, примерно до более 100 нг/мл за период времени, составляющий от примерно 0,5 часа до примерно 40 дней после введения, предпочтительно, в течение 7 дней после введения. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения одно введение кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, приводит к увеличению in vivo уровня IGF-1 в сыворотке по сравнению с базовым уровнем IGF-1, имеющимся до указанного введения, примерно до более 50 нг/мл за период времени, составляющий от примерно 10 часов до примерно 72 часов после введения и примерно до 0,5-50 нг/мл за период времени, составляющий от примерно 72 часов до примерно 15 дней после введения, или от примерно 72 часов до примерно 10 дней после введения.

В соответствии с настоящим изобретением одно введение кристаллов чГР или кристаллов производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, определяется как введение дозы примерно 0,01-100 мг/кг/неделю, где объем введения составляет примерно 0,1-1,5 мл. Так, например, при дефиците гормона роста у детей, доза кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, составляет примерно 0,3 мг/кг в неделю, примерно 9 мг для ребенка весом 30 кг. При синдроме Тернера доза кристаллов чГР или производного чГР, или композиции, содержащей такие кристаллы, составляет примерно 0,375 мг/кг в неделю, примерно 11,25 мг для ребенка весом 30 кг. Кроме того, при дефиците гормона роста у взрослых доза чГР составляет примерно 0,2 мг/кг в неделю, примерно 16 мг для взрослого человека весом 80 кг. При синдроме истощения при СПИД'е, такая доза чГР может составлять 6 мг/день, например 42 мг в неделю.

В еще одном варианте осуществления изобретения кристаллы чГР или производного чГР, или композиция, содержащая такие кристаллы, имеют относительную биологическую доступность, аналогичную биологической доступности растворимого чГР у млекопитающего. Кристаллы по изобретению имеют относительную биологическую доступность по крайней мере 50% или выше по сравнению с биологической доступностью растворимого чГР, вводимого тем же самым способом (например, путем подкожной или внутримышечной инъекции), где указанная биологическая доступность измеряется по площади под кривой (AUC) общей концентрации чГР в сыворотке in vivo для указанного растворимого чГР и для указанных кристаллов. Таким образом, кристаллы чГР или производного чГР характеризуются преимущественными параметрами растворимости in vivo.

Настоящее изобретение также относится к способам введения кристаллов чГР или производного чГР млекопитающему, страдающему расстройством, ассоциированным с дефицитом человеческого гормона роста, или расстройством, симптомы которого могут быть ослаблены путем лечения чГР. Указанный способ включает стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества кристаллов чГР или производного чГР. Альтернативно, указанный способ включает стадию введения млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей только кристаллы чГР или производного чГР, или указанные кристаллы в комбинации с наполнителем. Различными вариантами кристаллов чГР или производного чГР настоящего изобретения являются кристаллы чГР или производного чГР, содержащие кальций, кристаллы, содержащие одновалентный катион, и кристаллы, содержащие протамин или полиаргинин. Такие кристаллы или композиции, содержащие эти кристаллы, могут быть введены примерно один раз в три дня, примерно один раз в неделю, примерно один раз в две недели или примерно один раз в месяц.

Расстройствами, связанными с недостаточностью чГР, которые могут быть подвергнуты лечению способом согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, дефицит гормона роста у взрослых, дефицит гормона роста у детей, синдром Прадера-Вилли, синдром Тернера, синдром укороченной тонкой кишки, хроническая почечная недостаточность, идиопатическая недостаточность роста, карликовость, гипофизарная карликовость, регенерация костей, бесплодие у женщин, замедление внутриматочного роста, кахексия, ассоциированная со СПИД'ом, болезнь Крона, ожоги, а также другие генетические и метаболические нарушения. В одном из вариантов осуществления изобретения указанным расстройством является дефицит гормона роста у детей, и лечение таких детей приводит к ежегодному увеличению роста примерно на 7-11 см.

В другом варианте осуществления изобретения кальцийсодержащие кристаллы чГР или производного чГР могут служить подходящим вспомогательным средством для лечения болезни костей, а также для лечения дефицита человеческого гормона роста у млекопитающих.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции увеличения массы млекопитающего, включающим стадию введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества кристаллов чГР или производного чГР. Альтернативно, такие способы включают стадию введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей кристаллы чГР или производного чГР, и наполнитель. В одном из вариантов указанных способов такое индуцированное увеличение массы у крыс с гипофизэктомией после введения им указанных кристаллов путем инъекции один раз в неделю составляет примерно 5-40%.

Кристаллы чГР, кристаллы производного чГР или композиции, содержащие только одни кристаллы или кристаллы в комбинации с наполнителем, могут быть введены отдельно или как часть фармацевтического, терапевтического или профилактического препарата. Эти кристаллы могут быть введены любым стандартным способом, включая, например, парентеральное, пероральное, пульмональное, интраназальное, аурикулярное, анальное, дермальное, офтальмическое, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное и внутрибрюшинное введение, введение через слизистую, а также подъязычное, подкожное, чрезкожное, местное, трансбуккальное или интракраниальное введение.

В одном из вариантов осуществления изобретения кристаллы чГР или производного чГР, или композиции, содержащие эти кристаллы, в присутствии или в отсутствие наполнителя, вводят перорально или парентерально. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кристаллы чГР или производного чГР, или композиции, содержащие эти кристаллы, в присутствии или в отсутствие наполнителя, вводят подкожно или внутримышечно.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения кристаллы или композиции настоящего изобретения вводят подкожно с использованием иглы калибра 27 или выше. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная игла может иметь калибр 30. Указанные кристаллы или композиции могут быть введены из предварительно наполненного шприца или из инфузионного насоса с дозирующим клапаном. Альтернативно, они могут быть введены путем инъекции безыгольным шприцем.

Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно позволяет обеспечивать пролонгированное высвобождение чГР при его введении млекопитающему. В одном из вариантов осуществления изобретения кристаллы или композиции по изобретению вводят примерно один раз в неделю. В другом варианте осуществления изобретения кристаллы или композиции по изобретению вводят примерно один раз в две недели. В еще одном варианте осуществления изобретения кристаллы или композиции по изобретению вводят примерно один раз в месяц. Для специалиста очевидно, что конкретный курс лечения зависит от таких факторов, как тип заболевания, подвергаемого лечению, возраст и вес пациента, подвергаемого лечению, общее физическое состояние пациента, и назначается лечащим врачом.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения композиции, содержащие кристаллы чГР или производного чГР по изобретению, характеризуются тем, что в них концентрация чГР составляет примерно более 0,1 мг/мл. Так, например, указанная концентрация может составлять примерно 0,1-100 мг/мл. Альтернативно, указанные композиции могут характеризоваться тем, что в них концентрация чГР составляет примерно 1-100 мг/мл или примерно 10-100 мг/мл. Такие композиции также включают следующие компоненты: маннит - от примерно 0,5 мг/мл до примерно 100 мг/мл; ацетат натрия - от примерно 5 мМ до примерно 250 мМ (предпочтительно, от примерно 25 мМ до примерно 150 мМ); Трис-HCl - от примерно 5 мМ до примерно 100 мМ с рН от примерно 6,0 до примерно 9,0 (предпочтительно, от примерно 6,5 до примерно 8,5); ПЭГ (мол. масса 800-8000, предпочтительно 3350, 4000, 6000 или 8000) - примерно 0-25%; протамин, предпочтительно, в отношении чГР:протамин = 3:1; и полиаргинин, предпочтительно, в отношении чГР:полиаргинин = 5:1. Такие композиции могут, но необязательно, содержать сахарозу - от 0 мг/мл до примерно 100 мг/мл; аминокислоты (например, аргинин и глицин) от 0 мг/мл до примерно 50 мг/мл; консерванты (противомикробное средство, фенол, метакрезол, бензиловый спирт, парабензоат (парабен)) от 0% до примерно 5% (предпочтительно от 0% до примерно 0,9%); и полисорбат от 0 мг/мл до примерно 10 мг/мл. В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения композиции по изобретению характеризуются 80% эффективной загрузкой.

Предпочтительный носитель для композиции по изобретению содержит примерно 100 мМ ацетата натрия, примерно 5% ПЭГ с Mw 6000 и примерно 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5. чГР-содержащая композиция, полученная с использованием такого носителя, может содержать примерно 9,35 мг/мл кристаллического чГР и примерно 1,81 мг/мл полиаргинина (или примерно 3,12 мг/мл протамина). Для специалиста очевидно, что если композиции по изобретению содержат чГР в концентрации от примерно 1 мг/мл до примерно 100 мг/мл, то концентрация полиаргинина (или протамина) должна быть соответствующим образом скорректирована так, чтобы она была достаточной для поддержания отношения рчГР:полиаргнинин = 5:1 (мас./мас.) или отношения чГР:протамин = 3:1 (мас./мас.) и для поддержания низкой растворимости и высвобождения чГР в количестве примерно 5 нг/мл. Так, например, для вышеописанной композиции в том случае, если желаемая концентрация кристаллического чГР составляет примерно 20 мг/мл, концентрация полиаргнинина (или протамина) должна составлять примерно 4 мг/мл.

Настоящее изобретение также относится к способам получения кристаллов чГР или производного чГР. Один из таких способов включает стадии: (а) смешивания раствора человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста с раствором для кристаллизации, где указанный раствор для кристаллизации содержит соль и ионогенный полимер; и (b) инкубации указанного раствора в течение примерно более 12 часов при температуре примерно 4-37°С вплоть до образования кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста. В другом варианте осуществления изобретения указанный способ включает стадии: (а) смешивания раствора человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста с раствором для кристаллизации, где указанный раствор для кристаллизации содержит соль и осадитель; и (b) инкубации указанного раствора в течение примерно более 16 часов при температуре примерно 4-37°С вплоть до образования кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста. В другом варианте осуществления изобретения раствор, используемый в стадии (b) любого из описанных выше способов, может быть инкубирован в течение примерно более одной недели при температуре примерно 15°С. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кристаллами чГР или производного чГР являются кристаллы, содержащие кальций; кристаллы, содержащие одновалентный катион; кристаллы, содержащие протамин; или кристаллы, содержащие полиаргинин; а ионногенным полимером является протамин или полиаргинин. В другом варианте осуществления изобретения указанным ионногенным полимером является полилизин или полиортинин. В еще одном варианте осуществления изобретения указанным ионногенным полимером является смесь из любых двух или более полимеров, таких как протамин, полиаргинин и полилизин.

Соль, используемая в стадии (а) в вышеописанных способах, может быть либо одновалентной, либо двухвалентной, а также неорганической или органической. В предпочтительном варианте изобретения двухвалентной солью является соль кальция. В более предпочтительном варианте изобретения соль кальция выбрана из группы, состоящей из ацетата кальция, хлорида кальция, глюконата кальция и сульфата кальция. В еще одном предпочтительном варианте изобретения указанной солью кальция является ацетат кальция. В другом предпочтительном варианте изобретения одновалентный катион выбран из группы, состоящей из лития, натрия, калия и аммония. В более предпочтительном варианте изобретения указанным одновалентным катионом является натрий.

В альтернативном предпочтительном варианте изобретения солью одновалентного катиона является соль натрия. В более предпочтительном варианте изобретения соль натрия выбрана из группы, состоящей из цитрата натрия, фосфата натрия и ацетата натрия. В еще одном предпочтительном варианте изобретения указанной солью натрия является ацетат натрия.

В вышеописанном способе, в том случае, если указанной солью является соль кальция или соль одновалентного катиона, то она присутствует в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (а), в концентрации примерно 0,01 мМ - 1 М. В предпочтительном варианте изобретения эта концентрация составляет примерно 25-205 мМ. Если указанной солью является соль кальция, то она присутствует в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (а), в концентрации примерно 0,01 мМ-235 мМ.

В предпочтительном варианте изобретения раствор для кристаллизации, используемый в стадии (а), дополнительно содержит рН-корректирующий буфер. В более предпочтительном варианте изобретения указанный рН-корректирующий буфер имеет рН примерно 6-10. В более предпочтительном варианте изобретения указанный буфер имеет рН примерно 7,5-10. В более предпочтительном варианте изобретения указанный буфер имеет рН примерно 7,0-10. В еще более предпочтительном варианте изобретения указанный буфер имеет рН примерно 6-9. В еще одном варианте изобретения указанный буфер имеет рН примерно 7,8-8,9.

В другом аспекте вышеописанных способов рН-корректирующий буфер, используемый в стадии (а), выбран из группы, состоящей из триса, HEPES, ацетата, фосфата, цитрата, бората, имидазола и глицина. В предпочтительном варианте вышеописанных способов, рН-корректирующий буфер, используемый в стадии (а), выбран из группы, состоящей из бикарбоната, имидазол-малата, глицина, 2,2-бис(гидроксиметил)-2,2',2”-нитрилтриэтанола (“бис-трис”), карбоната, N-(2-ацетамидо)иминодиуксусной кислоты, 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола и (N-(1-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновой кислоты.

В одном из вышеописанных способов осадитель, используемый для получения кристаллов чГР или производного чГР, обычно является полимером, включая низкомолекулярные полиспирты и протамин. В другом варианте изобретения указанным осадителем, используемым в стадии (а) одного из вышеописанных способов, является неионогенный полимер. В предпочтительном варианте изобретения указанный неионогенный полимер выбран из группы, состоящей из спиртов, полиэтиленгликоля (ПЭГ) и поливинилового спирта или этанола. В еще более предпочтительном варианте изобретения указанным осадителем является изопропиловый спирт или этанол. В еще более предпочтительном варианте изобретения указанный ПЭГ имеет молекулярную массу примерно 200-8000, Указанный ПЭГ может иметь молекулярную массу 3350, 4000, 6000 или 8000. В более предпочтительном варианте изобретения указанный ПЭГ имеет молекулярную массу примерно 6000. В еще одном предпочтительном варианте изобретения указанный ПЭГ присутствует в концентрации примерно 0,5-12% мас./об.

В другом варианте одного из вышеописанных способов указанным осадителем, используемым в стадии (а), является ионогенный полимер. В предпочтительном варианте изобретения указанный ионогенный полимер выбран из группы, состоящей из протамина, полиаргинина, полиорнитина и полилизина.

Стадия смешивания (а) в вышеописанном способе предусматривает смешивание раствора чГР или производного чГР с раствором для кристаллизации. В одном из вариантов такого способа полученная концентрация чГР или производного чГР в указанном растворе для кристаллизации составляет примерно 1-1000 мг/мл. В предпочтительном варианте изобретения чГР или производное чГР в указанном растворе присутствуют в концентрации примерно 2-50 мг/мл. В другом варианте изобретения чГР или производное чГР в указанном растворе присутствуют в концентрации примерно 10-25 мг/мл.

В предпочтительном варианте вышеописанного способа получения кристаллов чГР или производного чГР раствор, содержащий чГР или производное чГР, и раствор для кристаллизации инкубируют в стадии (b) в течение периода времени, составляющего примерно 0,25-2 дня при температуре примерно 33°С. Альтернативно, температура может составлять примерно 37°С. В другом варианте изобретения раствор, содержащий чГР или производное чГР, и раствор для кристаллизации инкубируют в течение периода времени, составляющего примерно 0,25-2 дня при температуре примерно 25°С. В еще одном варианте изобретения раствор, содержащий чГР или производное чГР, и раствор для кристаллизации инкубируют в течение периода времени, составляющего примерно 0,25-2 дня при температуре примерно 15°С.

