DE2932604A1

DE2932604A1 - Verfahren zum modifizieren der antigeneigenschaften eines einen quercitinrest enthaltenden graspollen-antigens oder fragments davon, das dabei erhaltene modifizierte graspollen-antigen, dessen verwendung fuer die behandlung von graspollenallergien und das modifizierte graspollen- antigen enthaltende immunotherapeutische mittel

Info

Publication number: DE2932604A1
Application number: DE19792932604
Authority: DE
Inventors: Arthur Malley
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1978-08-15
Filing date: 1979-08-10
Publication date: 1980-02-28
Also published as: AU4963279A; JPS5551026A; US4215036A; SE7906793L; FI792430A; GB2031433A; FR2433341A1; CA1137078A; AU526205B2; BE878197A; ZA794060B; NO792643L; ES483374A1; FR2433341B1; GB2031433B; DK337479A; NL7906183A

Description

51 953-BR

Anmelder: Research Corporation
405 Lexington Avenue

New York, N.Y., USA

Verfahren zum Modifizieren der Antigeneigenschaften eines einen Quercitinrest enthaltenden Graspollen-Antigens oder Fragments davon, das dabei erhaltene modifizierte Graspollen-Antigen, dessen Verwendung für die Behandlung von Graspollenallergien und das modifizierte Graspollen-Antigen enthaltende immunotherapeutische Mittel

Die Erfindung betrifft modifizierte Graspollen-Antigene, sie betrifft insbesondere ein Verfahren zum Modifizieren der Antigeneigenschaften eines einen Quercitinrest enthaltenden Graspollen-Antigens oder Fragments davon, das dabei erhaltene modifizierte Graspollen-Antigen, dessen Verwendung in einem immunotherapeutischen Verfahren zur Behandlung von Graspollenallergien und das modifizierte Graspollen-Antigen enthaltende immunotherapeutische Mittel.

Neuere Untersuchungen haben zu einer Charakterisierung der Antigendeterminanten des Antigens B von Timothy-Graspollen geführt. Das Antigen besteht aus einem Flavanoid-Pigment, Quercitin; einem Disaccharid, Cellobiose; und einem Polypeptid "Schwanz". Antigen B ist der Gattungs-Name für Gemische, die zwei oder mehr Antigenfragmente enthalten, die üblicherweise als "Antigen D, D-, D„, D„ und dgl." bezeichnet werden. Sie unterscheiden sich voneinander in bezug auf die Länge des

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Polypeptid -"Schwanzes". In dem Antigen D₃ besteht der "Schwanz" aus einer einzelnen Aminosäure, nämlich Threonin (vgl. Malley et .al in "Dev. Biol. Stand.", 1975, 29 (Int. WHO-IABS, Symp, Stand, Control Allergens Adm. Man., 1974), 29 bis 40j Kramer-Kleinert et al in "Dev. Biol. Stand.", 1975, 29 (Int. VJHO-IABS, Symp. Stand. Control Allergens Adm. Man., 1974), 188 bis 196; Malley et al in "immunochemistry", 1975, Band 12, Seiten 551 bis 554} Malley et al in"Journal of Allergy", Band 43, Nummer 2, Februar 1969, Seiten 59 bis 64; Gerard et al in "Immunochemistry", 1975, Band 12, Seiten 545 bis 549; Malley et al in "Jorunal of Immunology", Band 99, Nr. 4 (1967), Seiten 825 bis 830; Sanderson et al in "immunology", Band 20 (1971), Seiten 1061 bis 1065; und Axen et al in "Nature", Band 214 (1967), Seiten 1302 bis 1304).

In der US-Patentanmeldung Nr. 731 414 ist angegeben, daß die verschiedenen Antigen D-Fragmente,die über die freie Carboxylgruppe des Threonins an verschiedene Proteine oder Peptide gekoppelt sind, eine signifikante Histaminfreisetzung aus sensibilisiertem Gewebe initiieren. Darin ist jedoch ferner angegeben, daß die gleichen Antigen D-Fragmente, die über den Zuckerrest an verschiedene Proteine und Peptide gekoppelt sind, zu einer dosenabhängigen Inhibierung der Histaminfreisetzung aus sensibilisiertem Gewebe führen.

Diese Untersuchungen legen die Vermutung nahe, daß Quercitin den Hauptanteil der Antigendeterminanten des Antigens B darstellt.

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Antigen B und seine verschiedenen Fragmente können durch, die Strukturformel dargestellt werden:

Il

0 - G - G - O - T

worin G Glucose und T Threonin oder ein Peptid, das über das Threoninmolekül an die Struktur gebunden ist, darstellen.

