CN101659701B - 人生长激素晶体和制备它们的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人生长激素晶体和制备它们的方法。具体地说，本发明涉及人生长激素或人生长激素衍生物的稳定、延长释放晶体和包含这类晶体的组合物或制剂。本发明还提供了生产那些晶体和组合物的方法。本发明进一步提供了使用那些晶体和组合物或制剂治疗具有障碍的个体的方法，所述障碍与人生长激素缺乏有关或通过用人生长激素治疗而得到改善。

Description

人生长激素晶体和制备它们的方法

本申请是申请号为200380109408.2、申请日为2003年12月31日、发明名称为“人生长激素晶体和制备它们的方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及人生长激素或人生长激素衍生物的晶体和包含它们的组合物或制剂。此外，本发明提供了生产人生长激素或人生长激素衍生物晶体的方法。本发明的晶体在治疗具有障碍的哺乳动物中特别有用，所述障碍与人生长激素缺乏有关或通过用人生长激素治疗而得到改善。

背景技术

促生长素或生长激素(“GH”)是一种哺乳动物蛋白，该蛋白包含一类在大脑中由内分泌系统的主要腺体，腺垂体合成和分泌的促激素。腺垂体分泌的GH和其它促激素调节全身其它内分泌腺和组织中细胞的活动。特别地，GH由腺垂体腺的促生长激素细胞分泌，有刺激肝和其它组织合成和分泌IGF-1的功能，IGF-1是一种控制细胞分裂、调节新陈代谢进程的蛋白并以游离的状态存在或与6个被指定为IGFBP-1至6的其它蛋白中的一个蛋白结合。分泌过程本身由促生长素释放素(促进GH释放)和生长激素释放抑制激素(抑制GH释放)对抗作用来调节。

人生长激素(“hGH”)是特别有意义的，因为他在细胞和器官生长的调节和各衰老阶段的生理功能中都作为重要的激素起作用。例如，hGH的过量产生在儿童导致巨人症和在成人导致肢端肥大症，反之，hGH产生不足在儿童导致侏儒症[Mauras等，J.Clin.Endocrinologyand Metabolism，85(10)，3653-3660(2000)；Frindik等，HormoneResearch，51(1)，15-19(1999)；Leger等，J.Clin.Endocrinology andMetabolism，83(10)，3512-3516(1998)]、特纳综合征(只限女性)[Bramswig，Endocrine，15(1)，5-13(2001)；Pasquino et al.，HormoneResearch，46(6)，269-272(1996)]和慢性肾功能不全[Carroll等，Trends in Endocrinology and Metabolism，11(6)，231-238(2000)；Ueland等，J.Clin.Endocrinology and Metabolism，87(6)，2760-2763(2002)；Simpson等，GrowthHormone & IGF Research，12，1-33(2002)]。在成人，hGH的缺乏能影响蛋白质、糖类、脂类、矿物质和结缔组织的新陈代谢过程，并能导致肌肉、骨或皮肤的萎缩[Mehlsand Haas，Growth Hormone &IGF Research，Supplement B，S31-S37(2000)；Fine等，J.Pediatrics，136(3)，376-382(2000)；Motoyama等，Clin.Exp.Nephrology，2(2)，162-165(1998)]。以生长不足为特征的其它hGH缺乏包括AIDS消瘦综合征[Hirschfeld，HormoneResearch，46，215-221(1996)；Tritos等，Am.J.Medicine，105(1)，44-57(1998)；Mulligan等，J.Parenteral and Enteral Nutrition，23(6)，S202-S209(1999)；Torres and Cadman，BioDrugs，14(2)，83-91(2000)]和普-威综合征[Ritzen，Hormone Research，56(5-6)，208(2002)；Eiholzer等，Eur.J.Pediatrics，157(5)，368-377(1998)]。

迄今为止，人hGH缺乏的治疗方案主要集中在皮下注射通过重组DNA技术生产的纯化hGH。这种治疗剂被包装成筒中的溶液或者在使用时需要重构的冻干粉末。注射的频率根据治疗的疾病和使用的商业上可获得的产品而变化。例如，侏儒症通过每天皮下注射重组hGH来治疗。

使用皮下给药作为hGH的快速递送途径是溶液中蛋白的固有的不稳定性所必需的。这种不稳定性起因于蛋白质的氨基酸序列内部特定位置上关键的分子内交联的裂解，这接着又破坏患者体内由细胞表面识别并与其相关联的必需的三-维结构。hGH的裂解或降解机理主要是由在溶解时蛋氨酸残基的氧化作用或天冬氨酸残基的脱酰胺作用协调，因此使蛋白失活。由于这种脆性，在本领域中对稳定和长时间起作用，并且不仅能通过皮下给药而且能通过其它常规的剂量途径，例如口部的、皮肤的和静脉内的途径给药的hGH组合物或制剂存在需求。

许多商业上可获得的hGH产品已经被开发以试图解决这种需要。例如，Nutropin是一种植入聚交酯-共乙交酯(PLG)微球体的可注射的重组人生长激素(rhGH)的悬浮液(参见http://www.gene.com)。除rhGH和PLG之外，微球体还包含乙酸锌和碳酸锌的成分。在给药之前，固体物质必须用包含羧甲基纤维素钠盐、聚山梨酯、氯化钠和水的水溶液重构。这种主要由聚合物组成的悬浮液每月给药一次或两次并要求用21量规的注射针头进行注射。由于微球体的大小和产品的粘性，会发生不利的注射部位反应，导致小结、红斑、疼痛、青舯、搔痒、脂肪萎缩和肿胀(参见http://www.genentech.com/gene/products/information/opportunistic/nutropin-depot/index.jsp)。

另一个已在开发中但随后又被中止的hGH产品是Albutropin^TM，一种通过遗传学的方法生产的长时间起作用的人白蛋白和人生长激素的融合蛋白(参见http://www.hgsi.com/products/albutropin.html).据说这种产品在循环中表现出延长的半衰期，比可溶的天然的hGH的半衰期增加大约50％。Albutropin^TM代表性地在每星期的基础上注射给药，并且在被从身体内清除很久之后刺激IGF-1的水平。这种产品的生物效应与当前可利用的生长激素疗法类似。

另一个已被开发的产品是Infitropin CR^TM，一种由聚乙二醇-缀合的hGH分子构成的hGH制剂。这种缀合的hGH要求每星期注射一次并且据说是以连续的速率释放，没有明显的突发效应[Ross等，J.Biol.Chem.，271(36)，21696-21977(1996)]。然而，这种产品已被停止。

美国专利5,981,485和6,448,225提到hGH的水制剂，该制剂据说不需要重构步骤并且每天注射给药。这种制剂代表性地包含hGH，缓冲液，非离子型表面活性剂和选择性地，中性的盐，甘露糖醇，或者防腐剂。

各式各样的其它药物给药技术，例如水凝胶[Katakam等，J.Controlled Release，49(1)，21-26(1997)]、脂质体、油乳剂和生物可降解聚合物微球体，已经被使用以试图提供持续的hGH释放。然而，得到的制剂表现出突发的药物释放，使用苛刻的条件并且其中的一些对制造来说是复杂的。这些对于基于DL-乳酸共羟基乙酸(PLGA)微球体技术的hGH制剂来说是尤其真实的，因为用于生产微球体的方法趋向使用一些条件例如提高的温度、表面活性剂、有机溶剂、和水/有机溶剂界面，所有这些可引起蛋白变性[Herberger等，Proc.Intl.Symp.Controlled Release of Bioactive Materials，23，835-836(1996)；Kim等，Intl.J.Pharmaceutics，229(1-2)，107-116(2001)]。

上面描述的一些制剂要求hGH被贮藏在冻干状态，这可能是一个费时的和贵的过程。美国专利5,780,599和6,117,984涉及到hGH的二价阳离子结晶和生产hGH二价阳离子结晶的方法，不需要冷冻干燥步骤。

尽管努力解决常规的hGH产品的缺点，包括贮藏和注射时的不稳定性、体内半衰期短、突发效应、缺乏口服生物利用度、和给药困难和给药频率，但仍然存在改进hGH制剂的需要。为了满足这种需要，本发明有利地提供生产稳定的、长时间起作用的hGH的人生长激素的结晶。

发明内容

本发明涉及稳定的、长时间起作用的、方便的和患者友好的人生长激素或人生长激素衍生物的晶体。本发明进一步地提供人生长激素或人生长激素衍生物的晶体的组合物，包括它的药物的可接受的组合物。本发明进一步地提供制备这类晶体，以及包含它们的组合物的方法。本发明的晶体和组合物被有利地用于治疗具有障碍的个体的方法，所述障碍与人生长激素缺乏有关或通过用人生长激素治疗而得到改善。

人生长激素或人生长激素衍生物的晶体，或者包含它们的组合物或制剂，有几个优点，包括：能够每周给药一次，立即可用的晶状悬浮液形式，安全性，有效性，纯度，稳定性，在短时间段内可再悬浮性和可注射性。鉴于本申请的公开内容，本领域的技术人员将理解本发明的其它目的，包括与常规的hGH制剂相比，hGH晶体和包含它们的组合物或制剂的改进。

本发明的详细说明

定义

除非在此处有另外的定义，与本发明有关使用的的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员一般理解的含义。此外，除非上下文的另外要求，单一的术语应包含复数的术语并且复数的术语应包括单一的术语。一般来说，与这里描述的柱色谱法、光学显微术、UV-VIS分光术、药物动力学分析、重组DNA方法、肽和蛋白质化学、核酸化学和分子生物学有关的专门用语和技术是众所周知的和在本领域中通常使用的。

下列术语，除非另外指明，应被理解为具有下列含义：

术语“生长激素(GH)”通常指哺乳动物垂体腺分泌的生长激素。尽管没有一个穷尽的列表，哺乳动物的例子包括人、猿、猴、大鼠、猪、狗、兔、猫、母牛、马、小鼠、大鼠和山羊。根据本发明的一个优选的实施方案，哺乳动物是人。

“人生长激素(hGH)”表示一种具有天然的人生长激素的氨基酸序列、结构和功能特征的蛋白质。正如这里使用的，人生长激素(hGH)也包括天然的人生长激素的任何一种同种型，包括但不限于，分子质量为5、17、20、22、24、36和45kDa的同种型[Haro等，J.Chromatography B，720，39-47(1998)]。这样，术语hGH包括天然hGH(促生长素)的191个氨基酸序列和包含N-末端蛋氨酸的192个氨基酸序列(Met-hGH)和人蛋氨生长激素[美国专利4,342,832和5,633,352]。hGH也可以通过从生物来源分离纯化或通过重组DNA方法来获得。如果通过重组DNA方法来制成，hGH被命名为重组人生长激素(rhGH)。Met-hGH代表性地是通过重组DNA方法制备的。

术语“人生长激素衍生物”指具有与自然存在的人生长激素可比较的氨基酸序列的蛋白质。术语“可比较的”指与hGH的191个氨基酸序列或Met-hGH的192个氨基酸序列有从2％到100％之间同源的氨基酸序列。在本发明的不同实施方案中，人生长激素衍生物包含hGH或Met-hGH的有机阳离子、生物合成的hGH或Met-hGH蛋白质的置换、缺失和插入的变异体、翻译后修饰的hGH或Met-hGH蛋白质，包括脱酰胺作用、磷酸化作用、糖基化作用(glycoslylation)、乙酰化作用、聚合和酶裂解反应[Haro等，J.Chromatography B，720，39-47(1998)]，化学修饰的来自于生物来源的hGH或Met-hGH蛋白质、包含类似于hGH或Met-hGH的氨基酸序列的多肽类似物和化学合成肽。

用于制备hGH或Met-hGH的方法包括从生物来源中分离、重组DNA方法、合成化学途径或它们的组合。迄今为止，编码hGH的不同的DNA序列的基因包括hGH-N和hGH-V[Haro等，J.Chromatography B，720，39-47(1998)；Bennani-Baiti等，Genomics，29，647-652(1995)]。

术语“价”被定义为一种元素与其它元素结合的能力，它由在原子最外壳的电子数目决定并且表达为能够结合(或替代)它的原子的氢(或者任何其它标准单价元素)的原子数[Webster′s New WorldDictionary of Science，Lindley，D.and Moore T.H.，Eds.，Macmillan，New York，New York，1998]。术语“一价阳离子”和“二价阳离子”指分别具有一价状态或二价状态的带有正电荷的离子。具有不同价状态的阳离子在自然界可以是有机的或者无机的。一价无机阳离子的例子包括铵(NH⁴⁺)和周期表组I元素(H⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺、Cs⁺和Fr⁺)，并且二价无机阳离子包括组II元素(Be⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、MO²⁺和Ra²⁺)。

“人生长激素或人生长激素衍生物的钙晶体”指在二价钙离子存在时已经被结晶的人生长激素或它的衍生物。二价钙离子以钙盐的形式被导入结晶溶液。在优选的实施方案中，人生长激素或人生长激素衍生物的钙晶体包含每个人生长激素或人生长激素衍生物的单体或单体链约1到约500个钙分子。在一个更优选的实施方案中，人生长激素或人生长激素衍生物的钙晶体包含每个人生长激素或人生长激素衍生物的单体或单体链约1到约140个钙分子组成。

术语“钙盐”包括与钙离子组成离子键的无机的和有机的反荷离子或者分子。不同钙盐的例子包括乙酸钙水合物、乙酸钙一水合物、乙酰丙酮化钙水合物、L-抗坏血酸钙二水合物、双(6，6，7，7，8，8，8-庚氟-2，2-二甲基-3，5-辛二酮化)钙、双(2，2，6，6-四甲基-3，5-庚二酮化)钙、溴化钙、碳酸钙、氯化钙、二水氯化钙、六水氯化钙、氯化钙水合物、柠檬酸钙四水合物、磷酸二氢钙、2-乙基己酸钙、氟化钙、葡萄糖酸钙、氢氧化钙、次氯酸钙、碘酸钙、碘化钙、碘化钙水合物、实电解质I钙、钼酸钙、硝酸钙、草酸钙、草酸钙水合物、氧化钙、泛酸钙、丙酸钙、焦磷酸钙和硫酸钙。在本发明的一个优选的实施方案中，钙盐选自由乙酸钙、氯化钙、硫酸钙和葡萄糖酸钙组成的组。在一个更优选的实施方案中，钙盐是乙酸钙。

“人生长激素或人生长激素衍生物的有机阳离子晶体”指在有机阳离子存在时已经被结晶的人生长激素。术语“有机阳离子”指带正电荷的原子或包含碳的原子团。有机阳离子的例子包括季铵阳离子、四乙铵(TEA)、三丁基甲基铵(TBuMA)、普鲁卡因酰胺ethobromide(PAEB)、叠氮基普鲁卡因酰胺N-甲碘化物(APM)、右旋筒箭毒碱、二甲箭毒维库溴铵(metocurine vecuronium)、罗库溴铵、1-甲基-4-苯基吡啶、胆碱和N-(4，4-axo-正戊基)-21-脱氧阿马林(ajmalinium)(APDA)。

hGH商业上可以冻干形式得到并且代表性地通过重组DNA方法来生产。根据本发明，hGH的结晶通常通过制备hGH的缓冲溶液、纯化和/或脱盐、透析和浓缩溶液和向溶液中加入一价或二价阳离子或盐来完成。后面的步骤导致结合的hGH有机或无机阳离子的形成。

本发明的一个优选的实施方案涉及hGH或hGH衍生物的一价阳离子晶体。在一个更优选的实施方案中，一价阳离子选自由锂、钠、钾和铵组成的组。在一个最优选的实施方案中，一价阳离子是钠。在一个最优选的实施方案中，人生长激素或人生长激素衍生物包含每个人生长激素或人生长激素衍生物的单体或单体链约从1到约500个一价阳离子分子。

术语“一价阳离子盐”包括与一价离子组成离子键的无机的和有机的反荷离子或者分子。在一个优选的实施方案中，一价阳离子盐是钠盐。在一个更优选的实施方案中，钠盐选自由柠檬酸钠、磷酸钠和乙酸钠组成的组。在一个最优选的实施方案中，钠盐是乙酸钠。

本发明的另一个优选的实施方案涉及hGH或hGH衍生物的鱼精蛋白晶体。同样地，也在另一个优选的实施方案中，本发明涉及hGH或hGH衍生物的聚精氨酸(polyarginine)晶体。

本发明的另外一个优选的实施方案包括与鱼精蛋白或聚精氨酸结合或共结晶的hGH或hGH衍生物的一价或二价晶体。更优选地，晶体是与鱼精蛋白或聚精氨酸络合或共结晶的钠晶体。

hGH的可溶形式可以用多种方法表征，包括反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、大小排阻色谱法高效液相色谱法(SEC-HPLC)和疏水相互作用色谱法(HIC)[Wu等，J.Chromatography，500，595-606(1990)；″Hormone Drugs″，FDA publication，(1982)]。另一方面，hGH的晶状形式可以用光学显微术和X射线衍射表征。一般而言，结晶条件将决定蛋白晶体的形状，也就是，选自由球状、针状、棒状、盘状(六角形的和正方形的)、菱形的、立方体、双锥体和棱柱组成的组的形状。