Настоящее изобретение также относится к альтернативному способу получения кристаллов чГР, кристаллов производного чГР или композиций, содержащих указанные кристаллы и наполнитель. Этот способ включает стадии: (а) смешивания раствора чГР или производного чГР с буфером для кристаллизации с получением раствора для кристаллизации; (b) добавления к указанному раствору для кристаллизации деионизованной воды; (с) добавления к указанному раствору для кристаллизации небольшой ионогенной молекулы или ионогенного полимера; (d) добавления соли к указанному раствору для кристаллизации; и (е) инкубации указанного раствора для кристаллизации в течение примерно 2-168 часов при температуре примерно 10-40°С вплоть до образования кристаллов чГР или производного чГР. В другом варианте изобретения такую инкубацию осуществляют примерно в течение 4-48 часов. В другом предпочтительном варианте изобретения раствор для кристаллизации, используемый в стадии (е) вышеописанного способа, инкубируют в течение примерно 4-48 часов при температуре примерно 4-40°С вплоть до образования кристаллов чГР или производного чГР. В соответствии с альтернативным вариантом изобретения в вышеописанном способе после стадии (b) проводят необязательную стадию. Эта необязательная стадия предусматривает добавление осадителя к раствору для кристаллизации. В другом варианте вышеописанного способа стадия (с) является необязательной. Независимо от того, проводятся указанные необязательные стадии или нет, в предпочтительном варианте изобретения раствор для кристаллизации, используемый в стадии (е), инкубируют в течение примерно 1-2 дней при температуре примерно 15-37°С. В другом предпочтительном варианте изобретения раствор для кристаллизации, используемый в стадии (е), инкубируют в течение примерно 1-2 дней при температуре примерно 4-37°С.

В предпочтительном варианте изобретения в стадии (d) вышеописанного способа указанной солью является соль кальция или соль одновалентного катиона. В предпочтительном варианте кальцийсодержащих кристаллов соль кальция выбрана из группы, состоящей из ацетата кальция, хлорида кальция, глюконата кальция и сульфата кальция. В еще более предпочтительном варианте изобретения солью кальция является ацетат кальция. В предпочтительном варианте изобретения ацетат кальция присутствует в форме водного раствора, имеющего рН примерно 3-9,0. В более предпочтительном варианте изобретения водный раствор ацетата кальция имеет рН примерно 7,0-8,6. В другом варианте изобретения ацетат кальция в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 0,1-205 мМ. В более предпочтительном варианте изобретения ацетат кальция в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 85-100 мМ.

В более предпочтительном варианте изобретения соль одновалентного катиона выбрана из группы, состоящей из лития, натрия, калия и аммония. В еще более предпочтительном варианте изобретения солью одновалентного катиона, используемой в стадии (d) вышеописанного способа, является соль натрия. Аналогичным образом, в более предпочтительном варианте изобретения соль одновалентного катиона выбрана из группы, состоящей из цитрата натрия, фосфата натрия и ацетата натрия. В еще более предпочтительном варианте изобретения солью одновалентного катиона является ацетат натрия. В предпочтительном варианте изобретения ацетат натрия присутствует в форме водного раствора, имеющего рН примерно 3-9,0. В более предпочтительном варианте изобретения водный раствор ацетата натрия имеет рН примерно 7,0-8,6. В другом варианте изобретения ацетат натрия в растворе, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 0,5-800 мМ. В более предпочтительном варианте изобретения ацетат натрия в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 100-500 мМ. Эта концентрация может также составлять примерно 85-100 мМ.

В еще одном предпочтительном варианте изобретения чГР или производное чГР в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е) вышеописанного способа, присутствует в концентрации примерно 2-17,5 мг/мл. В другом предпочтительном варианте изобретения чГР или производное чГР в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 14,5-15,5 мг/мл. В еще одном варианте изобретения чГР или производное чГР в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 2-100 мг/мл.

В предпочтительном варианте изобретения буфер для кристаллизации, используемый в стадии (а) вышеописанного способа, выбран из группы, состоящей из Трис-HCl, HEPES, ацетата, фосфата, цитрата, бората, имидазола и глицина. Альтернативно, указанный буфер для кристаллизации выбран из группы, состоящей из трис-HCl, глицина, HEPES, имидазола, бис-триса, АМР (2-амино-2-метилпропанола), AMPD (2-амино-2-метил-1,3-пропандиола), AMPSO (3-([1,1-диметил-2-гидроксиэтил]амино)-2-гидроксипропансульфоновой кислоты), бицина, этаноламина, глицилглицина, TAPS, таурина, триана и их смесей. В другом предпочтительном варианте изобретения буфер для кристаллизации в растворе, используемом в стадии (а), присутствует в концентрации примерно 10-800 мМ.

В другом варианте вышеописанного способа буфер для кристаллизации, используемый в стадии (а), имеет рН примерно 3-10. В предпочтительном варианте указанный буфер для кристаллизации имеет рН примерно 6-9. В другом предпочтительном варианте указанный буфер для кристаллизации имеет рН примерно 7,5-10.

В другом предпочтительном варианте изобретения рН буфера для кристаллизации в растворе, используемом в стадии (е) вышеописанного способа, составляет примерно 3-10. В более предпочтительном варианте изобретения рН указанного буфера для кристаллизации в растворе составляет примерно 6-9,5. В еще более предпочтительном варианте изобретения рН указанного буфера для кристаллизации в растворе составляет примерно 7,5-9,5.

В предпочтительном варианте указанных способов, которые после стадии (b) включают необязательную стадию добавления осадителя в раствор для кристаллизации, указанным осадителем является небольшая неионогенная молекула или неионогенный полимер. В предпочтительном варианте изобретения неионогенный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилового спирта и их смесей. В другом предпочтительном варианте изобретения ПЭГ имеет молекулярную массу, выбранную из группы, состоящей из молекулярных масс примерно 200-8000, примерно 6000, примерно 4000 и примерно 3350. В другом предпочтительном варианте изобретения ПЭГ, присутствующий в растворе для кристаллизации, имеет концентрацию примерно 0,5-20% (мас./об.). В другом предпочтительном варианте вышеописанного способа осадитель выбран из группы, состоящей из аминокислот, пептидов, полиаминокислот и их смесей.

В другом предпочтительном варианте изобретения в стадии (с) вышеописанного способа ионогенный полимер выбран из группы, состоящей из протамина, полиаргинина, полилизина, полиорнитина и октаргинина. В другом предпочтительном варианте изобретения в стадии (с) вышеописанного способа полиаргинин добавляют в отношении чГР:полиаргинин (мг:мг), составляющем от 5:1 до примерно 1:25. Полученный раствор для кристаллизации инкубируют при температуре примерно 15-37°С в течение от примерно 16 до примерно 48 часов.

Настоящее изобретение относится к еще одному способу получения кристаллов человеческого гормона роста, кристаллов производного человеческого гормона роста или композиций, содержащих такие кристаллы и наполнитель. Этот способ включает стадии: (а) смешивания раствора человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста с буфером для кристаллизации с получением раствора для кристаллизации; (b) добавление к указанному раствору для кристаллизации деионизованной воды; (с) добавления осадителя к указанному раствору для кристаллизации; (d) добавления соли к указанному раствору для кристаллизации; (е) инкубации указанного раствора для кристаллизации в течение примерно 2-168 часов при температуре примерно 10-40°С вплоть до образования кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста; и (f) добавления ионогенного полимера к указанным кристаллам человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста. В соответствии с одним из вариантов вышеописанного способа стадия (f) является необязательной. В предпочтительном варианте изобретения раствор для кристаллизации, используемый в стадии (е), инкубируют в течение примерно 1-2 дней при температуре примерно 15-37°С. В другом предпочтительном варианте изобретения раствор для кристаллизации, используемый в стадии (е), инкубируют в течение примерно 1-2 дней при температуре примерно 4-37°С. В другом варианте изобретения такую инкубацию осуществляют в течение примерно 2-48 часов. В другом предпочтительном варианте изобретения раствор для кристаллизации, используемый в стадии (е) вышеописанного способа, инкубируют в течение примерно 4-48 часов при температуре примерно 4-40°С вплоть до образования кристаллов чГР или производного чГР.

В предпочтительном варианте изобретения в стадии (d) вышеописанного способа указанной солью является соль кальция или соль одновалентного катиона. В более предпочтительном варианте изобретения соль кальция выбрана из группы, состоящей из ацетата кальция, хлорида кальция, глюконата кальция и сульфата кальция. В еще более предпочтительном варианте изобретения солью кальция является ацетат кальция. В предпочтительном варианте изобретения ацетат кальция присутствует в форме водного раствора, имеющего рН примерно 3-9,0. В более предпочтительном варианте изобретения водный раствор ацетата кальция имеет рН примерно 7,0-8,6. В другом варианте изобретения ацетат кальция в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 0,1-205 мМ. В более предпочтительном варианте изобретения ацетат кальция в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 85-100 мМ.

В более предпочтительном варианте изобретения одновалентный катион выбран из группы, состоящей из лития, натрия, калия и аммония. В еще более предпочтительном варианте изобретения одновалентным катионом является натрий. Аналогичным образом, в более предпочтительном варианте изобретения соль одновалентного катиона выбрана из группы, состоящей из цитрата натрия, фосфата натрия и ацетата натрия. В еще более предпочтительном варианте изобретения солью одновалентного катиона является ацетат натрия. В предпочтительном варианте изобретения ацетат натрия присутствует в форме водного раствора, имеющего рН примерно 3-9,0. В более предпочтительном варианте изобретения водный раствор ацетата натрия имеет рН примерно 7,0-8,6. В другом варианте изобретения ацетат натрия в растворе, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 0,5-800 мМ. В более предпочтительном варианте изобретения ацетат натрия в растворе для кристаллизации, используемом в стадии (е), присутствует в концентрации примерно 100-500 мМ. Альтернативно, эта концентрация может также составлять примерно 85-100 мМ.

В предпочтительном варианте изобретения буфер для кристаллизации, используемый в стадии (а) вышеописанного способа, выбран из группы, состоящей из Трис-HCl, HEPES, ацетата, фосфата, цитрата, бората, имидазола и глицина. В другом предпочтительном варианте изобретения буфер для кристаллизации в растворе, используемой в стадии (а), присутствует в концентрации примерно 10-800 мМ.

В предпочтительном варианте изобретения в стадии (с) вышеописанного способа указанным осадителем является небольшая неионогенная молекула или неионогенный полимер. В предпочтительном варианте изобретения указанный неионогенный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилового спирта и их смесей. В другом предпочтительном варианте изобретения ПЭГ имеет молекулярную массу, выбранную из группы, состоящей из молекулярной массы, составляющей примерно 200-8000, примерно 6000, примерно 4000 и примерно 3350. В другом предпочтительном варианте изобретения ПЭГ, присутствующий в растворе для кристаллизации, имеет концентрацию примерно 0,5-20% (мас./об.). В другом предпочтительном варианте в стадии (с) вышеописанного способа указанный осадитель выбран из группы, состоящей из аминокислот, пептидов, полиаминокислот и их смесей.

В другом предпочтительном варианте изобретения в стадии (f) вышеописанного способа указанный ионогенный полимер выбран из группы, состоящей из протамина, полиаргинина, полилизина, полиорнитина и октаргинина. В другом предпочтительном варианте изобретения в стадии (f) вышеописанного способа полиаргинин добавляют в отношении чГР:полиаргинин (мг:мг), составляющем примерно 5:1-1:25. В альтернативном варианте изобретения полиаргнин добавляют в отношении чГР:полиаргинин (мг:мг), составляющем примерно 1:5-1:25. Полученный раствор в стадии (f) инкубируют при температуре примерно 15-37°С в течение от примерно 16 до примерно 48 часов. Влияние полимера на скорость растворения кристаллов чГР или производного чГР определяется числом промываний, необходимых для полного растворения. Для полного растворения контрольного кристалла требуется от примерно 7 до примерно 13 промываний, тогда как для полного растворения кристалла, полученного с использованием полиаргинина, требуется примерно 30-90 идентичных промываний буфером для растворения. Термин “промывание” означает стадии промывания в последовательном процессе растворения (см. пример 5).

В альтернативных вариантах любого из вышеописанных способов соль кальция или соль одновалентного катиона может присутствовать в растворе для кристаллизации в концентрации примерно 0,01-1 M, или примерно 25-205 мМ. В альтернативных вариантах любого из вышеописанных способов раствор для кристаллизации инкубируют в течение периода времени, составляющего примерно 0,25-2 дня при температуре примерно 33°С; или в течение периода времени, составляющего примерно 0,25-2 дня, при температуре примерно 25°С; или в течение периода времени, составляющего примерно 0,25-2 дня, при температуре примерно 15°С.

Настоящее изобретение также относится к способам скрининга кристаллов чГР или производного чГР на возможность их использования в терапевтическом препарате. Стадии таких способов включают: (1) промывание указанных кристаллов чГР или производного чГР буфером для растворения при температуре примерно 37°С (например, 2 мг кристаллов и 1 мл буфера для растворения) и (2) измерение степени растворения in vitro указанных кристаллов чГР или производного чГР за одно промывание в указанном буфере для растворения, где указанная степень растворения in vitro указанных кристаллов составляет примерно 2-16% указанных кристаллов в течение примерно 10-1500 минут, при этом за одну стадию промывания в последовательном процессе растворения такое растворение происходит примерно в течение 2 минут и 32 минут (см. пример 5). Степень растворения in vitro указанных кристаллов может также составлять примерно 4-10% указанных кристаллов примерно за 15 минут или примерно 0,04-0,32 мг указанных кристаллов примерно за 15 минут.

Для лучшего понимания настоящего изобретения представлены нижеследующие примеры. Эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и никоим образом не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

В представленных ниже примерах были использованы следующие материалы:

Материалы

Коммерчески доступный рекомбинантный человеческий гормон роста (рчГР) был закуплен у BresaGen Ltd. (Thebarton, Australia), полиэтиленгликоль со среднечисленной молекулярной массой 4000 или 6000 (ПЭГ-4000 или ПЭГ-6000) был закуплен у Hampton Research (Laguna Niguel, California) и сульфат протамина был закуплен у Fisher, ICN Biomedical Inc. (Pittsburgh, PA). Фосфат аммония, трис-HCl, цитрат натрия, двухосновный фосфат натрия, ацетат кальция, хлорид кальция, ацетат цинка, HEPES, хлорид натрия, хлорид калия, азид натрия, изопропанол (IPA), этанол и монометиловый эфир полиэтиленгликоля поставлялись от Fisher (Pittsburgh, PA). Крысы Sprague-Dawley были получены из лаборатории Charles River Laboratories (Worcester, MA) или у Biomedical Research Laboratories, Inc. (Worcester, MA). Полиаргинин был закуплен у Sigma (St. Louis).

