RO113529B1 - Procedeu de preparare a cristalelor de analog de insulina umana - Google Patents

Description

RO 113529 Bl 1

Prezenta invenţie se referă la un procedeu de preparare a cristalelor de analog de insulină umană, utilizat la purificarea şi fabricarea insulinei umane LysB28ProB29· care se foloseşte în tratamentul diabetului.

De la folosirea insulinei în anul 1920, s-au făcut eforturi continue pentru îmbunătăţirea tratamentului bolii diabetice. Progrese majore au fost făcute în domeniul purităţii insulinei şi a posibilităţilor de obţinere şi utilizare. De asemenea, au fost efectuate diferite formulări, care au perioade şi durate de activitate sau de acţiuni diferite. în ciuda acestor îmbunătăţiri şi ameliorări, terapia de injectare subcutanată nu a fost eliminată şi asigură pacientului o reglare comodă, convenabilă şi un control glicemic normal. Frecventele devieri peste nivelele normale ale glicemiei, de hiper-şi hipoglicemie, pe durata vieţii unui pacient, conduc la retinopatie, neuropatie, nefropatie şi micro- şi macroangiopatie.

Pentru a scăpa sau a evita nivelele extreme de glicemie, diabeticii practică deseori, terapia multiplei injectări, prin care insulina este administrată cu fiecare masă de prânz. Câteodată, această terapie nu este bine optimizată. Insulina comercială cu acţiunea cea mai rapidă conduce la obţinerea unor maxime, prea târziu după injectare şi, de asemenea, durează prea mult, până se obţine nivelul optim de glucoză. Recent a fost efectuat un efort considerabil, pentru obţinerea formulei insulinei şi a altor formule similare de analogi ai insulinei, care să modifice cinetica procesului de absorbţie subcutanată.

Deoarece, formulele farmaceutice comerciale ale insulinei conţin insulină, în stare neasociată, ca atare, şi predominant sub formă de hexamer cu zinc, se apreciază că, etapa de limitare a vitezei de absorbţie a insulinei din depozitul obţinut prin injecţiile subcutanate, în fluxul sangvin, cuprinde disocierea hexa-merului insulinei. Pentru accelerarea a-cestui procedeu de absorbţie, s-au dezvoltat analogii insulinei monomerice. A-ceşti analogi monomerici posedă o 2 acţiune mai rapidă, comparativ cu activitatea insulinei şi au o activitate biologică asemănătoare cu a insulinei umane naturale. Ei produc o absorbţie rapidă la locul şi în timpul injectării, şi cresc acţiunea insulinei într-o proximitate mai apropiată cu devierea glucozei postpran-dială asociată cu răspunsul la o masă.

Este cunoscută cristalizarea insulinei. Ea a fost cristalizată prima dată , în anul 1926, când Abel cristalizează insulina, în domeniul izoelectric, dintr-un a-mestec tampon sau o soluţie tampon cu brucină, piridină si acetat de amoniu (Abel J.J., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S. 12:132, 1926). Peterson ş.a., în Brevetul US 2920104, descrie cristalele de insulină şi procedeul de preparare al acestora.

Astăzi, procedeul acceptat din punct de vedere comercial, pentru cristalizarea insulinei, cuprinde ajustarea bazicităţii unei soluţii de insulină, care cuprinde 0,25 N acid acetic, aproximativ 2 g/l insulină şi 2 % zinc, la un pH de la 5,9 la 6,0, cu ajutorul unei baze, de preferinţă, hidroxid de sodiu ( Jens Brange, GALENICS OF INSULIN, Springer-Verlag, 1987). Mai important este faptul că, analogul monomeric LysK Pro -iu este supus unor condiţii, care permit insulinei umane să formeze cristale de zinc, nu doar a unei cristalizări.

