PL180968B1 - Sposób wytwarzania krystalicznej Lys Pro insuliny ludzkiej - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania krystalicznej LysB 2 8 ProB 2 9 - insuliny ludzkiej, znamienny tym, ze krystalizuje sie LysB 2 8 ProB 2 9 - insuline ludzka z roztworu zawierajacego LysB 2 8 ProB -insu- line ludzka, cynk, co najmniej 0,3 N kwas organiczny wybrany z grupy obejmujacej kwas oc- towy, kwas cytrynowy i glicyne oraz zwiazek fenolowy, przy pH okolo 5,5 - 6,5. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania krystalicznego analogu insuliny. Sposób jest przydatny przy oczyszczaniu i wytwarzaniu LysB28Pro^B29-insuliny ludzkiej. Lys^Pro^-insulina ludzka jest przydatna w leczeniu cukrzycy.

Od wprowadzenia insuliny w latach 1920 obserwuje się stały postęp w leczeniu cukrzycy. Główne osiągnięcia dotyczą czystości i dostępności insuliny. Opracowano szereg preparatów o różnych czasach działania. Pomimo tych osiągnięć podskórne wstrzykiwanie w dalszym ciągu nie umożliwia pacjentowi wygodnego regulowania i zapewnienia prawidłowego poziomu cukru. Częste odchylenia od normalnych poziomów cukru w życiu pacjenta prowadzą do hiper- lub hipoglikemii oraz dalszych komplikacji takichjak retynopatia, neuropatia, nefropatia oraz mikroi makroangiopatia.

Aby uniknąć krańcowych poziomów cukru diabetycy często stosują terapię wielokrotnej iniekcji, dzięki czemu insulinajest podawana wraz z każdym posiłkiem. Jednakże jak dotychczas terapie ta nie została zoptymalizowana. Najszybciej działająca insulina dostępna na rynku osiąga poziom szczytowy zbyt późno po iniekcji, a ponadto poziom taki trwa zbyt długo, aby można było w sposób optymalny regulować poziom glukozy. Ostatnio nasiliły się badania nad opracowaniem preparatów insuliny i preparatów analogów insuliny, które zmieniająkinetykę wchłaniania podskórnego.

W związku z tym, że wszystkie dostępne w handlu farmaceutyczne preparaty insuliny zawierają insulinę w postaci samozasocj owanej, a przede wszystkim w postaci heksameru cynkowego, uważa się, że etapem limitującym szybkość wchłaniania insuliny z podskórnie wstrzykniętego depotu do krwioobiegu jest dysocjacja samo-zagregowanego heksameru insuliny. W celu przyspieszenia tego wchłaniania opracowano monomeryczne analogi insuliny. Takie monomeryczne analogi uaktywniają się stosunkowo szybciej niż insulina, zachowując przy tym aktywność biologiczną naturalnej insuliny ludzkiej. Zapewniają one szybkie wchłanianie zaraz po wstrzyknięciu oraz osiągnięcie szczytowej aktywności przez insulinę w okresie bardziej zbliżonym do skoku poziomu glukozy spowodowanego spożyciem posiłku.

Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania kryształówjednego z monomerycznych analogów, LysB28ProB²⁹-insuliny nidzkiej (LysB28ProB29-hI). LysB28ProB29-hI ujawniona

180 968 została w publikacji patentowej europejskiej nr 383 472. Jednakże w opisie tym nie ujawniono możliwego do zastosowania w skali technicznej sposobu wytwarzania krystalicznej Lys^B28Pro^B29-hI.

Krystalizacja insuliny jest dobrze znana. Pierwsze odkrycia pochodzą z 1926 roku, gdy Abel krystalizował insulinę w obszarze izoelektrycznym z roztworu buforowanego brucyną, pirydynąi octanem amonu. J.J. Abel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 12:132 (1926). W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 920 104 ujawniono kryształy i preparaty insuliny oraz sposoby ich wytwarzania. Obecnie w skali technicznej krystalizacja insuliny obejmuje nastawianie zasadowości roztworu insuliny zawierającego 0,25 N kwas octowy, około 2 g/litr insuliny i 2% cynku do pH 5,9-6,0 za pomocą zasady, korzystnie wodorotlenku amonowego. Jens Brange, Galenics ofInsulin, Springer-Verlag (1987). Należy zaznaczyć, że w warunkach umożliwiających wytwarzanie kryształów insuliny ludzkiej z cynkiem LysB2⁸ProB2^?-hI nie krystalizuje.