Аналитические методы и анализы

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

Хроматограммы, полученные с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), регистрировали на хроматографе серии Agilent 1100 series HPLC (Palo Alto, CA), снабженном колонкой, 5 см × 4,6 мм, с С5 3 мкм (Supelco, Bellefonte, PA). Образцы растворяли в буфере для растворения (50 мМ HEPES (рН 7,2), 140 мМ NaCl, 10 мМ KCl и 0,02% (об./об.) NaN₃) и перед инжекцией фильтровали (0,2 мкм). Затем проводили мониторинг профилей элюирования при 214 и 280 нм с использованием градиента растворителей А и В. Растворитель А состоял из 99,9% деионизованной воды/0,1% TFA. Растворитель В состоял из 99,9% ацетонитрила/0,1% TFA. Все химические вещества имели ВЭЖХ-чистоту и были закуплены у Fisher. Элюирование проводили в течение 15 минут с использованием градиента 0-2 мин - 40-50% В, 2-12 мин - 50-60% В и 12-15 мин - 60-85% В. Скорость потока составляла 1 мл/мин, а температура колонки поддерживалась при 35°С во время всего процесса хроматографии. Данные анализировали с использованием программы Agilent Chemstation (Palo Alto, CA).

Концентрацию протамина или полиаргинина в препаратах образцов определяли с использованием градиента растворителей А (99,9% деионизованной воды/0,1% TFA) и В (99,9% ацетонитрила/0,1% TFA). Элюирование проводили в течение 20 минут при скорости потока 1 мл/мин с использованием градиента 0-2,5 мин - 95:5 (А:В), 2,5-7,5 мин - 65:35 (А:В), 7,5-15,5 мин - 25:75 (А:В), 15,5-17,0 мин - 25:75 (А:В), 17-17,1 мин - 95:5 (А:В). Обычно элюирование протамина или полиаргинина происходило за 6,2 минуты с использованием интактного чГР, элюирующегося за 14 минут. Площадь под кривой (AUC) вычисляли при 213 нм. Содержание добавок, таких как протамин и/или полиаргинин (мг/мл), вычисляли по калибровочной кривой, построенной для каждой из соответствующих добавок. Тот же самый метод может быть использован для анализа наполнителя, выделяемого из комплексов.

Связанный разлагаемый чГР определяли отдельным, но аналогичным методом с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Так, например, такой анализ проводили на колонке С5 Supelco Discovery Bio Wide Pore Column (5 см × 4,6 мм, с размером частиц 3 мкм и размером пор 30 нм) при температуре термостата 37°С, поддерживаемой во время всего процесса хроматографии. Мониторинг профилей элюирования проводили с использованием градиента, имеющего подвижную фазу А (20% ACN, 80% H₂O, 0,1% TFA) и подвижную фазу В (20% ACN, 80% 2-пропанол, 0,1% TFA). При этом использовали следующую систему градиентов: от 20% до45% В в течение 0-5 минут, от 45% до 55% В в течение 5-15 минут, от 55% до 90% В в течение 15-15,1 минуты, 90% В устанавливалось в течение 17 минут, а затем сразу после проведения этой стадии снова достигалось 20% В в течение 20 минут.

Эксклюзионная хроматография

Хроматограммы, полученные с помощью высокоразрешающей эксклюзионной хроматографии (Э-ВЭЖХ), регистрировали на ВЭЖХ-хроматографе серии Agilent 1100 (Palo Alto, CA), снабженном колонкой TSK-Gel G200SWXL (part# 08450, Tosoh Biosep LLC, Montgomeryville, PA) (7,8 мм × 30 см, 5 мкм) и колонкой MWD серии Agilent 1100 (УФ). Образцы растворяли в 0,2 мл буфера для растворения и 0,2 мкм образца фильтровали, а затем вводили путем инжекции в автоматический сборщик образцов серии Agilent 1100, снабженный терморегулятором. Мониторинг профилей элюирования проводили при 214 и 280 нм с подвижной фазой 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,05% NaN₃, рН 7,5. Температуру колонки поддерживали при 25°С, а растворители дегазировали с использованием дегазатора серии Agilent 1100.

Поглощение в УФ-визуальной области спектра и оптическая микроскопия

Фотографии UV-VIS-спектров получали на спектрофотометре Beckman DU 7400, Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA. Микрофотографии оптических изображений получали методом светлого поля на микроскопе Olympus BX-51 и фиксировали цветной цифровой видиокамерой Sony DXC-97MD 3CCD с использованием программы Image-Pro, Media Cybernetics L.P., Silver Springs, Maryland, при увеличении от 40× до 400×.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)

ПЭМ-анализ осуществляют следующим образом. Суспензии кристаллов чГР в маточном растворе промывают два раза водой для удаления избыточного маточного раствора, а затем подвергают негативному окрашиванию 0,5% уранилацетатом в течение 1 часа. Окрашенные суспензии кристаллов чГР (1-5 мкл) наносят на медные ПЭМ-сетки. Избыточную жидкость удаляют тампоном, и сетку с образцами быстро сушат воздухом. Затем ПЭМ-сетку переносят на предметный столик просвечивающего электронного микроскопа JEOL 1210 и получают изображение с использованием электронного луча в 80 кВ. Внутри кристаллов наблюдается очень хорошо организованная кристаллическая решетка с ориентацией вдоль оси призмы кристалла.

Пример 1

Кристаллизация чГР с использованием фосфата аммония

Коммерчески доступный чГР (50 мг) сначала растворяли в 15 мл Трис-HCl (10 мМ, рН 8,0) и диализовали против 2×4000 мл Трис-HCl (10 мМ, рН 8,0) с использованием диализной трубки (Pierce) с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 10000. Белок концентрировали путем центрифугирования с использованием концентратора Millipore (MWCO 10000) при 4000 об/мин в течение 20-30 минут. Концентрация чГР составляла в пределах 30-45 мг/мл, как было измерено по оптической плотности при 280 нм/0,813 (1 мг/мл чГР А₂₈₀ = 0,813 единиц оптической плотности). Затем к раствору добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 10-20 мг/мл. Кристаллы чГР выращивали путем добавления фосфата аммония (NH₄H₂PO₄)(2,5 М; рН 8,9) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация NH₄H₂PO₄ составляла 860 мМ. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину примерно 8-15 мкм, а выход кристаллизации составлял более 90%. См. фиг.1.

Пример 2

Кристаллизация чГР с использованием цитрата натрия

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 17,5 мг/мл. Кристаллы чГР выращивали путем добавления цитрата натрия (Na-цитрата) (1,5 М) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация Na-цитрата составляла 390 мМ. При этом коррекции рН не требовалось в том случае, если чГР уже содержался в 10 мМ Трис-HCl. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину примерно менее 8 мкм, а выход кристаллизации составлял более 85%. См. фиг.2.

Пример 3

Кристаллизация чГР с использованием фосфата натрия

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 12,5-17,5 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. Кристаллы чГР выращивали путем добавления двухосновного фосфата натрия (Na₂HPO₄) (1 M) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация Na₂HPO₄ составляла 600 мМ. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину примерно 5-25 мкм, а выход кристаллизации составлял более 75%. См. фиг.3.

Пример 4

Кристаллизация чГР

с использованием ацетата кальция и сульфата протамина

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 15 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. К этому раствору добавляли сульфат протамина до конечной концентрации 1 мг/мл. Кристаллы чГР выращивали путем добавления ацетата кальция (Са-ацетата) (1 M) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация Са-ацетата составляла 85 мМ. Затем раствор инкубировали в течение 8 часов при 37°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину менее 20 мкм, а выход кристаллизации составлял более 70%. См. фиг.4.

Пример 5

Профиль растворимости кристаллов чГР,

полученных путем кристаллизации, индуцированной солью

После инкубации растворов для кристаллизации, как описано в примерах 1-4, кристаллы осаждали и остаточный супернатант удаляли. Кристаллический осадок (0,4 мг) ресуспендировали в 0,200 мл буфера для растворения (50 мМ HEPES (рН 7,2), 140 мМ NaCl, 10 мМ KCl и 0,02% (об./об.) NaN₃) путем пипетирования или интенсивного перемешивания с последующим уравновешиванием примерно в течение 15 минут при 37°С. Затем образцы центрифугировали при 10000g в течение 2 минут, и супернатант полностью удаляли для определения концентрации белка, которую измеряли при 280 нм с помощью ОФ-ВЭЖХ, Э-ВЭЖХ или UV-VIS-спектроскопии. Затем кристаллический осадок ресуспендировали в 0,200 мл буфера для растворения и эту процедуру повторяли до тех пор, пока белок уже больше не детектировался в супернатанте. Эту процедуру называют последовательным растворением.

На фиг.5 показан характер растворения различных кристаллов чГР, полученных с использованием солей одновалентных (Na или NH₄) или двухвалентных (Са) солей как описано выше в примерах 1-4, в зависимости от времени в минутах. График растворимости чГР строили как кривую процента общего высвобождения кристаллов, определенного с помощью ОФ-ВЭЖХ, где величины AUC для образцов белка измеряли в мг/мл с помощью UV-VIS-спектрофотометра. Эти данные показывали, что кристаллы чГР, полученные путем добавления 390 мМ Na-цитрата, полностью растворялись через 60 минут. При этом кристаллы чГР, полученные путем добавления 600 мМ Na₂HPO₄ или 860 мМ NH₄H₂PO₄, полностью растворялись через 60 или 75 минут соответственно. С другой стороны, кристаллы чГР, полученные путем добавления 85 мМ Са-ацетата и сульфата протамина, полностью растворялись через 390 минут (см. ниже таблицу 1).

Таблица 1 Тест на последовательное растворение, измеряемое при 280 нм для солей чГР в буфере для растворения. Концентрация белка выражена в процентах от общего высвобожденного белка
Время (минуты)	390 мМ Na-цитрата (пример 2)	600 нМ Na₂HPO₄ (пример 3)	860 нМ NH₄H₂PO₄ (пример 1)	85 мМ Са-ацетат+протамин (пример 4)
0	0,00	0,00	0,00	0,00
15	71,59	78,99	93,77	8,53
30	99,36	99,85	99,18	19,39
45	99,99	99,99	99,50	26,81
60	100,00	100,00	99,50	34,92
75	100,00	100,00	100,00	38,31
90	100,00	100,00	100,00	42,22
105	100,00	100,00	100,00	46,26
120	100,00	100,00	100,00	49,62
135	100,00	100,00	100,00	52,73
150	100,00	100,00	100,00	55,08
165	100,00	100,00	100,00	57,20
180	100,00	100,00	100,00	59,65
195	100,00	100,00	100,00	63,95
210	100,00	100,00	100,00	67,57
225	100,00	100,00	100,00	69,17
240	100,00	100,00	100,00	71,63
255	100,00	100,00	100,00	74,35
270	100,00	100,00	100,00	76,85
285	100,00	100,00	100,00	78,39
300	100,00	100,00	100,00	81,06
315	100,00	100,00	100,00	83,97
330	100,00	100,00	100,00	87,97
345	100,00	100,00	100,00	90,57
360	100,00	100,00	100,00	94,20
375	100,00	100,00	100,00	98,28
390	100,00	100,00	100,00	100,00

Пример 6

Кристаллизация чГР

с использованием ацетата кальция и 10% изопропанола

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 15 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. Кристаллы чГР выращивали путем добавления Са-ацетата (1 M) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация Са-ацетата составляла 85 мМ. К этому раствору добавляли 10% (об./об.) изопропанол (IPA). Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали стержневидные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину более 100 мкм, а выход кристаллизации составлял более 85%. См. фиг.6.

Пример 7

Кристаллизация чГР

с использованием хлорида кальция и 5% изопропанола

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 15 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. Кристаллы чГР выращивали путем добавления хлорида кальция (CaCl₂) (1 M) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация CaCl₂ составляла 85 мМ. К этому раствору добавляли 5% (об/об) IPA. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали стержневидные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину более 200 мкм, а выход кристаллизации составлял более 85%. См. фиг.7.

Пример 8

Кристаллизация чГР с использованием 10% ПЭГ-6000 и 10% этанола

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 25 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. Кристаллы чГР выращивали путем добавления 10% (об./об.) ПЭГ-6000 и 10% (об./об.) этанола (EtOH) к полученному раствору. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 37°С. В результате получали стержневидные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину менее 25 мкм, а выход кристаллизации составлял более 70%. См. фиг.8.

Пример 9

Профиль растворимости кристаллов чГР,

полученных с использованием спирта

После инкубации растворов для кристаллизации, как описано в примерах 6-8, кристаллы осаждали и остаточный супернатант удаляли. Кристаллический осадок ресуспендировали в 0,200 мл буфера для растворения (см. пример 5) путем пипетирования или интенсивного перемешивания с последующим уравновешиванием примерно в течение 15 минут при 37°С. Затем образцы центрифугировали при 10000×g в течение 2 минут и супернатант полностью удаляли для определения концентрации белка, которую измеряли при 280 нм с помощью ОФ-ВЭЖХ, Э-ВЭЖХ или UV-VIS-спектроскопии. Растворение чГР измеряли как процент общего высвобождения кристаллов и определяли путем измерения AUC-величин или UV-VIS-спектров (в мг/мл). Затем кристаллический осадок ресуспендировали в буфере для растворения и эту процедуру повторяли до тех пор, пока белок уже больше не детектировался в супернатанте.

На фиг.9 и в таблице 2 проиллюстрирован характер растворения кристаллов чГР, полученных с использованием 10% IPA/85 мМ Са-ацетата, 5% IPA/85 мМ CaCl₂ и 10% EtOH/10% ПЭГ-6000 в зависимости от времени в минутах. Полученные результаты продемонстрировали, что кристаллы чГР, полученные путем добавления 10% IPA/85 мМ Са-ацетата, полностью растворялись через 150 минут, тогда как кристаллы чГР, полученные путем добавления 5% IPA/85 мМ CaCl₂ и 10% EtOH/10% ПЭГ-6000, полностью растворялись через 120 минут и 135 минут соответственно.

Таблица 2 Результаты in vitro растворения кристаллов чГР, полученных с использованием спирта (примеры 6-8). Концентрацию белка измеряли при 280 нм и выражали в процентах от общего высвобожденного белка
Время (минуты)	10% IPA, 85 мМ Са-ацетата (пример 6)	5% IPA, 85 мМ CaCl₂ (пример 7)	10% EtOH, 10% ПЭГ-6000 (пример 8)
0	0,00	0,00	0,00
15	19,39	70,16	76,12
30	53,88	82,84	86,50
45	74,59	92,33	92,33
60	84,13	96,03	94,62
75	90,64	98,48	94,87
90	95,47	99,91	96,28
105	98,32	99,94	96,82
120	99,51	100,00	99,68
135	99,51	100,00	100,00
150	100,00	100,00	100,00
165	100,00	100,00	100,00
180	100,00	100,00	100,00

Пример 10

Кристаллизация чГР

с использованием ацетата кальция и 2% ПЭГ-6000

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 15 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. К этому раствору добавляли 2% (об./об.) ПЭГ-6000. Кристаллы чГР выращивали путем добавления Са-ацетата (1 M) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация Са-ацетата составляла 85 мМ. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину примерно 25-75 мкм, а выход кристаллизации составлял более 85%. См. фиг.10.