Antigen D, hat die oben angegebene Struktur, in der der Peptidschwanz so ist, daß das Molekulargewicht etwa 5000 beträgt. Antigen D„ hat ein Molekulargewicht von etwa 2500. In dem Antigen D„ stellt T nur Threonin dar.

Die Quercitinfraktion der Antigenstruktur ist über eine Ätherbrückenbindung durch OH-Gruppen an den jeweiligen Molekülen an die Glucosereste gebunden. Die Threonin-Brückenbindung an den Glucoserest ist ebenfalls eine Ätherbrückenbindung über eine OH-Gruppe an der Cellobiosefraktion und die OH-Gruppe von Threonin.

Die Natur der allergischen Reaktion oder Ansprechempfindlichkeit bei Menschen und Tieren ist noch nicht völlig geklärt. Es wird angenommen, daß die Allergie-Ansprechempfindlichkeit gegenüber einem fremden Antigen, wie z.B. dem Antigen von

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Graspollen, die Wechselwirkung zwischen mindestens zwei verschiedenen Zelltypen umfaßt» Einer dieser Zelltypen wird üblicherweise als T-Zelle oder als aus dem Thymus stammender Lymphocyt bezeichnet, und der zweite Typ wird als B-Zelle bezeichnet, bei dem es sich um einen aus dem Knochenmark stammenden Lymphocyten handelt. Jede dieser beiden Zellen, die T- und B-Lymphocyten erkennt . verschiedene Teile des Proteins, welche die Allergie-Empfindlichkeit hervorrufen. Der B-Lymphocyt erkennt die Antigen-Determinant e, während der T-Lymphocyt einen anderen Teil des Proteins, der als Trägerdeterminante bezeichnet wird,

erkennt. Um eineSuppreesion(Unterdrückung) der Immunempfindlichkeit, die bei Allergieerkrankungen auftritt, zu erzielen, kann man das Problem so angehen, daß man entweder die Bildung des Antikörpers durch Blockierung der B-Zellendifferenzierung unterdrückt oder daß man die T-Zellenpopulation beeinflußt (schwächt). Der B-Lymphocyt bildet nämlich den Antikörper. Die T-Zellen bilden nicht den zirkulierenden Antikörper, der an der Allergieerkrankung beteiligt ist, sondern regulieren ihre Bildung. Eine Subpopulation der T-Zellen, welche die Herstellung von Antikörpern unterstützt, sind die sogenannten Helfer-T-Zellen. Sie cooperieren oder reagieren in wirksamer Weise mit dem B-₍ Lymphocyten unter Bildung von Antikörpern. Eine andere Subpopulation der T-Zellen, die "Suppressor"-T-Zelle oder T -

Zelle, unterdrückt in wirksamer Weise die Wirkung der Helfer-T-Zellen, so daß sie nicht mit den B-Lymphocyten reagieren können unter Bildung von Antikörpern,

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum

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Modifizieren der Antigeneigenschaften von Timothy-Antigen B und/oder seinen verschiedenen Fragmenten anzugeben, das ein Produkt liefert, das frei von Antigeneigenschaften ist, das jedoch T-Zellen aktivieren kann.

Es wurde nun gefunden, daß dieses Ziel erfindungsgemäß dadurch erreicht werden kann, daß man den Quercitinrest von Graspollenantigen mit der Struktur

η - π - G - O - T

HO

worin G Glucose und T Threonin oder ein Peptid, das über ein Threoninmolekül an die Struktur gebunden ist, bedeuten, solchen oxidativen Bedingungen aussetzt, daß die aromatischen Dihydroxyringe des Quercitinrestes eine Umlagerung und Ringspaltung erfahren unter Bildung eines Produktes, das im wesentlichen frei von Antigeneigenschaften ist, das jedoch in

der Lage ist, T-Zellen zu aktivieren und T -Zellen zu indu-⁷ s

zieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung betrifft die Erfindung die oxidative Umlagerung und Spaltung der aromatischen Hydroxy-Ringe des Quercitinrestes des Timothy-Graspollen-Antigens oder der Antigen-Fragmente, die ein modifiziertes An-

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tigen ergeben, das keine Antigeneigenschaften aufweist, jedoch seine Fähigkeit behält, T-Zellen zu aktivieren zur Regulierung der Immun-Ansprechempfindlichkeit.

Die vorliegende Erfindung umfaß-t auch die modifizierten Antigene, das Verfahren zur oxidativen Spaltung, immunotherapeutische Verfahren zur Linderung der Allergie-Ansprechempfindlichkeiten gegenüber Thimothy-Graspollen-Antigenen und dafür geeignete immunotherapeutische Mittel.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.