根据本发明，当用光学显微术成像时，hGH或hGH衍生物的晶体形成棒状或针状的形态。在一个实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体形成长度在大约0.1到大约200μm之间的棒状或针状。在一个优选的实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体形成长度在大约3到大约100μm之间的棒状或针状。在一个更优选的实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体形成长度在大约10到大约25μm之间的棒状或针状。

本发明的另一个实施方案涉及包含hGH或hGH衍生物的钙、一价阳离子、鱼精蛋白或聚精氨酸晶体和药物上可接受的赋形剂的组合物。也在另一个优选的实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体和赋形剂大约1∶250到大约1∶20摩尔比率的hGH∶赋形剂存在于这样组合物中。在另一个可选择的优选的实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体和赋形剂以大约3∶1到大约1∶10摩尔比率的hGH∶赋形剂存在。在还另一个优选的实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体和赋形剂以大约1∶10到大约1∶0.125摩尔比率的hGH∶赋形剂存在。在一个优选的实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体与乙酸钠一起生长，它可能与聚精氨酸或鱼精蛋白结晶或包被。

人生长激素或人生长激素衍生物的晶体可与任何药物上可接受的赋形剂结合。根据本发明，“药物上可接受的赋形剂”是在药物组合物中使用的起填料或填料组合物作用的赋形剂。包括在该类别中的优选的赋形剂是：1)氨基酸类，例如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、脯氨酸；2)糖类，例如，单糖类例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖；3)二糖类，例如乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖；4)多糖类，例如麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉、糖原；5)非环多羟醇类，例如甘露糖醇、木糖醇、乳糖醇、山梨糖醇；6)葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸；7)环糊精类，例如甲基环糊精、羟丙基-β-环糊精和类似物；8)无机分子类，例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、钠和钾的磷酸盐、硼酸、碳酸铵和磷酸铵；9)有机分子类，例如乙酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐；10)乳化或增溶/稳定剂例如阿拉伯胶、二乙醇胺、甘油单硬脂酸酯、卵磷脂、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸、失水山梨糖醇单月桂酸酯、失水山梨糖醇单硬脂酸酯、和其它失水山梨糖醇衍生物、聚烃氧基衍生物、蜡、聚氧化乙烯衍生物、失水山梨糖醇衍生物；和11)增加粘性试剂例如，琼脂、海藻酸和它的盐、瓜耳树胶、果胶、聚乙烯醇、聚乙烯氧化物、纤维素和它的衍生物、碳酸丙烯、聚乙二醇、己二醇、泰洛沙泊。这些化合物的盐也可以用。更优选的一组赋形剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、肌醇、钠和钾的盐、例如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和硼酸盐、甘氨酸、精氨酸、聚乙烯氧化物、聚乙烯醇、聚乙二醇、己二醇、甲氧基聚乙二醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、聚赖氨酸和聚精氨酸。

在本发明的一个实施方案中，赋形剂选自由氨基酸、盐、醇、糖类、蛋白质、脂类、表面活性剂、聚合物、聚氨基酸和它们的混合物组成的组。在一个优选的实施方案中，赋形剂选自由鱼精蛋白、聚乙烯醇、环糊精、葡聚糖、葡萄糖酸钙、聚氨基酸、例如聚精氨酸、聚赖氨酸和聚谷氨酸、聚乙二醇、树状聚体、聚鸟氨酸(polyorthinine)、聚乙烯亚胺、脱乙酰壳多糖和它们的混合物组成的组。在一个更优选的实施方案中，赋形剂选自由鱼精蛋白、聚精氨酸、聚乙二醇和它们的混合物组成的组。

根据本发明，人生长激素或人生长激素衍生物的晶体也可以与载体或赋形剂结合，该载体或赋形剂是一种当将其加入一种治疗剂时，可以加速或改进治疗剂的作用的物质。[The On-Line MedicalDictionary，http://cancerweb.ncl.ac.uk/omd/index.html]。载体或赋形剂的例子包括，例如，缓冲剂物质、例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质、例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、氯化钠、锌盐、胶体硅、镁、三硅酸盐、纤维素基的物质和聚乙二醇。凝胶基质形式的载体或赋形剂可以包括，例如，羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯类、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇和木蜡醇(wood wax alcohols)。

在还一个更优选的实施方案中，赋形剂是鱼精蛋白。而且，hGH或hGH衍生物的晶体和鱼精蛋白以大约5∶1到大约1∶10(w/w)比率的hGH∶鱼精蛋白存在。这个比率也可以在大约10∶1到大约20∶1(w/w)之间。更优选，这个比率在大约12∶1到大约15∶1(w/w)之间。根据一个可选择的实施方案，这个比率在大约3∶1到大约1∶10(w/w)之间。在另一个实施方案中，这个比率在大约5∶1到大约40∶1(w/w)之间。而且，在进一步的实施方案中，这个比率是大约5∶1(w/w)。

在本发明的另一方面，药物上可接受的赋形剂选自由聚氨基酸，包括聚赖氨酸、聚精氨酸和聚谷氨酸组成的组。在本发明的一个优选的实施方案中，赋形剂是聚赖氨酸。在一个更优选的实施方案中，聚赖氨酸的分子量在大约1,500和大约8,000kD之间。在另一个实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体和聚赖氨酸以大约5∶1到大约40∶1比率的(w/w)hGH∶聚赖氨酸存在。这个比率也可以在大约10∶1到大约20∶1(w/w)之间。更优选，这个比率在大约12∶1到大约15∶1(w/w)之间。根据一个可选择的实施方案，这个比率在大约5∶1到大约1∶50(w/w)之间。而且，在进一步的实施方案中，这个比率是大约5∶1(w/w)。

在本发明的还另一个优选的实施方案中，赋形剂是聚精氨酸。在一个更优选的实施方案中，聚精氨酸的分子量在大约15,000和大约60,000kD之间。在另一个实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体和聚精氨酸以大约5∶1到大约40∶1(w/w)比率的hGH∶聚精氨酸存在。这个比率也可以在大约10∶1到大约20∶1(w/w)之间。更优选，这个比率在大约12∶1到大约3∶1(w/w)之间。根据一个可选择的实施方案，这个比率在大约5∶1到大约1∶50(w/w)的之间。在另一个实施方案中，这个比率在大约12∶1到大约15∶1(w/w)的范围。而且，在进一步的实施方案中，这个比率是大约5∶1(w/w)。

根据本发明的一个实施方案包括含有大约20mg/ml hGH或hGH衍生物的晶体的一种可注射的晶状悬浮液。这种悬浮液特征为容易再悬浮、慢沉淀和大约为7天的时间作用特征。它可以每周注射一次，用30量规的注射器并提供80％水平的有效负荷。如通过参数0.02％集聚(SE-HPLC)和2.3％相关蛋白质(RP-HPLC)反映的，该悬浮液是纯的。这种纯度在冷藏的条件下维持至少4个月。

本发明的一个实施方案涉及hGH或hGH衍生物的晶体，与常规的可溶hGH或hGH制剂相比，它们的特征为当置入个体时具有溶解延迟行为。根据本发明，hGH或hGH衍生物的晶体的溶解特征为体内或体外的溶解参数。例如，将体外溶解描述为在一个连续的溶解过程中，每15分钟或每一洗涤步骤所得到的可溶hGH的浓度(表示为最初存在的总的hGH或hGH衍生物的晶体的百分比或者总的hGH或hGH衍生物的晶体的mg)(参见实施例5)。在本发明的一个实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体的特征表现为在温度37℃时暴露于溶解缓冲液(50mMHEPES(pH 7.2)，140mM NaCl，10mMKCl和0.02％(v/v)NaN₃)时，每一洗涤步骤大约2到大约16％的所说晶体的体外溶解率，其中溶液中hGH或hGH衍生物的浓度以大约2mg/ml存在。在另一个实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体的特征表现为在一个连续的溶解过程中，每一洗涤步骤大约0.04到大约0.32mg的所说晶体的体外溶解率(参见实施例5)。另一方面，通过在单次注射hGH入哺乳动物后，哺乳动物体内随时间的hGH血清水平描述体内溶解。

在哺乳动物体内，GH刺激组织合成和分泌IGF-1，一种依次在细胞分裂和新陈代谢过程中起作用的蛋白质。正如本领域技术人员将理解的，血清hGH和IGF-1水平取决于许多因素，包括生理学的和治疗相关的因素。这样的因素包括，但不限于：生理学因素，例如：出生年龄和骨年龄、性别、体重、发育阶段(例如，在青春期增加的水平)和治疗相关的因素，例如剂量、给药的速率(动力学)和给药途径。同样地，本领域技术人员将理解，从安全和功效的立场来看，对于不同的患者人群不同的hGH和IGF-1水平也可能是有益的。

患有多种hGH缺乏、疾病状态或综合征的成人或儿童可以通过用根据本发明的hGH晶体或hGH衍生物的晶体，通过多种外源性递送的hGH的方案来治疗。例如，内分泌学家可以用大约0.2mg/kg/周的剂量对儿童开始治疗，经过几个星期或几个月的治疗以后增加剂量到0.3mg/kg/周，在青春期左右，剂量可进一步增加到大约0.7mg/kg/周。正如本领域技术人员将理解的，这种外源性递送的对需要hGH递送的成人或儿童递送hGH的水平也取决于hGH存在的生理水平或浓度。

成人和儿童的hGH剂量方案用mg/kg或国际单位(IU/kg)表示。这样的方案通常按天或周排定，也就是，mg/kg/天或mg/kg/周。有这种考虑，根据本发明的一个实施方案，hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这些晶体的组合物的单次给药，例如，每30kg儿童每周单次给药大约9mg，在给药后第1和第2天提供体内hGH血清浓度大于大约10ng/ml，在给药后第3和第4天体内hGH血清浓度大于大约5ng/ml和在给药后第5和第7天体内hGH血清浓度大约0.3ng/ml。可选择地，hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这些晶体的组合物的单次给药，在所说的哺乳动物中提供大约0.3ng/ml到大约2,500ng/mlhGH，优选大约0.5ng/ml到大约1,000ng/ml hGH，更优选大约从1ng/ml到大约100ng/ml hGH的体内hGH血清浓度，达给药后大约0.5小时到大约40天，优选给药后大约0.5小时到大约10天、7天或1天中的任一项。同样地，hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这些晶体的组合物的单次给药，在所说的哺乳动物中提供大于大约2ng/mlhGH，优选大于大约5ng/ml hGH，更优选大于大约10ng/ml hGH的体内血清浓度，达给药后大约0.5小时到大约40天，优选给药后大约10天、7天或1天中的任一项。在本发明的一个更优选的实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这些晶体的组合物的单次给药，在所说的哺乳动物中提供大于大约0.3ng/ml hGH的体内血清浓度，达给药后大约0.5小时到大约40天，优选给药后10天、7天或1天中的任一项的任一阶段。根据本发明的一个实施方案，hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这些晶体的组合物的单次给药，在给药后第1和第2天提供体内hGH血清浓度大于大约10ng/ml，在给药后第3和第4天体内hGH血清浓度大于大约5ng/ml和在给药后第5和第7天体内hGH血清浓度大于大约0.3ng/ml。而且，在进一步的实施方案中，单次给药hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这类晶体的组合物，提供大于大约0.3ng/ml hGH的体内血清浓度，达给药后约0.5小时至约10天。

按照本发明的一个实施方案，单次给药hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这类晶体的组合物，提供体内IGF-1血清升高，该血清升高在所述施用前的基线IGF-1水平以上，从施用后约10小时至约72小时大于约50ng/ml，以及从施用后约72小时至约15天，优选施用后约10天，在约0.5ng/ml至约50ng/ml之间。可替代地，单次给药hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这类晶体的组合物，提供约5ng/ml至约2,500ng/ml，优选约100ng/ml至约1,000ng/ml的体内IGF-1血清升高，达施用后约0.5小时至约40天，优选施用后约7天。可替代地，单次给药hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这类晶体的组合物，按照本发明可提供约50ng/ml以上，优选约100ng/ml以上的体内IGF-1血清升高，达施用后约0.5小时至约40天，优选施用后约7天。按照本发明的一个实施方案，单次给药hGH或hGH衍生物的晶体，或包含这类晶体的组合物，提供体内IGF-1血清升高，该血清升高在所述施用前的基线IGF-1水平以上，从施用后约10小时至约72小时大于约50ng/ml，以及从施用后约72小时至约15天或施用后约72小时至约10天，在约0.5ng/ml至约50ng/ml之间。

按照本发明，将单次给药定义为约0.01mg/kg/周至约100mg/kg/周hGH晶体或hGH衍生物晶体，或包含这类晶体的组合物，其中给药的体积在0.1ml和约1.5ml之间。例如，可以以约0.3mg/kg/周，例如对于30kg儿童来说约9mg，用hGH晶体或hGH衍生物晶体，或包含这类晶体的组合物给药儿童生长激素缺乏。可以以约0.375mg/kg/周，例如对于30kg儿童来说约11.25mg，用hGH晶体或hGH衍生物晶体，或包含这类晶体的组合物给药特纳综合征。另外地，可以以约0.2mg/kg/周，例如对于80kg成人来说约16mg，用hGH给药成人生长激素缺乏。可以以6mg/天，例如42mg/周，用hGH给药AIDS消瘦疾病。

在本发明的还一个实施方案中，hGH晶体或hGH衍生物晶体，或包含这类晶体的组合物，在哺乳动物中显示与可溶的hGH类似的相对生物利用度。与通过相同途径递送的可溶hGH的相对生物利用度比较，按照本发明的晶体具有至少50％或更大的相对生物利用度，其中对于所述可溶的hGH和所述晶体，通过总的体内hGH血清浓度的曲线下面积(AUC)测定所述生物利用度。因此hGH或hGH衍生物的晶体以有利的体内溶解速率为特征。

本发明进一步提供对具有障碍的哺乳动物给予hGH或hGH衍生物的晶体的方法，所述障碍与人生长激素缺乏有关或或通过用hGH治疗得到改善。所述方法包括对哺乳动物给予治疗有效量的hGH或hGH衍生物晶体的步骤。可替代地，所述方法包括对哺乳动物给予治疗有效量的包含hGH或hGH衍生物晶体单独或具有赋形剂的组合物的步骤。按照本发明的hGH或hGH衍生物晶体的不同实施方案是：hGH或hGH衍生物的钙晶体、一价晶体、鱼精蛋白晶体或聚精氨酸晶体。可以通过每三天约一次、一周约一次、每两周约一次或每月约一次的时间方案给予这样的晶体，或包含它们的组合物。

可以按照本发明治疗的与hGH缺乏有关的障碍包括，但不限于：成人生长激素缺乏、儿童生长激素缺乏、普-威综合征、特纳综合征、短肠综合征、慢性肾功能不全、自发的短身材、侏儒症、垂体功能减退侏儒症、骨再生、雌性不育症、宫内生长迟缓、AIDS有关的恶病质、局限性回肠炎、烧伤、以及其它遗传和代谢障碍。在本发明的一个实施方案中，所述障碍是儿童生长激素缺乏并且在经历治疗的儿童中，治疗导致约7cm和约11cm之间的每年生长速度。

在本发明的另一个实施方案中，hGH或hGH衍生物的钙晶体在哺乳动物中可以作为骨治疗，以及人生长激素缺乏的治疗的有用辅助剂而起作用。

本发明还提供在哺乳动物中诱导体重增加的方法，该方法包括对所述哺乳动物给予治疗有效量的hGH或hGH衍生物的晶体的步骤。可替代地，这类方法包括对所述哺乳动物给予治疗有效量的包含hGH或hGH衍生物的晶体和赋形剂的组合物的步骤。在这类方法的一个实施方案中，在一周一次通过注射给予所述晶体后，在切除垂体的大鼠中诱导的体重增加在约5％和约40％之间。

hGH的晶体、hGH衍生物的晶体或包含它们单独，或具有赋形剂的组合物可以单独，或作为药物、治疗或预防制剂的部分被给予。可以通过任何常规给药途径包括，例如，胃肠外、口、肺、鼻、耳、肛门、皮肤、眼、静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、粘膜、舌下、皮下、透皮、局部、颊或颅内途径给予它们。

在本发明的一个实施方案中，通过口途径或胃肠外途径给予hGH或hGH衍生物的晶体，或包含它们的组合物，有或没有赋形剂。在优选的实施方案中，通过皮下或肌内途径给予hGH或hGH衍生物的晶体，或包含它们的组合物，有或没有赋形剂。