Пример 11

Кристаллизация чГР с использованием ацетата натрия и 6% ПЭГ-6000

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 15 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. К этому раствору добавляли 6% (об./об.) ПЭГ-6000. Кристаллы чГР выращивали путем добавления ацетата натрия (Na-ацетата) (2 М) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация Na-ацетата составляла 500 мМ. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину примерно 25-75 мкм, а выход кристаллизации составлял более 85%. См. фиг.11.

Пример 12

Кристаллизация чГР

с использованием хлорида кальция и 6% ПЭГ-6000

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 15 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. К этому раствору добавляли 6% (об./об.) ПЭГ-6000. Кристаллы чГР выращивали путем добавления CaCl₂ (1 M) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация CaCl₂ составляла 85 мМ. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину более 100 мкм, а выход кристаллизации составлял более 90%. См. фиг.12.

Пример 13

Кристаллизация чГР с использованием ацетата кальция,

6% ПЭГ-6000 и сульфата протамина

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 15 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. К этому раствору добавляли сульфат протамина (1 мг/мл) и 6% ПЭГ-6000 (об./об.). Кристаллы чГР выращивали путем добавления Са-ацетата (1 M) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация Са-ацетата составляла 85 мМ. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 37°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину менее 25 мкм, а выход кристаллизации составлял более 70%. См. фиг.13.

Пример 14

Кристаллизация чГР

с использованием ацетата кальция и 6% ПЭГ-ММЕ-5000

Коммерчески доступный чГР очищали и концентрировали, как описано в примере 1. К концентрированному раствору чГР добавляли деионизованную воду с получением конечной концентрации белка 15 мг/мл. Затем добавляли Трис-HCl (1 M, рН 8,6) до конечной концентрации 100 мМ. К этому раствору добавляли 6% (об./об.) монометиловый эфир полиэтиленгликоля-5000 (ПЭГ-ММЕ-5000). Кристаллы чГР выращивали путем добавления Са-ацетата (1 M) к полученному раствору так, чтобы конечная концентрация Са-ацетата составляла 125 мМ. Затем раствор инкубировали в течение 16 часов при 25°С. В результате получали иглообразные кристаллы, которые визуализировали с помощью оптической микроскопии. Было установлено, что полученные кристаллы имели длину менее 50 мкм, а выход кристаллизации составлял более 90%. См. фиг.14.

Пример 15

Профиль растворимости кристаллов чГР,

полученных с использованием полиэтиленгликоля

После инкубации растворов для кристаллизации, как описано в примерах 10-14, кристаллы осаждали и остаточный супернатант удаляли. Кристаллический осадок ресуспендировали в 0,2 мл буфера для растворения (см. пример 5) путем пипетирования или интенсивного перемешивания с последующим уравновешиванием примерно в течение 15 минут при 37°С. Затем образцы центрифугировали при 10000×g в течение 2 минут и супернатант полностью удаляли для определения концентрации белка, которую измеряли при 280 нм с помощью ОФ-ВЭЖХ, Э-ВЭЖХ или UV-VIS-спектроскопии. Затем кристаллический осадок ресуспендировали в буфере для растворения и эту процедуру повторяли до тех пор, пока в белок уже больше не детектировался в супернатанте.

На фиг.15 и в таблице 3 проиллюстрирован характер растворения кристаллов чГР, полученных с использованием 2% ПЭГ-6000/85 мМ Са-ацетата, 6% ПЭГ-6000/500 мМ Na-ацетата, 6% ПЭГ-6000/85 мМ CaCl₂, 6% ПЭГ-6000/85 мМ Са-ацетата/протамина и 6% ПЭГ-ММЕ-5000/125 мМ Са-ацетата в зависимости от времени в минутах. Растворимость чГР измеряли как процент общего высвобождения кристаллов и определяли путем измерения величин AUC и UV-VIS-спектров в мг/мл. Полученные результаты продемонстрировали, что медленнее всего растворялись кристаллы чГР, полученные путем добавления 6% ПЭГ-6000/85 мМ Са-ацетата/протамина, причем полное их растворение достигалось через 495 минут. Кристаллы, полученные путем добавления 2% ПЭГ-6000/85 мМ Са-ацетата, растворялись через 300 минут, а другие кристаллы чГР растворялись за меньший период времени.

Таблица 3 Тест на последовательное растворение ПЭГ- и сольсодержащего чГР в буфере для растворения, измеряемое при 280 нм. Концентрация белка выражена в процентах от общего высвобожденного белка
Время (минуты)	2% ПЭГ-6000/85 мМ Са-ацетат (пример 10)	6% ПЭГ-6000/500 мМ Na-ацетат (пример 11)	6% ПЭГ-6000/85 мМ Са-хлорид (пример 12)	6% ПЭГ-6000/85 мМ Са-ацетат/сульфат протамина (пример 13)	6% ПЭГ-ММЕ-5000/125 мМ Са-ацетат (пример 14)
0	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
15	8,41	14,23	6,63	5,66	9,50
30	16,80	23,03	19,50	11,58	28,46
45	27,64	34,74	37,74	17,22	48,04
60	35,57	47,34	54,60	21,25	62,61
75	48,57	65,16	67,67	24,63	73,76
90	56,18	78,86	77,90	28,15	82,70
105	62,70	88,66	85,26	31,77	91,15
120	66,49	90,36	90,59	34,05	95,70
135	70,07	90,36	95,18	38,83	98,18
150	72,87	90,36	98,04	40,60	99,60
165	74,82	90,58	100,00	43,28	100,00
180	90,23	93,06	100,00	45,69	100,00
195	90,23	95,80	100,00	47,52	100,00
210	90,23	100,00	100,00	51,27	100,00
225	92,90	100,00	100,00	53,38	100,00
240	92,90	100,00	100,00	55,31	100,00
255	96,61	100,00	100,00	57,24	100,00
270	96,61	100,00	100,00	58,61	100,00
285	96,61	100,00	100,00	60,28	100,00
300	100,00	100,00	100,00	64,90	100,00
315	100,00	100,00	100,00	68,04	100,00
330	100,00	100,00	100,00	72,46	100,00
345	100,00	100,00	100,00	76,26	100,00
360	100,00	100,00	100,00	79,36	100,00
375	100,00	100,00	100,00	83,20	100,00
390	100,00	100,00	100,00	86,17	100,00
405	100,00	100,00	100,00	89,15	100,00
420	100,00	100,00	100,00	92,25	100,00
435	100,00	100,00	100,00	94,40	100,00
450	100,00	100,00	100,00	95,96	100,00
465	100,00	100,00	100,00	98,07	100,00
480	100,00	100,00	100,00	99,07	100,00
495	100,00	100,00	100,00	100,00	100,00

Пример 16

Фармакокинетические исследования на крысах Sprague-Dawley

Дозу 2,5 мг/кг суспензии растворимого (коммерчески доступного) или кристаллического (85 мМ Са-ацетат/2% ПЭГ-6000) чГР, полученных как описано в примере 10, подкожно вводили 24 самкам крыс Sprague-Dawley. Средний вес каждой крысы составлял 200 г. 24 крысы разделяли на две группы. Каждая группа включала 3 подгруппы, каждая из которых состояла из 4 крыс. Затем у крыс каждой подгруппы три раза через определенные интервалы времени брали кровь через трубку, имплантированную в яремную вену. Из-за ограниченного количества крови, которое можно было взять в данный момент времени, использовали метод “перескакивания”. Для поддержания стабильности животных в указанный момент времени брали кровь у подгрупп животных, входящих в данные группы. Затем регистрировали пробы сыворотки и получали кривую с линейной монотонно возрастающей зависимостью от времени. Стандартные отклонения определяли по отклонению уровней в сыворотке для данной подгруппы в данный момент времени среднего для данной подгруппы. См. таблицы 4-6. В таблицах 4-5 животным, обозначенным 1-12, вводили растворимый чГР, а животным, обозначенным 13-24, вводили кристаллический чГР в дозе 500 мкг для каждого животного.

На фиг.16 проиллюстрированы уровни растворимого чГР и кристаллического чГР в сыворотке в зависимости от времени. Время полужизни кристаллического чГР почти в 19 раз превышало время полужизни растворимого чГР. Время, за которое концентрация чГР в сыворотке достигала максимума, составляло 4 часа для кристаллизованного чГР и 0,5 часа - для растворимого чГР. При обработке групп и подгрупп крыс растворимым чГР или кристаллическим чГР в концентрации 5,5 мг/мл, т.е. дозой, равной 2,2 мг/кг, получали величины С_max, перечисленные ниже в таблице 6, которые указывали на то, что максимальная концентрация чГР в сыворотке при его введении в кристаллической форме была значительно ниже по сравнению с максимальной концентрацией, полученной при введении идентичной дозы растворимой формы. Кроме того, площади под кривыми (AUC), построенными для общего уровня растворимого чГР в сыворотке и для уровня кристаллического чГР, были аналогичными, что указывало на то, что кристаллизация не оказывала значительного влияния на биологическую доступность. Значение Т_90% было вычислено как для растворимого, так и для кристаллического чГР. Этот параметр указывает на время, за которое достигается 90% от всей AUC. Более высокое значение Т_90% указывает на более длительное пребывание лекарственного средства в сыворотке. Результаты Т_90%, приведенные в таблице 6, ясно указывают на то, что кристаллическая форма чГР обеспечивает значительно более длительное пребывание чГР в сыворотке, чем растворимая форма чГР.

Таблица 4 Результаты фармакокинетических исследований растворимого чГР на животных
Животные	Время отбора пробы крови (часы)	Средний уровень чГР в сыворотке (нг/мл)	Стандартное отклонение
1-4	0	0,00	0,00
5-8	0,5	1171,65	116,03
9-12	1	924,49	67,90
1-4	2	726,84	163,83
5-8	4	205,90	29,40
9-12	6	17,48	6,66
1-4	8	1,14	1,68
5-8	12	0,00	0,00
9-12	24	0,00	0,00
	Всего =	3047,50

Таблица 5 Результаты фармакокинетических исследований кристаллического чГР на животных (85 мМ Са-ацетата/2% ПЭГ-6000)
Животные	Время (часы)	Средний уровень чГР в сыворотке (нг/мл)	Стандартное отклонение
13-16	0	0,00	0,00
17-20	0,5	151,39	60,30
21-24	1	159,19	69,50
13-16	2	236,64	75,70
17-20	4	334,08	63,86
21-24	6	302,69	73,09
13-16	8	193,22	23,10
17-20	12	6,50	6,39
21-24	24	2,69	0,74
	Всего =	1386,379

Таблица 6 Фармакокинетические параметры, полученные исходя из данных, представленных в таблицах 4 и 5
	Растворимый	Кристаллический
Количество (мкг)	500	500
Доза (мг/кг)	2,5	2,5
Время полужизни (ч)	0,5	9,4
С_max (нг/мл)	1172	334
Т_max (ч)	0,5	4
AUC (0-t) (нг/ч/мл)	2819	2472
AUC (2)	2819	2508
Т_90% (ч)	4	10

Пример 17

Влияние сульфата протамина

на параметры растворимости кристаллов чГР

На фиг.17 показаны количества кристаллов чГР, полученных, как описано в примере 10 (85 мМ ацетата кальция, 2% (об./об.) ПЭГ-6000 и 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6)) и растворенных после инкубации в течение 1 часа в буфере для растворения при 37°С и после добавления указанного количества сульфата протамина к предварительно полученному раствору кальцийсодержащих кристаллов чГР. Отношения чГР:протамин (мг:мг) указаны на фиг.17. Как видно из этого графика, протамин оказывает значительное влияние на растворимость кристаллов чГР.

Пример 18

Кристаллизация чГР с использованием ацетата натрия

В этом примере основную замороженную массу питательного раствора растворимого рекомбинантного чГР (рчГР) получали из двух источников, одним из которых была E. coli (Novartis), а другим - дрожжи (Lucky Gold). Проводимые отдельно анализы рчГР, полученных из маточных растворов E. coli и дрожжей, показали, что рчГР имеет одинаковые параметры кристаллизации и растворимости, независимо от его происхождения. Приблизительно 3,3 мл (10-20 мг/мл рчГР, поставляемого в неизвестном буфере) оттаянного питательного раствора рчГР, очищали на обессоливающей колонке 10 DG, поставляемой BioRad. Перед загрузкой образца колонку кондиционировали путем промывки 30 мл Трис-HCl (10 мМ, рН 8,0). Затем образец рчГР загружали и оставляли для его прохождения в колонку под действием силы тяжести. После отбрасывания первых 3 мл элюента добавляли еще 5,0 мл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Затем элюировали и собирали 4,5 мл обессоленного рчГР. После этого проводили концентрирование путем центрифугирования при 3500 об/мин в течение 20-30 минут с использованием концентратора Millipore (MWCO 10000). Концентрация чГР составляла в пределах 30 мг/мл, как было измерено по оптической плотности при 280 нм/0,813 (А₂₈₀ для 1 мг/мл чГР = 0,813 единиц оптической плотности). Кристаллы чГР выращивали путем добавления деионизованной воды, Трис-HCl (рН 8,6), ПЭГ-6000 и Na-ацетата до конечной концентрации 100 мМ, 6% (об./об.) и 500 мМ соответственно в общий раствор с конечной концентрацией белка 15 мг/мл. После этого раствор подвергали мягкому размешиванию и инкубировали при 33°С в течение 12-16 часов. В результате получали иглообразные или стержневидные кристаллы, которые визуализировали с помощью ПЭМ (просвечивающей электронной микроскопии) (фиг.18А и 18В). Кристаллы имели длину примерно 2-25 мкм. После центрифугирования и осаждения кристаллов супернатант экстрагировали, при этом выход кристаллизации составлял более 85%. Такие кристаллы могут быть также получены при температуре 33-15°С, но для этого требуется более длительное время кристаллизации и возможен более низкий выход.

Пример 19

Образование комплексов натрийсодержащих кристаллов чГР с добавленным ионогенным полимером

После определения выхода кристаллизации (см. пример 18) натрийсодержащие кристаллы рчГР ресуспендировали в маточном растворе (250 мМ NaOAc, 25 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 6% ПЭГ-6000 и либо 7 мг/мл сульфата протамина, либо 4,2 мг/мл полиаргинина) так, чтобы конечная концентрация натрийсодержащих кристаллов рчГР составляла 21 мг/мл. Отношение белок:добавка, то есть рчГР:сульфат протамина, составляло приблизительно 3:1 (мг:мг), а отношение рчГР:полиаргинин составляло 5:1 (мг:мг). Были также вычислены молярные отношения, которые составляли приблизительно 1:1,715 для рчГР:протамин, и приблизительно 1:0,587 для рчГР:полиаргинин. Вышеуказанный осадок рчГР подвергали гомогенному ресуспендированию в подходящем маточном растворе и инкубировали в течение ночи при 2-8°С, а затем центрифугировали с получением конденсированного осадка. Супернатанты удаляли и полученный осадок ресуспендировали в том же самом маточном растворе (без ионогенной полимерной добавки) и хранили при 4°С.

