JPH08505127A

JPH08505127A - 成長ホルモンの結晶体を製造する方法およびそれにより得られる結晶体

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Publication number: JPH08505127A
Application number: JP6510964A
Authority: JP
Inventors: ロベルトソンエバフロリン; エルビーホクビー; ロンニールンデン; シルッカトム; ソダールゲルトラドウエスチン
Original assignee: ファーマシアアクチボラーグ
Priority date: 1992-10-28
Filing date: 1993-10-27
Publication date: 1996-06-04
Anticipated expiration: 2018-11-25
Also published as: EP0669934B1; CA2147482C; SE9302278D0; AU679012B2; NO951547L; FI952021A0; JP3470135B2; EP0669934A1; FI952021A; NO320171B1; HK1013299A1; ATE174602T1; DE69322654D1; DE69322654T2; DK0669934T3; CA2147482A1; FI110609B; WO1994010192A1; US5734026A; AU5401194A

Abstract

(57)【要約】本発明は成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的派生物の結晶体を製造するための新規な方法に関し、その方法はｉ）ＧＨまたはその機能的派生物を緩衝剤および一般式（１）、Ａｒ−〔−ＣＲ₁Ｒ₂−〕_n〔−ＣＲ₃Ｒ₄−〕_m−ＣＲ₅Ｒ₈−ＯＨ（１）を有する化学化合物とからなる水性溶液と混合し、式中、Ａｒはフェニル、アルキル置換フェニル、ナフチル、アルキル置換ナフチル、Ｒ₁〜Ｒ₈はＨ，ＯＨまたはアルキル、ｎおよびｍは０または１であり、ii）定温放置しiii）公知の方法により結晶体を単離する工程からなるものである。本発明はまた緩衝剤溶液からのＧＨの結晶体に関するもので、更に少なくとも２０ミクロンの長さを有する針、三角形形状、立方体または平行六面体の形状において成長ホルモンまたはその機能的類似物の結晶体の製造において一般式（１）を有する化学化合物の使用、結晶体からなる注入用懸濁液、沈澱調合および乾燥調合に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称成長ホルモンの結晶体を製造する方法およびそれにより得られる結晶体技術分野本発明は成長ホルモン（ＧＨ）の結晶体またはその機能的派生物を製造する方法に関する。本発明はまた成長ホルモンの結晶体およびそれらを含有する組成物に関する。成長ホルモンはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、牛成長ホルモン（ｂＧＨ）、魚および豚成長ホルモン（ｐＧＨ）のごとき人間および動物両方に存在し得る。ｈＧＨは１９１個のアミノ酸の単一鎖からなる蛋白質である。分子は２つの二硫化物ブリッジにより架橋されかつ単量体形状は２２ｋＤａの分子量を有する。しかしながら、下垂体ヒト成長ホルモンは同質ではない。例えば、同一遺伝子から製造された小さい２０ｋＤａｈＧＨ変異体もまた知られている。妊娠中胎盤により発現される「基本ｈＧＨ」変異体（ｈＧＨ−Ｖ）は別個の遺伝子の生成物であるところの他の類似物である。２２ｋＤａｈＧＨと同様に１９１個のアミノ酸からなるが、しかし種々の位置においてそれらの１３個が異なる。例えば、ビューリー・ティーエー氏等著、１９７５年、酵素学の進歩、第４２巻、第７３頁乃至１６６頁およびフランケン・エフ氏等著、臨床内分泌および新陳代謝ジャーナル、１９８８年、第６６巻、第１１７１頁乃至第１１８０頁参照。組換えｈＧＨ（２２ｋＤａ）は数年来市場で入手可能である。これは人間の組織から製造された製品がクロイツフェルトーヤコブ病の病原体のごとき感染性病原体を含有するため下垂体派生製品より好適である。