Die Fig. 1 bis 4 der beiliegenden Zeichnungen zeigen in graphischer Darstellung die Antigeneigenschaften des erfindungsgemäß oxidativ-modifizierten Antigens.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf jedes beliebige, einen Quercitinrest enthaltende Antigen oder Antigen-Fragment, wie z.B. Antigen B, Antigen D, Antigen D,, D , D und dgl., anwendbar. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert ein modifiziertes Antigen, das in einer Einheitsdosierungsform compoundiert werden kann unter Bildung eines immunotherapeutischen Mittels für die Inhibierung (Hemmung bzw. Unterdrückung) von Allergiereaktionen bei Menschen und Tieren, die gegenüber diesen Antigenen empfindlich sind.

Es ist bekannt, daß aromatische Hydroxyringe einer oxidativen Spaltung und einer anschließenden Umlagerung un-

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terliegen, je nach den angewendeten Reaktionsbedingungen. Es ist auch bekannt, daß bestimmte Oxidationen die verschiedensten Aminosäuren auf verschiedene Weise beeinflussen. Es ist ferner bekannt, daß Tyrosin und Methionin in dem PoIypeptid-¹¹ Schwanz" der Antigene B oder D enthalten sind. Es ist ferner bekannt, daß oxidative Bedingungen, die genügend scharf sind, um die Ringspaltung in dem Quercitinrest zu bewirken, auch den Tyrosin- und Methioningehalt des Polypeptid-"Schwanzes" beeinflussen. Es wurde jedoch gefunden, daß die Modifizierung dieser beiden Rest und eines Minimums an anderen Aminosäureresten, die in dem Schwanz vorhanden sind, die Fähigkeit des modifizierten Antigens, aktive T-Zellen zu induzieren, nicht beeinflußt.

Jede Oxidationsreaktion, die in der Lage ist, die Umlagerung und Ringspaltung der aromatischen Hydroxyringe des Quercitinrestes zu bewirken, ohne wesentlich den Polypeptid-"Schwanz" zu modifizieren, führt zu einem Produkt, das praktisch keine Antigeneigenschaften aufweist, jedoch seine Fähigkeit beibehält, T-Zellen zu aktivieren und T -ZeI-len zu induzieren.

Die photooxidative Spaltung der aromatischen Hydroxyringe hat sich als sehr wirksam bei der Herstellung des erfindungsgemäßen modifizierten Antigens erwiesen. Offensichtlich hängen die Oxidationsrate bzw. -geschwindigkeit und die beeinflußten Reste von vielen Variablen einschließlich des pH-Wertes der Konzentration des Lichtsensibilisators, der Grb'sse des Gefäßes und der Intensität und Dauer der Einwirkung von Licht auf die Probe ab. Es ist jedoch klar, daß jedes

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oxidative Verfahren, das zu einer Umlagerung und Spaltung der hydroxyaromatischen Ringe von Quercitin in dem Antigen oder Fragmenten davon unter Vermeidung einer wesentlichen Modifizierung des Peptid-Schwanzes führt, erfindungsgemäß angewendet werden kann. So können beispielsweise auch ChIoramine-T [Natrium-p-toluolsulfonchloramin], Lactoperoxidase und Kaliumpermanganat als geeignete Oxidationsmittel zum Modifizieren des Quercitinrestes des Antigens oder der Antigenfragmente verwendet werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Timothy-Pollenextrakt (WST) und gereinigtes Antigen B, AgB, wurden wie von Malley et .al in ¹¹J. Immunol.¹¹, 99_, 825 (1967), beschrieben hergestellt. Die Proteinkonzentration dieser Antigenpräparate wurde mit dem Nessler-Reagens bestimmt (vgl. Campbell et al in "Methods in Immunology", Ed., W.A, Benjamin, N.Y., Seite 53, 1963).

Das AgB wurde mit 8 M Harnstoff, wie von. Takatsu und Ishizaka in "Cell Immunol.", 20, 276, 1975, beschrieben, behandelt, d.h. es wurden 2 g Harnstoff zu 2,5 ml einer 1 %-igen Lösung von AgB in einem 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) zugegeben. Nach achtzehnstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Proteinlösung gegen eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung dialysiert, wieder auf ihr ursprüngliches

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Volumen (2,5 ml) durch einen negativen Druck eingeengt und unter Anwendung des Radioallergosorbens (RAST)-Inhibierungsverfahreiisauf seine Reagin-Bindungsaktivität hin untersucht,