In EP 0383472 este descris analogul monomeric Lys:: Pro: -insulină umană. Aceasta este o insulină ana-loagă, care este stabilă, mai puţin predispusă la dimerizare sau la o combinare cu ea însăşi. Lys1 Pro; -iu este o insulină umană, în care Pralina din poziţia 28 a lanţului B este substituită cu lizină, iar lizina din poziţia 29 a lanţului B este substituită cu pralină, aşa cum este descris în EP 0383472. în EP 0132770 sunt descrişi noi derivaţi de insulină şi procedee de preparare a acestor derivaţi. în EP 214826 sunt descrişi noi analogi ai insulinei şi motede de preparare a acestora. Metoda de preparare a analogilor de insulină umană, în care un precursor biosintetic cu formula RO 113529 Bl 3 4 generală : a- lanţ

n a- lanţ în care: Q„ este un lanţ peptidic, R este 15 Lys sau Arg, n este un număr întreg de la O la 33, care este reacţionat cu un L-treonină ester, în prezenţa tripsinei sau a unui derivat de tripsină urmată de conversia esterului treoninei obţinut al ana- 20 logului de insulină umană, în analogul de insulină umană.

Prepararea insulinei cristaline a fost intens studiată. Insulina umană comercială este cristalizată, în prezenţa a 25 0,25N acid acetic, 1,6 la 2,1 g/l insulină şi 2 % zinc la un pH de la 5,95 la 6,05. Cristalizarea are loc prin adăugarea unei baze, cum ar fi, hidroxidul de sodiu. Cel mai neaşteptat fapt este 30 acela că, LysB28ProB29-insulină umană solubilă nu poate fi cristalizată, în condiţiile cunoscute de preparare a cristalelor de insulină. l_ysB28ProB29-insulină umană este destinată minimalizării asocierii cu ea 35 însăşi şi agregării. Observaţia că Lys828 ProB29-insulină umană nu poate fi agregată a fost iniţial notată de Brems ş.a., Protein Engineering, 5:6, 527-533 (1992). O minimă asociere cu ea însăşi, 40 şi agregarea care determină ca, substanţa analogă să fie monomerică, se crede a fi responsabilă pentru eşecul lui LysB28ProB29-insulină umană, în condiţiile de cristalizare descoperite pentru insu- 45 lină.

LysB28ProB29-insulină umană poate fi preparată printr-o mare varietate de tehnici de sinteză, a peptidelor cunoscute, cuprinzând metode clasice (soluţii 50 clasice), metode în fază solidă, metode semisintetice şi, cel mai recent, metodele de recombinare AND. Astfel,

Chance et al, în EP 0383472 descrie prepararea LysB28ProB29-insulină umană.

Procedeele, mai sus- menţionate, conduc la obţinerea unei insuline nu de mare puritate, sunt mai complicate.

Procedeul, conform invenţiei, înlătură dezavantajele de mai sus, prin a-ceea că, el cuprinde: (A) . Adăugarea compusului fenolic la soluţia apoasă, care conţine Lys828 ProB29-insulină umană, în cel puţin 0,3 N până la 1N acid organic ales dintre, acid acetic, acid citric sau glicină; (B) . Ajustarea pH-ului de la aproximativ, 5,5 la aproximativ, 6,5 cu o bază; (C) . Adăugarea unei soluţii de sare de zinc, până la o concentraţie finală de aproximativ, 40 la aproximativ, 400 mg zinc per gram de LysB28ProB29-insulină umană.

Procedeul, conform invenţiei, prezintă mai multe avantaje: - modul de introducere a materiilor prime, nu este critic ca la procedeele cunoscute până acum; - se prepară cristale de o mare puritate şi cu un randament mare, pe scară largă; - cristalele obţinute prezintă o formă stabilă de depozitare în vrac, fiind o substanţă cu proprietăţi îmbunătăţite de depozitare şi distribuţie în operaţiunile de umplere/finisare.