２種類の治療に有用な組換えｈＧＨ製品が市場に存在しており、そのうちの１つは、例えばカビ・ファーマシア・アクチボラーグ社製のジエノトロピン（商標）およびＮ終端で追加のメチオニン残留物を有する類似物、例えばソマトノーム（商標）である。ｈＧＨは下垂体低下の矯小発育症またはターナー症候群の患者における直線成長を剌激するのに使用されているが、しかし他の適応症も示唆されている。蛋白質の安定性は一般に製薬産業における問題である。この問題は冷凍乾燥のごとき種々の乾燥方法において蛋白質を乾燥することによりしばしば解決された。蛋白質はその後乾燥された形状において分配されかつ貯蔵された。患者は使用前に溶媒中で乾燥された蛋白質を元に戻さねばならず、使用前に蛋白質を元に戻すことは不利点でありかつ患者にとって不便である。凍結乾燥方法はコストがかかりかつ時間を消費する工程であり、そして蛋白質の製品を大量生産するとき、この工程が回避され得るならば大きな利点である。成長ホルモン例えばｈＧＨの毎日の注入を必要とする患者に関して、とくに患者が子供であるとき、製品が扱い易いこと、投与し易いこと、および注入し易いことが重要である。凍結乾燥ｈＧＨの復元は用心と慎重さを必要とし、好ましくは回避させねばならないが、しかし今日利用し得るただ１つの方法である。この問題の種々の解決策が開示されているが、いままでこのような製品は市場に出現していない。ジェネテック社の国際特許出願公開第ＷＯ８９／０９６１４号公報において、グリシン、マニトールおよび緩衝剤からなるｈＧＨの安定化した調合が開示されており、好適な実施例においてボリソルベート８０のごとき非イオン表面活性剤が添加されている。燐酸ナトリウムが緩衝物質として示唆されている。その調合は凍結乾燥調合においてかつ復元時において増加した安定性を有する。溶液中で成長ホルモンを投与する他の可能性はインターナシヨナル・ミネラルズ・アンド・ケミカル・コーポレーション社のヨーロッパ特許第２１１６０１号明細書によればポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンを含有するブロック共重合体を添加することにある。この解決策は動物に投与した時にその放出を長時間延長させることができる。ＧＨの安定性および製造の問題を迂回するための異なる方法が本明細書に開示されている。結晶化により成長ホルモンを製造する新たな方法が達成され得る。成長ホルモンの結晶体はまた、例えば種々の型の注入可能な懸濁液、インプラントおよび局所用調合のごときホルモンの種々の新規な調合に使用され得る。成長ホルモンの結晶化は以前には工業的方法において実施することができなかった。クラークソン氏等は分子生物学ジャーナル、１９８９年、第２０８巻、第７１９頁乃至第７２１頁において、前述したものと異なる、３つの異なる結晶化方法について報告している。以下の方法が使用れた、すなわち、１）緩衝液中にエタノールまたはメタノールを使用し、懸滴で、１年後に１０^-3 ｍｍ³の大きさおよび１３４オングストローム（０．０１３４ミクロン）の細胞寸法を有する四角形両錐体が得られた。２）緩衝液中にアセトンを使用し、懸滴で、３〜１４日後に２×１０^-3ｍｍ³ の大きさを有する三角形プリズムが得られた。３）パラアルデヒドを使用し、バッチ方法で、数週間後に２×１０^-3ｍｍ³の大きさを有する斜方晶系平行六面体が得られた。著者は彼らが大きな単結晶を得ることに成功しなかったと解説した。ノヴオ・ノルディスカ・アクテセレスカベット社の国際特許出願公開第ＷＯ９２／００９９８号公報において、化学的に安定で生物学的活性の成長ホルモンカチオン結晶体を製造する方法が開示されている。この方法は、５〜８の間のｐＨでＧＨの溶液にカチオンを添加し、０〜３０℃の温度で結晶体を生成させその結晶体を分離する工程からなっている。得られた結晶体はカチオンＧＨ結晶体である。好適なカチオンはＺｎ²⁺でありそして好ましくは有機溶媒がカチオンとともに添加される。得られた結晶体は常にカチオンを包含しそして小さい。例において亜鉛含有結晶体の長さは３〜１２ミクロンの間で変化する。サイエンス、第２５３巻、第５４５頁乃至第５４８頁、１９９１年のビー・シー・カニンガム氏等著の論文中に、亜鉛によるｈＧＨの二量重合が開示されている。ｈＧＨを投与するための良好な方法について市場で要望がある。