Przedmiotem wynalazku jest sposób krystalizacji LysB2⁸ProB2⁹-hI, unikatowy dla tej cząsteczki, to znaczy w takich warunkach, w których insulina ludzka nie krystalizuje. Sposób umożliwia wytwarzanie z wysoką wydajnością kryształów insuliny cynkowej w dużej skali. Kryształy stanowią stabilną, stałąpostać cząsteczki. Krystaliczne substancje stałe są szczególnie dogodne, gdyż możnaje łatwo analizować i oczyszczać, a ponadto stanowiądogodniejsząpostać farmaceutyczną niż bezpostaciowe substancje stałe. W związku z tym sposób nadaje się do wykorzystania w skali przemysłowej.

Według wynalazku sposób wytwarzania krystalicznej LysB2⁸ProB29-insuliny ludzkiej polega na tym, że krystalizuje się Lys^B28ProB29_insulinę ludzkąz roztworu o pH .od około 5,5 do około 6,5 zawierającego l.ysB-²⁸ProB²⁹-insulinę ludzką, cynk, co najmniej 0,3 N kwas organiczny wybrany spośród kwasu octowego i cytrynowego oraz glicyny, a także związek fenolowy.

Jak to zaznaczono wyżej, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania krystalicznej LysB28P_roB29-insuliny ludzkiej. Określenie „LysB28ProB²9-insulina ludzka” lub „LusB28ProB29_hi” oznacza szybko działający analog insuliny, mniej podatny na dimeryzację i asocjację. Lys^B2sProB29-hl stanowi insulinę ludzką, w której prolina w pozycji B28 łańcucha B została zastąpiona lizyną, a lizyna w pozycji B29 łańcucha B została zastąpiona prolirną, jak to ujawniono w publikacji patentowej europejskiej nr 383 472.

Wszystkie skróty aminokwasów użyte w opisie stanowią skróty zaakceptowane przez Urząd Patentowy i Znaków Towarowych Stanów Zjednoczonych, jak to podano w 37 C.F.R. § 1.822(b) (2).

W użytym znaczeniu określenia „związek fenolowy” lub „pochodna fenolu” oznaczają łącznie fenol, rezorcynę, m-krezol - p-hydroksybenzoesan metylu oraz ich mieszaniny.

Określenie „krystalizacja” odnosi się do powstawania kryształów LysB²8ProB29-insuliny ludzkiej.

Określenie „fizjologicznie tolerowana zasada” jest dobrze znane. Do fizjologicznie tolerowanych zasad należy wodorotlenek sodowy, wodorotlenek potasowy i wodorotlenek amonowy. Korzystnie zasadę stanowi wodorotlenek amonowy.

Powstawanie krystalicznej insuliny zostało obszernie przebadane. Insulinę ludzką krystalizuje się w skali technicznej z roztworu zawierającego 0,25 N kwas octowy, 1,6-2,1 g/litr insuliny oraz 2% cynku, przy pH 5,95-6,05. Krystalizacja przebiega w wyniku doprowadzenia roztworu ze stanu kwaśnego do stanu krystalizacji za pomocą zasady, zazwyczaj wodorotlenku sodowego. Nieoczekiwanie rozpuszczalna LysB28ProB29-hI nie krystalizuje w znanych warunkach wytwarzania kryształów insuliny. L-ysB^2SPro^U29-hI została tak skonstruowana, aby ograniczyć do minimum samoasocjację i zbrylanie. Fakt, że LysB28ProB29-hI nie ulega agregacji, został po raz pierwszy zauważony przez Bremsa i innych, Protein Engineering, 5: 6, 527-533 (1992). Uważa się, że taka minimalna samoasocjacja i agregacja powodująca występowanie analogu w postaci monomeru, jest przyczyną tego, że LysB28Pro^B29-hI nie krystalizuje w warunkach ustalonych dla krystalizacji insuliny.

Ustalono warunki, w jakich LysB28ProB29-hI krystalizuje z cynkiem i związkiem fenolowym tworząc stabilną. krystaliczną substancję stałą. Korzystny związek fenolowy wybrany jest

180 968 spośród fenolu, rezorcyny i ich mieszanin. Obecność zarówno cynku jak i związku fenolowego wywiera decydujący wpływ na zajście krystalizacji.