Photooxidation von Antigen B

3 mg (0,4 ml) AgB und 2 ml eines 0,2 M Phosphatpuffers (pH 9) wurden zu 10 ml-Serum Phiolen zugegeben. Die Phiolen wurden mit einer Aluminiumfolie abgedeckt, so daß kein Licht eindringen konnte. Jeder Phiole wurde 0,5 ml eines Methylenblau-Photosensibilisators (0,2 mg/ml in einem 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9)) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde durch langsames Einleiten von Sauerstoffgas in die Lösung für einen Zeitraum von 8 bis 10 Minuten mit 0„ gesättigt. Die Serumphiolen wurden sofort mit einem Stopfen verschlossen und 30 Minuten lang bei 37 C inkubiert. Die Aluminiumfolie wurde von den Phiolen entfernt und ihr Inhalt wurde für variierende Zeitspannen bei 37 C mit zwei 150 Watt-Lampen, die einen Abstand von 3,81 cm (1,5 inches) von den Phiolen hatten, belichtet. Die Proben wurden aus den Phiolen entnommen und gegen destilliertes Wasser in Spektropor-Membranen (6000 bis 8000 Molekulargewicht/Porengröße) (Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, California/USA) 48 Stunden lang dialysiert.

Aminosäureanalyse

2 mg-Proben von AgB und des photooxidierten Antigens B (OX-AgB) (Photooxidation 0,5 Stunden, 1 Stunde und 2 Stunden)

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wurden in Pyrex-Digerierröhrchen (13 mm χ 100 mm) bis zur Trockne lyophilisiert. Jede Probe wurde wieder in 5,7 η HGl suspendiert und mit Stickstoffgas behandelt, wobei das Gas 10 Minuten lang in jedes Röhrchen eingeleitet wurde, dann wurde jedes Röhrchen mittels eines Sauerstoffbrenners verschlossen und 20 Stunden lang auf 110 C erhitzt. Die Aminosäureanalyse jeder Probe wurde nach dem Verfahren von Spackman et al ("Anal, Chem.", 30, 1190, 1958) unter Verwendung eines Beckman-Aminosäureanalysators Modell 120 C, durchgeführt. Der Tryptophangehalt wurde bestimmt nach dem Verfahren von Spies und Chambers ("Anal. Chera.", 2jL, 1249, 1949). Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

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-yC-

	Tabelle I	a) Nflt-ivp.q AgR	auf die	Aminosäure-	2Std.
Einfluß	der Photooxidation	(M/Mol) 0,5	B		7
zusammensetzung von Antigen	7		OX-AgB	8
Aminosäure	8	Std.	1 Std.	5
rest	5	7	7	4
■Asparagin	4	8	.8	4
Glutamin	4	5	5	3
Threonin	3	4	4	14
Serin	14	4	4	5
Prolin	5	3	3	Spuren
Glycin	1	14	14	2
Alanin	2	5	5	4
Valin	4	.5	Spuren	3
Methionin	3	2	2	0
Isoleucin	2	4	4	3
Leucin	6	3	3	6
Phenylalanin	6	0	0	A
Tyrosin	JL	3	3	69
Tryptophan	75	6	6
Lysin		I^	I^
Histidin	69.5	69
Gesamtzahl der Reste

Die Zahlen geben dieyuMol Aminosäure pro Mol Protein an und sie sind auf die nächste ganze Zahl abgerundet.

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- Lc ·

Antiseren

Ein wie vorstehend beschrieben (vgl. Malley et al, supra, 1967) hergestelltes Kaninchen-Anti-WST-Serum enthielt 1,1 mg Antikörper-Protein/ml, gerichtet gegen AgB. Ein gegen die Titnothy-Pollenantigene gerichtetes Humanreagin-Serum wurde aus 50 Patienten gewonnen und gesammelt ( 5 ml aus jedem Patienten)« Diese Mischung hatte einen Prausnitz-Kuestner (P-K)-Titer von 1:2500.

Präzipitationsanalyse

0,5 ml Kaninchen-Anti-WST-Serum wurde zu 0,5 ml AgB oder OX-AgB mit variierenden Konzentrationen (0,03 bis 1 mg Protein) zugegeben. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei 37 C und 48 Stunden lang bei 4 C inkubiert. Die Niederschläge wurden dreimal mit einem 0,01 M Cacodyl-Salz-Puffer (pH 7) gewaschen und an der Luft getrocknet; die getrockneten Niederschläge wurden quantifiziert wie von Campbell et al, supra, Seite 36, beschrieben. Der Proteingehalt jedes Niederschlags wurde bestimmt mit dem Nessler-Reagens (Campbell et al, supra, Seite 53). Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 1 dargestellt. Die angegebenen Werte stellen den Mittelwert von zwei Analysen dar.