この要望に合う幾つかの方法は注入溶液を使用するか、または例えば懸濁されたｈＧＨの結晶体として注入可能な沈澱調合を備えることにある。ｈＧＨの結晶体と緩衝液とともにかつ保存料とともにまたは保存料なしで懸濁液においてまたは水性の注入可能な溶液において使用され得る。それらはまた例えば油性または水性懸濁液としてまたはインプラントとして沈澱調合において使用させることができ、従ってゆっくりした薬剤放出を付与する。結晶体が十分に大きい場合に、それらは粉末として使用することができ、表面、例えば傷上に分散させることができる。非常に小さい粒子はそれらが埃を形成するので適切でなく、直接使用に用いることができない。薬学的観点から容認できないカチオンまたはメタノール、エタノール、アセトンまたはパラアルデヒドのごとき溶媒の添加なしに純粋な活性ＧＨ結晶体を製造するための新規な方法を発見した。この新規な方法により結晶体は非常に短時間に形成され得る。有名な化合物の幾つか（例えば例２２参照）を使用するとき、結晶体は瞬時に形成され、他のものに関しては１時間以内で形成された。これは数週間後のみ結晶体を製造するカールソン等により示された方法と比較させることができる。ＧＨの水性溶液に一般構造（１）を有する化学化合物を添加することにより、ＧＨの結晶体は容易にかつ迅速に形成され得る。添加は好ましくは化合物を含有する溶液による透析またはクロマトグラフィによる最後の純化工程において実施され得る。この方法によれば条件および時間に依存して結晶体の大きさを変化させることができ、それはｈＧＨの投与のために異なる調合を製造するときに大きな利点である。結晶体中で得られたＧＨは８０％以上の単量体ＧＨを通常含有する材料である。カチオンの回避により結晶体を製造するための迅速な方法があることは、ｈＧＨの製造において大きな利点である。この方法は純化および製造のための技術的な過程において使用することができる。発明の開示成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的派生物の結晶体を製造するための新規な方法は、ｉ）ＧＨまたはその機能的派生物を緩衝剤と一般式（１）、Ａｒ−〔−ＣＲ₁Ｒ₂−〕_n〔−ＣＲ₃Ｒ₄−〕_m−ＣＲ₅Ｒ₆−ＯＨ（１）を有する化学化合物とからなる水性溶液と混合し、式中、Ａｒはフェニル、アルキル置換フェニル、ナフチル、アルキル置換ナフチル、Ｒ₁〜Ｒ₆はＨ，ＯＨまたはアルキル、ｎおよびｍは０または１であり、 ii）定温放置し、 iii）公知の方法により結晶体を単離する構成を包含する。定温放置は当業者に公知の種々のすべての型式の結晶化方法を意味する。実験室規模において懸滴方法が好適であるが、工業規模において最も容易な方法は溶液をそのままにすることによる。化学物は好ましくは、ベンジルアルコール、２−メチルベンジルアルコール、１−（１−ナフチル）エタノール、フェニルエタノール、１−フェニル−１−プロパノール、２−フェニル−２−プロパノール、３−フェニル−１−プロパノール中から選ばれる。本発明はまた緩衝剤の溶液からＧＨの結晶体を製造するために一般式（１）を有する化学化合物の使用に関する。ベンジルアルコールが使用されるとき好適な量は少なくとも１％である。緩衝剤は例えば２ないし５０ｍＭ、好ましくは５ないし２０ｍＭかつとくに５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度のクエン酸塩にすることができる。緩衝剤はまたクエン酸ナトリウムおよび燐酸ナトリウムの混合物にすることができる。水溶液はグリシン、リシン、マニトール、および／またはグリセロールから構成することができる。５．８ないし６．３かつ好ましくは６．２の初期ｐＨが良好な結果を付与した。結晶体の調合は時間、ｐＨおよび温度に依存している。２０℃ないし３０℃の間の温度で結晶体は通常迅速に、時には瞬時にかつ多くは１時間以内に形成される。本発明の成長ホルモンまたはその機能的な類似物の結晶体は少なくとも２０ミクロンの長さを有する針、三角形形状、立方体または平行六面体の形状である。幾つかの場合において得られた結晶体は同様に１ｍｍ以上であった。好ましくは長さは少なくとも５０〜２０００ミクロンかつより好ましくは１００〜３００ミクロンである。本発明の結晶体はかくして以前に得られた結晶体より大きい。