Procedeul de obţinere a Lys828 ProB29-insulinei umane cristaline, conform invenţiei, cuprinde cristalizarea LysB2aProB29-insulinei umane dintr-o soluţie, care cuprinde LysB28ProB29-insu- RO 113529 Bl 5 lină umană, zinc, cel puţin G,3 N dintr-un acid organic ales dintr-uh grup constând, din acid citric sau glicină şi un acid fenolic, la un pH de la aproximativ, 5,5 la aproximativ, 6,5.

Invenţia descrie un procedeu de preparare a LysB28ProB29-insulină umană cristaline. Termenul '‘LysB28ProB29-insulină umană” sau “LysB28ProB29-i.u.” se referă la o insulină analogă, funcţionând stabil, care este mai puţin predispusă la dime-rizare sau la combinare cu ea însăşi.

Toate abrevierile aminoacizilor utilizate în această descriere sunt cele acceptate de Oficiul de Brevet SUA şi prezentate în 37 C.F.R. # 1.822 (b](2).

Termenul “fenolic” sau “derivat fenolic” utilizat aici, se referă la fenol, rezorcinol, m-crezol sau metil-p-hidroxi-benzoat sau amestecurile acestora.

Termenul “cristalizare" utilizat aici, se referă la formarea cristalelor de LysB2BProB29-insulină umană.

Termenul “bază tolerată din punct de vedere fiziologic” se referă la hidroxid de sodiu, hidroxid de potasiu şi hidroxid de amoniu. Preferabil, baza este hidroxid de amoniu.

Prezenta invenţie descrie condiţiile, în care LysB28ProB29-insulină u-mană cristalizează cu zinc şi cu un compus fenolic, pentru a forma o substanţă solidă, cristalină. Compuşii fenolici preferaţi, sunt aleşi dintr-un grup constând din, fenol, rezorcinol sau un amestec al acestora. Ambii, zincul şi compusul fenolic sunt componentele de bază pentru realizarea cristalizării. □ soluţie de l_ysB28ProB29-insulină umană este preparată prin dizolvarea insulinei analoage într-un diluent apos. Concentraţia soluţiei de LysB28Pro829-insulină umană este de aproximativ 1,8 g/l până la aproximativ 2,5 g/l. Preferabil, concentraţia substanţei analoage este de 2 g/l. Dizolvarea poate fi ajutată prin aceea că, este cea utilizată la dizolvarea unui acid, de exemplu, pH scăzut, de aproximativ 3,0 până la 3,5, cu un acid tolerat din punct de vedere fiziologic, de preferinţă, acidul clorhidric. Alţi acizi toleraţi din punct de vedere 6 fiziologic sunt acidul acetic, acidul citric şi acidul fosforic.

Concentraţia acidului organic ales dintr-un grup constând din acidul acetic, acidul citric sau glicină este de cel puţin 0,3 N, sub această concentraţie rezultă un produs puternic amorf. De preferinţă, LysB28ProB29-insulină umană este dizolvată în aproximativ, 0,8 la aproximativ, 1,2 N acid acetic, preferabil, 1 N acid acetic.

Concentraţia zincului adăugat este astfel calculată, încât concentraţia finală este de aproximativ ,40 mg până la aproximativ, 400 mg per gram din substanţa analoagă. Zincul este adăugat, de preferinţă, sub forma unei sări. Exemplele reprezentative de săruri de zinc cuprind acetat de zinc, bromură de zinc, clorură de zinc, fluorură de zinc, iodură de zinc şi sulfat de zinc.

Se pot utiliza şi alte săruri de zinc. De preferinţă, acetatul de zinc sau clo-rura de zinc se folosesc, deoarece a-ceste săruri nu pot adiţiona noi ioni chimici, la procedeele acceptate comercial. Concentraţia optimă de zinc la cristalizare este de, la aproximativ, 100 până la 300 mg per gram de LysB2B ProB29-insulină umană.