Roztwór Lys^B28Pro^B29-hł wytwarza się rozpuszczając analog insuliny w wodnym rozcieńczalniku. Stężenie L-ys^H28ProB²9-hI wynosi od około 1,8 do około 2,5 g/litr-. Najkorzystniej stężenie analogu wynosi około 2 g g/litr. Rozpuszczanie można ułatwić przeprowadzając tak zwane rozpuszczanie na kwaśno, to znaczy obniżając pH do około 3,0-3,5 za pomocą fizjologicznie tolerowanego kwasu, korzystnie kwasu solnego. Do innych fizjologicznie tolerowanych kwasów należy kwas octowy, kwas cytrynowy i kwas fosforowy.

Stężenie kwasu organicznego wybranego spośród kwasu octowego i cytrynowego oraz glicyny jest co najmniej 0,3 N; przy stężeniu niższym od 0,3 N powstają głównie produkty bezpostaciowe. Korzystnie LysB28proB29-hł rozpuszcza się w około 0,8-1,2 N kwasie octowym, a najkorzystniej w 1,0 N kwasie octowym.

Cynk dodaje się w takiej ilości, aby jego ostateczne stężenie wynosiło od około 40 do około 400 mg/g analogu. Cynk korzystnie dodaje się w postaci soli. Do typowych przykładów soli cynku należy octan cynku, bromek cynku, chlorek cynku, fluorek cynku, jodek cynku i siarczan cynku. Dla specjalisty zrozumiałe jest, że istnieje wiele innych soli cynku, które można zastosować zgodnie ze sposobem według wynalazku. Korzystnie stosuje się octan cynku lub chlorek cynku, gdyż sole takie nie wprowadzająnowychjonów do procesu, który można wykorzystać w skali technicznej. Optymalne stężenie cynku w czasie krystalizacji wynosi od około 100 do około 300 mg/g LysB2⁸ProB29-hł.

Przebieg krystalizacji jest wrażliwy na obecność związku fenolowego i zasady oraz stężenie cynku. Oznacza to, że specjalista powinien odpowiednio nastawić parametry określone w opisie, aby uzyskać dobrze wykształcone kryształy. Optymalne warunki dla każdej kombinacji związek fenolowy-zasada wahają się w ujawnionych zakresach. Korzystnym związkiem fenolowym jest fenol stosowany w stężeniu od około 0,15 do około 0,25% objęt. (stężenie ostateczne). Jeszcze korzystniejsze jest stężenie fenolu 0,2%.

Sposób, w jaki Lys^B2⁸ProB29-hł rozpuszcza się w roztworze oraz kolejność, w jakim związek fenolowy, cynk i LysB28ProB²⁹-hł wprowadza się do roztworu, nie ma istotnego znaczenia z punktu widzenia sposobu według wynalazku. Bardzo ważne jest natomiast to, aby związek fenolowy oddziaływał z LysB28ProB29-hł poniżej punktu izoelektrycznego LysB28ProB29_hl. W związku z tym krystalizację można zainicjować dodając cynk lub nastawiając zasadowość roztworu od odczynu kwaśnego do pH około 5,5-6,5 w wyniku dodania fizjologicznie tolerowanej zasady. Do fizjologicznie tolerowanych zasad należy wodorotlenek sodowy, wodorotlenek potasowy i wodorotlenek amonowy. Korzystną zasadą jest wodorotlenek amonowy.

Krystalizację można przeprowadzić nastawiając zasadowość roztworu zawierającego LysB²8Pro^B29-insulinę ludzką, cynk, co najmniej 0,3 N kwas organiczny wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas cytrynowy i glicynę, oraz związek fenolowy do pH około 5,5-6,5, za pomocą fizjologicznie tolerowanej zasady. Korzystnie pH nastawia się do około 5,9-6,2. Kryształy tworzą się przy nastawianiu pH.

Jeszcze korzystniej LysB28ProB29-hł rozpuszcza się w około 1N kwasie octowym (w razie potrzeby, aby ułatwić rozpuszczanie, pH można doprowadzić do 3,0-3,5). Następnie do roztworu dodaje się związek fenolowy i całość pozostawia się do ustalenia równowagi. pH roztworu doprowadza się do około 5,5-6,5 za pomocą fizjologicznie tolerowanej zasady. Korzystną zasadą jest wodorotlenek amonowy, apH doprowadza się do około 5,9-6,2. Krystalizację inicjuje się dodając cynk.