Другие отношения рчГР:ионогенная полимерная добавка могут быть получены путем варьирования концентрации добавки (мг/мл) в маточном растворе при ресуспендировании до получения концентрации рчГР 21 мг/мл. Так, например, возрастающие концентрации сульфата протамина (10,5 мг/мл) маточного раствора могут быть использованы для получения после ресуспендирования отношения рчГР:добавка 2:1.

Пример 20

Кристаллизация чГР с использованием ацетата цинка

Кристаллизация чГР с использованием ацетата цинка и ацетона

Приблизительно 3,3 мл (10-20 мг/мл) оттаянного питательного раствора рчГР очищали на обессоливающей колонке 10 DG, поставляемой BioRad. Перед загрузкой образца колонку кондиционировали путем промывания 30 мл Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (10 мМ, рН 6,1). Затем образец рчГР загружали и оставляли для его прохождения в колонку под действием силы тяжести. После отбрасывания первых 3 мл элюента добавляли еще 5,0 мл 10 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, рН 6,1. Затем элюировали и собирали 4,5-мл аликвоту обессоленного рчГР. После этого проводили концентрирование путем центрифугирования при 3500 об/мин в течение 5-10 минут с использованием концентратора Millipore (MWCO 10000). Концентрация чГР составляла в пределах 15 мг/мл, как было измерено по оптической плотности при 280 нм/0,813 (А₂₈₀ для 1 мг/мл чГР = 0,813 единиц оптической плотности). Кристаллы чГР выращивали путем добавления 400 мкл маточного раствора, содержащего деионизованную воду, 8,91 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, рН 6,1, 0,88 мг/мл ацетата цинка, 9,89% ацетона, к 100 мкл полученного белка

(15 мг/мл белка в 10 мМ Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, рН 6,1). Затем раствор подвергали мягкому размешиванию и инкубировали при 15°С в течение 24-48 часов. В результате получали кристаллы гексагональной формы, имеющие ширину в пределах приблизительно от 2 до 25 мкМ. После центрифугирования и осаждения кристаллов супернатант экстрагировали и определяли выход кристаллизации, который по грубым оценкам составил 55%.

Пример 21

Кристаллизация чГР с использованием ацетата кальция и образование комплекса кальцийсодержащего чГР

с ионогенной полимерной добавкой (полиаргинином)

В этом примере основную замороженную массу питательного раствора растворимого рекомбинантного чГР (рчГР) получали из двух источников, одним из которых была E. coli (Novartis), а другим - дрожжи (Lucky Gold). Приблизительно 3,5 мл (12 мг/мл рчГР в Трис-HCl (10 мМ, рН 8,0)) оттаянного питательного раствора рчГР очищали на обессоливающей колонке 10 DG, поставляемой BioRad. Перед загрузкой образца колонку кондиционировали путем промывания 30 мл Трис-HCl (10 мМ, рН 8,0). Затем образец рчГР загружали и оставляли для его прохождения в колонку под действием силы тяжести. После отбрасывания первых 3 мл элюента, добавляли еще 5,0 мл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Затем элюировали и собирали 4,5 мл обессоленного рчГР. После этого проводили концентрирование путем центрифугирования с использованием концентратора Millipore (MWCO 10000) при 3500 об/мин в течение 20-30 минут. Концентрация чГР составляла в пределах 30 мг/мл, как было измерено по оптической плотности при 280 нм/0,813 (А₂₈₀ для 1 мг/мл чГР = 0,813 единиц оптической плотности). Кристаллы чГР выращивали путем добавления 1 M Трис-HCl (рН 8,6), 50% ПЭГ-6000 и 1 M Са-ацетата в исходный раствор, содержащий 30 мг/мл рчГР, в результате чего получали конечные концентрации 15 мг/мл рчГР, 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 2% (об./об.) ПЭГ-6000 и 85 мМ Са-ацетата. Затем раствор подвергали мягкому размешиванию и инкубировали при 33°С в течение 12-16 часов. В результате получали иглообразные кристаллы, имеющие длину примерно 2-25 мкм. После экстракции супернатанта и после центрифугирования и осаждения кристаллов выход кристаллизации составлял более 85%. Такие кристаллы могут быть также получены при температуре 33-15°С, но для этого требуется более длительное время кристаллизации и возможен более низкий выход. После определения выхода кристаллизации (см. пример 18), кальцийсодержащие кристаллы рчГР ресуспендировали в фармацевтическом носителе (5 мМ СаОАс, 100 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 6% ПЭГ-6000 и 4,2 мг/мл полиаргинина) так, чтобы конечная концентрация кальцийсодержащих кристаллов рчГР составляла 21 мг/мл. Отношение белок:добавка, то есть рчГР:полиаргинин, составляло 5:1 (мг:мг). Было также вычислено молярное отношение рчГР:полиаргинин, которое составляло приблизительно 1:0,587. Вышеуказанный осадок рчГР подвергали гомогенному ресуспендированию в подходящем маточном растворе и инкубировали в течение ночи при 2-8°С, а затем центрифугировали с получением конденсированного осадка. Супернатанты удаляли и полученный осадок ресуспендировали в том же самом маточном растворе без ионогенной добавки и хранили при 4°С.

Пример 22

Фармакокинетические и фармакодинамические исследования, проводимые на крысах Sprague-Dawley,

которым подкожно вводили чГР,

и содержащие двухвалентный катион кристаллы чГР

Это исследование имело целью определить уровень регулируемого высвобождения чГР из суспензий кристаллов чГР и определить степень увеличения массы животного после подкожной имплантации суспензий кристаллов чГР крысам Sprague-Dawley с гипофизектомией. Протокол исследований приводится ниже:

^аВсе образцы хранили при 4°С и нагревали до комнатной температуры в течение 30 минут, а затем разводили фармацевтическим носителем, определенным в (d), если это необходимо, и инъецировали указанному числу крыс.

^bБуфер содержал 7,5 мг/мл D-маннита, 12 мг/мл сахарозы.

^сКоммерчески доступный чГР закупали у BesaGen Ltd., Australia.

^d5 мМ СаОАс, 4% ПЭГ-6000, 0,025 М глицина (рН 8,6), 15 мг/мл D-маннита, 60 мг/мл сахарозы.

^еАцетат цинка, NaH₂PO₄ (рН 6,1), этанол.

^fОдин сформулированный носитель, определенный в (d), использовали в качестве носителя-контроля для всех указанных групп.

После доставки животных 80 самок крыс Sprague-Dawley, имеющих массу приблизительно 150 граммов ±25 г и возраст примерно 4-6 недель, помещали в отдельные клетки в регулируемых условиях (температура примерно 21±3°С; относительная влажность 50±20%; суточный режим (24 часа): 12 часов - день и 12 часов - ночь; смена воздуха 10-15 раз за один час), и этим крысам обеспечивали свободный (ad libitum) доступ к чистой воде и к лабораторному корму в процессе исследования). Перед тестированием крыс оставляли на одну неделю для акклиматизации.

Из 80 крыс 48 крысам вводили суспензии чГР, как указано в таблице 7. Тестируемые соединения вводили один раз на 1-й день или ежедневно непрерывно в течение 7 дней в виде разовой ударной дозы путем подкожной инъекции в область спины. Место инъекции выбривали и помечали за 3 дня до введения дозы, и позже, если это было необходимо для облегчения инъекции. Тестируемые соединения вводили с использованием 300-мкл шприца с иглой калибра 30×8 мм. Для придания однородности суспензии или раствору пробирки с тестируемыми соединениями осторожно переворачивали перед забором этих соединений в шприц, не вызывая при этом образования пены, а затем шприц с тестируемыми соединениями снова переворачивали перед их введением животному. Объем инъекции составлял приблизительно 0,1 мл на крысу.

Пробы крови у крыс групп 1, 5, 7 и 8 (каждая группа включала по 3 крысы) брали через 4, 32, 96 и 168 часов после инъекции на день 1. Для отбора проб каждую группу крыс 2, 3, 4 и 9 (по 9 крыс на группу) дополнительно подразделяли на 3 группы, по 3 крысы в каждой. В данном случае пробы крови брали у крыс первой подгруппы через 0,5, 24, 72 и 168 часов, у крыс второй подгруппы - через 4, 32, 96 и 168 часов, а у крыс третьей подгруппы - через 8, 48, 120 и 168 часов после инъекции на день 1. Кровь обычно брали у крыс без анестезии или с анестезией CO₂/О₂ через орбитальный синус и собирали в пробирки BD Microtainer с помощью сывороточных сепараторов. Затем пробы крови центрифугировали примерно при 4°С, сыворотку отделяли и хранили в замороженном виде (примерно при -80°С) до определения уровней чГР и IGF-1.

Затем собирали пробы сыворотки и анализировали, и в случае групп 2, 3, 4 и 9 наблюдалась линейная монотонно возрастающая зависимость от времени. Стандартные отклонения определяли по отклонению уровней в сыворотке для данной подгруппы в данный момент времени от среднего для данной подгруппы. См. таблицы 8-14 и фиг.19А. Показаны уровни чГР в сыворотке (нг/мл) при его введении в виде конкретной кристаллической композиции. У животных брали кровь в соответствии с указанным протоколом исследования через определенные промежутки времени в зависимости от дозы. Полученные результаты ясно указывали на различие между абсорбцией комплексного кристаллического материала (например, комплекса с протамином и полиаргинином) и некомплексных кристаллических композиций (например, СаОАс и ZnOAc).

Таблица 8 Результаты фармакокинетических исследований чГР для группы 2: ежедневно вводимый растворимый чГР
Животные	Время отбора проб крови (часы)	Средний уровень чГР в сыворотке (нг/мл)	Стандартное отклонение
Все	0	0	0
1-3	1	1262	18
4-6	4	234	45
7-9	8	2	2
1-3	24	1218	258
4-6	32	3	1
7-9	48	0	0
1-3	72	1098	40
4-6	96	0	0
7-9	120	1355	337
Все	168	0	0
	Всего =	5174

Таблица 9 Результаты фармакокинетических исследований чГР для группы 3: Са-ацетат, ПЭГ
Животные	Время отбора проб крови (часы)	Средний уровень чГР в сыворотке (нг/мл)	Стандартное отклонение
Все	0	0,00	0,00
1-3	0,5	1927	771
4-6	4	5204	1040
7-9	8	1409	881
1-3	24	1	0,49
4-6	32	0,00	0,00
7-9	48	0,00	0,00
1-3	72	0,00	0,00
4-6	96	0,00	0,00
7-9	120	0,00	0,00
Все	168	0,00	0,00
	Всего =	8542

Таблица 10 Результаты фармакокинетических исследований чГР для группы 4: Са-ацетат, ПЭГ, протамин
Животные	Время отбора проб крови (часы)	Средний уровень чГР в сыворотке (нг/мл)	Стандартное отклонение
Все	0	0,00	0,00
1-3	0,5	0,00	0,00
4-6	4	38	27
7-9	8	961	385
1-3	24	1468	357
4-6	32	192	73
7-9	48	190	266
1-3	72	0	0
4-6	96	0	0
7-9	120	0	0
Все	168	0	0
	Всего =	2849

Таблица 11 Результаты фармакокинетических исследований чГР для группы 5: Zn-ацетат
Животные	Время отбора проб крови (часы)	Средний уровень чГР в сыворотке (нг/мл)	Стандартное отклонение
Все	0	0,00	0,00
1	4	2417	767
2	32	1	1
3	96	0	0
Все	168	0	0
	Всего =	2418

Таблица 12 Результаты фармакокинетических исследований чГР для группы 9: Са-ацетат, полиаргинин
Животные	Время отбора проб крови (часы)	Средний уровень чГР в сыворотке (нг/мл)	Стандартное отклонение
Все	0	0,00	0,00
1-3	1	502	75
4-6	4	846	102
7-9	8	1036	448
1-3	24	634	462
4-6	32	543	168
7-9	48	407	169
1-3	72	9	0
4-6	96	0,00	0,00
7-9	120	0,00	0,00
Все	168	0,00	0,00
	Всего =	3980

Таблица 13 Фармакокинетические параметры, полученные исходя из данных, представленных в таблицах 8-12
Группы	Доза за 7 дней	С_max (нг/мл)	Т_max (ч)
2: Растворимый чГР для ежедневного введения	6,7 мг/кг	1262,70	1
3: Са-ацетат, ПЭГ	6,7 мг/кг	5203,80	4
4: Са-ацетат, ПЭГ, протамин	6,7 мг/кг	1468,47	8
5: Zn-ацетат	6,7 мг/кг	2416,97	4
9: Са-ацетат, полиаргинин	6,7 мг/кг	1036,63	8

Массу каждой крысы измеряли и регистрировали перед инъекцией на 1-й день исследования и позже, в каждое последующее утро проведения исследования перед отбором проб крови. В соответствии с этим увеличение или потерю массы каждой крысы в каждой группе вычисляли путем вычитания значения массы животного на день 1 (перед инъекцией) из значения массы каждого следующего дня (перед инъекцией). Среднее значение массы всех крыс данной группы вычисляли на каждый день. Эти результаты приводятся в таблице 14.

Таблица 14 Увеличение или потеря массы (граммы) у крыс Sprague-Dawley на каждый день
Группа	День 1	День 2	День 3	День 4	День 5	День 6	День 7	День 8
1	0	-3,31	1,00	-0,02	-4,78	-6,82	-9,02	-7,45
2	0	1,68	6,82	3,55	5,07	7,06	7,86	12,69
3	0	3,09	3,97	2,08	1,55	2,07	0,33	2,02
4	0	6,10	9,25	5,80	1,15	3,95	5,01	6,20
5	0	-0,09	1,40	-0,48	0,01	-1,41	-2,22	-0,95
7	0	-3,96	0,62	1,39	1,70	2,09	1,24	2,13
8	0	-2,18	-0,27	-1,42	0,85	-0,82	-1,16	0,61
9	0	4,17	8,45	8,81	8,09	9,10	7,31	10,00

В таблице 14 и на фиг.19В проиллюстрирован семидневный эффект введения одной дозы (в 1-й день) кристаллов по изобретению по сравнению с эффектом введения ежедневной дозы коммерчески доступного чГР. Так, например, на фиг.19В продемонстрировано, что введение кальцийсодержащих кристаллов чГР в комплексе с полиаргинином приводит к увеличению массы по сравнению с массой, которая достигается при введении только одной дозы стандартного растворимого чГР за тот же самый период. Сравнение увеличения массы и соответствующих профилей высвобождения рчГР в сыворотке со всей очевидностью показало, что более длительное высвобождение полиаргининсодержащей композиции коррелирует с меньшей скоростью увеличения массы.

Пример 23

Сравнительное фармакокинетическое исследование,

проводимое на молодых самках собакоподобных обезьян

Целью настоящего исследования является оценка in vivo фармакокинетического профиля кристаллического рекомбинантного человеческого гормона роста (рчГР) при его подкожном введении самкам собакоподобных обезьян. Эти данные получали для в целях установления модели регулируемого высвобождения кристаллического рчГР в сыворотке крови и увеличения массы в зависимости от высвобождения кристаллического рчГР.