本発明による結晶体は種々の投与形態、例えば局所、鼻、肺、経口、直腸およびおよび非経口の人間および家畜用途において有用である。本発明は本発明による結晶体からなる注入用懸濁液、沈澱調合および乾燥調合にある。本発明はまた本発明の調合を投与することにより成長ホルモンまたはその機能的類似物を必要とする患者の治療方法および成長ホルモンまたはその機能的類似物を必要とする患者の治療用薬剤の製造のためのＧＨ結晶体の使用に関する。本発明の方法はＧＨの純化方法において使用され得る。本発明の結晶体は生物学的に活性である。成長ホルモンはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、牛成長ホルモン（ｂＧＨ）、魚および豚成長ホルモン（ｐＧＨ）のごとく人間および動物の両方に存在し得る。成長ホルモン（ＧＨ）は自然発生および組換えＧＨ（ｒＧＨ）の両方を意味する。機能的類似物は動物中の成長ホルモンと同一の治療効果を有する化合物を意味する。組換えＧＨ（ｒＧＨ）が好ましい。ＧＨの結晶体を使用することにより調合は容積当たりのＧＨの量に制限を付与する使用担体／緩衝剤中のその溶解度に依存しない。これは本発明の結晶体の明らかな利点である。乾燥組成物、懸濁液または沈澱調合において薬剤供給系におけるＧＨの容積当たりの量は非常に高くなる。図面の簡単な説明第１図は形成された結晶体を示す顕微鏡検査の拡大図である。発明を実施するための最良の形態例１〜２０調合研究用材料はジエノトロピン（商標）方法における薬剤物質であった。純化過程後得られた溶出液は約３６ＩＵ／ｍｌを有する。調合は前の純化工程において使用された塩を除去しかつ最終調合の成分を添加する目的に役立つゲル濾過により実験室規模において実施された。コラムセファデックスＧ−２５（ファーマシア製）は調合緩衝剤で平衡させられた。クロマトグラフィは＋７℃で実施された。所望の蛋白質濃度が調合緩衝剤で希釈することにより達成された。溶液は殺菌濾過されかつガラスカートリッジ内に分配された。種々の溶液における針の形成は例１〜２０および２２に追随された。得られたｈＧＨ結晶体は特性を付与した。方法分離結晶体は遠心分離されかつ懸濁液がピペットにより取り去られた。残留物は水で６回、その後アセトンで３回そして最後にジエチルエーテルで２回遠心分離された。結晶体が乾燥された。ポリペプチド大きさ分布（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ソマトロピン、ｈＧＨの製造において蛋白質はＳＤＳ−蛋白質の負に帯電された分子錯体を発生するためにナトリウムドデシル燐酸塩（ＳＤＳ）により変性された。単離は次いでＳＤＳの存在においてポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）中の電気泳動により分子の大きさにしたがって得られた。ｈＧＨの関連のポリペプチド大きさ分布は銀焼き付けポリペプチド帯の濃度計走査により定量された。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）薄層クロマトグラフィはシリカゲル板（メルクｗｔ５７１５）上で実施されかつｎ−ブタノール：酢酸：水：エチルアセテート、１：１：１：１において展開された。評価は全般的なスクリーニングに関して２５４ｎｍでのＵＶ光、主要アミノ基および過マンガン酸カリウム試薬に関してのニンヒドリン反応からなる３つの異なる目視技術に基礎を置いた。ＥＬＩＳＡ、免疫吸着剤分析評価ｈＧＨに対して向けられた免疫吸着剤純化ラビット抗体で被覆されたマイクメタイター板（デンマーク国所在のヌンク・アクチェセレスカベット社製）血清サンプル、基準（標準）および対照標準により定温放置された。洗浄後ファブアンチｈＧＨ−ビオチン共役が添加されかつ固体相抗原に結合させた。固体相についてのＨＲＰの量が次いで、基板Ｈ₂Ｏ₂および３，３′，５，５′，−テトラーメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）および過ホウ酸塩を使用して決定される。最終酸化生成物は４５０ｎｍでその吸収より測定される。検出し得る最小濃度は０．４ｍＵ／Ｌである。０．７２ｍＵ／Ｌで分析評価間および分析評価内の変化率はそれぞれ２．３および９．０％でありそして４．０７ｍＵ／Ｌにおいて変化はそれぞれ２．