在优选的实施方案中，使用具有大于或等于27的量规的针，通过皮下途径给予本发明的晶体或组合物。在本发明的一个实施方案中，所述针量规可以等于30。可以从预填充的注射器或变剂量输注泵给予所述晶体或组合物。或者，通过无针注射给予它们。

本发明有利地允许hGH持续释放到哺乳动物中。在一个实施方案中，一周约一次给予按照本发明的晶体或组合物。在另一个实施方案中，每两周约一次给予按照本发明的晶体或组合物。在还另一个实施方案中，每月约一次给予按照本发明的晶体或组合物。本领域的技术人员将理解，具体治疗方案将取决于因素例如将要治疗的疾病、将要治疗的患者的年龄和体重、患者的一般身体状况和治疗医生的判断。

根据一个实施方案，包含本发明hGH或hGH衍生物晶体的组合物以大于约0.1mg/ml的hGH浓度为特征。例如，所述浓度可以在约0.1mg/ml和约100mg/ml之间。或者，那些组合物可能以约1mg/ml和约100mg/ml之间或约10mg/ml和约100mg/ml之间的hGH浓度为特征。这样的组合物还包括下列组分：甘露糖醇-约0.5mg/ml至约100mg/ml；乙酸钠-约5mM至约250mM(优选约25mM至约150mM)；Tris HCl-约5mM至约100mM；pH约6.0至约9.0(优选约6.5至约8.5)；PEG(MW 800-8000，优选3350、4000、6000或8000)-0至约25％；鱼精蛋白，优选3∶1比率的hGH∶鱼精蛋白；以及聚精氨酸，优选5∶1比率的hGH∶聚精氨酸。这样的组合物可以选择性地包含：蔗糖-0mg/ml至约100mg/ml；氨基酸(例如精氨酸和甘氨酸)-0mg/ml至约50mg/ml；防腐剂(抗微生物剂，苯酚，间甲酚(matacrescol)，苯甲醇，对羟基苯甲酸酯)-0％至约5％(优选0％至约0.9％)；以及聚山梨酯-0mg/ml至约10mg/ml。根据一个实施方案，按照本发明的组合物以80％有效载荷为特征。

按照本发明优选的制剂载体包含约100mM乙酸钠、约5％PEG6000MW和约25mM TrisHCl，pH7.5。使用这样的载体制备的hGH组合物可以包含：约9.35mg/ml结晶hGH和约1.81mg/ml聚精氨酸(或约3.12mg/ml鱼精蛋白)。如本领域的技术人员将理解的，假定按照本发明的组合物可以包含约1mg/ml至约100mg/ml hGH浓度，因此应该调整聚精氨酸(或鱼精蛋白)的浓度，使得足以保持5∶1hGH∶聚精氨酸(w/w)比率或3∶1hGH∶鱼精蛋白(w/w)比率并且保持低溶解度和约5ng/ml的hGH的释放。例如，对于上面描述的制剂，如果期望的hGH浓度是约20mg/ml，那么聚精氨酸(或鱼精蛋白)浓度应该是约4mg/ml。

本发明进一步提供了制备hGH或hGH衍生物的晶体的方法。一种这样的方法包括如下步骤：(a)将人生长激素或人生长激素衍生物的溶液与结晶溶液混合，所述结晶溶液包含盐和离子型聚合物；以及(b)在约4℃和约37℃之间的温度下培育所述溶液大于约12小时，直到形成人生长激素或人生长激素衍生物的晶体为止。在另一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：(a)将人生长激素或人生长激素衍生物的溶液与结晶溶液混合，所述结晶溶液包含盐和沉淀剂；以及(b)在约4℃和约37℃之间的温度下培育所述溶液大于约16小时，直到形成人生长激素或人生长激素衍生物的晶体为止。在另一个实施方案中，上述任一种方法的步骤(b)中的溶液可以在约15℃的温度下被培育大于约一周。在优选的实施方案中，hGH或hGH衍生物的晶体是钙晶体、一价阳离子晶体、鱼精蛋白晶体或聚精氨酸晶体并且离子型聚合物是鱼精蛋白或聚精氨酸。在另一个实施方案中，离子型聚合物是聚赖氨酸或聚鸟氨酸(polyorthinine)。在还另一个实施方案中，离子型聚合物是鱼精蛋白、聚精氨酸和聚赖氨酸中的任何两种或更多种的混合物。

在上述方法的步骤(a)中的盐可以是一价的也可以是二价的并且可以是无机的或有机的。优选的二价盐的实施方案是钙盐。在更优选的实施方案中，钙盐选自由乙酸钙、氯化钙、葡糖酸钙和硫酸钙组成的组。在还更优选的实施方案中，钙盐是乙酸钙。在另一个优选的实施方案中，一价阳离子选自由锂、钠、钾和铵组成的组。在更优选的实施方案中，一价阳离子是钠。

在本发明可替代的优选实施方案中，一价阳离子盐是钠盐。在更优选的实施方案中，钠盐选自由柠檬酸钠、磷酸钠和乙酸钠组成的组。在还更优选的实施方案中，钠盐是乙酸钠。

在上述方法中，当所述盐是钙盐或一价阳离子盐时，它以约0.01mM和约1M之间的浓度存在于步骤(a)的结晶溶液中。在优选的实施方案中，该浓度在约25和约205mM之间。当所述盐是钙盐时，它以约0.01mM和235mM之间的浓度存在于步骤(a)的结晶溶液中。

在优选的实施方案中，步骤(a)的结晶溶液进一步包含pH缓冲液。在更优选的实施方案中，缓冲液具有约pH6和约pH10之间的pH。在更优选的实施方案中，缓冲液的pH在约pH7.5和约pH10之间。在更优选的实施方案中，缓冲液的pH在约pH7.0和约pH10之间。在还更优选的实施方案中，缓冲液的pH在约pH6和约pH9之间。在还一个更优选的实施方案中，缓冲液的pH在约pH7.8和约pH8.9之间。

在上述方法的另一方面，步骤(a)中的缓冲液选自由Tris、HEPES、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、咪唑和甘氨酸组成的组。在上述方法的优选实施方案中，步骤(a)中的缓冲液选自由碳酸氢盐、咪唑-苹果酸盐、甘氨酸、2，2-双(羟基甲基)-2，2’，2”-次氮基三乙醇(“双-tris”)、碳酸盐、N-(乙酰氨基)-亚氨基二乙酸、2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇和(N-(1-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸组成的组。

在上述方法之一中，用于制备hGH或hGH衍生物晶体的沉淀剂典型地是聚合的，包括低分子量聚醇和鱼精蛋白。在本发明的另一个实施方案中，上述方法之一步骤(a)中的沉淀剂是非离子型聚合物。在优选的实施方案中，非离子型聚合物选自由醇、聚乙二醇(PEG)和聚乙烯醇或乙醇组成的组。在更优选的实施方案中，沉淀剂是异丙醇或乙醇。在还一个更优选选的实施方案中，PEG具有约200和约8000之间的分子量。PEG以具有3350、4000、6000或8000的分子量。在一个更优选选的实施方案中，PEG具有约6000的分子量。在还另一个优选的实施方案中，PEG以约0.5％和约12％w/v之间的浓度存在。

在上述方法之一的另一个实施方案中，步骤(a)中的沉淀剂是非离子型聚合物。在优选的实施方案中，非离子型聚合物选自由鱼精蛋白、聚精氨酸、聚鸟氨酸和聚赖氨酸组成的组。

上述方法的混合步骤(a)包括将hGH或hGH衍生物的溶液与结晶溶液混合。在所述方法的一个实施方案中，得到的hGH或hGH衍生物在所述结晶溶液中的浓度在约1mg/ml和约1,000mg/ml之间。在优选的实施方案中，在所述溶液中的hGH或hGH衍生物以约2mg/ml和约50mg/ml之间的浓度存在。在进一步的实施方案中，在所述溶液中的hGH或hGH衍生物以约10m g/ml和约25mg/ml之间的浓度存在。

在上述制备hGH或hGH衍生物晶体的方法的优选实施方案中，在步骤(b)中在约33℃的温度下培育包含hGH或hGH衍生物和结晶溶液的溶液达约0.25天至约两天。可替代地，所述温度可以是约37℃。在另一个实施方案中，在约25℃的温度下培育包含hGH或hGH衍生物和结晶溶液的溶液达约0.25天至约两天。在还另一个实施方案中，在约15℃的温度下培育包含hGH或hGH衍生物和结晶溶液的溶液达约0.25天至约两天。

本发明进一步提供了制备hGH晶体、hGH衍生物的晶体或包含这类晶体和赋形剂的组合物的替代方法。该方法包括如下步骤：(a)将hGH或hGH衍生物的溶液与结晶缓冲液混合以产生结晶溶液；(b)向所述结晶溶液中添加去离子水；(c)向所述结晶溶液中添加离子型小分子或离子型聚合物；(d)向所述结晶溶液中添加盐；以及(e)在约10℃和约40℃的温度下培育所述结晶溶液约2至约168小时，直到形成hGH或hGH衍生物的晶体为止。在本发明的进一步实施方案中，所述培育进行约4至约48小时。在另一个优选的实施方案中，在上述方法的步骤(e)的结晶溶液，在约4℃和约40℃之间的温度下被培育约4至约48小时，直到形成hGH或hGH衍生物的晶体为止。按照替代的实施方案，进行上述方法，在步骤(b)后具有任意的步骤。所述任意的步骤包括向所述结晶溶液中添加沉淀剂。在上述方法的进一步实施方案中，步骤(c)是任意的。不论是否使用那些任意的步骤，在优选的实施方案中，在约15℃和约37℃之间的温度下培育步骤(e)的结晶溶液约1至约2天。在另一个优选的实施方案中，在约4℃和约37℃之间的温度下培育步骤(e)的结晶溶液约1至约2天。

在按照本发明的优选实施方案中，在上述方法的步骤(d)中，所述盐是钙盐或一价阳离子盐。在优选的钙晶体实施方案中，钙盐选自由乙酸钙、氯化钙、葡糖酸钙和硫酸钙组成的组。在还一个更优选的实施方案中，钙盐是乙酸钙。在优选的实施方案中，乙酸钙呈具有约3和约9.0之间的pH的水溶液形式。在更优选的实施方案中，乙酸钙水溶液具有约7.0和约8.6之间的pH。在另一个实施方案中，在步骤(e)溶液中的乙酸钙以约0.1mM和约205mM之间的浓度存在。在更优选的实施方案中，在步骤(e)结晶溶液中的乙酸钙以约85mM和约100mM之间的浓度存在。

在更优选的实施方案中，一价阳离子盐选自由锂、钠、钾和铵组成的组。在还一个更优选的实施方案中，上述方法步骤(d)中的一价阳离子盐是钠。相似地，在更优选的实施方案中，一价阳离子盐选自由柠檬酸钠、磷酸钠和乙酸钠组成的组。在还一个更优选的实施方案中，一价阳离子盐是乙酸钠。在优选的实施方案中，乙酸钠呈具有约3和约9.0之间的pH的水溶液形式。在更优选的实施方案中，乙酸钠水溶液具有约7.0和约8.6之间的pH。在另一个实施方案中，在步骤(e)结晶溶液中的乙酸钠以约0.5mM和约800mM之间的浓度存在。在更优选的实施方案中，在步骤(e)结晶溶液中的乙酸钠以约100mM和约500mM之间的浓度存在。所述浓度也可以在约85mM和约100mM之间。

在还另一个优选的实施方案中，在上述方法步骤(e)结晶溶液中的hGH或hGH衍生物以约2mg/ml和约17.5mg/ml之间的浓度存在。在另一个优选的实施方案中，在上述方法步骤(e)结晶溶液中的hGH或hGH衍生物以约14.5mg/ml和约15.5mg/ml之间的浓度存在。在进一步的实施方案中，在步骤(e)结晶溶液中的hGH或hGH衍生物以约2mg/ml和约100mg/ml之间的浓度存在。

在优选的实施方案中，在上述方法步骤(a)的结晶缓冲液选自由Tris-HCl、HEPES、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、咪唑和甘氨酸组成的组。可替代地，结晶缓冲液选自由Tris-HCl、甘氨酸、HEPES、咪唑、双-Tris、AMP(2-氨基-2甲基丙醇)、AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、AMPSO(3-([1，1-二甲基-2-羟基乙基]氨基)-2-羟基丙烷磺酸)、N-二(羟乙基)甘氨酸、乙醇胺、glyclglycine、TAPS、牛磺酸(Taurin)

、Triane和它们的混合物组成的组。在另一个优选的实施方案中，步骤(a)溶液中的结晶缓冲液以约10mM和约800mM之间的浓度存在。

在上述方法另一个实施方案中，步骤(a)中的结晶缓冲液以约3和约10之间的pH存在。在优选的实施方案中，结晶缓冲液以约6和约9之间的pH存在。在还另一个优选的实施方案中，结晶缓冲液以约7.5和约10之间的pH存在。

在另一个优选的实施方案中，上述方法步骤(e)溶液中的结晶缓冲液的pH在约3和约10之间。在更优选的实施方案中，溶液中的结晶缓冲液的pH在约6和约9.5之间。在还一个更优选的实施方案中，溶液中的结晶缓冲液的pH在约7.5和约9.5之间。

在那些包括向结晶溶液中添加沉淀剂的步骤(b)后的任意步骤的方法的优选实施方案中，所述沉淀剂是非离子型小分子或非离子型聚合物。在优选的实施方案中，非离子型聚合物选自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇、和它们的混合物组成的组。在另一个优选的实施方案中，PEG具有选自由约200和约8000之间、约6000、约4000、和约3350组成的组的分子量。在还另一个优选的实施方案中，PEG以约0.5％和约20％(w/v)之间的浓度存在于结晶溶液中。在上述方法的另一个优选实施方案中，沉淀剂选自由氨基酸、肽、聚氨基酸和它们的混合物组成的组。

在另一个优选的实施方案中，在上述方法的步骤(c)中，离子型聚合物选自由鱼精蛋白、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚鸟氨酸和八精氨酸(octarginine)组成的组。在另一个优选的实施方案中，在上述方法的步骤(c)中，以在5∶1和约1∶25之间的hGH∶聚精氨酸的比率添加聚精氨酸。在约15℃和约37℃之间的温度下培育得到的结晶溶液达约16至约48小时。

本发明还提供了制备人生长激素的晶体、人生长激素衍生物的晶体或包含这类晶体和赋形剂的组合物的还另一种方法。该方法包括如下步骤：(a)将人生长激素或人生长激素衍生物的溶液与结晶缓冲液混合以产生结晶溶液；(b)向所述结晶溶液中添加去离子水；(c)向所述结晶溶液中添加沉淀剂；(d)向所述结晶溶液中添加盐；(e)在约10℃和约40℃之间的温度下培育所述结晶溶液约2至约168小时，直到形成人生长激素或人生长激素衍生物的晶体为止，以及(f)向所述人生长激素或人生长激素衍生物的晶体中添加离子型聚合物。按照上述方法的一个实施方案，步骤(f)是任意的。在优选的实施方案中，在约15℃和约37℃之间的温度下，培育步骤(e)的结晶溶液达约一至约两天。在另一个优选的实施方案中，在约4℃和约37℃之间的温度下，培育步骤(e)的结晶溶液达约一至约两天。在本发明的进一步实施方案中，所述培育进行约2至约48小时。在另一个优选的实施方案中，在约4℃和约40℃之间的温度下，培育上述方法步骤(e)的结晶溶液达约4至约48小时，直到形成hGH或hGH衍生物的晶体为止。

在按照本发明的优选实施方案中，在上述方法的步骤(d)中，所述盐是钙盐或一价阳离子盐。在更优选的实施方案中，所述钙盐选自由乙酸钙、氯化钙、葡糖酸钙和硫酸钙组成的组。在还一个更优选的实施方案中，所述钙盐是乙酸钙。在优选的实施方案中，乙酸钙呈具有约3和约9.0之间的pH的水溶液形式。在更优选的实施方案中，乙酸钙水溶液具有约7.0和约8.6之间的pH。在另一个实施方案中，在步骤(e)结晶溶液中的乙酸钙以约0.1mM和约205mM之间的浓度存在。在更优选的实施方案中，在步骤(e)结晶溶液中的乙酸钙以约85mM和约100mM之间的浓度存在。

在更优选的实施方案中，一价阳离子选自由锂、钠、钾和铵组成的组。在还一个更优选的实施方案中，一价阳离子是钠。相似地，在更优选的实施方案中，一价阳离子盐选自由柠檬酸钠、磷酸钠合乙酸钠组成的组。在还一个更优选的实施方案中，一价阳离子盐是乙酸钠。在优选的实施方案中，乙酸钠呈具有约3和约9.0之间的pH的水溶液形式。在更优选的实施方案中，乙酸钠水溶液具有约7.0和约8.6之间的pH。在另一个实施方案中，在步骤(e)溶液中的乙酸钠以约0.5mM和约800mM之间的浓度存在。在更优选的实施方案中，在步骤(e)结晶溶液中的乙酸钙以约100mM和约500mM之间的浓度存在。可替代地，所述浓度还可以在约85mM和约100mM之间。