Таблица 15 Протокол исследований I для приматов
Группа #	Образец	Введение дозы^с (часы)	Уровень дозы (мг/кг)	Концентра ция дозы (мг/мл)	Объем дозы (мл/кг)	Число животных (самки)
1	Ежедневно вводимый растворимый^а	0, 24, 48, 72, 96, 120, 144	0,8	3,2	0,25	4
2	Na-ацетат, ПЭГ, полиаргинин^b	0	5,6	22,4	0,25	4
3	Na-ацетат, ПЭГ, протамин^b	0	5,6	22,4	0,25	4

^аКоммерчески доступный чГР (растворимая некристаллизованная форма) закупали у Novartis и подвергали диафильтрации в WFI. Животным группы 1 (положительный контроль) вводили растворимый чГР ежедневно в период введения.

^bСм. примеры 18 и 19 для получения препарата.

^сВсе дозы вводили после ежедневного отбора проб крови.

Двенадцать молодых самок собакоподобных обезьян разделяли на три группы, каждая из которых содержала по четыре животных на группу, и этим животным вводили либо растворимый рчГР (группа 1), либо натрийсодержащие кристаллы рчГР с ПЭГ и полиаргинином (группа 2, примеры 18 и 19), либо натрийсодержащие кристаллы рчГР с ПЭГ и протамином (группа 3, примеры 18 и 19). Обезьян, имеющих массу 2-6 кг и возраст 4-7 лет на начало проведения обработки, помещали в отдельные клетки из нержавеющей стали, которые были снабжены автоматической поильной системой или в которые помещали бутылки с водой. В клетках с животными поддерживались регулируемые условия (температура примерно 21±3°С, относительная влажность 30-70%; суточный режим (24 часа): 12 часов - день и 12 часов - ночь; смена воздуха 12-20 раз за один час), и этим животным ежедневно два раза в день давали стандартный сертифицированный коммерчески доступный корм для приматов (Harlan Teklad Certified Primate Diet #2055C).

Такое исследование приматов проводили для измерения и сравнения концентраций чГР и IGF-1 в сыворотке после введения растворимого рчГР (группа 1), натрийсодержащих кристаллов гчГР с ПЭГ и полиаргинином (группа 2) и натрийсодержащих кристаллов рчГР с ПЭГ и протамином (группа 3). Массы тела регистрировали для всех животных при их доставке и перед введением дозы в период времени, указанный в вышеприведенной таблице 15. Пробы крови (приблизительно 1 мл) брали у каждого животного из бедренной, плечевой или подкожной вены ноги каждое утро на дни -216, -120, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288 и 312. Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки, оставляли на 30-45 минут при комнатной температуре для свертывания крови и центрифугировали при 2-8°С в течение 10 минут при 3000 об/мин. Каждую пробу сыворотки разделяли на 100-мкл аликвоты и остаточные аликвоты, и все эти аликвоты хранили при -70±10°С перед проведением анализа. Обычно для определения рчГР использовали меньшие аликвоты, т.е. 100 мкл, а для IGF-1 использовали более крупные остаточные аликвоты. При этом были сделаны некоторые исключения в том случае, когда требовался определенный объем для получения дубликатов.

Затем собранные пробы сыворотки анализировали на концентрацию чГР (см. таблицу 16). Для тех концентраций рчГР, которые выпадали из интервала стандартных величин, делали соответствующие разведения. Все величины использовали для получения среднего фонового уровня ГР для каждого отдельного животного-примата. Это среднее значение для каждого животного вычитали из уровней чГР в сыворотке, определенных в каждый соответствующий момент времени для каждого тестируемого животного. Затем скорректированные значения для каждого момента времени усредняли и получали скорректированный средний уровень рчГР в сыворотке. После этого вычисляли стандартные ошибки с использованием стандартного отклонения скорректированного среднего значения и делили на квадратный корень из N=4.

На фиг.20А проиллюстрирован уровень рчГР в сыворотке после коррекции на фоновый уровень, в зависимости от времени (в часах) для групп 1, 2 и 3.

Таблица 17 Систематизированные фармакокинетические параметры, полученные исходя из данных, представленных в таблице 16
	Группа 1^а	Группа 2	Группа 3
Количество (мг)	3,2	22,4	22,4
Доза (мг/кг)	0,8	5,6	5,6
С_max (нг/мл)	372	409	381
Т_max (ч)	2	10	10
AUC (0-t) (нг·ч·кг/мл·мг)	4570	3503	3455
Т_90% (ч)	20	74	77
^аКоммерчески доступный чГР (растворимый, в некристаллической форме) подвергали диафильтрации в WFI. Группе 1 (положительный контроль) вводили растворимый чГР ежедневно в течение 7 дней.

Приведенные выше данные продемонстрировали, что время, в которое наблюдался максимум чГР в сыворотке (Т_max), составляло 10 часов для комплекса натрийсодержащих кристаллов чГР с полиаргинином, 10 часов для комплекса натрийсодержащих кристаллов чГР с протамином и 2 часа для растворимого чГР. Если растворимый чГР вводили в дозе, составляющей 1/7 от дозы вводимого кристаллического чГР, то даже в этом случае величины С_max, указанные выше в таблице 17, свидетельствовали о том, что чГР, при его введении в любой из комплексных кристаллических форм, имел значительно меньший начальный пик концентрации в сыворотке. Кроме того, были вычислены величины Т_90% для групп, которым вводили растворимый и кристаллический чГР. Т_90% для группы 1, которой вводили растворимую форму, составляло 20 часов, тогда как Т_90% для групп 2 и 3, которым вводили комплексные кристаллические формы, составляло 74 и 77 часов соответственно. Эти результаты со всей очевидностью указывают на то, что комплексные кристаллические формы дают увеличение уровней чГР в течение значительно более длительного времени, чем растворимая форма.

Помимо определения концентраций чГР в сыворотке также измеряли уровень IGF-1 в зависимости от времени. Путем измерения уровня продуцирования IGF-1 определяли эффективность рчГР. В нижеследующей таблице 18 приводятся концентрации IGF-1 для животных групп 1-3. Как видно из фиг.20В, после вычитания фонового уровня из эндогенных уровней IGF-1 было продемонстрировано, что комплексные кристаллические композиции стимулировали высвобождение IGF-1, сравнимое с высвобождением, наблюдаемым при ежедневном введении растворимой композиции. Эти результаты, полученные для приматов, не являющихся человеком, показали, что композиции настоящего изобретения могут быть преимущественно использованы для достижения аналогичной эффективности у человека.

Пример 24

Сравнительные фармакодинамические исследования,

проводимые на молодых самках собакоподобных обезьян,

которым вводили протамин в различных соотношениях

Целью настоящего исследования является оценка in vivo фармакокинетического профиля кристаллического рекомбинантного человеческого гормона роста (рчГР) при его подкожном введении самкам собакоподобных обезьян. Эти данные получали в целях исследования влияния отношения “натрийсодержащий чГР:протамин” на регулируемое высвобождение кристаллического рчГР в сыворотке крови и на увеличение массы в зависимости от высвобождения кристаллического рчГР.

Таблица 19 Экспериментальное исследование II для приматов
Группа #	Образец	Введение дозы^с (часы)	Уровень дозы (мг/кг)	Концентрация дозы (мг/мл)	Объем дозы (мл/кг)	Число животных (самки)
1	Ежедневно вводимый растворимый^а	0, 24, 48, 72, 96, 120, 144	0,8	3,2	0,25	4
2	Na-ацетат, ПЭГ, протамин (3:1)^b	0	5,6	22,4	0,25	4
3	Na-ацетат, ПЭГ, протамин (2:1)^b	0	5,6	22,4	0,25	4
^аКоммерчески доступный чГР (растворимая некристаллизованная форма) закупали у Novartis и подвергали диафильтрации в WFI. Животным группы 1 (положительный контроль) вводили растворимый чГР ежедневно в период введения. ^bСм. примеры 18 и 19 для получения препарата. ^сВсе дозы вводили после ежедневного отбора проб крови.

При проведении исследования II на приматах двенадцать молодых самок собакоподобных обезьян, описанных в исследовании I на приматах, разделяли на три группы, каждая из которых содержала четыре животных на группу, и этим животным вводили либо растворимый рчГР (группа 1), либо натрийсодержащие кристаллы рчГР с ПЭГ и протамином (рчГР:протамин, 3:1) (группа 2) (примеры 18 и 19), либо натрийсодержащие кристаллы рчГР с ПЭГ и протамином (рчГР:протамин, 2:1) (группа 3) (примеры 18 и 19). Обезьян, имеющих массу 2-6 кг и возраст 4-7 лет на начало проведения обработки, помещали в отдельные клетки из нержавеющей стали, которые были снабжены автоматической поильной системой или в которые помещали бутылки с водой. В клетках с животными поддерживались регулируемые условия (температура - примерно 21±3°С; относительная влажность 30-70%; суточный режим (24 часа): 12 часов - день и 12 часов -ночь; и смена воздуха 12-20 раз за один час), и этим обезьянам ежедневно два раза в день давали стандартный сертифицированный коммерчески доступный корм для приматов (Harlan Teklad Certified Primate Diet #2055C).

Такое исследование на приматах проводили для измерения и сравнения концентраций чГР и IGF-1 в сыворотке после введения растворимого рчГР (группа 1), натрийсодержащих кристаллов гчГР с ПЭГ и протамином (рчГР:протамин, 3:1) (группа 2), и натрийсодержащих кристаллов рчГР с ПЭГ и протамином (рчГР:протамин, 2:1) (группа 3). Массы тела всех животных регистрировали для всех животных при их доставке и перед введением дозы в период времени, указанный в вышеприведенной таблице 19. Пробы крови (приблизительно 1 мл) брали у каждого животного из бедренной вены, плечевой вены или подкожной вены ноги каждое утро на дни -144, -120, -96, -72, -48, -24, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288 и 312. Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки, оставляли на 30-45 минут при комнатной температуре для ее свертывания и центрифугировали при 2-8°С в течение 10 минут при 3000 об/мин. Каждую пробу сыворотки разделяли на 100-мкл аликвоты и остаточные аликвоты, которые перед тестированием хранили при -70±10°С.

Затем определяли концентрацию чГР (нг/мл) в собранных пробах сыворотки, и эту концентрацию корректировали на фоновый уровень (см. данные таблицы 20). При этом следует отметить, что для тех концентраций рчГР, которые выпадали из интервала стандартных величин, делали соответствующие разведения. Все величины использовали для получения среднего фонового уровня чГР для каждого отдельного животного-примата. Это среднее значение для животного вычитали из уровней чГР в сыворотке, определенных в каждый соответствующий момент времени для каждого тестируемого животного. Затем скорректированные значения для каждого данного момента времени усредняли и получали скорректированный средний уровень рчГР в сыворотке. После этого вычисляли стандартные ошибки с использованием стандартного отклонения скорректированного среднего значения и делили на квадратный корень из N=4.

Таблица 20 Уровни рчГР для групп: 1 (стандартный растворимый для ежедневного введения), 2 (натрийсодержащий рчГР/протамин (3:1)) и 3 (натрийсодержащий рчГР/протамин (2:1))
Время (ч)	Группа 1 - среднее для ежедневно вводимого растворимого рчГР (нг/мл)	Стандартная ошибка	Группа 2 - среднее для натрийсодержащего рчГР/протамин (3:1) (нг/мл)	Стандартная ошибка	Группа 3 - среднее для натрийсодержащего рчГР/протамин (2:1) (нг/мл)	Стандартная ошибка
-144	-14	6	-13	6	34	22
-120	-14	5	-9	5	10	6
-96	18	12	48	23	28	43
-72	-1	5	-5	6	3	9
-48	-9	5	-2	5	14	6
-24	-2	9	-14	7	-3	10
0	21	9	-4	9	1	5
2	312	47	8	10	-29	16
4	401	57	77	32	13	8
6	186	16	172	62	89	52
8	157	29	330	104	222	108
10	172	24	456	109	364	142
24	3	4	316	29	372	74
48	8	7	153	47	128	15
72	6	6	116	81	30	23
96	-2	5	42	15	13	21
120	14	3	22	22	22	14
144	16	16	8	12	-13	11
168	14	8	7	6	-21	13
192	2	7	-4	7	3	22
216	11	9	6	14	-29	19
240	27	19	14	9	-4	8
264	-1	6	35	21	-19	18
288	-2	9	2	5	-32	18
312	-0,58	9	10	6	-21	18
Примечание: Величина рчГР представляет собой среднюю величину для 4 животных, которая была скорректирована на фоновый уровень, то есть величину минус фоновый уровень. Фоновый уровень представляет собой среднее из величин, определенных в часы -144, -120, -96, -72, -48, -24 и 0.

На фиг.21А проиллюстрирован уровень рчГР в сыворотке после коррекции на фоновый уровень в зависимости от времени (в часах) для групп 1, 2 и 3.

Таблица 21 Систематизированные фармакокинетические параметры, полученные исходя из данных, представленных в таблице 20
	Группа 1^а	Группа 2	Группа 3
Количество (мг)	3,2	22,4	22,4
Доза (мг/кг)	0,8	5,6	5,6
С_max (нг/мл)	401	456	380
Т_max (ч)	4	10	24
AUC (0-t) (нг·ч·кг/мл·мг)	4432	3669	2893
Т_90% (ч)	20	119	72
^аКоммерчески доступный чГР (растворимый, в некристаллической форме) подвергали диафильтрации в WFI. Группе 1 (положительный контроль) ежедневно вводили растворимый чГР в течение 7 дней.

Приведенные выше данные продемонстрировали, что время, в которое наблюдался максимум чГР в сыворотке, составляло 10 часов для комплекса кристаллический чГР:протамин (3:1), 24 часа для комплекса кристаллический чГР:протамин (2:1) и 4 часа для растворимого чГР. Если растворимый чГР вводили в дозе, составляющей 1/7 от дозы вводимого кристаллического чГР, то даже в этом случае величины С_max, указанные выше в таблице 22, свидетельствовали о том, что чГР, при его введении в любой из комплексных кристаллических форм, имеет значительно меньшую максимальную концентрацию в сыворотке. Т_90% для группы 1, которой вводили растворимую форму, составляло 20 часов, тогда как Т_90% для групп 2 и 3, которым вводили комплексные кристаллические формы, составляло 119 и 72 часа соответственно. Эти результаты со всей очевидностью указывают на то, что комплексные кристаллические формы дают увеличение уровней чГР в течение значительно более длительного периода времени, чем растворимая форма.

Помимо определения концентраций чГР в сыворотке, также измеряли уровень IGF-1 в зависимости от времени. Путем измерения уровня продуцирования IGF-1 была определена эффективность рчГР. В нижеследующей таблице 22 приводятся концентрации IGF-1 для животных групп 1-3. Как видно из фиг.21В, после вычитания фонового уровня из эндогенного уровня IGF-1 было продемонстрировано, что комплексные кристаллические композиции стимулировали высвобождение IGF-1, сравнимое с высвобождением, наблюдаемым при ежедневном введении растворимого препарата. Эти результаты, полученные для приматов, не являющихся человеком, показали, что композиции настоящего изобретения могут быть преимущественно использованы для достижения аналогичной эффективности у человека.