２および１１％である。ＨＰＬＣＡｓｈａｉＰａｃ−ＯＤ５５０、逆相／ＴＲＩＳ（ｐＨ８．５）−ｎ−ブタノール、イソクラティック検出：２１０および２８０ｎｍゲル濾過スーパーデックス７５／０．０５Ｍ燐酸塩緩衝剤ｐＨ７．４検出：２８０ｎｍ目視検査溶液の出現がＰｈ．Ｅｕｒ．第二Ｅｄにより目で検査された。ｐＨｐＨはガラスおよびカロメル電極により測定された。討論通常ベンジルアルコールからなる調合は６．１ないし６．３のｐＨ範囲において結晶体を付与しかつベンジルアルコールなしの溶液はこのｐＨ範囲内で結晶体を付与しなかった。調合１および２はベンジルアルコール中の結晶体の形成のための臨界値であると思われるｐＨ６．３でベンジルアルコールの添加にも拘わらず静澄であった。結果および個性顕微鏡検査結晶体は異なる長さの針の形であった。最大の結晶体は約０．３×０．０３ｍｍであった。第１図参照。溶融点決定溶融点はライツ−ヴエツラー顕微鏡で行われた。結晶体は、それらが不当に色付けされ始めたとき、２３０℃まで完全であった。約２９０℃で結晶体は黒くなったが溶融しなかった（熱分解）。溶解度結晶体はジクロロメタン、アセトニトリル、エタノール、ジメチルフオルムアミド、ジエチルエーテルのごとき有機溶媒中に不溶であった。結晶体は水および水中の７０％エタノールに溶解し難いが１％酢酸、６ＭＨＣｌのごとき０．１Ｍ燐酸緩衝剤、ｐＨ８のごとき塩基に溶解可能であった。薄装クロマトグラフィ（ＴＬＣ）１０％酢酸中に溶解された結晶体および緩衝剤成分、すなわち、クエン酸、マニトール、グリシンおよびベンジルアルコールが研究された。結晶サンプルはＵＶ光を吸収しかつ芳香族基、アミノ基および酸化基を示す、ニンヒドリンおよび過マンガン酸試薬により正の反応を示した。加水分解結晶サンプルおよびｈＧＨ基準の６ＭＨＣ１１，１１０℃、２０時間の加水分解。ＴＬＣを使用することにより分析は同一点を示した。ＨＰＬＧ，ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ＩＥＦ結晶サンプルはｈＧＨ基準とほぼ同一であった。アミノ酸分析結晶体について得られた実験データは理論値ならびにｈＧＨ基準サンプルと良好に一致した。以下の表を参照。０．２２ｍｇの量に基づいて、結晶サンプルの蛋白質含量は８４％であった。基準材料（０．４５ｍｇ）中の含量は９１％であった。例２１結晶体は、２０ＩＵ／ｍｌｈＧＨ５ｍＭＮａ−クエン酸１２ｍＭグリシン２５０ｍＭマニトールおよび１％ベンジルアルコールを６．４のｐＨにおいて含有する溶液中に形成されなかった。より多くのベンジルアルコール（すなわち＞１％）の添加により結晶体は迅速に形成された。６近くにまたは６以下にｐＨを低減することによっても結晶体が製造された。結晶体の形態はｐＨおよび成長率により変化され得る。ｐＨが６．３に近いとき結晶体は針および平行六面体のようである。２４時間以内で結晶体は０．１ないし０．３ｍｍの長さで約０．００１ないし０．００５ｍｍの厚さに形成される。ｐＨを変化させることにより結晶体の大きさはかくして変化され得る。小さい結晶体が短い時間内に形成される。例２２他の化学化合物が成長ホルモンの結晶体を形成する可能性に関して研究された。調合研究用材料は通常のジエノトロン（商標）方法における薬剤物質であった。純化過程後得られた溶出液は調合前に約３６ＩＵ／ｍｌを含有する。調合は使用された緩衝剤に対して透析により実験室規模において行われた。「懸滴」方法が成長ホルモンの結晶用の有用な薬品の研究のために使用された。「懸滴」方法は、１９９１年、オックスフォードに所在のアイアールエル新聞社発行、エー・デュクルイックス氏およびアール・ジージエ氏著の核酸および蛋白質の結晶化の実用的アプローチに記載されている。滴剤の初期容積は５μｌ＋５μｌおよび良好な容積は１ｍｌであった。実験中使用された緩衝剤は以下の成分を含んでいた。以下に示されるような化合物２００ｍＭＮａ−クエン酸ｐＨ６．２結果は異なる結晶化薬品により以下のごとくであった。化合物結晶体ベンジルアルコール大きな単結晶 ±１−（１−ナフチル）エタノール大きな単結晶（±）フェニルエタノール大きな単結晶＋フェニルエタノール大きな単結晶 −フェニルエタノール大きな単結晶１−フェニル−１−プロパノール大きな単結晶（±）１−フェニループロパノール大きな単結晶２−フェニル−２−プロパノール大きな単結晶３−フェニル−１−プロパノール大きな単結晶２−メチルベンジルアルコール単結晶使用した結晶化薬品の幾つかに関して結晶体はゆっくり形成された。