Condiţiile de cristalizare sunt în funcţie de compusul fenolic, baza utilizată şi concentraţia zincului. Condiţiile optime, pentru fiecare combinaţie fenol-bază, variază în diferite intervale. De preferinţă, compusul fenolic este fenol la o concentraţie de aproximativ, 0,15 % până la aproximativ, 0,25 % (v/v, concentraţie finală). Preferabil, compusul fenolic este fenol la o concentraţie de 0,2 %.

Modul, în care LysB28ProB29-insu-lină umană este dizolvată în soluţie sau ordinea, în care compusul fenolic, zincul şi LysB28ProB29-insulină umană sunt adăugate în soluţie, nu este critică în actualul procedeu. Câteodată este critică interacţiunea compusului fenolic cu Lys828 ProB29-insulină umană, sub punctul izo-electric al LysB28ProB29-insulină umană. Prin urmare, cristalizarea poate fi iniţiată, fie prin adăugarea zincului sau, fie RO 113529 Bl 7 prin ajustarea bazicităţii soluţiei cu un acid de la un pH de aproximativ, 5,5 la un pH de 6,5, cu adăugarea unei baze tolerate din punct de vedere fiziologic. Bazele tolerate, din punct de vedere fiziologic sunt, hidroxidul de sodiu, hi-droxidul de potasiu şi hidroxidul de a-moniu. Este preferabil, ca baza să fie, hidroxidul de amoniu.

Cristalizarea poate fi dusă la bun sfârşit, prin ajustarea bazicităţii la o soluţie care conţine LysB28ProB29-inşulină umană, zinc, cel puţin, 0,3 N acid organic ales dintr-o grupă constând, din acid acetic, acid citric sau glicicnă, şi un compus fenolic, la un pH de la aproximativ, 5,5 la aproximativ, 6,5, cu o bază acceptabilă, din punct de vedere fiziologic. De preferinţă, pH-ul soluţiei este ajustat de la aproximativ, 5,9 la 6,2. Cristalele sunt formate când se ajustează pH-ul.

Cel mai preferabil, dizolvarea lui LysB28ProB29-insulină umană are loc la aproximativ , 1N acid acetic [ dacă este necesar, pH-ul se poate ajusta la 3,0 ...3,5). Se adaugă apoi, compusul fenolic în soluţie şi are loc echilibrarea. pH-ul soluţiei este ajustat la aproximativ, 5,5 la aproximativ, 6,5 cu ajutorul unei baze acceptabile din punct de vedere fiziologic. De preferinţă, baza este hidroxidul de amoniu, iar pH-ul este ajustat de la aproximativ, 5,9 la 6,2. Cristalizarea este apoi, iniţiată prin adăugarea zincului.

Folosind alt reactiv pentru cristalizare, se pot obţine cristale cu, sau fără agitare, ce pot fi colectate şi spălate. Preferabil, cristalizarea este finalizată prin agitare. LysB28ProB29-insulină umană poate fi recristalizată, dacă este necesar, prin filtrare. Cristalele sunt colectate şi uscate prin metode convenţionale. Dacă cristalele sunt colectate prin filtrare, zincul se poate adăuga în mod suplimentar la filtrat sau la soluţia mamă, iar în continuare are loc recuperarea LysB28ProB29-insulină umană. Procedeul de cristalizare nu poate determina agregarea cinetică a materialului.

Temperatura de cristalizare nu 8 este critică. Domeniul acceptabil pentru temperatură este de la aproximativ, 4°C la aproximativ, 26°C. Preferabil, temperatura este cuprinsă între 22°C şi aproximativ, 24°C. în continuare, se dau următoarele exemple de realizare a procedeului, conform invenţiei.