PassiveÜbertragungstests

0,1 ml des verdünnten gesammelten Serums wurde intradermal an verschiedenen Stellen in die Haut eines nicht-allergi-

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sehen Freiwilligen injiziert und 48 Stunden später wurde jede Stelle mit 0,025 ml AgB (0,1 jug Protein/ml) gereift. Die Reaktionen wurden 30 Minuten später bestimmt und wie folgt bewertet: negativ, -; 5 bis 10 mm-Quaddel,+; 10 bis 15 mm-Quaddel^+; 15 bis 20 mm-Quaddel,3+j und mehr als 20 mm-Quaddel, 4+.

Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Passive Übertragungsreaktivität von nativem und photooxidiertem Antigen B mit einem Gemisch von Human-Antitimpthy-Seren

a) Protein- P-K-Reaktionen

Antigen _konzentra.

^tlon^^S^^m:L-⁾ ltlOO 1:200 1:400 l;800 1:1000

AgB 0.1 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ OX~AgB^b' 10.0 -

'In diesen Versuchen wurde ein Serengemisch von 50 Patienten, die gegenüber Timothy-Graspollen empfindlich waren, verwendet; der durchschnittliche P-K-Titer dieses Serums betrug 1:2500. 0,1 ml des verdünnten Serums wurden intradermal an verschiedenen Stellen in die Haut eines nichtallergischen Human-Freiwilligen injiziert. Jede Stelle wurde 48 Stunden mit 0,025 ml Antigen gereizt.

'1 Stunden- und 2 Stunden-Proben

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Rad ioallergo s ο r b en s ■» jnhi b Ϊ

2 g Whatman 3 MM-Papierscheiben (mit einem Durchmesser von

3 mm) wurden nach dem Verfahren von March, et al ("Anal, Biochem.", b_O, 149, 1974) mit CKBr aktiviert. Die aktivierten Scheiben wurden mit 500 ml eines kalten, 0,1 M NaHCO₀-Kochsalz-Puffers (,pH 9) auf einem gesinterten Glasfilter gewaschen und die feuchten ScheiDen wurden zu 30 ml einer WST-Lösung (1 mg Protein/ml) in dem 0,1 M ¹KaHCO ^-Kochsalz-Puffer (pH 9) zugegeben. Diese Mischung wurde 36 Stunden lang bei 4^WC gerührt und mit 500 ml jedes der nachfolgend angegebenen kalten Reagentien gewaschen: 0,2 M Na₇CO-,, 2 M

Harnstoff, 0,2 M KaAc und einer 0,1 M Phosphat -gepufferte

Salzlösung, pH 7,2, Die mit WST beschichteteteri Scheiben wurden bis zu ihrer Verwendung in einer Phosphat-gepufferten Salzlösung bei 4" G gelagert,

0,1 ml Human-Reagin-Serum, verdünnt im Verhältnis 1:37,5 (P-K-Titer 10 000) aus einem gegenüber Timothy empfindlichen Patienten wurden mit 0,1 ml AgB oder OX-AgB mit variierenden Konzentrationen (0,5 bis 20^g Protein) 45 Minuten lang bei 37'C inkubiert. Die mit WST beschichteten Scheiben wurden durch Ablöschen getrocknet und eine Scheibe mrde zu jeder Mischung von vorxnkubiertem Reagin zugegeben. Nach sechstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde jede Scheibe dreimal (3x5 ircL) gewaschen und zu jeder Scheibe wurden 5000 bis 8000 cpm J-Anti-IgE zugegeben. Die Mischungen wurden 16 Stunden lang bei 4 C inkubiert. Die mit VJST beschichteten Scheiben wurden viermal (4x5 ml) mit einem RAST-Puffer gewaschen und unter Ver-

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Wendung eines Packard-Scintillationszählers (Packard Instrument Company, Inc., Downers Grove, 111./USA) ausge-

125 zählt. 20 bis 30 % des zugegebenen J-Anti-IgE wurden an die Scheiben gebunden, wenn das Reagin-Serum mit normalem Humanserum vorinkubiert wurde. Der durch AgB und OX-AgB erzielte Prozentsatz der Inhibierung wurde aus der folgenden Gleichung errechnet:

RAST-Zähler mit der zugegebenen Fraktion

Inhibierung (%) = (1- ) x

RAST-Zähler ohne Fraktion

Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt. Die angegebenen Werte stellen die Mittelwerte von jeweils zwei Versuchen dar.