在还另一个实施方案中，在上述方法的步骤(e)结晶溶液中的hGH或hGH衍生物以约2mg/ml和约17.5mg/ml之间的浓度存在。在另一个优选的实施方案中，在步骤(e)结晶溶液中的hGH或hGH衍生物以约14.5mg/ml和约15.5mg/ml之间的浓度存在。在进一步的实施方案中，在上述方法的步骤(e)结晶溶液中的hGH或hGH衍生物以约2mg/ml和约100mg/ml之间的浓度存在。

在优选的实施方案中，上述方法的步骤(a)的结晶缓冲液选自由Tris-HCl、HEPES、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、咪唑和甘氨酸组成的组。在另一个优选的实施方案中，步骤(a)溶液中的结晶缓冲液以约10mM和约800mM之间的浓度存在。

在上述方法的另一个实施方案中，步骤(a)中的结晶缓冲液以约3和约10之间的pH存在。在优选的实施方案中，结晶缓冲液以约6和约9之间的pH存在。在还另一个优选的实施方案中，结晶缓冲液以约7.5和约10之间的pH存在。

在另一个优选的实施方案中，上述方法步骤(e)溶液中结晶缓冲液的pH在约3和约10之间。在更优选的实施方案中，溶液中结晶缓冲液的pH在约6和约9.5之间。在还一个更优选的实施方案中，溶液中结晶缓冲液的pH在约7.5和约9.5之间。

在优选的实施方案中，在上述方法步骤(c)中，沉淀剂是非离子型小分子或非离子型聚合物。在优选的实施方案中，非离子型聚合物选自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇和它们的混合物组成的组。在另一个优选的实施方案中，PEG具有选自由约200和约8000之间、约6000、约4000和约3350组成的组的分子量。在还另一个优选的实施方案中，PEG以约0.5％合约20％(w/v)的浓度存在于结晶溶液中。在另一个优选的实施方案中，在上述方法步骤(c)中，沉淀剂选自由氨基酸、肽、聚氨基酸和它们的混合物组成的组。

在另一个优选的实施方案中，在上述方法步骤(f)中，离子型聚合物选自由鱼精蛋白、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚鸟氨酸和八精氨酸组成的组。在另一个优选的实施方案中，在上述方法步骤(f)中，以约5∶1和约1∶25之间的hGH∶聚精氨酸(mg∶mg)比率添加聚精氨酸。在替代的实施方案中，以约1∶5和约1∶25之间的hGH∶聚精氨酸(mg∶mg)比率添加聚精氨酸。在约15℃和约37℃之间的温度下培育得到的步骤(f)中的溶液达约16至约48小时。通过完全溶解所需的洗涤次数反映聚合物对hGH或hGH衍生物的晶体溶解速率的影响。对于完全溶解，对照晶体需要约7至约13次洗涤，而对于完全溶解，用聚精氨酸制备的晶体需要约30至90次之间的溶解缓冲液的相同洗涤。洗涤是连续溶解过程中的洗涤步骤(见实施例5)。

在上述方法中任一种的替代实施方案中，钙盐或一价阳离子盐可以以约0.01M和约1M之间或约25mM和约205mM之间的浓度存在于结晶溶液中。在上述方法中任一种的替代实施方案中，培育结晶溶液，时间和温度选自由在约33℃的温度下，约0.25天至约两天；在约25℃的温度下，约0.25天至约两天和在约15℃的温度下，约0.25天至约两天组成的组。

本发明还包括筛选用于治疗制剂中的hGH或hGH衍生物的晶体的方法。这类方法的步骤包括：(1)在37℃的温度下用溶解缓冲液洗涤所述hGH或hGH衍生物的晶体(例如，2mg的晶体和1ml的溶解缓冲液)和(2)测定在所述溶解缓冲液中每次洗涤的所述hGH或hGH衍生物的晶体的体外溶解速率，其中所述晶体的所述体外溶解速率是在约10分钟和约1500分钟之间，约2％和约16％之间的所述晶体，在连续溶解过程中的每次洗涤步骤约2分钟至约32分钟(见实施例5)。所述晶体的体外溶解速率还可以是约15分钟内约4％和约10％之间的所述晶体或者约15分钟内约0.04和约0.32mg之间的所述晶体。

为了更好地理解本发明，陈述下面的实施例。这些实施例仅为举例说明的目的，不应被解释为以任何的方式限制本发明的范围。

附图简单说明

图1说明了如通过光学显微术成像的，在860mM磷酸铵(pH 8.9)存在下hGH晶体生长。见实施例1。

图2说明了如通过光学显微术成像的，在390mM柠檬酸钠存在下hGH晶体生长。见实施例2。

图3说明了如通过光学显微术成像的，在600mM磷酸二钠和100mM Tris-HCl(pH8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例3。

图4说明了如通过光学显微术成像的，在85mM乙酸钙和100mMTris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长以及与硫酸鱼精蛋白(1mg/ml)共结晶。见实施例4。

图5显示了作为时间的函数并在280nm监测的，从磷酸铵、柠檬酸钠、磷酸二钠和乙酸钙/鱼精蛋白沉淀剂生成的hGH晶体的溶解度。见实施例5。

图6说明了如通过光学显微术成像的，在10％(v/v)异丙醇、85mM乙酸钙和100mMTris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例6。

图7说明了如通过光学显微术成像的，在5％(v/v)异丙醇、85mM氯化钙和100mMTris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例7。

图8说明了如通过光学显微术成像的，在10％(v/v)乙醇、10％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例8。

图9显示了作为以分为单位的时间的函数，在280nm监测的，按照实施例6-8生成的hGH晶体的溶解度。见实施例9。

图10说明了如通过光学显微术成像的，在85mM乙酸钙、2％(v/v)PEG-6000和100mMTris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例10。

图11说明了如通过光学显微术成像的，在500mM乙酸钠、6％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例11。

图12说明了如通过光学显微术成像的，在85mM氯化钙、6％(v/v)PEG-6000和100mMTris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例12。

图13说明了如通过光学显微术成像的，在85mM乙酸钙、6％(v/v)PEG-6000、100mMTris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长和与硫酸鱼精蛋白(1mg/ml)共结晶。见实施例13。

图14说明了如通过光学显微术成像的，在125mM乙酸钙、6％(v/v)PEG-MME-6000和100mM Tris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例14。

图15显示了作为以分为单位的时间的函数，在280nm监测的，按照实施例10-14生成的hGH晶体的溶解度。见实施例15。

图16显示了商业上的hGH(可溶的hGH)和按照实施例10制备的hGH(hGH晶体)在雌性Sprague-Dawley大鼠中的血清水平(ng/ml)，每只大鼠单次皮下给予2.5mg/kg剂量的可溶的或结晶hGH后，24小时内取样。在t＝0，0.5，1，2，4，6，8，12和24小时测定血清水平。见实施例16。

图17说明了在添加不同量的硫酸鱼精蛋白后的hGH晶体(在85mM乙酸钙、2％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH 8.6)存在下形成)的溶解特征。然后将这些不同的hGH晶体的制剂添加到溶解缓冲液中并在通过RP-HPLC测定上清液中可溶hGH的浓度(面积)前，允许放置1小时。见实施例17。

图18A表明了如通过TEM纵长成像的，在500mM乙酸钠、6％v/v PEG-6000和100mMTris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例18。

图18B说明了如通过TEM横切面成像的，在500mM乙酸钠、6％v/v PEG-6000和100mMTris-HCl(pH 8.6)存在下hGH晶体生长。见实施例18。

图19A显示了组3-5和9的雌性Sprague-Dawley大鼠中hGH的血清水平(ng/ml)，每只大鼠七天内每天皮下给予或七天内单次皮下给予6.7mg/kg剂量的hGH后168小时内取样(显示的0-72小时)。见实施例22和表7-12。

图19B显示了每只大鼠七天内每天皮下给予(组2)或在七天的第一天单次皮下给予(组4和9)6.7mg/kg剂量的hGH后8天内，选择制剂(组2、4和9)的雌性Sprague-Dawley大鼠的体重增加。见实施例22和表13。

图20A显示了雌性幼猕猴作为时间的函数的血清中hGH的浓度，按照表16，所述猴每天皮下给予可溶的hGH(组1)、与聚精氨酸络合的hGH钠晶体(组2)和与鱼精蛋白络合的hGH钠晶体(组3)。见实施例23。

图20B显示了雌性幼猕猴作为时间的函数的血清中IGF-1的浓度，按照表18，所述猴每天皮下给予可溶的hGH(组1)、与聚精氨酸络合的hGH钠晶体(组2)和与鱼精蛋白络合的hGH钠晶体(组3)。见实施例23。

图21A显示了雌性幼猕猴作为时间的函数的血清中hGH的浓度，按照表20，所述猴被每天皮下给予可溶的hGH(组1)、与鱼精蛋白络合的hGH钠晶体(3∶1比率的hGH∶鱼精蛋白)(组2)和与鱼精蛋白络合的hGH钠晶体(2∶1比率的hGH∶鱼精蛋白)(组3)。见实施例24。

图21B显示了雌性幼猕猴作为时间的函数的血清中IGF-1的浓度，按照表22，所述猴被每天皮下给予可溶的hGH(组1)、与鱼精蛋白络合的hGH钠晶体(3∶1比率的hGH∶鱼精蛋白)(组2)和与鱼精蛋白络合的hGH钠晶体(2∶1比率的hGH∶鱼精蛋白)(组3)。见实施例24。

图22说明了雄性Wistar大鼠的七天生长，按照表25，所述大鼠被皮下给予对照(组1，七天内每天一次)、可溶的hGH(组4和5，七天内每天一次)和晶体hGH(组6、7、9和10，七天内一次)。见实施例25。

图23说明了七天内每天诱导的雄性Wistar大鼠的体重增加(克)，按照表26，所述大鼠被皮下给予对照(组1，七天内每天一次)、可溶的hGH(组4和5，七天内每天一次)和晶体hGH(组6、7、9和10，七天内一次)。见实施例25。

具体实施方式

在下面陈述的实施例中使用了以下材料。

材料

商业上可获得的重组人生长激素(rhGH)来自BresaGen Ltd.(Thebarton，Australia)，具有4000或6000(PEG-4000或PEG-6000)平均分子量的聚乙二醇来自HamptonResearch(Laguna Niguel，California)以及硫酸鱼精蛋白购自Fisher from ICNBiomedicals Inc.(Pittsburgh，PA)。磷酸铵、Tris-HCl、柠檬酸钠、磷酸二钠、乙酸钙、氯化钙、乙酸锌、HEPES、氯化钠、氯化钾、叠氮化钠、异丙醇(IPA)、乙醇和聚乙二醇单甲基醚各自从Fisher(Pittsburgh，PA)获得。Sprague-Dawley大鼠从Charles River Laboratories(Worcester，MA)或从Biomedical Research Laboratories，Inc.(Worcester，MA)获得。聚精氨酸从Sigma(St.Louis)获得。

分析技术和试验

反相高效液相色谱法。在装备有C5，5cmx4.6mm，3μm柱(Supelco，Bellefonte，PA)的Agilent 1100系列HPLC(Palo Alto，CA)上获得反相高效液相色谱(RP-HPLC)。将样品溶解在溶解缓冲液(50mM HEPES pH 7.2，140mM NaCl，10mMKCl和0.02％(v/v)NaN₃)中并在注射前过滤(0.2μm)。使用溶剂A和B的梯度方法在214和280nm监测洗脱曲线。溶剂A由99.9％去离子水/0.1％TFA组成。溶剂B由99.9％乙腈/0.1％TFA组成。所有化学物质都是HPLC级的，从Fisher获得。使用0-2分钟40-50％B，2-12分钟50-60％B，和12-1560-85％B的梯度，进行洗脱15分钟。通过运行维持1ml/min的流速和35℃的柱温。使用Agilent化学工作站软件(Palo Alto，CA)分析数据。

使用溶剂A(99.9％去离子水/0.1％TFA)和B(99.9％乙腈/0.1％TFA)的梯度方法测定样品制剂中的鱼精蛋白或聚精氨酸的浓度。使用0-2.5分钟95∶5(A∶B)，2.5-7.5分钟65∶35(A∶B)，7.5-15.5分钟25∶75(A∶B)，15.5-17.0分钟25∶75(A∶B)，17-17.1分钟95∶5(A∶B)的梯度设计，以1ml/min的流速进行洗脱20分钟。在6.2分钟获得典型的鱼精蛋白或聚精氨酸的洗脱，在14分钟洗脱出完整的hGH。在213nm测定AUC计算。由标准曲线计算鱼精蛋白和/或聚精氨酸添加剂的含量(mg/ml)，所述标准曲线由各添加剂的每个生成。可以使用这一相同的方法来分析从络合物中释放的赋形剂。

用分开但相似的反相方法测定有关降解的hGH。例如，在c5Supelco DiscoveryBio Wide Pore柱(5cmx4.6mm，3μm粒径，30nm孔径)上进行分析，在整个运行中维持37℃的恒温器温度。使用具有流动相A(20％ACN，80％H₂O，0.1％TFA)和流动相B(20％ACN，80％2-propanol，01.％TFA)的梯度方法监测洗脱曲线。梯度系统在0至5分钟内从20％变化至45％B，在5至15分钟内从45％变化至55％B，在15至15.1分钟内从55％变化至90％B，90％B固定直到17分钟并且在这一步骤后，重建立20％B直至达到20分钟。

大小排阻色谱法。在装备有TSK-Gel G2000SWXL柱(part#；08450，Tosoh BiosepLLC，Montgomeryville，PA)(7.8mmx30cm，5μm)和Agilent 1100系列MWD(UV)的Agilent1100系列HPLC(PaloAlto，CA)上获得高效大小排阻色谱(SEC-HPLC)。将样品溶解在0.2ml溶解缓冲液中并在注入Agilent 1100系列温度控制自动加样器前用0.2μm过滤。在214和280nm监测洗脱曲线，流动相为50mMTris-HCl，150mM Nacl，0.05％NaN₃，pH 7.5。维持柱温在25℃，使用Agilent 1100系列脱气器将溶剂脱气。

UV-VIS吸收和光学显微术。在Beckman Coulter Inc.，Fullerton，CA的BeckmanDU 740分光光度计上获得UV-VIS分光光谱。通过使用Olympus BX-51显微镜的明视场成像并用Sony DXC-970MD3CCD彩色数字视频照相机获得在放大40x至400x下光学显微照片，使用Media Cybernetics L.P.，Silver Springs，Maryland的Image-Pro软件。

透射电镜术(TEM)。TEM分析进行如下。用水洗涤母液中的hGH晶体悬浮液两次以除去过量的母液然后用0.5％乙酸双氧铀阴性染色1小时。将染色的hGH晶体悬浮液(1-5μL)转移到铜TEM栅极上。过量的液体流掉(wicked away)并且短暂地空气干燥样品栅极。将TEM栅极转移到JEOL 1210透射电子显微镜的样品载物台上并使用80KV电子束收集图像。在晶体内观察到组织非常好的点阵结构，具有与晶体棱柱轴成一直线的定向。

实施例1

用磷酸铵结晶hGH。首先将商业上可获得的hGH(50mg)溶解在15ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)中并使用具有10,000分子量切割值(cut off)(MWCO)的Pierce透析仪筒对着2x4000ml Tris-HCl(10mM，pH 8.0)进行透析。通过使用Millipore浓缩器(MWCO 10,000)在4000rpm离心20-30分钟调节蛋白质浓度。如在280nm/0.813(1mg/ml hGH A₂₈₀＝0.813吸收单位)通过吸收测量的，发现hGH的浓度在30-45mg/ml的范围内。向溶液中加入去离子水以产生10-20mg/ml的终蛋白质浓度。通过向溶液中添加磷酸铵(NH₄H₂PO₄)(2.5M；pH8.9)以致获得860mM NH₄H₂PO₄的终浓度，生成hGH的晶体。然后在25℃下培育溶液16小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度为大约8至15μm，结晶收率大于90％。见图1。

实施例2

用柠檬酸钠结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生17.5mg/ml的终蛋白质浓度。通过向溶液中添加柠檬酸钠(1.5M)，以致获得390mM柠檬酸钠的终浓度，生成hGH的晶体。不需要pH调节，除已经在10mM Tris-HCl中的hGH外。然后在25℃下培育溶液16小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度小于8μm，结晶收率大于85％。见图2。