Exemplul 1 .într-un procedeu curent, 846,5 g LysB28ProB29-insulină u-mană în 116 I soluţie tampon de acid acetic se diluează la o absorbanţă de 276 nm la 2,25 cu apă purificată (260,6 I) şi acid acetic glacial ( 19,44 I) într-un cilindru din oţel inoxidabil, la o concentraţie finală a acidului acetic de 1N. Se adaugă fenol lichid la o soluţie de 2 ml/l (792 ml total] şi pH-ul soluţiei rezultate este sub 3. Soluţia este ajustată la un pH de 6,01 prin adăugarea a 24 I hidroxid de amoniu şi apoi este încălzită la 22°C. După încălzire, se adaugă o soluţie de clorură de zinc de 5,35 I (2 % gr/vîn apă). pH-ul soluţiei este în limita dorită ( 5,9...6,1), iar soluţia se agită, timp de 12 h. Soluţia este răcită la 8°C, se opreşte agitarea, iar cristalele vor fi ordonate timp de 18 h, la o temperatură cuprinsă între 2 şi 8°C. După ce cristalele s-au ordonat, se decantează 37Q I lichid supernatant, iar restul de lichid supernatant şi stratul de cristale sunt transferate într-un cilindru mai mic, pentru o sedimentare adiţională, utilizând o parte din lichidul supernatant decantat pentru a clăti cilindrul original. După 14 h, timp de sedimentare, se decantează 61 I lichid supernatant rămânând un rest de aproximativ, 9 I de strat u-med de cristale şi lichid supernatant.

Cristalele sunt suspendate, în a-cest volum şi sunt centrifugate o dată, într-o centrifugă de 6 I din sticlă, la o viteză de 4000 rot/min ( aproximativ 4000 x G), într-un aparat DPR 6000, timp de 45 min. După încărcări sunt necesare 6 flacoane pentru a introduce cristalele. Cristalele ( aproximativ 250 ml per flacon) sunt suspendate în 500 ml apă purificată într-un vas de sticlă din centrifugă şi recentrifugat la o viteză de 4000 rot/min, timp de 45 min. Crista- RO 113529 Bl 9 lele sunt apoi, resuspendate în vasul de sticlă din centrifugă în aproximativ, 5GO ml alcool absolut SD nr. 3A, răcit la o temperatură de 2...8°C, per vasul de sticlă şi recentrifugat la o viteză de 4GQ rot/min, timp de 15 min. Alcoolul central este decantat, iar alcoolul este spălat de două ori. Cu alcool sunt spălate cristalele ( 1,9 kg greutate umede), care sunt uscate sub vacuum.

Exemplul 2. O soluţie de LysB2B ProB29-insulină umană de aproximativ, 2 g/l este preparată la o concentraţie finală de 1N acid acetic ( după cum a fost determinat prin absorbanţă la 280 nm). Adăugarea de fenol lichid ( 3,3 ml/l soluţie) la o soluţie urmată de ajustarea pH-ului la 5,9...6,2, folosind hi-droxid de amoniu concentrat şi adăugarea de clorură de zinc de 2 % (gr./v) sau 20 % ( gr./v) în soluţie, la o concentraţie finală de 40...160 mg clorură de zinc per gram de l_ysB28ProB29-insulină umană. Cristalele rezultate sunt lăsate să sedimenteze, iar soluţia-mamă este recuperată prin decantare urmată de centrifugare. Cristalele sunt spălate prin suspendare secvenţială şi centrifugare în apă, iar, în final, în alcool etilic absolut, înaintea uscării sub vaccum. □ a doua recoltă sau cultură de cristale, poate fi generată prin adăugare de zinc la soluţia-mamă la o concentraţie de 160 mg/l de LysB28ProB29-insulină umană.

Exemplul 3. 222 mg de LysB28 ProB29-insulină umană este dizolvată în 100 ml de Mili-Q apă. Soluţia conţine 2.0 mg de LysB28ProB29-insulină umană per ml soluţie prin analiză HPLC. Soluţia este limpezită sau decantată prin adăugarea de 10 % acid clorhidric pentru a o ajusta la un pH de 3,0. 5 ml alicotă sunt extrase şi puse în acid acetic 1N, prin adăugare de acid acetic glacial, iar pH-ul este sub 3,5. 10 ml de fenol lichid urmate de 6 ml de soluţie de clorură de zinc ( 20 % gr./v în apă) sunt adăugate la fiecare mostră. pH-ul este ajustat la 6.0 prin adăugarea unui hidroxid de amoniu concentrat, hidroxid de sodiu (10 % gr./v) sau hidroxid de potasiu (10 % soluţie gr./v). Soluţiile sunt agitate, 10 timp de aproximativ, 15 min, iar, apoi sunt menţinute în repaus, acoperite, la temperatura camerei. După aproximativ 2 h, se observă cristale romboedrice, în toate cele trei soluţii, cristalele formân-du-se cel mai rapid, în soluţia ajustată cu hidroxid de potasiu.