Immun i s i e run g e η

LAF.-Mäuse (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine/USA) wurden mit WST wie bereits früher beschrieben (Fairchild et al, "J.Immunol.", 115·, 446, 197 5) immunisiert. Die Immunogenizität von OX-AgB wurde untersucht durch Immunisierung von LAF -Mäusen mit OX-AgB (10 bis 100 iig), das an Aluminiumhydroxid adsorbiert war (Levine et al, "Int. Arch. Allergy", 39_, 156, 1970). Die Tiere wurden mit OX-AgB in wöchentlichen Intervallen zwei Wochen lang immunisiert und drei Wochen später wurde eine weitere Dosies OX-AgB verabreicht. Sieben Tage nach den ersten Injektionen, 7, 10 und 14 Tage nach den zweiten Injektionen und 7, 10

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und 14 Tage nach den letzten Injektionen von OX-AgB wurden Blutproben gesammelt. Die Serum-IgG·,- und IgE-Titer der immunisierten Mäuse wurden durch passive Cutan-Anaphylaxie bestimmt, wie bereits beschrieben (Fairchild et al, supra). Die erzielten Ergebnisse sind in der Fig. 3 dargestellt. Die angegebenen Titer stellen den Mittelwert dar, der bei mindestens zwei Tieren mit einer Serummischung aus mindestens 5 Mäusen erhalten wurde. Die Pfeile zeigen an, wann die Mäuse mit AgB oder OX-AgB immunisiert wurden.

Durch Photooxidation wurde das gelb-pigmentierte AgB in ein farbloses Material umgewandelt mit einer entsprechenden Abnahme der optischen Dichte bei 280 nm. Ein Vergleich zwischen der Aminosäurezusammensetzung von AgB- und mehreren OX-AgB-Proben (Tabelle I) zeigt eine vollständige Reduktion des Tyrosingehaltes von OX-AgB und eine Abnahme der Methionin- und Tryptophan-Gehalte; die übrigen Aminosäuren blieben jedoch verhältnismäßig unverändert, eine Tatsache, die zeigt, daß die Polypeptidstruktur von AgB durch die Photooxidation nicht signifikant verändert wurde.

Der Einfluß der Photooxidation auf die Antigen-Determinanten von AgB wurde bestimmt durch Vergleich von AgB mit OX-AgB im Hinblick auf ihre Fähigkeit (1) Kaninchenantikörper gegen AgB auszufällen, (2) P-K-Reaktionen in der Haut eines nicht-allergischen Individuums, das mit einem IgE enthaltenden Serum aus Timothy-empfindlichen Patienten passiv sensibilisiert worden war, zu initiieren, und (3) die

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-X-

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spezifische IgE-Bindung an mit WST beschichtete Papierscheiben in dem RAST-Versuch zu inhibieren.

Ein Kaninchen-Anti-Timothy-Serum, das 1,1 mg Antikörperprotein/ml gegen AgB enthielt, ergab keinen präzipitier« baren Antikörper mit OX-AgB (0,5 Stunden-, 1 Stunden- und 2 Stunden-Proben)(Fig. 1).

Die Tabelle II zeigt, daß AgB (2,5 ng) selbst bei einer Verdünnung des Reagin-Gemisches von 1 : 1000 P-K-Reaktionen stark induzierte. Im Gegensatz dazu rief eine Konzentration von OX-AgB (1 Stunde- und 2 Stunden-Proben), die 100 χ größer war (250 ng) als die verwendete AgB-Konzentration keine allergischen Hautreaktionen in der Haut des nichtallergischen Freiwilligen hervor.

125 Die Fähigkeit von OX-AgB, die Bindung von J-Anti-IgE an Timothy-Reagens zu inhibieren, wurde bestimmt durch Vergleich der AgB- und OX-AgB-Inhibierung der Bindung in einem RAST-Versuch bei Timothy-Reagin-Antikörpern (Fig.

2). Bei diesen Versuchen ergab AgB eine lineare dosenab-

125
hängige ..Inhibierung der J-Anti-IgE-Bindung an IgE-gebundene, mit WST beschichtete Papierscheiben, OX-AgB (1 Stunde- und 2 Stunden-Proben) ergab jedoch selbst bei

125

einer Konzentration von 20 tig keine Inhibierung der J-Anti-IgE-Bindung. Im Gegensatz dazu ergab mit Harnstoff

125 behandeltes AgB eine dosenabhängige Inhibierung der J-Anti-IgE-gebundenen, mit WST beschichteten Scheiben, die identisch mit derjenigen des nativen AgB war.