实施例3

用磷酸钠结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生12.5-17.5mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH8.6)至100mM的终浓度。通过向溶液中添加磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)(1M)生成hGH的晶体，以致获得600mM Na₂HPO₄的终浓度。然后在25℃下培育溶液16小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度在5和25μm之间，结晶收率大于75％。见图3。

实施例4

用乙酸钙和硫酸鱼精蛋白结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生15mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。向溶液中，添加硫酸鱼精蛋白至1mg/ml的终浓度。通过向溶液中添加乙酸钙(1M)，以致获得85mM乙酸钙的终浓度，生成hGH的晶体。然后在37℃下培育溶液8小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度小于20μm，结晶收率大于70％。见图4。

实施例5

由盐诱导结晶制备的hGH晶体的溶解度特征。培育实施例1-4中的结晶溶液后，沉淀晶体并除去余下的上清液。通过吸移或涡旋将晶体沉淀块(0.4mg)重悬浮在0.200ml溶解缓冲液(50mM HEPES(pH7.2)，140mM NaCl，10mM KCl和0.02％(v/v)NaN₃)中，然后在37℃平衡约15分钟。然后在10,000xg离心样品约2分钟并且完全除去上清液用于通过RP-HPLC、SEC-HPLC或UV-VIS在280nm测量的蛋白质浓度测定。进一步将晶体沉淀块重悬浮在0.200ml溶解缓冲液中并重复上述过程直到在上清液中测量不到可检测的蛋白质。这一过程被称为连续溶解。

图5显示了在上述实施例1-4中用一价(Na或NH₄)或二价(Ca)盐制备的不同hGH晶体的作为以分钟为单位的时间函数的溶解度行为。hGH溶解被以衍生自RP-HPLC的累积百分比释放作图，其中使用UV-VIS分光光度计以mg/ml测量蛋白质样品的AUC值。数据说明，通过添加390mM柠檬酸钠制备的hGH晶体在60分钟后完全溶解。另外，通过添加600mM Na₂HPO₄或860mM NH₄H₂PO₄制备的hGH晶体分别在60或75分钟后完全溶解。另一方面，通过添加85mM乙酸钙和硫酸鱼精蛋白制备的hGH晶体在390分钟后完全溶解(见下表1)。

表1.在280nm测量的hGH盐在溶解缓冲液中的连续溶解试验-将蛋白质浓度表示为 释放总计的百分比

时间(分)	390mM柠檬酸钠(实施例2)	600mMNa<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>(实施例3)	860mMNH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(实施例1)	85mM乙酸钙+鱼精蛋白(实施例4)
					0	0.00	0.00	0.00	0.00
15	71.59	78.99	93.77	8.53
					30	99.36	99.85	99.18	19.39
45	99.99	99.99	99.50	26.81
					60	100.00	100.00	99.50	34.92
75	100.00	100.00	100.00	38.31
					90	100.00	100.00	100.00	42.22
105	100.00	100.00	100.00	46.26
					120	100.00	100.00	100.00	49.62
135	100.00	100.00	100.00	52.73
					150	100.00	100.00	100.00	55.08
165	100.00	100.00	100.00	57.20
					180	100.00	100.00	100.00	59.65
195	100.00	100.00	100.00	63.95
					210	100.00	100.00	100.00	67.57
225	100.00	100.00	100.00	69.17
					240	100.00	100.00	100.00	71.63
255	100.00	100.00	100.00	74.35
					270	100.00	100.00	100.00	76.85
285	100.00	100.00	100.00	78.39
					300	100.00	100.00	100.00	81.06
315	100.00	100.00	100.00	83.97
					330	100.00	100.00	100.00	87.97
345	100.00	100.00	100.00	90.57
					360	100.00	100.00	100.00	94.20
375	100.00	100.00	100.00	98.28
					390	100.00	100.00	100.00	100.00

实施例6

用乙酸钙和10％异丙醇结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生15mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。通过向溶液中添加乙酸钙(1M)，以致获得85mM乙酸钙的终浓度，生成hGH的晶体。向该溶液中，添加10％(v/v)异丙醇(IPA)。然后在25℃下培育溶液16小时。获得棒状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度在大于100μm，结晶收率大于85％。见图6。

实施例7

用氯化钙和5％异丙醇结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生15mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。通过向溶液中添加氯化钙(CaCl₂)(1M)，以致获得85mM氯化钙的终浓度，生成hGH的晶体。向该溶液中，添加5％(v/v)异丙醇(IPA)。然后在25℃下培育溶液16小时。获得棒状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度在大于200μm，结晶收率大于85％。见图7。

实施例8

用10％PEG-6000和10％乙醇结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生25mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。通过向溶液中添加10％(v/v)PEG-6000和10％(v/v)乙醇(EtOH)生成hGH的晶体。然后在37℃下培育溶液16小时。获得棒状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度小于25μm，结晶收率大于70％。见图8。

实施例9

用醇制备的hGH晶体的溶解度特征。培育实施例6-8中制备的结晶溶液后，沉淀晶体并除去余下的上清液。通过吸移或涡旋将晶体沉淀块重悬浮在0.200ml溶解缓冲液(见实施例5)中，然后在37℃平衡约15分钟。然后在10,000xg离心样品2分钟并且除去上清液用于通过RP-HPLC、SEC-HPLC或UV-VIS在280nm测量的蛋白质浓度测定。hGH溶解被测量为累积百分比并衍生自AUC值或UV-VIS mg/ml测量值。进一步将晶体沉淀块重悬浮在溶解缓冲液中并重复上述过程直到在上清液中测量不到可检测的蛋白质。

图9和表2说明了用10％IPA/85mM乙酸钙、5％IPA/85mM氯化钙和10％乙醇/10％PEG-6000制备的hGH晶体作为以分为单位的时间函数的溶解度行为。结果证实，通过添加390mM柠檬酸钠制备的hGH晶体在60分钟后完全溶解。另外，通过添加10％IPA/85mM乙酸钙制备的hGH晶体在150分钟后完全溶解，而通过添加5％IPA/85mM氯化钙和10％乙醇/10％PEG-6000制备的hGH晶体分别在120分钟和135分钟后完全溶解。

表2.用乙醇制备的hGH晶体的体外溶解结果(实施例6-8)-蛋白质浓度在280nm进 行测量并被表示为释放总量的百分比

0	0.00	0.00	0.00
				15	19.39	70.16.	76.12
30	53.88	82.84	86.50
				45	74.59	92.33	92.33
60	84.13	96.03	94.62
				75	90.64	98.48	94.87
90	95.47	99.91	96.28
				105	98.32	99.94	96.82
120	99.51	100.00	99.68
				135	99.51	100.00	100.00
150	100.00	100.00	100.00
				165	100.00	100.00	100.00
180	100.00	100.00	100.00

实施例10

用乙酸钙和2％PEG-6000结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生15mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。向该溶液中添加2％(v/v)PEG-6000。通过向溶液中添加乙酸钙(1M)，以致获得85mM乙酸钙的终浓度，生成hGH的晶体。然后在25℃下培育溶液16小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度在约25和约75μm，结晶收率大于85％。见图10。

实施例11

用乙酸钠和6％PEG-6000结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生15mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。向该溶液中，添加6％(v/v)PEG-6000。通过向溶液中添加乙酸钠(1M)，以致获得500mM乙酸钠的终浓度，生成hGH的晶体。然后在25℃下培育溶液16小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度在约25和约75μm，结晶收率大于85％。见图11。

实施例12

用氯化钙和6％PEG-6000结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生15mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。向该溶液中，添加6％(v/v)PEG-6000。通过向溶液中添加CaCl₂(1M)，以致获得85mM CaCl₂的终浓度，生成hGH的晶体。然后在25℃下培育溶液16小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度在大于100μm之间，结晶收率大于90％。见图12。

实施例13

用乙酸钙、6％PEG-6000和硫酸鱼精蛋白结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生15mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。向该溶液中，添加硫酸鱼精蛋白(1mg/ml)和6％PEG-6000(v/v)。通过向溶液中添加乙酸钙(1M)，以致获得85mM乙酸钙的终浓度，生成hGH的晶体。然后在37℃下培育溶液16小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度小于25μm，结晶收率大于70％。见图13。

实施例14

用乙酸钙和6％PEG-MME-5000结晶hGH。按照实施例1中所述，纯化并浓缩商业上可获得的hGH。向浓缩的hGH溶液中加入去离子水以产生15mg/ml的终蛋白质浓度。添加Tris-HCl(1M，pH 8.6)至100mM的终浓度。向该溶液中，添加聚乙二醇单甲基醚(PEG-MME-500)。通过向溶液中添加乙酸钙(1M)，以致获得125mM乙酸钙的终浓度，生成hGH的晶体。然后在25℃下培育溶液16小时。获得针状晶体并通过光学显微术成像。发现获得的晶体长度小于50μm，结晶收率大于90％。见图14。

实施例15

用聚乙二醇制备的hGH晶体的溶解度特征。培育实施例10-14中制备的结晶溶液后，沉淀晶体并除去余下的上清液。通过吸移或涡旋将晶体沉淀块重悬浮在0.2ml溶解缓冲液(见实施例5)中，然后在37℃平衡约15分钟。然后在10,000xg离心样品2分钟并且除去上清液用于通过RP-HPLC、SEC-HPLC或UV-VIS在280nm测量的蛋白质浓度测定。进一步将晶体沉淀块重悬浮在溶解缓冲液中并重复上述过程直到在上清液中测量不到可检测的蛋白质。

图15和表3说明了用2％PEG-6000/85mM乙酸钙、6％PEG-6000/500mM乙酸钠、6％PEG-6000/85mM CaCl₂、6％PEG-6000A/85mM乙酸钙/鱼精蛋白和6％PEG-MME-5000/125mM乙酸钙制备的hGH晶体作为以分为单位的时间的函数的溶解度行为。hGH溶解被测量为累积百分比并衍生自AUC值或UV-VIS mg/ml测量值。结果证实，通过添加6％PEG-6000/85mM乙酸钙/鱼精蛋白制备的hGH晶体溶解最慢，在495分钟后出现完全溶解。添2％PEG-6000/85mM乙酸钙晶体的其它晶体在300分钟时溶解或者其它hGH晶体在更少时间内溶解。

表3.在280nm测量的PEG和hGH盐在溶解缓冲液中的连续溶解试验-蛋白质溶度被 表示为释放总量的百分比

时间(分)	2％PEG-6000/85mM乙酸钙(实施例10)	6％PEG-6000/500mM乙酸钠(实施例11)	6％PEG-6000/85mM氯化钙(实施例12)	6％PEG-6000/85mM乙酸钙/硫酸鱼精蛋白(实施例13)	6％PEG-MME-5000/125mM乙酸钙(实施例14)
						0	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
15	8.41	14.23	6.63	5.66	9.50
						30	16.80	23.03	19.50	11.58	28.46
45	27.64	34.74	37.74	17.22	48.04
						60	35.57	47.34	54.60	21.25	62.61
75	48.75	65.16	67.67	24.63	73.76
						90	56.18	78.86	77.90	28.15	82.70
105	62.70	88.66	85.26	31.77	91.15
						120	66.49	90.36	90.59	34.05	95.70
135	70.07	90.36	95.18	38.83	98.18
						150	72.87	90.36	98.04	40.60	99.60
165	74.82	90.58	100.00	43.28	100.00
						180	90.23	93.06	100.00	45.69	100.00
195	90.23	95.80	100.00	47.52	100.00
						210	90.23	100.00	100.00	51.27	100.00
225	92.90	100.00	100.00	53.38	100.00
						240	92.90	100.00	100.00	55.31	100.00
255	96.61	100.00	100.00	57.24	100.00
						270	96.61	100.00	100.00	58.61	100.00
285	96.61	100.00	100.00	60.28	100.00
						300	100.00	100.00	100.00	64.90	100.00
315	100.00	100.00	100.00	68.04	100.00
						330	100.00	100.00	100.00	72.46	100.00
345	100.00	100.00	100.00	76.26	100.00
						360	100.00	100.00	100.00	79.36	100.00
375	100.00	100.00	100.00	83.20	100.00
						390	100.00	100.00	100.00	86.17	100.00
405	100.00	100.00	100.00	89.15	100.00
						420	100.00	100.00	100.00	92.25	100.00
435	100.00	100.00	100.00	94.40	100.00
						450	100.00	100.00	100.00	95.96	100.00
465	100.00	100.00	100.00	98.07	100.00
						480	100.00	100.00	100.00	99.07	100.00
495	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00

实施例16

使用Sprague-Dawley大鼠的药物动力学研究。皮下给予24只雌性Sprague-Dawley大鼠2.5mg/kg剂量的可溶的(商业上可获得的)或晶体(85mM乙酸钙/2％PEG-6000)hGH(按实施例10中所述的制备)悬浮液。每只大鼠的平均体重为200克。将所述24只大鼠分成两组。每组包括各含4只大鼠的3个组的子系统。在每个子系统中以三个特定的时间点经由颈静脉导管植入物收集出血。由于在给定时间点能够抽取的血液的量有限，使用跳步(leap frog)设计。为了保持动物的稳定性，组内的动物子系统在注释的时间点出血。然后编辑血清样品以形成线性进展的时间线(timeline)。通过在给定时间点子系统内血清水平与所述子系统的平均值的变异测定标准离差。见表4-6。在表4-5中，指定的动物1-12接受可溶的hGH并且动物13-24接受结晶的hGH，每只动物的剂量为500μg。

图16说明了可溶的和结晶的hGH的作为时间的函数的血清中hGH的水平。结晶hGH的半衰期几乎比可溶hGH的半衰期高19倍。对结晶的hGH来说，血清中出现最大hGH的时间是4小时，而对可溶的hGH来说是0.5小时。假定以5.5mg/ml的浓度，等于2.2mg/kg的剂量，用可溶的hGH或结晶的hGH处理大鼠的组和子系统，表6中如下所列的Cmax值显示，与相同的可溶剂量比较，以晶体形式递送的hGH显著减少最大血清浓度。另外，可溶的hGH对hGH晶体的总血清水平的AUC相似，这表明结晶不显著影响生物利用度。计算了可溶和结晶结果的T_90％值。该参数表明90％的总AUC发生的时间。更高的T_90％值表明药物保留在血清中更长时间。表6中所含的T_90％结果清楚地显示，晶体形式导致升高的hGH水平比可溶解形式显著更长时间。

表4.可溶hGH的hGH动物药物动力学研究结果

动物	放血时间(小时)	血清中的平均hGH(ng/ml)	标准离差
				1-4	0	0.00	0.00
5-8	0.5	1171.65	116.03
				9-12	1	924.49	67.90
1-4	2	726.84	163.83
				5-8	4	205.90	29.40
9-12	6	17.48	6.66
				1-4	8	1.14	1.68
5-8	12	0.00	0.00
				9-12	24	0.00	0.00
	总计＝	3047.50

表5.结晶hGH(85mM乙酸钙/2％PEG-6000)的hGH动物药物动力学研究结果

动物	时间(小时)	血清中的平均hGH(ng/ml)	标准离差
				13-16	0	0.00	0.00
17-20	0.5	151.39	60.30
				21-24	1	159.19	69.50
13-16	2	236.64	75.70
				17-20	4	334.08	63.86
21-24	6	302.69	73.09
				13-16	8	193.22	23.10
17-20	12	6.50	6.39
				21-24	24	2.69	0.74
	总计＝	1386.379

表6.基于表4和表5中数据的药物动力学参数

	可溶解的	结晶的
			给药量(μg)	500	500
剂量(mg/kg)	2.5	2.5
			半衰期(小时)	0.5	9.4
C<sub>max</sub>(ng/ml)	1172	334
			T<sub>max</sub>(小时)	0.5	4
AUC(o-t)(ng/hr/ml)	2819	2472
			AUC(2)	2819	2508
T<sub>90％</sub>(小时)	4	10

实施例17

硫酸鱼精蛋白对hGH晶体的溶解特征的影响。图17说明了按照实施例10(85mM乙酸钙，2％(v/v)PEG-6000和100mM Tris-HCl(pH 8.6))制备的hGH晶体，在向预先存在的hGH钙晶体溶液中添加给定量的硫酸鱼精蛋白后，在37℃溶解缓冲液中培育1小时后的溶解量。HGH与鱼精蛋白的比率(mg∶mg)显示在图17中。所述图说明，鱼精蛋白显著影响hGH晶体的溶解。