Exemplul 4.Aproximativ 42 mg de LysB28ProBa9-insulină umană sunt dizolvate, în 20 ml apă Mili-Q, care conţine 1,2 ml acid acetic glacial. O cantitate de 44 ml de fenol lichid este adăugată la prima mostră şi 34 ml de fenol lichid se adaugă la a doua mostră. în ambele cazuri, pH-ul este ajustat la 6,0 prin adăugarea unui hidroxid de amoniu concentrat, urmată de adăugarea a 45 pl soluţie de clorură de zinc ( 20 % gr./v în apă). Soluţia este agitată, timp de aproximativ 5 min, după care se ţine în repaus, acoperită, la temperatura camerei. După aproximativ 24 h sunt observate cristale romboedrale, bine definite.

Exemplul 5. 222 mg de LysB2B ProB29-insulină umană este dizolvată în 100 ml de Mili-Q apă, iar soluţia conţine 2,0 mg de LysB28ProB29-insulină umană per ml soluţie prin analiză HPLC. Soluţia este limpezită sau decantată prin adăugarea de 10 % acid clorhidric pentru a ajusta la un pH de 3,0. 4 alicote de 5 ml alicotă sunt extrase şi puse în acid acetic 1N, prin adăugare de acid acetic glacial, iar pH-ul este sub 3,5. Se adaugă oricare dintre m-crezol (12 pl), fenol (10 μΙ], rezorcinol ( 2,1 μΙ) la o soluţie de 100 mg/ml, în apă sau metil para-ben (1,6 ml soluţie de 10 mg/l în apă), se adaugă la un alicot, generând cristalizarea soluţiilor, având un raport molar similar de peptide la compus fenolic. 6 μΙ de soluţie de clorură de zinc (20 % gr./v în apă) se adaugă la fiecare mostră, iar pH-ul este ajustat la 6,0 cu hidroxid de amoniu concentrat. Soluţiile sunt agitate, timp de aproximativ 15 min, iar, apoi sunt menţinute în repaus, acoperite, la temperatura camerei. După aproximativ 24 h, se observă cristale romboedrice, bine definite, în soluţiile conţinând fenol. Soluţia, care conţine metilparaben, produce câteva

Claims (5)