Przy przeprowadzeniu krystalizacji w dowolny sposób kryształy tworzą się zarówno przy stosowaniu mieszania jak i bez mieszania, po czym można je zebrać i przemyć. Korzystnie krystalizację przeprowadza się z mieszaniem. W razie potrzeby Lys^Pro^-hł można rekrystalizować, aby ułatwić sączenie. Kryształy można zebrać i wysuszyć w zwykły sposób. Jeśli kryształy odsącza się, dodatkową ilość cynku można wprowadzić do przesączu lub ługu macierzystego w celu odzyskania większej ilości LysB28Pro^B29-hł. Sposobem według wynalazku wytwarza się w skali technicznej kryształy o wysokiej jakości i z dużą wydajnością. Kryształy stanowią stabilną

180 968 postać masowo produkowanego leku, którym można łatwo manipulować i stosować w operacji napełniania i wykańczania. Sposób krystalizacji nie wpływa na czystość i kinetykę agregacji materiału.

Temperatura krystalizacji nie jest parametrem o decydującym znaczeniu. Dopuszczalny jest zakres temperatur od około 4 do około 26°C. Korzystnie temperatura wynosi około 22-24°C.

Lys^B28Pro^B29hI wytwarzać można dowolnym ze znanych sposobów syntezy peptydów obejmujących sposoby klasyczne (w roztworze), sposoby w fazie stałej, sposoby półsyntetyczne oraz wprowadzone ostatnio sposoby rekombinacji DNA. Sposób wytwarzania LysB2⁸ProB29-insuliny ludzkiej przedstawiono np. w publikacji patentowej europejskiej nr 383 472.

Poniższe przykłady podano jedynie w celu zilustrowania wytwarzania analogów insuliny sposobem według wynalazku. Nie należy uważać, że zakres wynalazku jest w jakikolwiek sposób ograniczony poniższymi przykładami.

Przykładl . Strumień procesowy zawierający 846,5 g LysB28p_roB29-hI w 116 litrach kwasu octowego jako buforu rozcieńczono do uzyskania absorbancji 2,25 przy 276 nm dodając oczyszczonąwodę (260,6 litra) i lodowaty kwas octowy (19,44 litra) w zbiorniku ze stali nierdzewnej, do uzyskania ostatecznego stężenie kwasu octowego 1N. Do roztworu dodano ciekły fenol w ilości 2 ml/litr (łącznie 792 ml), po czym stwierdzono, że pH roztworujest poniżej 3. Roztwór nastawiono na pH 6,01 dodając 24 litry wodorotlenku amonowego i ogrzano go do 22°C. Po ogrzaniu dodano 5,35 litra roztworu chlorku cynku (2% wag./objęt. w wodzie). Ponownie sprawdzono, że pH roztworu jest w pożądanym zakresie (5,9-6,1) i roztwór mieszano przez 12 godzin. Roztwór schłodzono do 8°C, mieszanie przerwano i roztwór pozostawiono na 18 godzin w 2-8°C do opadnięcia kryształów. Po opadnięciu kryształów 370 litrów supernatantu zdekantowano, a resztę supernatantu z kryształami przeniesiono do mniejszego zbiornika, aby zapewnić dokładniejsze opadnięcie kryształów, stosując część zdekantowanego supernatantu do przemycia pierwszego zbiornika. Po odstawieniu na 14 godzin 61 litrów supernatantu zdekantowano uzyskując około 9 litrów wilgotnego złoża kryształów z supematantem.

Wytworzonązawiesinę kryształów odwirowano wól -litrowych butelkach do wirowania z szybkością4000 obrotów/minutę (około 4000 x G) w wirówce DPR6000 przez około 45 minut. Konieczne było dwukrotne napełnianie, aby pomieścić całą zawiesinę kryształów w 6 butebkach. Ciecz ze środka zdekantowano. Kryształy (około 250 ml/butelkę) zawieszono dodając do każdej butelki do wirowania 500 ml oczyszczonej wody i butelki ponownie odwirowano przy 4000 obrotów/minutę przez 45 minut. Kryształy zawieszono następnie dodając do każdej butelki do wirowania około 500 ml zimnego (2-8°C) absolutnego alkoholu wysuszonego sitami molekularnymi 3A, po czym butelki ponownie odwirowano przy 4000 obrotów/minutę przez 15 minut. Alkohol ze środka zdekantowano, po czym przemywanie alkoholem powtórzono jeszcze dwukrotnie. Wilgotne kryształy przemyte alkoholem (1,9 kg) wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