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Eine andere Art der Bestimmung des Einflusses der Photooxidation auf die Antigen-Determinante von AgB besteht darin, die immunogenen Eigenschaften von nativem AgB und OX-AgB miteinander zu vergleichen» LAF,-Mause in Gruppen zu 5 Tieren wurden entweder mit 10 tig AgB-Protein oder mit 10 bis 100 iig OX-AgB-Protein (1-Stunde-Probe.) immunisiert. Die mit AgB immunisierten Mäuse ergaben signifikante Gehalte an IgG,- und IgE-Antikörperii nach einer zweiten und dritten Injektion von AgB, Im Gegensatz dazu entstanden bei den nach dem gleichen Immunisierungsprogramm mit 10 oder 100 ng OX-AgB-Protein immunisierten Mäusen weder IgG,- noch IgE-Antikörper, die mit AgB oder OX-AgB reagiert Int ten (Fig, 3),

Die durch Antigen induzierte Lymphocyten-Transformation wurde angewendet zum Vergleich der relativen T-Zellen-Aktivierungseigenschaf ten von AgB und OX-AgB (vgl, die Fig. 4, in der die angegebenen Werte den Mittelwert von 4 Versuchen darstellt, wobei die einzelnen Versuche weniger als 10 % von dem Mittelwert abwichen). Innerhalb des getesteten Konzentrationsbereiches (0,1 bis 10 ug Protein) ergab AgB eine dosenabhängige Zunahme der durch Ag induzierten Vermehrung von immunen LAF,-Mause -Milzzellen. Andererseits wies OX-AgB (1 Stunde- bis 2 Stunden-Proben) eine Spitzen-Ansprechempfindlichkeit bei 1 jug auf, die offensichtlich über dem Rest der getesteten OX-AgB-Konzentrationen auf diesem Niveau ein Plateau bildete. Diese Daten zeigen an, daß OX-AgB einen signifikanten Anteil der durch Ag induzierten Vermehrungsfähigkeit von nativem AgB beibe-

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hielt.

Die Photooxidation von AgB führt zu einem vollständigen Verlust der Fähigkeit des OX-AgB, mit Kaninchen-Anti-AgB (Fig. 1) oder Human-IgE-Antiköfpern (Tabelle II, Fig. 2), diegegaidie Antigen-Determinanten von AgB gerichtet sind, zu reagieren. Die vollständige Säurehydrolyse von OX-AgB zeigt an, daß die einzige signifikante Modifizierung des nativen AgB die in Bezug auf die Quercitin- und Tyrosin-Reste war (Tabelle II). Versuche, die Antigen-Determinante von AgB zu modifizieren durch Denaturieren mit 8 M Harnstoff waren erfolglos, da natives und mit Harnstoff

behandeltes AgB identische Dosen-Ansprechempfindlichkeitskur-125
ven für die J-Anti-IgE-Bindung an IgE-gebundene Antigenkonjugierte Papierscheiben ergaben (vgl. Fig. 2). Diese Daten zeigen zusammen mit den Daten von früheren Versuchen (Malley et al, 1975a, 1975b, 1978), daß der Hauptanteil der Antxgendeterminanten von AgB nicht von seiner dreidimensionalen Polypeptidstruktur, sondern von der Anwesenheit des Pigment-Quercitin in dem Antigenmolekül abhängt.

Eine Reihe von Untersuchungen (Takatsu et al, "Cell Immunol.", 2£, 276, 1975; Scibienski et al,^MJ. Exp. Med.", 136, 1308, 1972; Türkin et al, "Proc. Natl. Acad. Sei.", 74, 3984, 1977) haben gezeigt, daß die von T- und B-Zellen erkannten Determinanten verschieden sein können. Die B-Zellen-Rezeptoren verbinden sich mit Hapten-Determinanten und dieT-Zellen-Rezeptoren werden durch Wechselwirkung mit Trägerdeterminanten an dem Antigen aktiviert. Das obige

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Beispiel zeigt klar, daß OX-AgB sich weder mit IgG,- oder IgE-Antikörpern vereinigt noch die Bildung von Antikörpern gegen AgB induziert, eine Tatsache, die nahelegt, daß OX-AgB keine B-Zellen initiiert, die für das native Antigen spezifisch sind. Frühere Untersuchungen (Fairchild et al, ¹¹J. Immunol.¹¹, 117, 2137, 1976) haben gezeigt, daß die durch AgB induzierte Vermehrungs-Ansprechempfindlichkeit von mit AgB immunisierten Mäusen sowohl auf T- als auch auf B-Zellen zurückzuführen war. Die Trägerdeterminante an OX-AgB behält einen wesentlichen Anteil (> 40 %) der Ver- mehrungs-Ansprechempfindlichkeit von immunen Milzzellen gegenüber AgB bei[ vgl. die Fig. 3). Das obige Beispiel zeigt, daß die Trägerdeterminante von OX-AgB die mit nativem AgB initiierten T-Zellen aktiviert.