1. RO 113529 Bl 11 cristale slab definite. Soluţiile, care conţin m-crezol şi rezorcinol ,nu pot produce cristale în aceste condiţii. Un procedeu similar se realizează folosind, o zecime din cantitatea de rezorcinol şi ajustând cu hidroxid de sodiu (10 % gr./v soluţie) rezultând cristale romboedrice, bine definite. Acest exemplu demonstrează că, prin optimizarea condiţiilor, cristalele pot fi formate cu compuşi fenolici. Exemplul G. 222 mg de LysB2B ProB29-insulină umană este dizolvată în 100 ml de Mili-Q apă şi soluţia conţine 2,0 mg de LysB28ProBa9-insulină umană per ml la soluţia pentru analiză HPLC. Soluţia este limpezită sau decantată prin adăugarea de 10% acid clorhidric pentru a o ajusta la un pH de 3,0. 5 ml alicotă sunt extrase şi puse în acid acetic 0,25N, prin adăugare de acid acetic glacial, iar pH-ul este sub 3,5. Se a-daugă 20 pl soluţie de clorură de zinc (2 % gr./v în apă) în mostră. pH-ul este ajustat la 6,0 prin adăugarea unui hidroxid de amoniu concentrat. Soluţia este agitată, timp de aproximativ ,15 min, iar apoi, este menţinută în repaus, acoperită, la temperatura camerei. După aproximativ 24 h, nu se observă cristale în soluţie, dar se depune un precipitat amorf pe fundul vasului de sticlă. Pentru verificare, se extrag 5 ml alicotă şi se supun procedeului cu hidroxid de amoniu descris în exemplul 1. Se formează cristale romboedrice bine definite de LysB28ProB29-insulină umană. Când insulina umană ( 2,3 mg/ml în a-cid acetic 1N) este supusă condiţiilor descrise în exemplul 1, în care se utilizează hidroxid de amoniu, nu se formează cristale în 7 zile. Aceste experiemnte demonstrează faptul că, condiţiile de rutină folosite în cristalizarea insulinei umane biosintetice sunt improprii pentru cristalizarea LysB28ProB29-insulină umană şi, în mod similar, condiţiile descrise pentru cristalizarea LysB28ProB29-insulină umană, nu pot produce cristale de insulină u-mană. Exemplul 7. în mod analog exem- 12 plului 1, cristalizarea este dusă la bun sfârşit prin înlocuirea acidului acetic 1N cu acid citric 1N. Cristalizarea conduce la cristale bine definite de l_ysB28Pro829-insulină umană. Revendicări 1. Procedeu de preparare a cristalelor de analog monomeric Lys628 ProB29-insulină umană dintr-o soluţie a-poasă, care conţine l_ysB2aProB29-insulină umană, zinc, acid organic, compus feno-lic, caracterizat prin aceea că cuprinde: (A) . Adăugarea compusului fenolic la soluţia apoasă care conţine Lys828 ProB29-insulină umană în cel puţin 0,3 N până la 1N acid organic ales dintre acid acetic, acid citric sau glicină; (B) . Ajustarea pH-ului de la aproximativ, 5,5 la aproximativ, 6,5 cu o bază; (C) .Adăugarea unei soluţii de sare de zinc până la o concentraţie finală de aproximativ, 40 la aproximativ, 400 mg zinc per gram de LysB28ProB29-insulină u-mană,
2. 2. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că , concentraţia soluţiei apoase în LysB28ProB29-in-sulină umană este de la aproximativ 1,8 până la aproximativ 2,5 g/l; compusul fenolic este fenol; concentraţia soluţiei în zinc este de la aproximativ 40 mg/mg de LysB28ProB29-insulină umană până la aproximativ 400 mg/mg de Lys828 ProB29-insulină umană.
3. 3. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, concentraţia în fenol a soluţiei apoase este de la aproximativ, 0,15% până la 0,25% la un volum de bază.
4. 4. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, pH-ul soluţiei este de la 5,9 la 6,2.
5. 5. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că cuprinde: (A). Adăugarea compusului fenolic la soluţia apoasă, care conţine Lys828 Pro829-insulină umană de concentraţie de RO 113529 Bl 13 14 la aproximativ 1,8 până la 2,5 g/l Lys828 ProB29-insulină umană în 1 N acid a- cetic; (B), Ajustarea pH-ului de la aproximativ, 5,9 la aproximativ, 6,2 cu hi- 5 droxid de sodiu; (C).Adăugarea unei soluţii de sare de zinc până la o concentraţie finală de la aproximativ, 40 la aproximativ, 400 mg zinc per gram de l_ysB28ProB29-insu-lină umană. Preşedintele comisiei de examinare: ing.Marin Elena Examinator: ing.Puşcaş Corina / \ Editare şi t Tipărit la: C ehnoredactare computerizată - OSIM ficiul de Stat pentru Invenţii şi Mărci Editura Editare şi tehnoredactare computerizată - OSIM Tipărit la: Oficiul de Stat pentru Invenţii şi Mărci