Przykładl I. Roztwór zawierający około 2 g/litr LysB28ProB29-hI doprowadzono do ostatecznego stężenia 1M kwasu octowego (oznaczonego na podstawie absorbancji przy 280 nm). Do roztworu dodano ciekły fenol (3,3 ml/litr roztworu), po czym pH nastawiono na 5,9-6,2 stężonym wodorotlenkiem amonowym i dodano chlorek cynku w postaci 2% wag./objęt. lub 20% wag./objęt. roztworu, do uzyskania ostatecznego stężenia chlorku cynku 40-160 mg/g LysB28ProB29-hl. Uzyskane kryształy pozostawiono do opadnięcia, po czym ług macierzysty zdekantowano, a następnie odwirowano. Kryształy przemyto kolejno zawieszając je i przeprowadzając wirowanie z zastosowaniem wody, a na koniec absolutnego etanolu, po czym przeprowadzono suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem. Drugi rzut kryształów można uzyskać dodając cynk do ługu macierzystego w ilości do 160 mg/g LysB28ProB29-hI.

Przykład III. Lys^B28ProB29-insulinę ludzką (222 mg) rozpuszczono w 100 ml wody Milli-Q. Na podstawie analizy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) stwierdzono, że zawiera on 2,0 mg Lys^N28ProB29-hI/ml. Roztwór sklarowano doprowadzając pH do około 3,0 za pomocą 10% HCl. Pobrano 4 próbki po 5 ml i stężenie kwasu octowego doprowadzono do 1N dodając lodowaty kwas octowy. Sprawdzono, że pH jest poniżej 3,5. Do każdej

180 968 próbki dodano po 10 μΐ ciekłego fenolu, a następnie 6 μΐ 20% wag./objęt. roztworu chlorku cynku w wodzie. pH doprowadzono do 6,0 dodając stężony wodorotlenek amonowy, wodorotlenek sodowy (10% wag./objęt.) lub wodorotlenek potasowy (10% wag./objęt.). Roztwory mieszano przez około 15 minut, po czym odstawiono pod przykryciem w temperaturze pokojowej. Po około 2 godzinach we wszystkich trzech roztworach zaobserwowano dobrze wykształcone kryształy romboedryczne, przy czym najszybciej kryształy powstały w roztworze nastawianym za pomocą wodorotlenku potasowego.

Przykład IV. Około 42 mg Lys^B28Pro^B29-hI rozpuszczono w 20 ml wody Milli-Q zawierające 1,2 ml lodowatego kwasu octowego. Do pierwszej próbki dodano 44 pl ciekłego fenolu, a do drugiej próbki 34 pl ciekłego fenolu. W obydwu przypadkach pH nastawiono na 6,0 dodając stężony wodorotlenek amonowy, po czym dodano po 45 pl 20% wag./objęt. roztworu chlorku cynku w wodzie. Roztwór wymieszano przez około 5 minut, a następnie odstawiono pod przykryciem w temperaturze pokojowej. Po około 24 godzinach zaobserwowano dobrze wykształcone kryształy romboedryczne.

PrzykładV. 1 w^^PnC^-insulinę ludzką (222 mg) rozpuszczono w 100 ml wody Milli-Q_. Na podstawie HPLC stwierdzono, że zawiera on 2,0 mg LysB28Pro^B29-hI/ml. Roztwór sklarowano doprowadzając pH do około 3,0 za pomocą 10% HCl. Pobrano 4 próbki po 5 ml i stężenie kwasu octowego doprowadzono do 1N dodając lodowaty kwas octowy. Sprawdzono, że pHjest poniżej 3,5. Do próbek dodano m-krezol (12 pl), fenol (10 pl), rezorcynę (2,1 pl 100 mg/ml roztworu w wodzie) lub metyloparaben (1,6 ml 10 mg/ml roztworu w wodzie) uzyskując roztwory krystalizacyjne o zbliżonym stosunku molowym peptydu do związku fenolowego. Do każdej próbki dodano 6 pl 20% wag./objęt. roztworu chlorku cynku w wodzie, po czym pH doprowadzono do 6,0 dodając stężony wodorotlenek amonowy. Roztwory mieszano przez około 15 minut, po czym odstawiono pod przykryciem w temperaturze pokojowej. Po około 24 godzinach zaobserwowano dobrze wykształcone kryształy romboedryczne w roztworach zawierających fenol. Z roztworu zawierającego metyloparaben uzyskano pewną ilość źle wykształconych płaskich kryształów. Z roztworów zawierających m-krezol i rezorcynę nie uzyskano kryształów w tych warunkach.