实施例18

用乙酸钠结晶hGH。这里，从两种储备液获得可溶的重组生产的hGH(rhGH)冷冻的大量进料溶液-一种来自大肠杆菌(E.coli，Novartis)以及另一种来自酵母(Lucky Gold)。不论其来源，来自大肠杆菌和酵母储备溶液的rhGH单独分析产生具有相同结晶和溶解度特征的rhGH。使用由BioRad供应的10DG-脱盐柱纯化大约3.3ml(供应在未知缓冲液中的10-20mg/ml rhGH)解冻的rhGH进料溶液。在样品装载前，通过用30ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)洗涤柱来处理柱。然后装载rhGH样品并允许其借助重力进入所述柱。弃去第一个3ml洗脱液后，加入另一个5ml的10mM Tris-HClpH8.0。洗脱并收集4.5ml脱盐的rhGH。然后使用Millipore浓缩器(MWCO10,000)在3500rpm下进行离心浓缩20-30分钟。hGH的浓度在30mg/ml的范围内，如通过在280nm/0.813的吸收度(1mg/ml hGHA280＝0.813吸收度单位)测定的。通过添加去离子水、Tris-HCl(pH8.6)、PEG-6000和乙酸钠至它们分别在总溶液中终浓度为100mM、6％(v/v)和500mM，蛋白质终浓度为15mg/ml，以生产晶体。然后温和地混合溶液并在33℃下培育溶液12-16小时。获得了针状或棒状晶体并TEM成像(图18A和18B)。晶体长度从大约2至25μm之间变化。离心并使晶体沉淀成小丸后，提取上清液并且，结晶收率被测量大于85％。在33℃和15℃之间的温度下也能够形成晶体，但需要增加的结晶时间并可能导致收率的减少。

实施例19

hGH钠与离子型聚合物添加剂的络合。测定结晶收率后(见实施例18)，将rhGH钠晶体重悬浮在母液(250mM NaOAc，25mMTris-HCl(pH 8.6)、6％PEG-6000，以及7mg/ml硫酸鱼精蛋白或4.2mg/ml聚精氨酸)中，以致达到21mg/ml rhGH钠晶体的终浓度。对于rhGH与硫酸鱼精蛋白来说，蛋白质与添加剂的比率为约3∶1(mg∶mg)，对于rhGH与聚精氨酸来说，蛋白质与添加剂的比率为5∶1(mg∶mg)。将这些比率计算为摩尔比率，该摩尔比率对于rhGH与鱼精蛋白来说为约1∶1.715，对于rhGH与聚精氨酸来说为约1∶0.587。将上述rhGH沉淀均匀地重悬在适合的母液中并在离心获得冷凝的小丸前在2-8℃下培育过夜。除去上清液并将小丸重悬浮在相同的母液(没有离子型聚合物添加剂)并在4℃下储存。

通过变化母液的添加剂浓度(mg/ml)但仍然重悬浮至21mg/ml的rhGH，可以获得另外的rhGH∶聚合物添加剂比率。例如，可以使用母液中增加的硫酸鱼精蛋白的浓度(10.5mg/ml)以在重悬后获得2∶1的rhGH∶添加剂的比率。

实施例20

用乙酸锌结晶rhGH。用乙酸锌和丙酮结晶rhGH。使用由BioRad供应的10DG-脱盐柱纯化大约3.3ml(10-20mg/ml)解冻的rhGH进料溶液。在样品装载前，通过用30ml Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(10mM，pH6.1)洗涤柱来处理柱。然后装载rhGH样品并允许其借助重力进入所述柱。弃去第一个3ml洗脱液后，加入另一个5.0ml的10mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH6.1。洗脱并收集脱盐rhGH的4.5ml等分样。然后使用Millipore浓缩器(MWCO 10,000)在3500rpm下进行离心浓缩5-10分钟。hGH的浓度在15mg/ml的范围内，如通过在280nm/0.813的吸收度(1mg/ml hGHA280＝0.813吸收度单位)测定的。通过添加400μl含有去离子水、8.91mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄pH6.1、0.88mg/ml乙酸锌、9.89％丙酮的母液，至100μl在10mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH6.1)中的制备的15mg/ml蛋白质，以生产晶体。然后温和地混合溶液并在15℃下培育溶液24-48小时。获得了六方形样的晶体，宽度从大约2至25μm之间变化。离心并使晶体成小丸状后，提取上清液并且，结晶收率被测量大致55％。

实施例21

用乙酸钙结晶hGH以及hGH钙与离子型聚合物添加剂(聚精氨酸)的络合。这里，从两种储备液获得可溶的重组生产的hGH(rhGH)的冷冻的大量进料溶液-一种来自大肠杆菌(Novartis)，另一种来自酵母(Lucky Gold)。使用由BioRad供应的10DG-脱盐柱纯化大约3.5ml(Tris-HCl(10mM，pH8.0)中的12mg/mlrhGH)解冻的rhGH进料溶液。在样品装载前，通过用30ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)洗涤柱来处理柱。然后将rhGH样品装载并允许其借助重力进入所述柱。弃去第一个3ml洗脱液后，添加另一个5.0ml的10mM Tris-HClpH8.0。洗脱并收集4.5ml脱盐的rhGH。然后使用Millipore浓缩器(MWCO 10,000)在3500rpm进行离心浓缩20-30分钟。如通过在280nm/0.813处的吸收度(1mg/ml hGH A280＝0.813吸收度单位)测量的，hGH的浓度在30mg/ml的范围内。通过向rhGH 30mg/ml储备溶液中添加1M Tris-HCl(pH8.6)、50％PEG-6000和1M乙酸钙，以便获得15mg/ml rhGH、100mM Tris-HCl(pH8.6)、2％(v/v)PEG-6000和85mM乙酸钙的终浓度，以生产晶体。然后温和地混合并在33℃下培育溶液12-16小时。获得长度范围在大约2知25μm的针状晶体。提取上清液并离心以及使晶体成小丸后，结晶收率被测量为大于85％。在33℃和15℃之间的温度下也能够形成所述晶体，但需要增加的结晶时间并减少收率。测定结晶收率后(见实施例18)，将rhGH钙重悬浮在制剂介质(5mM CaOAc、100mM Tris-HCl(pH8.6)、6％PEG-6000和4.2mg/ml聚精氨酸)中，以便达到21mg/mlrhGH钙的终浓度。对于rhGH与聚精氨酸来说，蛋白质与添加剂的比率为5∶1(mg∶mg)。对于rhGH与聚精氨酸来说，计算这些比率为大约10∶0.587的摩尔比率。将上述rhGH小丸均匀地重悬浮在适合的母液中并在离心获得冷凝的小丸前，在2-8℃下培育过夜。去除上清液以及将小丸重悬浮在没有离子型添加剂的相同母液中并在4℃下贮藏。

实施例22

使用Sprague-Dawley大鼠皮下给予的hGH和hGH二价阳离子晶体的药物动力学和药效学研究。本研究的目的是评估hGH从hGH晶体悬浮液中的控制释放以及在切除垂体的Sprague-Dawley大鼠中皮下植入hGH晶体悬浮液后增加的体重。研究设计如下：

表7.研究设计

组#或试验化合物	样品<sup>a</sup>	样品说明	大鼠的#	剂量水平(毫克/大鼠/周)	给药方案
						1	可溶性介质	注射用水中的缓冲液(WFI)<sup>b</sup>	3	--	100μl一天一次，共7天
2	每天可溶的	WFI中的商业上可获得的hGH<sup>c</sup>(1.5mg/ml)	9	1.05	100μl一天一次，共7天
						3	乙酸钙、PEG、鱼精蛋白	见实施例10-(21mg/ml，在注射前稀释并与母液1<sup>d</sup>温和混合1∶1)	9	1.05	第一天100μl一次
4	乙酸钙、PEG	见实施例13-(21mg/ml，在注射前稀释并与母液1<sup>d</sup>温和混合1∶1，hGH∶鱼精蛋白的比率＝5∶1)	9	1.05	第一天100μl一次
						5	乙酸锌	见实施例20-(21mg/ml，在注射前稀释并与母液2<sup>e</sup>温和混合1∶1)	3	1.05	第一天100μl一次
7	介质	来自组3、4&amp;5<sup>f</sup>的母液	3	--	第一天100μl一次
						8	介质	来自组9的母液	3	--	第一天100μl一次
9	乙酸钙、PEG、聚精氨酸	见实施例21-(21mg/ml，在注射前稀释并与母液1<sup>d</sup>温和混合1∶1，hGH∶聚精氨酸的比率＝12∶1)	9	1.05	第一天100μl一次

^a所有样品被储存在4℃并且如果希望，在用d中定义的制剂介质稀释前被温热至室温达30分钟，以及注射到所示数量的大鼠中。

^b缓冲液包含7.5mg/ml D-甘露糖醇、12mg/ml蔗糖。

^c商业上可获得的hGH从BesaGen Ltd.，澳大利亚获得。

^d5mM CaOAc、4％PEG-6000、0.025M甘氨酸(pH8.6)、15mg/mlD-甘露糖醇、60mg/ml蔗糖。

^e乙酸锌、NaH₂PO₄(pH6.1)、乙醇。

^f使用d中定义的单个制剂介质作为所有这些组的介质对照。

到达后，将80只雌性Sprague-Dawley大鼠，体重大约150克±25克以及大约4-6周龄，分别养在控制条件下(大致温度21±3℃，相对湿度50±20％，在每个24小时周期中12小时光和12小时黑暗，每小时10-15次空气交换)并在整个研究中让其自由获得纯水和实验室粮食。在测试前，允许大鼠适应环境一周。

80只大鼠中，48只被按照表7给予hGH悬浮液。在第一天一次或每天一次连续七天以单次快速浓注的形式在背部位皮下给予试验化合物。在注射前，将注射部位剃光并标记直到三天，此后视需要以促进注射。使用连接在300μl注射器的30-量规×8mm针给予试验化合物。在抽入注射器之前以及再在给药之前，小心地翻转试验化合物以确保悬浮液或溶液均一性，不引起发泡。注射体积大约是每只大鼠0.1ml。

在第一天注射后的第4、32、96和168小时从组1、5、7和8中(每组具有3只大鼠)大鼠中采集血液样品。将来自组2、3、4和9(每组具有9只大鼠)大鼠的血液样品进一步再分成3组，每组3只大鼠。在这里，在第一天注射后的第0.5、24、72和168小时从第一亚组的大鼠中采集血液样品，在第4、32、96和168小时从第二亚组的大鼠中采集血液样品，以及在第8、48、120和168小时从第三亚组的大鼠中采集血液样品。通常通过眼窝窦在未麻醉或CO₂/O₂麻醉的大鼠上收集出血，并且收集在具有血清分离剂的BD Microtainer管中。然后在大约4℃下离心样品以及回收血清并在测定hGH和IGF-1水平前冷冻贮藏(约-80℃)。

然后汇集血清样品并在组2、3、4和9的情况下，形成线性渐进的时间线(timeline)。通过在给定时间点的亚组内血清水平与所述亚组的平均值的变异，测定标准离差。见表8-14和图19A。当以特别的晶体制剂给药时，显示rhGH的血清水平(ng/ml)。按照研究方案在和给药相应的具体时间点给动物取血。结果清楚地显示，在络合的晶体物质(例如鱼精蛋白和聚精氨酸)和非络合的晶体制剂(例如CaOAC和ZnOAC)的吸收之间存在差异。

表8.hGH动物药物动力学研究结果，组2：每天可溶的

动物	取血时间(小时)	血清中平均hGH(ng/ml)	标准离差
				全部	0	0	0
1-3	1	1262	18
				4-6	4	234	45
7-9	8	2	2
				1-3	24	1218	258
4-6	32	3	1
				7-9	48	0	0
1-3	72	1098	40
				4-6	96	0	0
7-9	120	1355	337
				全部	168	0	0
	总计＝	5174

表9.hGH动物药物动力学研究结果，组3：乙酸钙、PEG

动物	取血时间(小时)	血清中平均hGH(ng/ml)	标准离差
				全部	0	0.00	0.00
1-3	0.5	1927	771
				4-6	4	5204	1040
7-9	8	1409	881
				1-3	24	1	0.49
4-6	32	0.00	0.00
				7-9	48	0.00	0.00
1-3	72	0.00	0.00
				4-6	96	0.00	0.00
7-9	120	0.00	0.00
				全部	168	0.00	0.00
	总计＝	8542

表10.hGH动物药物动力学研究结果，组4：乙酸钙、PEG、鱼精蛋白

动物	取血时间(小时)	血清中平均hGH(ng/ml)	标准离差
				全部	0	0.00	0.00
1-3	0.5	0.00	0.00
				4-6	4	38	27
7-9	8	961	385
				1-3	24	1468	357
4-6	32	192	73
				7-9	48	190	266
1-3	72	0	0
				4-6	96	0	0
7-9	120	0	0
				全部	168	0	0
	总计＝	2849

表11.hGH动物药物动力学研究结果，组5：乙酸锌

动物	取血时间(小时)	血清中平均hGH(ng/ml)	标准离差
				全部	0	0.00	0.00
1	4	2417	767
				2	32	1	1
3	96	0	0
				全部	168	0	0
	总计＝	2418

表12.hGH动物药物动力学研究结果，组9：乙酸钙、聚精氨酸

动物	取血时间(小时)	血清中平均hGH(ng/ml)	标准离差
				全部	0	0.00	0.00
1-3	1	502	75
				4-6	4	846	102
7-9	8	1036	448
				1-3	24	634	462
4-6	32	543	168
				7-9	48	407	169
1-3	72	9	0
				4-6	96	0.00	0.00
7-9	120	0.00	0.00
				全部	168	0.00	0.00
	总计＝	3980

表13.基于表8-12中的数据的药物动力学参数

组	每7天的剂量	C<sub>max</sub>(ng/ml)	T<sub>max</sub>(小时)
				2：每天可溶的	6.7mg/kg	1262.70	1
3：乙酸钙、PEG	6.7mg/kg	5203.80	4
				4：乙酸钙、PEG、鱼精蛋白	6.7mg/kg	1468.47	8
5：乙酸锌	6.7mg/kg	2416.97	4
				9：乙酸钙、聚精氨酸	6.7mg/kg	1036.63	8

在研究的第一天注射前以及再在研究的每个连续的早晨取血时间前，测量并记录每只大鼠的体重。因此，通过从每个连续天(注射前)的体重减去第1天(注射前)的体重，计算每组内每只大鼠的体重增加或减少。计算每天组内全部大鼠的体重平均值。将这些结果提供在表14中。

表14.Sprague-Dawley大鼠的每天体重增加或减轻(克)

组	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天	第8天
									1	0	-3.31	1.00	-0.02	-4.78	-6.82	-9.02	-7.45
2	0	1.68	6.82	3.55	5.07	7.06	7.86	12.69
									3	0	3.09	3.97	2.08	1.55	2.07	0.33	2.02
4	0	6.10	9.25	5.80	1.15	3.95	5.01	6.20
									5	0	-0.09	1.40	-0.48	0.01	-1.41	-2.22	-0.95
7	0	-3.96	0.62	1.39	1.70	2.09	1.24	2.13
									8	0	-2.18	-0.27	-1.42	0.85	-0.82	-1.16	0.61
9	0	4.17	8.45	8.81	8.09	9.10	7.31	10.00

表14和图19B说明了与给予日剂量商业上可获得的hGH的七天影响相比，给予单剂量(第1天)本发明的晶体的七天影响。例如，图19B证实，与聚精氨酸络合的hGH晶体钙实现了体重增加，该体重增加比得上在相同时间段内只一次剂量的每天可溶剂量的体重增加。在比较增加的体重和rhGH在血清中各自的释放特征中，明显的是，更长释放的聚精氨酸制剂与体重增加的更持续的速度相关。

实施例23

在雌性幼猕猴(jiuvenile cynomologous monkeys)中的比较药效学研究。本研究的目的是评估当皮下给予雌性幼猕猴时，结晶重组人生长激素(rhGH)的体内药物动力学特征。生成这些数据以建立结晶rhGH在血清中的控制释放和作为结晶rhGH释放的函数的体重增加的模型。

表15.灵长类研究I的研究设计

组#	样品	剂量的给予(小时)	剂量水平(mg/kg)	剂量浓度(mg/ml)	剂量容积(ml/kg)	动物数(雌性)
							1	每天可溶的<sup>a</sup>	0，24，48，72，96，120，144	0.8	3.2	0.25	4
2	乙酸钠、PEG、聚精氨酸<sup>b</sup>	0	5.6	22.4	0.25	4
							3	乙酸钠、PEG、鱼精蛋白<sup>b</sup>	0	5.6	22.4	0.25	4

^a商业上可获得的hGH(可溶的，未结晶的形式)从Novarits获得并在WFI中渗滤。组1(阳性对照)在每个给药天接受可溶的hGH。

^b关于制备见实施例18和19。

^c在每天取血后递送所有的剂量。

将12只雌性幼猕猴分成三组，每组具有四只动物，并且给予可溶的rhGH(组1)、具有PEG和聚精氨酸的rhGH钠晶体(组2，根据实施例18和19)或具有PEG和鱼精蛋白的rhGH钠晶体(组3，根据实施例18和19)。将在处理开始时体重2-6kg和年龄4-7岁的猴单个地养在装备有自动给水系统或水瓶的不锈钢笼中。控制动物房间环境(大约21±3℃，30-70％湿度，每24小时周期中12小时光和12小时黑暗，以及每小时12-20次空气交换)并且每天两次用标准有保证的商业上的灵长类粮食(Harlan Teklad Certified Primate Diet#2055C)喂养猴。