Beispiel 2

Zur oxidativen Modifizierung eines Antigens mit Chloramine T wurde das folgende Verfahren angewendet:

1 bis 5 mg Protein wurden in 4 ml eines 0,05 M Phosphat-Puffers, pH 7, gelöst. Die Proteinlösung wurde in einen 30 ml-Becher eingeführt und mittels eines Magnetrührers gerührt. Der Becher wurde in eine große Kunststoffschale, die mit Eis gefüllt war, um die Reaktanten kalt zu halten, gestellt. 100 ug bis 5 mg Chloramine T, gelöst in dem 0,05 M Phosphat-Puffer, pH 7, wurden innerhalb variierender Zeiträume zugetropft und damit gemischt. Zum Abstoppen der Reaktion wurde eine gleiche Gewichtsmenge Natriummetabisulfit.

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zugegeben, um irgendwelches restliches Oxidationsmittel zu neutralisieren. Die überschüssigen Reagentien wurden entfernt, indem man die Lösung über eine in FI₂O äquilibrierte Sephadex G25-Kolo.nne laufen ließ. Der Durchbruch-Spitzenwert, welcher das Protein enthielt, wurde gesammelt und lyophilisiert.

Beispiel 3

Zum oxidativen Modifizieren eines Antigens mit Lactoperoxidase wurde das folgende Verfahren angewendet:

1 bis 5 mg Protein wurden in 4 ml einer 0,01 M, mit Phosphat gepufferten Salzlösung, pH 7,2, gelöst. 200 iig Lactoperoxidase und 25 pl 0,03 bis 1 %-iges H„0„ wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 10 bis 20 Minuten lang bei 37 C inkubiert, wobei während dieser Zeit zwei weitere 25 jul-Portionen H„0„ zugegeben wurden. Die Reaktion wurde beendet durch Zugabe von 10 Volumenteilen kaltem 5 mM L-Cystein-HCl in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung. Das Protein wurde durch Überleiten der Mischung über eine Sephadex G75-Kolonne zurückgewonnen. Das Enzym wurde von dem Sephadex G75 nicht zurückgehalten, während das Antigen B von der Matrix zurückgehalten wurde. Dieses Material wurde eluiert durch kontinuierliches Waschen der Kolonne mit dem Puffer. Das eluierte Protein wurde durch Lyophilisierung eingeengt.

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Claims

Patentansprüche

!./Verfahren zum Modifizieren der Antigeneigenschaften eines einen Quercitinrest enthaltenden Graspollen-Antigens oder eines Fragments davon mit der Struktur

MO

0 - G - G - 0 - T

worin G Glucose und

T Threonin oder ein Peptid, das über ein Threoninmolekül an die Struktur gebunden ist, bedeuten,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen solchen oxidativen Bedingungen aussetzt, daß die aromatischen Dihydroxyringe eine Umlagerung und Ringspaltung erfahren unter Bildung eines Produktes, das im wesentlichen frei von Antigeneigenschaften ist, das jedoch in der Lage ist, T-Zellen zu aktivieren und T -Zellen zu induzieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

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es sich bei dem Graspollen-Antigen um Antigen B, Antigen D, Antigen D-, Antigen D₃ oder Antigen D₃ handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die oxidativen Bedingungen auch zu einer Umlagerung und Ringspaltung des in dem Tyrosinrest des Peptide T enthaltenen aromatischen Hydroxyringes führen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Grad der Oxidation ausreicht, um zu einem modifizierten Antigen zu führen, das nicht in der Lage ist, mit Antikörpern zu reagieren, diegqgeidie Antigen-Determinantenstruktur des Ausgangsantigens gerichtet sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die oxidativen Bedingungen so sind, daß eine wesentliche Modifizierung des Aminosäuregehaltes des Antigens vermieden wird. ·
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Graspollen-Antigen photooxidiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Photooxidation bewirkt wird durch Sättigen einer wäßrigen Lösung des Antigens mit Sauerstoff und anschließendes Einwirkenlassen von Licht auf diese Lösung.
8. Modifiziertes Graspollen-Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß es nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hergestellt worden ist.

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9, Verwendung des modifizierten Graspollen-Antigens gemäß Anspruch 8 in einem imraunotherapeutischen Verfahren zur Be handlung von Graspollenallergien, bei dem dieses einem In dividuum in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, um Suppressor-T-Zellen zu induzieren, was zu einer Unterdriikkung der Allergieantikörper zu Graspollen-Antigen führt,
10. Immunotherapeutisches Mittel, das sich für die Inhibie rung von Allergiereaktionen bei Menschen und niedrigeren Tieren eignet, dadurch gekennzeichnet, daß es das modifizierte Graspollen-Antigen gemäß Anspruch 8 und einen dafür geeigneten inerten Träger in einer Einheitsdosierungsforra enthält.

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