±１−（１−ナフチル）エタノールを使用するとき結晶体は２週間後形成され、そして大きさは２００ないし５００ミクロンであった。Ｎａ−クエン酸を使用する代わりに、またＭＥＳ−緩衝剤が使用された。結果はＮａ−クエン酸を使用するときと同一であった。しかしながら、より高い濃度の結晶化薬品がクエン酸が存在しないとき必要とされた。一般式（１）の範囲外になる他の結晶化薬品が上記と同一方法において試験されたとき、結晶体は形成されなかった。化合物結晶体３−メチル−４−ニトロベンジルアルコールナシ２−ニトロベンジルアルコールナシ４−ニトロベンジルアルコールナシ１−ナフトールナシ２−ナフトールナシフェノールナシベンズアルデヒドナシベンジルアミンナシ（−）１−フェニル−１−ブタノールナシＬ−フェニルグリシノールナシ例２３結晶体の免疫学的分析が行われた。結晶体は例１〜例２０にしたがって、２０ＩＵ／ｍｌ成長ホルモン５ｍモルＮａ−クエン酸１２ｍモルグリシン１３０ｍモルマニトール１％ベンジルアルコールを含有する緩衝剤中で形成された。形成された結晶体の０．１７ｍｇが０．０５％ツイーン２０を含有する０．３４ｍ１０．０５Ｍ燐酸塩緩衝塩水、ｐＨ７．５中に溶解された。溶液は同一緩衝剤中で１０段階においてさらに希釈された。すべての個々の希釈段階が同じもの４通に分析された。酵素結合免疫吸収剤分析評価、ＥＬＩＳＡ、免疫吸収剤分析評価が溶解された結晶中のｒｈＧＨを測定するのに使用された。ガラス瓶中のｒｈＧＨの量は０．１５ｍｇであると認められた。例２４生物学的定量結晶体は上記の例６による溶液から成長させられかつガラス容器中に０．５ｍ１サンプルとして分配された。製造後溶液は成長すべき結晶体のために１週間５ ℃で貯蔵された。それらはさらに結晶体を採取する前に３カ月間５℃で貯蔵された。結晶体が採取された後結晶体を取り囲む上清は吸い込まれた。結晶体は例６（すなわち、成長ホルモン以外の例６による組成物）による緩衝剤０．２５ｍｌにより２度濯ぎ洗いされた。第２の濯ぎ洗い工程は濯ぎ緩衝剤を放棄する前に結晶体の遠心分離により終了された。残りの結晶体は０．５ｍｌの５ｍＭクエン酸ナトリウム、１２ｍＭグリシンおよび１３０ｍＭマニトール、ｐＨ６．１からなる緩衝剤中に溶解された。幾つかのサンプルが生物学的定量分析に使用されるべくプールされた。ゲル濾過クロマトグラフィは上記手順により製造されたサンプルについて行われた。成長ホルモンは結晶化かつその後の溶解度１００％単量体であることを示した。溶解された成長ホルモン（ＧＨ）の生物学的定量：得られたＧＨ結晶体が生物学的に活性であるかどうかを調べるために下垂体切除されたラットの重量増加評価分析が行われた。ラットはデンマーク国に所在のミューレガールト・アクテセレスカベット社から購入された。ラットは到着前の週に下垂体切除されかつそれゆえ内因性の成長ホルモンおよび他の下垂体ホルモンが不足しており、妨げられた成長を生じた。ラットは研究室においてかつ評価分析前に到着時計量された。重量の変化が＜１０％のラットが研究に参入するために受け入れられた。ラットは次いで任意に１５のグループに分割された。それらのラットは４日間毎日２度ヒト組換えＧＨ（４．５ＩＵ／ガラス瓶の生物学的潜在力を有するようにＷＨＯ８０／５０５に対して較正された）の集団内標準プレパレートかまたは２回の投与量でＧＨ結晶から作られた溶液により処置された。標準投与量は０．０４ＩＵ／日および０．１６ＩＵ／ｍｌであった。グループは最初の注入（第１日）前にかつ最後の注入（第５日）後約１６時間に計量された。これらの重量間の差異が計算されかつ潜在力が標準処置グループの動物と結晶溶液処置の動物の結果を比較することにより決定された。結果は以下に示されている（重量増加、ｇ，ＳＤ）投与量０．０４ＩＵ／日０．１６ＩＵ／日標準１２．２８．９１７．７８．７ＧＨ結晶体１７．３８．０２１．３１．７溶解されたＧｈ結晶体の生物学的潜在力は７．１ＩＵ／ｍｌであるように認められた。かくして、溶解ＧＨ結晶体はヒト成長ホルモンが生物学的に生体内で活性であることを立証した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/00 Ｈ 9282−4Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＮＯ，ＵＳ (72)発明者ルンデンロンニースウェーデン国，エス―178 32 エケロ, ロボバーゲン３ (72)発明者トムシルッカスウェーデン国，エス―115 36 ストックホルム，リンドガータン 15，アイアイ (72)発明者ウエスチンソダールゲルトラドスウェーデン国，エス―152 57 ソテルタルエ，アルプバーゲン 22