Таблица 22 Уровни IGF-1 для групп: 1 (стандартный растворимый для ежедневного введения), 2 (натрий-содержащий рчГР/протамин (3:1)) и 3 (натрий-содержащий рчГР/протамин (2:1))
Время (ч)	Группа 1 - среднее для ежедневно вводимого растворимого IGF-1 (нг/мл)	Стандартная ошибка	Группа 2 - среднее для натрийсодержащего рчГР/ протамин (3:1), IGF-1 (нг/мл)	Стан дартная ошибка	Группа 3 - среднее для натрийсодержащего рчГР/протамин (2:1), IGF-1 (нг/мл)	Стандартная ошибка
-144	49	92	123	60	137	134
-120	-61	19	88	42	57	98
-96	-116	27	-178	11	-130	13
-72	-33	59	-69	40	-52	43
-48	24	47	-102	100	-10	64
-24	22	46	-56	85	-83	78
0	115	71	194	106	82	107
2	-15	71	-6	79	51	95
4	-6	96	45	42	-10	94
6	48	106	38	63	91	74
8	10	119	97	47	88	78
10	38	106	-37	56	57	75
24	200	160	20	48	150	107
48	99	90	85	68	342	97
72	505	391	100	155	278	105
96	328	202	363	161	289	122
120	329	224	294	89	261	136
144	279	282	210	81	86	103
168	591	266	424	184	219	104
192	259	185	169	163	131	50
216	127	152	55	107	-8	67
240	54	153	-54	141	-64	72
264	4	132	-165	103	-50	49
288	-16	105	-208	122	-43	75
312	11	100	-77	207	30	77
Примечание: Величина IGF-1 представляет собой среднюю величину, вычисленную для 4 животных, которая была скорректирована за фоновый уровень, то есть величину минус фоновый уровень. Фоновый уровень представляет собой среднее из величин, полученных в часы -144, -120, -96, -72, -48, -24 и 0.

Пример 25

Фармакодинамическое исследование человеческого гормона роста, вводимого один раз или ежедневно путем подкожной инъекции самцам гипофизэктомизированных крыс

Это исследование проводили в целях сравнения эффективности различных композиций чГР при их разовом или ежедневном подкожном введении гипофизэктомизированным самцам крыс Wistar непрерывно в течение семи дней. Ниже представлен протокол исследований.

Таблица 23 Протокол исследований - описание образцов
Группа # или тест-соединение	Образец^а	Описание образцов
1	Ежедневно вводимый растворимый носитель - ложная гипофизэктомия	(чГР отсутствует) 16,7 мг/мл D-маннита, 26,7 мг/мл сахарозы, 50 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,5)
2	Ежедневно вводимый растворимый носитель - низкая доза	(чГР отсутствует) 16,7 мг/мл D-маннита, 26,7 мг/мл сахарозы, 50 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,5)
3	Ежедневно вводимый растворимый носитель - высокая доза	(чГР отсутствует) 16,7 мг/мл D-маннита, 26,7 мг/мл сахарозы, 50 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,5)
4	Ежедневно вводимый растворимый чГР - низкая доза	0,71 мг/мл рчГР, 16,7 мг/мл D-маннита, 26,7 мг/мл сахарозы, 50 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,5)
5	Ежедневно вводимый растворимый чГР - высокая доза	1,0 мг/мл рчГР, 16,7 мг/мл D-маннита, 26,7 мг/мл сахарозы, 50 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,5)
6	Растворимый чГР - разовая ударная доза - высокая доза	3,5 мг/мл рчГР, 16,7 мг/мл D-маннита, 26,7 мг/мл сахарозы, 50 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,5)
7	Полиаргининсодержащие кристаллы - высокая доза	18,7 мг/мл кристаллического рчГР, 250 мМ NaOAc, 6% ПЭГ-6000, 25 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 3,6 мг/мл полиаргинин-HCl (молярное отношение рчГР:полиаргинин = 1:0,587)
8	Контрольный носитель - протаминовые кристаллы	250 мМ NaOAc, 6% ПЭГ-6000, 25 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 0,75 мг/мл сульфата протамина
9	Протаминсодержащие кристаллы - низкая доза	3,3 мг/мл кристаллического рчГР, 250 мМ NaOAc, 6% ПЭГ-6000, 25 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 0,75 мг/мл сульфата протамина (молярное отношение рчГР:полиаргинин = 1:1,715)
10	Протаминсодержащие кристаллы - высокая доза	18,7 мг/мл кристаллического рчГР, 250 мМ NaOAc, 6% ПЭГ-6000, 25 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 4 мг/мл сульфата протамина (молярное отношение рчГР:полиаргинин = 1:1,715)
11	Контрольный носитель - полиаргининовые кристаллы	250 мМ NaOAc, 6% ПЭГ-6000, 25 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 3,6 мг/мл полиаргинин-HCl
12	Контрольный носитель - разовая ударная доза	16,7 мг/мл D-маннита, 26,7 мг/мл сахарозы, 50 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,5)
^а Все образцы получали с использованием WFI в стерильных условиях. Носитель и образцы растворимого чГР фильтровали через 0,22-мкм фильтр после доведения растворов до их соответствующих конечных объемов.

Таблица 24 Протокол исследований - введение
Группа # или тест-соединение	Уровень дозы (мг/кг)	Концентрация дозы (мг/мл)	Объем дозы (мкл)	Схема введения дозы	Число животных (самцы)
1	0	0	200	Ежедневные дозы в течение 7 дней	13
2	0	0	20	Ежедневные дозы в течение 7 дней	11
3	0	0	80	Ежедневные дозы в течение 7 дней	11
4	0,143	0,71	20	Ежедневные дозы в течение 7 дней	11
5	0,8	1	80	Ежедневные дозы в течение 7 дней	12
6	5,6	3,5	160	День 1	11
7	5,6	18,7	30	День 1	12
8	0	0	30	День 1	11
9	1	3,3	30	День 1	12
10	5,6	18,7	30	День 1	12
11	0	0	30	День 1	11
12	0	0	30	День 1	11

После доставки животных, 138 самцов крыс Wistar, имеющих массу приблизительно 90-100 граммов и возраст примерно 25-30 дней, помещали группами в клетки в регулируемых условиях (температура примерно 23±3°С; относительная влажность 30-70%; суточный режим (24 часа): 12 часов - день и 12 часов - ночь; смену воздуха проводили 10-15 раз за один час) и во время исследования этим крысам обеспечивали свободный (ad libitum) доступ к чистой воде и к лабораторному корму. Перед тестированием крыс оставляли на две недели для акклиматизации.

138 крысам вводили образцы в соответствующих концентрациях и объемах и в соответствии со схемой введения доз, указанных в таблице 24. Тестируемые соединения вводили один раз в день или каждый день непрерывно в течение 7 дней в виде разовой ударной дозы путем подкожной инъекции в область спины. Место инъекции выбривали и помечали за 3 дня до введения дозы, и позже, если это было необходимо для облегчения инъекции. Тестируемые соединения вводили с использованием 300-мкл шприца с иглой калибра 30×8 мм. Для придания однородности суспензии или раствору пробирки с тестируемыми соединениями осторожно переворачивали перед забором этих соединений в шприц, не вызывая при этом образования пены, а затем шприц с тестируемыми соединениями снова переворачивали перед их введением животному.

Увеличение массы измеряли и регистрировали два раза в неделю в течение недель -3 и -2 и ежедневно начиная с дня -7 и по 14-й день. После введения дозы массы крыс составляли приблизительно 100 г ± 10%. Данные, выраженные в процентах индуцированного роста, представлены на фиг.22 и 23 и систематизированы в таблицах 25 и 26. В таблице 25 “высокая доза” означает 5,6 мг/кг в неделю. Эти данные иллюстрируют сравнение увеличения массы крыс, которым вводили одну инъекцию кристаллов рчГР:полиаргинин (группа 7, примеры 18 и 19) или кристаллов рчГР:протамин (группы 9 и 10, примеры 18 и 19) в течение семи дней, с увеличением массы крыс, которым ежедневно вводили инъекцию контроля (группа 1, без чГР) или образцов растворимого чГР (группы 4 и 5) в течение тех же семи дней. В группе 1, которая включала крыс, подвергнутых ложной гипофизэктомии, наблюдался нормальный рост животных в течение семи дней. Более того, у крыс, которым вводили рчГР:полиаргинин (группа 7), наблюдался более высокий процент индуцированного роста после одной инъекции за 7 дней, чем у крыс, которым ежедневно в течение 7 дней вводили растворимый чГР (группа 5). Эти результаты показали, что кристаллы и композиции чГР настоящего изобретения являются такими же эффективными, как и растворимый рчГР, ежедневно вводимый в течение одной недели.

Таблица 25 Индуцированное увеличение массы у гипофизэктомизированных крыс на день 8
Группа # или тест-соединение	Описание образцов	Индуцированный рост на день 8
1	Ложная гипофизэктомия	22%
7	Полиаргининовые кристаллы - высокая доза	21%
5	Ежедневно вводимый растворимый чГР - высокая доза	20%
4	Ежедневно вводимый растворимый чГР - низкая доза	11%
10	Протаминовые кристаллы - высокая доза	5%
6	Ежедневно вводимый растворимый чГР - разовая ударная доза -высокая доза	2%
9	Протаминовые кристаллы - низкая доза	2%

Таблица 26 Ежедневное индуцированное увеличение массы (граммы) у гипофизэктомизированных крыс
Группа	День
Группа	0	1	2	3	4	5	6	7
1	0	3	7	10	13	15	19	22
7	0	4	10	15	18	19	20	21
4	0	2	3	4	5	8	11	11
5	0	3	6	10	12	15	18	20
10	0	5	9	7	5	6	6	5
6	0	3	3	2	2	2	3	2
9	0	4	4	2	0	2	2	2

Пример 26

Кристаллизация чГР

с использованием ацетата натрия и сульфата протамина

В этом примере основную замороженную массу питательного раствора растворимого рекомбинантного чГР (рчГР) получали из двух источников, одним из которых была E. coli (Novartis), а другим - дрожжи (Lucky Gold). Проводимые отдельно анализы рчГР, полученных из маточных растворов E. coli и дрожжей, показали, что рчГР имел одинаковые параметры кристаллизации и растворимости, независимо от его источника. Приблизительно 3,3 мл (10-20 мг/мл) оттаянного питательного раствора рчГР очищали на обессоливающей колонке 10 DG, поставляемой BioRad. Перед загрузкой образца колонку кондиционировали путем промывания 30 мл Трис-HCl (10 мМ, рН 8,0). Затем образец рчГР загружали и оставляли для его прохождения в колонку под действием силы тяжести. После отбрасывания первых 3 мл элюента добавляли еще 5,0 мл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Затем элюировали и собирали 4,5 мл обессоленного рчГР. После этого проводили концентрирование путем центрифугирования при 3500 об/мин в течение 20-30 минут с использованием концентратора Millipore (MWCO 10000). Концентрация чГР составляла в пределах 30 мг/мл, как было измерено по оптической плотности при 280 нм/0,813 (А₂₈₀ для 1 мг/мл чГР = 0,813 единиц оптической плотности). Кристаллы выращивали путем добавления деионизованной воды, Трис-HCl (рН 8,6), ПЭГ-4000, сульфата протамина и Na-ацетата до конечной концентрации 100 мМ, 6% (об./об.), 2 мг/мл и 500 мМ соответственно в общий раствор, где конечная концентрация белка составляла 15 мг/мл. После этого раствор подвергали мягкому размешиванию и инкубировали при 33°С в течение 12-16 часов. В результате получали иглообразные кристаллы, которые имели длину примерно 2-25 мкм. После центрифугирования и осаждения кристаллов супернатант экстрагировали и измеряли выход кристаллизации, который составлял более 90%.

Пример 27

Кристаллизация чГР

с использованием ацетата натрия и полиаргинина-HCl

В этом примере основную замороженную массу питательного раствора растворимого рекомбинантного чГР (рчГР) получали из двух источников, одним из которых была E. coli (Novartis), а другим - дрожжи (Lucky Gold). Проводимые отдельно анализы рчГР, полученных из маточных растворов E. coli и дрожжей, показали, что рчГР имел одинаковые параметры кристаллизации и растворимости, независимо от его источника. Приблизительно 3,3 мл (10-20 мг/мл) оттаянного питательного раствора рчГР очищали на обессоливающей колонке 10 DG, поставляемой BioRad. Перед загрузкой образца колонку кондиционировали путем промывания 30 мл Трис-HCl (10 мМ, рН 8,0). Затем образец рчГР загружали и оставляли для его прохождения в колонку под действием силы тяжести. После отбрасывания первых 3 мл элюента добавляли еще 5,0 мл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Затем элюировали и собирали 4,5 мл обессоленного рчГР. После этого проводили концентрирование путем центрифугирования при 3500 об/мин в течение 20-30 минут с использованием концентратора Millipore (MWCO 10000). Концентрация чГР составляла в пределах 30 мг/мл, как было измерено по оптической плотности при 280 нм/0,813 (А₂₈₀ для 1 мг/мл чГР = 0,813 единиц оптической плотности). Кристаллы выращивали путем добавления деионизованной воды, Трис-HCl (рН 8,6), ПЭГ-4000, полиаргинина-HCl и Na-ацетата до конечной концентрации 100 мМ, 6% (об./об.), 2 мг/мл и 500 мМ соответственно в общий раствор с конечной концентрацией белка 15 мг/мл. После этого раствор подвергали мягкому размешиванию и инкубировали при 33°С в течение 12-16 часов. В результате получали иглообразные кристаллы, которые имели длину примерно 2-25 мкм. После центрифугирования и осаждения кристаллов супернант экстрагировали и измеряли выход кристаллизации, который составлял более 90%.

Хотя настоящее изобретение подробно описано в примерах и на графическом материале, которые имеют иллюстративный характер и приводятся лишь для лучшего понимания настоящего изобретения, однако для специалиста очевидно, что в изобретение могут быть внесены некоторые изменения и модификации, не выходящие за рамки существа и объема описанного здесь изобретения, включая прилагаемые варианты его осуществления.

Claims

1. Кальцийсодержащий кристалл человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, где кальцийсодержащий кристалл включает протамин или полиаргинин и где кальцийсодержащий кристалл образует комплекс или совместно кристаллизован с этим протамином или полиаргинином.

2. Кристалл человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащий одновалентный катион.

3. Кристалл, содержащий одновалентный катион, по п.2, где кристалл, содержащий одновалентный катион, включает протамин или полиаргинин и где кристалл, содержащий одновалентный катион, образует комплекс или совместно кристаллизован с этим протамином или полиаргинином.

4. Кристалл, содержащий одновалентный катион, по п.2 или 3, где указанный одновалентный катион выбран из группы, состоящей из лития, натрия, калия и аммония.

5. Кристалл, содержащий одновалентный катион, по п.4, где указанным одновалентным катионом является натрий.

6. Кристалл по любому из пп.1-3, где одно введение указанного кристалла млекопитающему обеспечивает in vivo концентрацию чГР в сыворотке указанного млекопитающего, выбранную из группы, состоящей из:
(a) примерно 0,3-2500 нг/мл чГР;
(b) примерно 0,5-1000 нг/мл чГР; и
(c) примерно 1-100 нг/мл чГР, в течение периода времени, выбранного из группы, состоящей из следующих периодов:
(i) примерно от 0,5 ч до 40 дней после введения;
(ii) примерно от 0,5 ч до 10 дней после введения;
(iii) примерно от 0,5 ч до 7 дней после введения; и
(iv) примерно от 0,5 ч до 1 дня после введения.