为了测量和比较给予可溶的rhGH(组1)、具有PEG和聚精氨酸的rhGH钠晶体(组2)或具有PEG和鱼精蛋白的rhGH钠晶体(组3)后的hGH和IGF-1的血清浓度，进行本灵长类研究。在转移和上述表15中所示时间上给药前，记录所有动物的体重。在第-216、-120、0、2、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288和312天的早晨，经股静脉、肱静脉或隐静脉从每只动物收集血液样品(大约1ml)。将血液收集在血清分离管中，在室温下放置30-45分钟以允许凝结，以及在3000rpm2-8℃下离心10分钟。将每个血清样品分成为100μl等份试样和余下的等份试样，在分析前它们全部被贮藏在-70±10℃下。典型地，被用于rhGH测定的100μl等份试样越小，被用于IGF-1测定的余下部分就越大。由于需要的复制体积，存在一些例外。

然后对收集的血清样品进行hGH浓度分析(见表16)。对落在标准值范围外的rhGH浓度作适当的稀释。使用所有值以获得灵长类GH的每只动物个体的平均背景水平。从在每个时间点测定的所述试验对象的血清水平中减去该每只动物平均值。然后将每个时间点的修正值平均以获得血清中rhGH的修正平均值。然后通过使用修正平均值的标准离差计算标准误差并且除以N＝4的平方根。

表16.组1(每天可溶的)、2(rhGH钠/聚精氨酸)和3(rhGH钠/鱼精蛋白)的rhGH水平

时间小时	组1-平均每天可溶的rhGH(ng/ml)	标准误差	组2-平均rhGH钠/聚精氨酸(ng/ml)	标准误差	组3-平均rhGH钠/鱼精蛋白(ng/ml)	标准误差
							-216	4	7	-4	7	-2	1
-120	8	9	7	5	7	9
							0	343	65	-4	3	-5	9
2	372	48	-6	6	1	13
							4	262	37	11	9	20	12
6	205	45	85	45	94	35
							8	132	29	186	93	159	57
10	18	37	409	202	381	189
							24	-14	7	404	17	333	37
48	-7	8	178	33	216	43
							72	-3	10	77	35	86	18
96	-9	9	12	14	21	13
							120	-11	6	6	13	2	11
144	-3	13	-6	10	3	13
							168	10	11	-2	4	-1	11
192	-11	10	3	2	0	7
							216	-13	9	18	12	9	6
240	1	5	18	14	31	12
							264	8	3	20	5	17	11
288	-15	8	1	4	17	11
							312	4	7	1	5	8	17

注：rhGH值是来自4只动物的平均值，它被基线调整，即，值减去基线。基线是在t＝-216、-120和0小时值的平均值。

图20A说明了组1、2和3中，在基线调整后，作为以小时为单位的时间的函数的血清中rhGH的水平。

表17.基于表16中数据的药物动力学参数的总结

	组1<sup>a</sup>	组2	组3
				给药量(mg)	3.2	22.4	22.4
剂量(mg/kg)	0.8	5.6	5.6
				C<sub>max</sub>(ng/ml)	372	409	381
T<sub>max</sub>(小时)	2	10	10
				AUC(0-t)(ng.hr.kg/ml.mg)	4570	3503	3455
T<sub>90％</sub>(小时)	20	74	77

^a将商业上可获得的hGH(可溶的，未结晶的形式)在WFI中渗滤。组1(阳性对照)在7个给药天的每一天接受可溶的hGH。

上述数据证实，对于聚精氨酸络合的hGH钠晶体，最大值hGH出现在血清中的时间(T_max)为10小时，对于鱼精蛋白络合的hGH钠晶体，为10小时，以及对于可溶的hGH，为2小时。假定以1/7th剂量的晶体施用递送可溶的hGH，上述表17中列出的C_max值显示，当以两种络合的结晶形式的任一种递送hGH时，显著减低初始血清浓度尖峰。另外，计算了可溶和晶体组的T_90％值。组1(可溶形式)的T_90％为20小时，而组2和组3(络合的结晶形式)的T_90％分别为74和77小时。这些结果清楚地显示，络合的结晶形式导致升高的hGH水平维持比可溶的形式明显更长的时间。

除了测定hGH的血清浓度以外，还测量了作为时间的函数的IGF-1的水平。通过测量IGF-1的产生，确定了rhGH的功效。下表18报道了组1-3中动物的IGF-1浓度。图20B说明，在减去内源性IGF-1水平的基线后，络合的晶体制剂已经证实了刺激IGF-1释放的能力，该能力比得上每天可溶的施用。在非人灵长类中的这些结果显示，可有利地使用本发明的制剂以在人中达到相似的功效。

表18.组(每天可溶的、rhGH钠/聚精氨酸和rhGH钠/鱼精蛋白)的IGF-1水平

时间小时	组1-平均每天可溶的IGF-1(ng/ml)	标准误差	组2-平均rhGH钠/聚精氨酸IGF-1(ng/ml)	标准误差	组3-平均rhGH钠/鱼精蛋白IGF-1(ng/ml)	标准误差
							-216	-48	54	263	148	31	94
-120	-0.63	22	4	34	218	115
							0	48	73	-268	158	-249	86
2	39	32	-160	146	-56	104
							4	22	52	-344	191	-120	114
6	37	45	-244	189	-19	96
							8	-22	9	-464	170	-66	119
10	106	63	-491	219	4	86
							24	130	130	-106	278	223	214
48	446	59	164	244	191	164
							72	414	95	248	224	340	207
96	485	114	402	67	416	243
							120	524	73	484	126	392	216
144	636	63	574	189	397	187
							168	636	82	415	191	240	176
192	438	71	356	136	227	153
							216	288	87	155	108	117	146
240	210	69	197	57	93	144
							264	161	67	88	82	85	167
288	222	113	243	95	201	208
							312	178	175	79	120	86	149

注：IGF-1值被报道为由4只动物计算的平均值，它被基线调整，即，值减去基线。基线是在t＝-216、-120和0小时值的平均值。

实施例24

用不同的鱼精蛋白比率在雌性幼猕猴中的比较药效学研究。本研究的目的是评估当皮下给予雌性幼猕猴时，结晶重组人生长激素(rhGH)的体内药物动力学特征。生成这些数据以研究hGH钠与鱼精蛋白的比率对结晶rhGH在血清中的控制释放和作为结晶rhGH释放的函数的体重增加的影响。

表19.灵长类研究II的实验研究

组#	样品	剂量的给予(小时)	剂量水平(mg/kg)	剂量浓度(mg/ml)	剂量体积(ml/kg)	动物数(雌性)
							1	每天可溶的<sup>a</sup>	0，24，48，72，96，120，144	0.8	3.2	0.25	4
2	乙酸钠、PEG、鱼精蛋白(3∶1)<sup>b</sup>	0	5.6	22.4	0.25	4
							3	乙酸钠、PEG、鱼精蛋白(2∶1)<sup>b</sup>	0	5.6	22.4	0.25	4

^a商业上可获得的hGH(可溶的，未结晶的形式)从Novarits获得并在WFI中渗滤。组1(阳性对照)在每个给药天接受可溶的hGH。

^b关于制备见实施例18和19。

^c在每天取血后递送所有的剂量。

在灵长类研究II中，将在灵长类研究I中所述的12只雌性幼猕猴分成三组，每组具有四只动物，并且给予可溶的rhGH(组1)、具有PEG和鱼精蛋白的rhGH钠晶体(3∶1rhGH∶鱼精蛋白)(组2)(实施例18和19)或具有PEG和鱼精蛋白的rhGH钠晶体(2∶1rhGH∶鱼精蛋白)(组3)(实施例18和19)。将在处理开始时体重2-6kg和年龄4-7岁的猴单个地养在装备有自动给水系统或水瓶的不锈钢笼中。控制动物房间环境(大约21±3℃，30-70％湿度，每24小时周期中12小时光和12小时黑暗，以及每小时12-20次空气交换)并且每天两次用标准有保证的商业上的灵长类粮食(Harlan Teklad CertifiedPrimate Diet#2055C)喂养猴。

为了测量和比较给予可溶的rhGH(组1)、具有PEG和鱼精蛋白的rhGH钠晶体(3∶1rhGH∶鱼精蛋白)(组2)和具有PEG和鱼精蛋白的rhGH钠晶体(2∶1rhGH∶鱼精蛋白)(组3)后的hGH和IGF-1的血清浓度，进行本灵长类研究。在转移和上述表19中所示时间给药前，记录所有动物的体重。在第-144、-120、-96、-72、-48、-24、0、2、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288和312天的早晨，经股静脉、肱静脉或隐静脉从每只动物收集血液样品(大约1ml)。将血液收集在血清分离管中，在室温下放置30-45分钟以允许凝结，以及在3000rpm 2-8℃下离心10分钟。将每个血清样品分成为100μl等份试样和余下的等份试样，在检测前它们全部被贮藏在-70±10℃下。

分析并基线修正收集的血清样品中的hGH浓度(ng/ml)(见表20中的数据)。注意，对落在标准值范围外的rhGH浓度作适当的稀释。然后使用所有值以获得灵长类hGH的每只动物个体的平均背景水平。从在每个时间点测定的所述试验对象的血清水平中减去该每只动物平均值。然后将每个时间点的修正值平均以获得血清中rhGH的修正平均值。然后通过使用修正平均值的标准离差计算标准误差并且除以N＝4的平方根。

表20.组1(每天可溶的)、2(rhGH钠/鱼精蛋白(3∶1))和3(rhGH钠/鱼精蛋白(2∶1)) 的rhGH水平

时间(小时)	组1-平均每天可溶的rhGH(ng/ml)	标准误差	组2-平均rhGH钠/鱼精蛋白(3∶1)，(ng/ml)	标准误差	组3-平均rhGH钠/鱼精蛋白(2∶1)(ng/ml)	标准误差
							-144	-14	6	-13	6	34	22
-120	-14	5	-9	5	10	6
							-96	18	12	48	23	28	43
-72	-1	5	-5	6	3	9
							-48	-9	5	-2	5	14	6
-24	-2	9	-14	7	-3	10
							0	21	9	-4	9	1	5
2	312	47	8	10	-29	16
							4	401	57	77	32	13	8
6	186	16	172	62	89	52
							8	157	29	330	104	222	108
10	172	24	456	109	364	142
							24	3	4	316	29	372	74
48	8	7	153	47	128	15
							72	6	6	116	81	30	23
96	-2	5	42	15	13	21
							120	14	3	22	22	22	14
144	16	16	8	12	-13	11
							168	14	8	7	6	-21	13
192	2	7	-4	7	3	22
							216	11	9	6	14	-29	19
240	27	19	14	9	-4	8
							264	-1	6	35	21	-19	18
288	-2	9	2	5	-32	18
							312	-0.58	9	10	6	-21	18

注：rhGH值被报道为由4只动物计算的平均值，它被基线调整，即，值减去基线。基线是在t＝-144、-120、-96、-72、-48、-24和0小时值的平均值。

图21A说明了组1、2和3中，在基线调整后，作为以小时为单位的时间的函数的血清中rhGH的水平。

表21.基于表20中数据的药物动力学参数的总结

	组1<sup>a</sup>	组2	组3
				给药量(mg)	3.2	22.4	22.4
剂量(mg/kg)	0.8	5.6	5.6
				C<sub>max</sub>(ng/ml)	401	456	380
T<sub>max</sub>(小时)	4	10	24
				AUC(0-t)(ng.hr.kg/ml.mg)	4432	3669	2893
T<sub>90％</sub>～(小时)	20	119	72

^a将商业上可获得的hGH(可溶的，未结晶的形式)在WFI中渗滤。组1(阳性对照)在7个给药天的每一天接受可溶的hGH。

这些数据证实，对于鱼精蛋白(3∶1)络合的hGH晶体，最大值hGH出现在血清中的时间为10小时，对于鱼精蛋白(2∶1)络合的hGH晶体，为24小时，以及对于可溶的hGH，为4小时。假定以1/7th剂量的晶体施用递送可溶的hGH，上述表22中列出的C_max值显示，当以两种络合的结晶中的任一种形式递送hGH时，显著减低最大血清浓度。组1(可溶形式)的T_90％为20小时，而组2和组3(络合的结晶形式)的T_90％分别为119和72小时。这些结果清楚地显示，络合的结晶形式导致升高的hGH水平维持比可溶的形式明显更长的时间。

除了测定hGH的血清浓度以外，还测量了作为时间的函数的IGF-1的水平。通过测量IGF-1的产生，确定了rhGH的功效。下表22报道了组1-3中动物的IGF-1浓度。图21B说明，在减去内源性IGF-1水平的基线后，络合的晶体制剂能够刺激IGF-1释放，该能力比得上每天可溶的施用。这些非人灵长类结果显示，可有利地使用本发明的制剂以在人中引起相似的功效。

表22.组1(每天可溶的)、2(rhGH钠/鱼精蛋白(3∶1))和3(rhGH钠/鱼精蛋白(2∶1)) 的IGF-1水平

时间(小时)	组1-平均每天可溶的，IGF-1(ng/ml)	标准误差	组2-平均rhGH钠/鱼精蛋白(3∶1)，IGF-1(ng/ml)	标准误差	组3-平均rhGH钠/鱼精蛋白(2∶1)，IGF-1(ng/ml)	标准误差
							-144	49	92	123	60	137	134
-120	-61	19	88	42	57	98
							-96	-116	27	-178	11	-130	13
-72	-33	59	-69	40	-52	43
							-48	24	47	-102	100	-10	64
-24	22	46	-56	85	-83	78
							0	115	71	194	106	82	107
2	-15	71	-6	79	51	95
							4	-6	96	45	42	-10	94
6	48	106	38	63	91	74
							8	10	119	97	47	88	78
10	38	106	-37	56	57	75
							24	200	160	20	48	150	107
48	99	90	85	68	342	97
							72	505	391	100	155	278	105
96	328	202	363	161	289	122
							120	329	224	294	89	261	136
144	279	282	210	81	86	103
							168	591	266	424	184	219	104
192	259	185	169	163	131	50
							216	127	152	55	107	-8	67
240	54	153	-54	141	-64	72
							264	4	132	-165	103	-50	49
288	-16	105	-208	122	-43	75
							312	11	100	-77	207	30	77

注：IGF-1值被报道为由4只动物计算的平均值，它被基线调整，即，值减去基线。基线是在t＝-144、-120、-96、-72、-48、-24和0小时值的平均值。

实施例25

通过单次或每天皮下注射给切除垂体的雄性大鼠给予的人生长激素的药效学研究。本研究的目的是比较当一次或每天连续七天皮下给予切除垂体的雄性Wistar大鼠时，不同hGH制剂的功效。研究设计如下：

表23.研究设计-样品说明

组#或试验化合物	样品<sup>a</sup>	样品说明
			1	每天可溶的介质-假垂体切除术	(没有hGH)16.7mg/ml D-甘露糖醇，26.7mg/ml蔗糖，50mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(pH 6.5)
2	每天可溶的介质-低剂量	(没有hGH)16.7mg/ml D-甘露糖醇，26.7mg/ml蔗糖，50mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(pH 6.5)
			3	每天可溶的介质-高剂量	(没有hGH)16.7mg/ml D-甘露糖醇，26.7mg/ml蔗糖，50mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(pH 6.5)
4	每天可溶的-低剂量	0.71mg/ml rhGH，16.7mg/ml D-甘露糖醇，26.7mg/ml蔗糖，50mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(pH 6.5)
			5	每天可溶的-高剂量	1.0mg/ml rhGH，16.7mg/ml D-甘露糖醇，26.7mg/ml蔗糖，50mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(pH 6.5)
6	可溶的单次快速浓注高剂量	3.5mg/ml rhGH，16.7mg/ml D-甘露糖醇，26.7mg/ml蔗糖，50mM NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(pH 6.5)
			7	聚精氨酸晶体-高剂量	18.7mg/ml rHGH晶体，250mM NaoAc，6％PEG-6000，25mM Tris-HCl(pH 8.6)，3.6mg/ml聚精氨酸HCl(rhGH∶聚精氨酸的摩尔比是1∶0.587)