Claims

【特許請求の範囲】１）成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的派生物の結晶体を製造する方法において、ｉ）ＧＨまたはその機能的派生物を緩衝剤と一般式（１）、Ａｒ−〔−ＣＲ₁Ｒ₂−〕_n〔−ＣＲ₃Ｒ₄−〕_m−ＣＲ₅Ｒ₆−ＯＨ（１）を有する化学化合物とからなる水性溶液と混合し、式中、Ａｒはフェニル、アルキル置換フェニル、ナフチル、アルキル置換ナフチル、Ｒ₁〜Ｒ₆はＨ，ＯＨまたはアルキル、ｎおよびｍは０または１であり、 ii）定温放置し iii）公知の方法により結晶体を単離する工程からなることを特徴とする成長ホルモンの結晶体の製造方法。２）ＧＨがヒトＧＨであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の成長ホルモンの結晶体の製造方法。３）ＧＨが組換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の成長ホルモンの結晶体の製造方法。４）化合物がベンジルアルコール、２−メチルベンジルアルコール、１−（１ −ナフチル）エタノール、フェニルエタノール、１−フェニル−１−プロパノール、２−フェニル−２−プロパノール、３−フェニル−１−プロパノール中から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の成長ホルモンの結晶体の製造方法。５）化合物がベンジルアルコールであることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の成長ホルモンの結晶体の製造方法。６）ベンジルアルコールの量が少なくとも１％であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の成長ホルモンの結晶体の製造方法。７）緩衝剤溶液からＧＨの結晶体の製造においてＡｒ−〔−ＣＲ₁Ｒ₂−〕_n〔−ＣＲ₁Ｒ₂−〕_m−ＣＲ₅Ｒ₈−ＯＨ（１）式中、Ａｒはフェニル、アルキル置換フェニル、ナフチル、アルキル置換ナフチル、Ｒ₁〜Ｒ₆はＨ，ＯＨまたはアルキル、ｎおよびｍは０または１である一般式（１）による化学化合物の使用。８）少なくとも２０ミクロンの長さを有する針、三角形形状、立方体または平行六面体の形状における成長ホルモンまたは機能的類似物の結晶体。９）ＧＨがヒトＧＨであることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の結晶体。１０）ＧＨが組換えヒトＧＨ（ｒｈＧＨ）であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の結晶体。１１）前記針が少なくとも５０、好ましくは５０〜２０００そしてより好ましくは１００〜３００ミクロンの長さを有することを特徴とする請求の範囲第８項に記載の結晶体。１２）請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法により製造された結晶体。１３）請求の範囲第８項ないし第１２項のいずれか１項に記載の結晶体からなる注入用懸濁液。１４）請求の範囲第８項ないし第１２項のいずれか１項に記載の結晶体からなる沈澱調合。１５）請求の範囲第８項ないし第１２項のいずれか１項に記載の結晶体からなる乾燥調合。１６）請求された調合を投与することによる成長ホルモンまたはその機能的類似物を必要とする患者の治療方法。１７）成長ホルモンまたはその機能的類似物を必要とする患者の治療用薬剤の製造についての請求の範囲第８項ないし第１２項のいずれか１項に記載のＧＨ結晶体の使用。１８）請求の範囲第１項に記載の結晶化方法を特徴とするＧＨの純化方法。