Postępując w podobny sposób po dodaniu 1/10 ilości rezorcyny i nastawianiu pH 10% wag./objęt. roztworem wodorotlenku sodowego otzymano dobrze wykształcone romboedryczne kryształy. Przykład ten wykazuje, że rutynowo optymalizując warunki uzyskać można dobrze wykształcone kryształy przy zastosowaniu związków fenolowych.

Przykład VI. LysB28ProB29-i_nsulinę ludzką (222 mg) rozpuszczono w 100 ml wody Milli-Q. Na podstawie HPLC stwierdzono, że zawiera on 2,0 mg LysB28ProB²9-hI/ml. Roztwór klarowano doprowadzając pH do około 3,0 za pomocą 10% HCl. Pobrano 1 próbkę 5 ml i stężenie kwasu octowego doprowadzono do 1N dodając lodowaty kwas octowy. Sprawdzono, że pH jest poniżej 3,5. Do próbki dodano 20 pl 2% wag./objęt. roztworu chlorku cynku w wodzie, po czym pH doprowadzono do 6,0 dodając stężony wodorotlenek amonowy. Roztwory mieszano przez około 15 minut, po czym odstawiono pod przykryciem w temperaturze pokojowej. Po około 24 godzinach nie zaobserwowano kryształów w roztworze, a jedynie bezpostaciowy osad, który osiadł na dnie pojemnika.

W próbie kontrolnej pobrano inną5-ml próbkę i przeprowadzono obróbkę wodorotlenkiem amonowym w sposób opisany w przykładzie I. Powstały dobrze wykształcone kryształy Lys®28ProB29-hI. Gdy insulinę ludAą(2,3 mg/ml w 1N kwasie octowym) poddano obróbce w warunkach opisanych w przykładzie I stosując wodorotlenek amonowy, w ciągu 7 dni kryształy nie powstały.

Doświadczenie to wykazuje, że warunki rutynowo stosowane przy krystalizacji biosyntetycznej insuliny ludzkiej nie są odpowiednie do krystalizacji LysB28ProB29-hI ludzkiej, oraz że w warunkach krystalizacji opisanych w odniesieniu do krystalizacji LysB2⁸Pro'B29-hI nie uzyskuje się kryształów insuliny ludzkiej.

Przykład VII. W sposób podobny jak w przykładzie I przeprowadzono krystalizację zastępując 1N kwas octowy 1N kwasem cytrynowym. W wyniku krystalizacji uzyskano dobrze wykształcone kryształy LysB2⁸ProB29-hI.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (5)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania krystalicznej Lys^B28Pro^B29-insuliny ludzkiej, znamienny tym, że krystalizuje się Lys^B2⁸Pro^B2⁹-insulinę ludzką z roztworu zawierającego Lys^B2⁸Pro^B2⁹-insulinę ludzką, cynk, co najmniej 0,3 N kwas organiczny wybrany z grupy obejmującej kwas octowy, kwas cytrynowy i glicynę oraz związek fenolowy, przy pH około 5,5 - 6,5.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że LysB2⁸ProB29-insulinę ludzką stosuje się w stężeniu około 1,8 - 2,5 g/litr, jako związek fenolowy stosuje się fenol, a cynk stosuje się w stężeniu około 40 - 400 mg/g LysB28ProB2⁹-insuliny ludzkiej.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się fenol w stężeniu około 0,15 - 0,25% objętościowych.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się pH około 5,9 - 6,2.

5. Sposób wytwarzania krystalicznej LysB28ProB29-insuliny ludzkiej według zastrz. 1, znamienny tym, że do roztworu zawierającego LysB28Pro29-insulinę ludzkąw ilości 1,8 - 2,5 g/litr, w 1N kwasie octowym dodaje się fenol w ilości 0,15 - 0,25% w stosunku do ostatecznej objętości, doprowadza się pH do około 5,9 - 6,2 za pomocą wodorotlenku amonowego oraz dodaje się sól cynku do uzyskania stężenia cynku 40 - 400 mg/g LysB²8ProB29-insuliny ludzkiej.