8	介质对照-鱼精蛋白晶体	250mM NaOAc，6％PEG-6000，25mM Tris-HCl(pH8.6)，0.75mg/ml硫酸鱼精蛋白
			9	鱼精蛋白晶体-低剂量	3.3mg/ml rHGH晶体，250mM NaOAc，6％PEG-6000，25mM Tris-HCl(pH 8.6)，0.75mg/ml硫酸鱼精蛋白(rhGH∶聚精氨酸的摩尔比是1∶1.715)
10	鱼精蛋白晶体-高剂量	18.7mg/ml rHGH晶体，250mM NaOAc，6％PEG-6000，25mM Tris-HCl(pH 8.6)，4mg/ml硫酸鱼精蛋白(rhGH∶聚精氨酸的摩尔比是1∶1.715)
			11	介质对照-聚精氨酸晶体	250mM NaOAc，6％PEG-6000，25mMTris-HCl(pH8.6)，3.6mg/ml聚精氨酸-HCl
12	介质对照-单次快速浓注	16.7mg/ml D-甘露糖醇，26.7mg/ml蔗糖，50mMNaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(pH 6.5)

^a使用WFI在无菌条件下制备全部样品。将溶液调至它们各自的终体积后，用0.22μm滤器过滤载体和可溶的hGH样品。

表24.研究设计-给药

组#或试验化合物	给药水平(mg/kg)	给药浓度(mg/ml)	给药体积(μl)	给药方案	动物数量(雄性)
						1	0	0	200	7每天给药	13
2	0	0	20	7每天给药	11
						3	0	0	80	7每天给药	11
4	0.143	0.71	20	7每天给药	11
						5	0.8	1	80	7每天给药	12
6	5.6	3.5	160	第1天	11
						7	5.6	18.7	30	第1天	12
8	0	0	30	第1天	11
						9	1	3.3	30	第1天	12
10	5.6	18.7	30	第1天	12
						11	0	0	30	第1天	11
12	0	0	30	第1天	11

到达后，将138只雌性Wistar大鼠，体重大约90-100克以及大约25-30天大，分组养在控制条件下(大致温度23±3℃，相对湿度30-70％，在每个24小时周期中12小时光和12小时黑暗，每小时10-15次空气交换)并在整个研究中让其自由获得纯水和实验室粮食。在测试前，允许大鼠适应环境两周。

按照表24中的浓度、体积和给药方案给予138只大鼠样品。一次或每天一次连续七天以单次快速浓注形式在背部皮下给予试验化合物。在给药前，将注射部位剃光并标记直到三天，此后视需要以促进注射。使用连接在300μl注射器上的30-量规×8mm针给予试验化合物。在抽入注射器之前以及再在给药之前，小心地翻转试验化合物以确保悬浮液或溶液均一性，不引起发泡。

在-3周和-2周期间每周两次以及从-7天至14天每天测量并记录体重增加。给药时，大鼠体重大约是100g±10％。在图22和23中提供并在表25和26中总结了诱导生长的百分比结果。表25中“高剂量”表示5.6mg/kg/周。数据说明了单次注射rhGH∶聚精氨酸(组7，实施例18和19)或rhGH∶鱼精蛋白(组9和10，实施例18和19)晶体七天期间与每天注射对照(组1，没有hGH)或可溶的hGH样品(组4和5)相同的七天期间大鼠体重增加的比较。组1，假垂体切除术大鼠，显示了七天期间的正常生长。此外，七天一次注射给予rhGH∶聚精氨酸(组7)的大鼠比七天每天给予可溶的hGH(组5)的那些大鼠具有更高的诱导生长百分比。这些结果说明，按照本发明的hGH晶体和制剂与一周每天给予可溶的rhGH一样有效。

表25.在切除垂体的大鼠中8天诱导的体重增加

表26.在切除垂体的大鼠中每天诱导的体重增加

实施例26

用乙酸钠和硫酸鱼精蛋白结晶hGH。这里，从两种储备液-一种来源于大肠杆菌(Novartis)，另一种来源于酵母(Lucky Gold)获得可溶的重组生产的hGH(rhGH)的冷冻大量进料溶液。不论其来源，来源于大肠杆菌和酵母储备溶液中rhGH的单独分析产生具有相同结晶和溶解度特征的rhGH。使用由BioRad供应的10DG脱盐柱纯化大约3.3ml(10-20mg/ml)解冻的rhGH进料溶液。样品装载前，通过用30ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)洗涤来处理柱。然后装载rhGH样品并允许其借助重力进入所述柱。弃去第一个3ml洗脱液后，添加另一个5.0ml的10mM Tris-HCl pH8.0。洗脱并收集4.5ml的脱盐rhGH。然后使用Millipore浓缩器(MWCO 10,000)在3500rpm下进行离心浓缩20-30分钟。如通过在280nm/0.813处的吸收度(1mg/ml hGH A280＝0.813吸收度单位)测量的，hGH的浓度在30mg/ml的范围内。通过添加去离子水、Tris-HCl(pH8.6)、PEG-4000、硫酸鱼精蛋白和乙酸钠至它们在总溶液中分别为100mM、6％(v/v)、2mg/ml和500mM的终浓度，最终蛋白质浓度为15mg/ml，生成晶体。然后温和地混合溶液并在33℃下培育溶液12-16小时。获得了长度为约2至25μm的针状晶体。离心并使晶体成小丸后，提取上清液以及，结晶收率被测量为大于90％。

实施例27

用乙酸钠和聚精氨酸HCl结晶hGH。这里，从两种储备液-一种来源于大肠杆菌(Novartis)，另一种来源于酵母(Lucky Gold)，获得可溶的重组生产的hGH(rhGH)的冷冻大量进料溶液。不论其来源，来源于大肠杆菌和酵母储备溶液中rhGH的单独分析产生具有相同结晶和溶解度特征的rhGH。使用由BioRad供应的10DG脱盐柱纯化大约3.3ml(10-20mg/ml)解冻的rhGH进料溶液。样品装载前，通过用30ml Tris-HCl(10mM，pH8.0)洗涤来处理柱。然后装载rhGH样品并允许其借助重力进入所述柱。弃去第一个3ml洗脱液后，添加另一个5.0ml的10mM Tris-HCl pH8.0。洗脱并收集4.5ml的脱盐rhGH。然后使用Millipore浓缩器(MWCO 10,000)在3500rpm下进行离心浓缩20-30分钟。如通过在280nm/0.813处的吸收度(1mg/ml hGH A280＝0.813吸收度单位)测量的，hGH的浓度在30mg/ml的范围内。通过添加去离子水、Tris-HCl(pH8.6)、PEG-4000、聚精氨酸HCl和乙酸钠至它们在总溶液中分别为100mM、2％(v/v)、2mg/ml和500mM的终浓度，最终蛋白质浓度为15mg/ml，生成晶体。然后温和地混合溶液并在33℃下培育溶液12-16小时。获得了长度为约2至25μm的针状晶体。离心并使晶体成小丸后，提取上清液以及，结晶收率被测量为大于90％。

尽管用举例说明和为理解清楚的目的的实施例，以一些细节描述了前述发明，但根据本发明的教导，对本领域的技术人员轻易明显的是，不偏离本申请公开内容(包括所附实施方案)的精神或范围，可以对本发明作出某些变化和修改。

Claims (69)

1.人生长激素的阳离子晶体与离子型聚合物的络合物，其中所述人生长激素选自天然人生长激素促生长素的191个氨基酸序列和包含N-末端蛋氨酸的人生长激素人蛋氨生长激素的192个氨基酸序列，其中所述的阳离子是钙或钠。

2.按照权利要求1的络合物，其中所述的离子型聚合物是鱼精蛋白。

3.按照权利要求1的络合物，其中所述的离子型聚合物是聚精氨酸。

4.按照权利要求1的络合物，其中所述晶体每个人生长激素的单体包含1至500个钙分子。

5.按照权利要求1的络合物，其中所述晶体每个人生长激素的单体包含1至500个钠离子。

6.按照权利要求1的络合物，其中所述晶体包含选自由乙酸钙、氯化钙、硫酸钙和葡糖酸钙组成的组的钙盐。

7.按照权利要求6的络合物，其中所述钙盐是乙酸钙。

8.按照权利要求1的络合物，其中所述晶体包含选自由柠檬酸钠、磷酸钠和乙酸钠组成的组的钠盐。

9.按照权利要求8的络合物，其中所述钠盐是乙酸钠。

10.一种组合物，该组合物包含如权利要求1中提供的络合物和赋形剂。

11.按照权利要求10的组合物，其中所述络合物和所述赋形剂以人生长激素∶赋形剂为1∶10至1∶0.125的摩尔比存在于所述组合物中。

12.按照权利要求10的组合物，其中所述赋形剂选自由氨基酸、盐、醇、碳水化合物、蛋白质、脂质、表面活性剂、聚合物、和它们的混合物组成的组。

13.按照权利要求12的组合物，其中所述赋形剂选自由聚乙烯醇、环糊精、葡聚糖、葡糖酸钙、和聚氨基酸、聚乙二醇、树状聚体、聚乙烯亚胺、脱乙酰壳多糖和它们的混合物组成的组。

14.按照权利要求13的组合物，其中所述赋形剂为聚乙二醇。

15.按照权利要求10的组合物，其中人生长激素在所述组合物中的浓度在0.1和100mg/ml之间。

16.治疗有效量的权利要求1或2的络合物或权利要求10的组合物在制备药物中的用途，其中所述的药物用于治疗具有障碍的哺乳动物，所述的障碍与人生长激素缺乏有关或被用人生长激素治疗改善。

17.治疗有效量的权利要求1或2的络合物或权利要求10的组合物在制备药物中的用途，其中所述的药物用于在哺乳动物中诱导体重增加。

18.按照权利要求17的用途，其中所述哺乳动物是垂体被切除的大鼠，并且通过一周一次注射施用所述晶体后在所述大鼠中诱导的体重增加在5％和40％之间。

19.按照权利要求16的用途，其中所述障碍选自由成人生长激素缺乏、儿童生长激素缺乏、普-威综合征、特纳综合征、短肠综合征、慢性肾功能不全、自发的短身材、侏儒症、垂体功能减退侏儒症、骨再生、雌性不育症、宫内生长迟缓、AIDS有关的恶病质、局限性回肠炎和烧伤组成的组。

20.按照权利要求19的用途，其中所述障碍是儿童生长激素缺乏并且所述药物的使用在所述哺乳动物中导致7和11厘米之间的每年生长速度。

21.按照权利要求16或17的用途，其中通过口途径、胃肠外途径、皮下途径或肌内途径将所述的药物给予所述哺乳动物。

22.按照权利要求21的用途，其中使用具有大于或等于27的量规的针，通过皮下途径将所述的药物给予所述哺乳动物。

23.按照权利要求16或17的用途，其中通过无针注射或变剂量输注泵将所述的药物给予所述哺乳动物。

24.按照权利要求16或17的用途，其中通过选自由下列各项组成的组的时间方案将所述的药物给予所述哺乳动物：

(a)每三天一次；

(b)一周一次；

(c)每两周一次；以及

(d)每月一次。

25.按照权利要求16或17的用途，其中所述哺乳动物是人。

26.一种生产人生长激素的钙晶体或钠晶体与离子型聚合物的络合物的方法，其中所述人生长激素选自天然人生长激素促生长素的191个氨基酸序列和包含N-末端蛋氨酸的人生长激素人蛋氨生长激素的192个氨基酸序列，该方法包括如下步骤：

(a)将人生长激素的溶液与结晶缓冲液混合以产生结晶溶液；

(b)向所述结晶溶液中添加去离子水；

(c)向所述结晶溶液中添加沉淀剂；

(d)向所述结晶溶液中添加钙盐或钠盐；

(e)在10℃和40℃之间的温度下，培育所述结晶溶液2至168小时，直到形成人生长激素的钙晶体或钠晶体为止；以及

(f)向所述人生长激素的钙晶体或钠晶体中添加离子型聚合物从而所述离子型聚合物与所述人生长激素的晶体络合。

27.按照权利要求26的方法，其中所述钙盐选自由乙酸钙、氯化钙、葡糖酸钙和硫酸钙组成的组。

28.按照权利要求27的方法，其中所述钙盐是乙酸钙。

29.按照权利要求26的方法，其中所述钠盐选自由柠檬酸钠、磷酸钠和乙酸钠组成的组。

30.按照权利要求29的方法，其中所述钠盐是乙酸钠。

31.按照权利要求26的方法，其中所述沉淀剂是非离子型小分子或非离子型聚合物。

32.按照权利要求31的方法，其中所述非离子型聚合物选自由聚乙二醇、聚乙烯醇和它们的混合物组成的组。

33.按照权利要求32的方法，其中所述聚乙二醇具有200和8000之间的分子量。

34.按照权利要求33的方法，其中所述聚乙二醇以0.5％和20％(w/v)之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

35.按照权利要求26的方法，其中所述沉淀剂选自由氨基酸、肽、聚氨基酸和它们的混合物组成的组。

36.按照权利要求26的方法，其中所述人生长激素以1mg/ml和1,000mg/ml之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

37.按照权利要求26的方法，其中所述钙盐或所述钠盐以0.01和1M之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

38.按照权利要求26的方法，其中培育所述结晶溶液，时间和温度选自由下列各项组成的组：

(a)在33℃的温度下0.25天和两天之间；

(b)在25℃的温度下0.25天和两天之间；以及

(c)在15℃的温度下0.25天和两天之间。

39.按照权利要求26的方法，其中所述离子型聚合物选自由鱼精蛋白、多糖、聚氨基酸、树状聚体、聚乙烯亚胺、脱乙酰壳多糖和它们的混合物组成的组。

40.按照权利要求39的方法，其中所述离子型聚合物是鱼精蛋白或聚精氨酸。

41.按照权利要求26的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，在10℃和40℃之间的温度下培育所述结晶溶液4至48小时，直到形成人生长激素的钙晶体或钠晶体为止。

42.按照权利要求26的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，所述人生长激素以2mg/ml和100mg/ml之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

43.按照权利要求26的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，所述人生长激素以14.5mg/ml和15.5mg/ml之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

44.按照权利要求26的方法，其中所述结晶缓冲液选自由Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、咪唑缓冲液、Bis-Tris缓冲液、AMP、AMPD、AMPSO、N-二(羟乙基)甘氨酸、乙醇胺、glyclglycine、TAPS、牛磺酸、Triane和它们的混合物组成的组。

45.按照权利要求26的方法，其中，在权利要求26的步骤(a)中，所述结晶缓冲液以10mM和800mM之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

46.按照权利要求26的方法，其中，在步骤(a)中，所述结晶缓冲液具有3和10之间的pH。

47.按照权利要求26的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，在所述结晶溶液中的所述结晶缓冲液使所述溶液达到3和10之间的pH。

48.按照权利要求46或47的方法，其中所述缓冲液选自由Tris、HEPES、乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、咪唑和甘氨酸组成的组。

49.按照权利要求28的方法，其中所述乙酸钙呈水溶液的形式，该水溶液具有3.0和9.0之间的pH。

50.按照权利要求28的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，所述乙酸钙以0.1mM和205mM之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

51.按照权利要求30的方法，其中所述乙酸钠呈水溶液的形式，该水溶液具有3.0和9.0之间的pH。

52.按照权利要求26的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，在10℃和37℃之间的温度下培育所述溶液一天至两天。

53.按照权利要求13的组合物，其中所述聚氨基酸是聚鸟氨酸。

54.按照权利要求10的组合物，其中人生长激素在所述组合物中的浓度在1和100mg/ml之间。

55.按照权利要求10的组合物，其中人生长激素在所述组合物中的浓度在10和100mg/ml之间。

56.按照权利要求26的方法，其中所述离子型聚合物是选自聚精氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚鸟氨酸和它们的混合物的聚氨基酸。

57.按照权利要求32的方法，其中所述聚乙二醇具有6000的分子量。

58.按照权利要求32的方法，其中所述聚乙二醇具有4000的分子量。

59.按照权利要求32的方法，其中所述聚乙二醇具有3350的分子量。

60.按照权利要求26的方法，其中所述人生长激素以2mg/ml和50mg/ml之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

61.按照权利要求26的方法，其中所述人生长激素以10mg/ml和25mg/ml之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

62.按照权利要求26的方法，其中所述钙盐或所述钠盐以25和205mM之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

63.按照权利要求26的方法，其中，在步骤(a)中，所述结晶缓冲液具有6和9之间的pH。

64.按照权利要求26的方法，其中，在步骤(a)中，所述结晶缓冲液具有7.5和10之间的pH。

65.按照权利要求26的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，在所述结晶溶液中的所述结晶缓冲液使所述溶液达到6和9.5之间的pH。

66.按照权利要求26的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，在所述结晶溶液中的所述结晶缓冲液使所述溶液达到7.5和9.5之间的pH。

67.按照权利要求28的方法，其中所述乙酸钙呈水溶液的形式，该水溶液具有7.0和8.6之间的pH。

68.按照权利要求28的方法，其中，在权利要求26的步骤(e)中，所述乙酸钙以85mM和100mM之间的浓度存在于所述结晶溶液中。

69.按照权利要求30的方法，其中所述乙酸钠呈水溶液的形式，该水溶液具有7.0和8.6之间的pH。