7. Кристалл по любому из пп.1-3, где одно введение указанного кристалла млекопитающему приводит к увеличению in vivo уровня IGF-1 в сыворотке по сравнению с фоновым уровнем IGF-1, имеющимся у указанного млекопитающего перед указанным введением, где указанный уровень выбран из группы, состоящей из:
(a) примерно от 5 до 2500 нг/мл;
(b) примерно от 100 до 1000 нг/мл; и
в течение периода времени, выбранного из группы, состоящей из
следующих периодов:
(i) примерно от 0,5 ч до 40 дней после введения;
(ii) примерно от 0,5 ч до 7 дней после введения.

8. Кристалл по любому из пп.1-3, где указанный кристалл имеет относительную биологическую доступность по крайней мере 50% или выше по сравнению с биологической доступностью растворимого чГР, вводимого в идентичной дозе тем же самым способом, где указанная биологическая доступность измеряется по площади под кривыми (AUC) общей концентрации чГР в сыворотке in vivo, построенными для указанного растворимого чГР и для указанного кристалла.

9. Кристалл по п.6 или 7, где указанным млекопитающим является человек.

10. Кристалл по п.1, где указанный кристалл содержит от примерно 1 до примерно 500 молекул кальция на мономер человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста.

11. Кристалл по п.2 или 3, где указанный кристалл содержит от примерно 1 до примерно 500 одновалентных катионов на мономер человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста.

12. Кристалл по п.1, где указанный кристалл содержит соль кальция, выбранную из группы, состоящей из ацетата кальция, хлорида кальция, сульфата кальция и глюконата кальция.

13. Кристалл по п.12, где указанной солью кальция является ацетат кальция.

14. Кристалл по п.5, где указанный кристалл содержит соль натрия, выбранную из группы, состоящей из цитрата натрия, фосфата натрия и ацетата натрия.

15. Кристалл по п.14, где указанной солью натрия является ацетат натрия.

16. Композиция, содержащая кристаллы человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста и эксципиент, где указанные кристаллы выбраны из группы, состоящей из:
(a) кальцийсодержащих кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста;
(b) кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащих одновалентный катион;
(c) протаминсодержащих кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, где протамин-содержащие кристаллы включают двухвалентный или одновалентный катион; и
(d) полиаргининсодержащих кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, где полиаргининсодержащие кристаллы включают двухвалентный или одновалентный катион.

17. Композиция по п.16, где указанные кристаллы и указанный эксципиент присутствуют в указанной композиции в молярном отношении чГР:эксципиент, равном примерно 1:10-1:0,125.

18. Композиция по п.16, где указанный эксципиент выбран из группы, состоящей из аминокислот, солей, спиртов, углеводов, белков, липидов, поверхностно-активных веществ, полимеров, полиаминокислот и их смесей.

19. Композиция по п.18, где указанный эксципиент выбран из группы, состоящей из протамина, поливинилового спирта, циклодекстринов, декстранов, глюконата кальция, полиаминокислот, полиэтиленгликоля, дендримеров, полиорнитина, полиэтиленимина, хитозана и их смесей.

20. Композиция по п.19, где указанный эксципиент выбран из группы, состоящей из протамина, полиаргинина, полиэтиленгликоля и их смесей.

21. Композиция по п.16, где указанная концентрация человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста в указанной композиции выбрана из группы, состоящей из:
(a) примерно 0,1-100 мг/мл;
(b) примерно 1-100 мг/мл; и
(c) примерно 10-100 мг/мл.

22. Способ лечения млекопитающего, страдающего расстройством, связанным с дефицитом человеческого гормона роста, или расстройством, которое может быть ослаблено путем лечения человеческим гормоном роста, включающий стадию введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества кристалла по любому из пп.1-3 или композиции по п.16.

23. Способ индуцирования увеличения массы тела млекопитающего, включающий стадию введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества кристалла по любому из пп.1-3 или композиции по п.16.

24. Способ по п.23, где указанным млекопитающим является гипофизэктомизированная крыса, и где указанное увеличение массы, индуцированное у указанной крысы, составляет от 5 до примерно 40% после введения указанных кристаллов путем инъекции один раз в неделю.

25. Способ по п.22, где указанное расстройство выбрано из группы, состоящей из дефицита гормона роста у взрослых, дефицита гормона роста у детей, синдрома Прадера-Вилли, синдрома Тернера, синдрома укороченной тонкой кишки, хронической почечной недостаточности, идиопатической недостаточности роста, карликовости, гипофизарной карликовости, регенерации костей, бесплодия у женщин, замедления внутриматочного роста, кахексии, ассоциированной со СПИДом, болезни Крона и ожогов.

26. Способ по п.25, где указанным расстройством является дефицит гормона роста у детей, и где указанный способ приводит к ежегодному увеличению скорости роста у детей примерно на 7-11 см.

27. Способ по п.22 или 23, где указанный кристалл или композицию вводят указанному млекопитающему перорально, парентерально, подкожно или внутримышечно.

28. Способ по п.27, где указанный кристалл или композицию вводят указанному млекопитающему подкожно с помощью иглы калибра 27 или выше.

29. Способ по п.22 или 23, где указанный кристалл или композицию вводят указанному млекопитающему путем безыгольной инъекции или с помощью инфузионного насоса с дозирующим клапаном.

30. Способ по п.22 или 23, где указанный кристалл или композицию вводят указанному млекопитающему в соответствии со схемой введения, выбранной из группы, состоящей из:
(a) введения примерно один раз в три дня;
(b) введения примерно один раз в неделю;
(c) введения примерно один раз в две недели; и
(d) введения примерно один раз в месяц.

31. Способ по п.22 или 23, где указанным млекопитающим является человек.

32. Способ получения кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащих кальций, одновалентный катион, протамин, полиаргинин или полилизин, где указанный способ включает стадии:
(a) смешивания раствора человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста с раствором для кристаллизации, где указанный раствор для кристаллизации содержит соль кальция или соль одновалентного катиона, и ионогенный полимер, где указанный ионногенный полимер включает протамин, полиаргинин или полилизин; и
(b) инкубации указанного раствора для кристаллизации в течение примерно более 12 ч при температуре примерно 4-37°С, вплоть до образования кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащих кальций, одновалентный катион, протамин, полиаргинин или полилизин.

33. Способ по п.32, где указанным ионогенным полимером является полилизин.

34. Способ по п.32, где указанным ионогенным полимером является смесь из двух или более полимеров из числа протамина, полиаргинина и полилизина.

35. Способ получения кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащих кальций или одновалентный катион, включающий стадии:
(a) смешивания раствора человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста с буфером для кристаллизации с получением раствора для кристаллизации;
(b) добавления деионизованной воды к указанному раствору для кристаллизации;
(c) добавления осадителя к указанному раствору для кристаллизации;
(d) добавления соли кальция или соли одновалентного катиона к указанному раствору для кристаллизации;
(e) инкубации указанного раствора для кристаллизации в течение примерно 2-168 ч при температуре примерно 10-40°С, вплоть до образования кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащих кальций или одновалентный катион; и
(f) добавления ионогенного полимера или небольшой ионогенной молекулы к указанным кристаллам человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащим кальций или одновалентный катион.

36. Способ получения кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащих кальций или одновалентный катион, где указанный способ включает стадии:
(a) смешивания раствора человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста с буфером для кристаллизации с получением раствора для кристаллизации;
(b) добавления деионизованной воды к указанному раствору для кристаллизации;
(c) добавления небольшой ионогенной молекулы или ионогенного полимера к указанному раствору для кристаллизации;
(d) добавления соли кальция или соли одновалентного катиона к указанному раствору для кристаллизации; и
(e) инкубации указанного раствора для кристаллизации в течение примерно 2-168 ч при температуре примерно 10-40°С, вплоть до образования кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащих кальций или одновалентный катион.

37. Способ по п.36, где после стадии (b) и перед стадией (с) способ включает стадию добавления осадителя к указанному раствору для кристаллизации.

38. Способ по любому из пп.32, 35 или 36, где указанная соль кальция выбрана из группы, состоящей из ацетата кальция, хлорида кальция, глюконата кальция и сульфата кальция.

39. Способ по п.38, где указанной солью кальция является ацетат кальция.

40. Способ по любому из пп.32, 35 или 36, где указанный одновалентный катион выбран из группы, состоящей из лития, натрия, калия и аммония.

41. Способ по п.40, где указанным одновалентным катионом является натрий.

42. Способ по любому из пп.32, 35 или 36, где указанная соль одновалентного катиона выбрана из группы, состоящей из цитрата натрия, фосфата натрия и ацетата натрия.

43. Способ по п.42, где указанной солью одновалентного катиона является ацетат натрия.

44. Способ по п.32, где указанный раствор для кристаллизации дополнительно содержит рН-корректирующий буфер.

45. Способ по п.44, где указанный рН-корректирующий буфер имеет рН, выбранный из группы, состоящей из:
(a) рН примерно 6-10;
(b) рН примерно 7,0-10;
(c) рН примерно 6-9; и
(d) рН примерно 7,8-8,9.

46. Способ по п.44, где указанным рН-корректирующим буфером является буфер, выбранный из группы, состоящей из триса, HEPES, ацетата, фосфата, цитрата, бората, имидазола и глицина.

47. Способ по п.35 или 37, где указанным осадителем является небольшая неионогенная молекула или неионогенный полимер.

48. Способ по п.47, где указанный неионогенный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, поливинилового спирта и их смесей.

49. Способ по п.48, где указанный полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу, выбранную из группы, состоящей из:
(a) молекулярной массы примерно 200-8000;
(b) молекулярной массы примерно 6000;
(с) молекулярной массы примерно 4000; и
(d) молекулярной массы примерно 3350.

50. Способ по п.49, где указанный полиэтиленгликоль присутствует в указанном растворе для кристаллизации в концентрации примерно 0,5-20% (мас./об.).

51. Способ по п.35 или 37, где указанный осадитель выбран из группы, состоящей из аминокислот, пептидов, полиаминокислот и их смесей.

52. Способ по любому из пп.32, 35 или 36, где указанный человеческий гормон роста или производное указанного человеческого гормона роста присутствует в указанном растворе для кристаллизации в концентрации, выбранной из группы, состоящей из:
(a) концентрации примерно 1-1000 мг/мл;
(b) концентрации примерно 2-50 мг/мл; и
(c) концентрации примерно 10-25 мг/мл.

53. Способ по любому из пп.32, 35 или 36, где указанная соль кальция или указанная соль одновалентного катиона присутствует в указанном растворе для кристаллизации в концентрации, выбранной из группы, состоящей из:
(a) концентрации примерно 0,01-1М; и
(b) концентрации примерно 25-205 мМ.

54. Способ по любому из пп.32, 35 или 36, где указанный раствор для кристаллизации инкубируют в течение периода времени и при температуре, выбранных из группы, состоящей из следующих параметров:
(a) примерно от 0,25 дня до двух дней при температуре примерно 33°С;
(b) примерно от 0,25 дня до двух дней при температуре примерно 25°С; и
(c) примерно от 0,25 дня до двух дней при температуре примерно 15°С.

55. Способ по п.35 или 36, где указанная небольшая ионогенная молекула выбрана из группы, состоящей из аминокислот, пептидов и их смесей.

56. Способ по п.35 или 36, где указанный ионогенный полимер выбран из группы, состоящей из протамина, полисахаридов, полиаминокислот, полиаргинина, полилизина, полиглутамата, дендримеров, полиорнитина, полиэтиленимина, хитозана и их смесей,

57. Способ по п.56, где указанным ионогенным полимером является протамин или полиаргинин.

58. Способ по п.35 или 36, где в стадии (е) по п.35 или в стадии (е) по п.36 указанный раствор для кристаллизации инкубируют в течение примерно 4-48 ч при температуре примерно 4-40°С вплоть до образования кристаллов человеческого гормона роста или производного человеческого гормона роста, содержащих кальций или одновалентный катион.

59. Способ по п.35 или 36, где в стадии (е) по п.35 или в стадии (е) по п.36 указанный человеческий гормон роста или указанное производное человеческого гормона роста присутствует в указанном растворе для кристаллизации в концентрации примерно 2-100 мг/мл.

60. Способ по п.35 или 36, где в стадии (е) по п.35 или в стадии (е) по п.36 указанный человеческий гормон роста или указанное производное человеческого гормона роста присутствует в указанном растворе для кристаллизации в концентрации примерно 14,5-15,5 мг/мл.

61. Способ по п.35 или 36, где указанный буфер для кристаллизации выбран из группы, состоящей из буфера трис-HCl, глицинового буфера, буфера HEPES, имидазолового буфера, бис-трис-буфера, AMP, AMPD, AMPSO, бицина, этаноламина, глицилглицина, TAPS, таурина, триана и их смесей.

62. Способ по п.35 или 36, где в стадии (а) по п.35 или в стадии (а) по п.36 указанный буфер для кристаллизации присутствует в указанном растворе для кристаллизации в концентрации примерно 10-800 мМ.

63. Способ по п.35 или 36, где в стадии (а) указанный буфер для кристаллизации имеет рН, выбранный из группы, состоящей из:
(a) рН примерно 3-10;
(b) рН примерно 6-9; и
(c) рН примерно 7,5-10.

64. Способ по п.35 или 36, где в стадии (е) по п.35 или в стадии (е) по п.36 указанный буфер для кристаллизации в указанном растворе для кристаллизации доводит указанный раствор до рН, выбранного из группы, состоящей из:
(a) рН примерно 3-10;
(b) рН примерно 6-9,5; и
(c) рН примерно 7,5-9,5.

65. Способ по п.63 или 64, где указанный буфер выбран из группы, состоящей из триса, HEPES, ацетата, фосфата, цитрата, бората, имидазола и глицина.

66. Способ по п.39, где указанный ацетат кальция присутствует в форме водного раствора, имеющего рН, выбранный из группы, состоящей из:
(a) рН примерно 3,0-9,0; и
(b) рН примерно 7,0-8,6.

67. Способ по п.39, где в стадии (е) по п.35 или в стадии (е) по п.36 указанный ацетат кальция присутствует в указанном растворе для кристаллизации в концентрации, выбранной из группы, состоящей из:
(a) концентрации примерно 0,1 -205 мМ; и
(b) концентрации примерно 85-100 мМ.

68. Способ по п.43, где указанный ацетат натрия присутствует в форме водного раствора, имеющего рН, выбранный из группы, состоящей из:
(a) рН примерно 3,0-9,0; и
(b) рН примерно 7,0-8,6.

69. Способ по п.44, где в стадии (е) по п.35 или в стадии (е) по п.36 указанный ацетат натрия присутствует в указанном растворе в концентрации, выбранной из группы, состоящей из:
(a) концентрации примерно 0,5-800 мМ;
(b) концентрации примерно 100-500 мМ.

70. Способ по п.35 или 36, где в стадии (е) по п.35 или в стадии (е) по п.36 указанный раствор инкубируют в течение примерно 1-2 дней при температуре примерно 4-37°С.