NL7906183A - Graspollen antigeen en werkwijze voor het wijzigen van de antigene eigenschappen van een graspollen antigeen. - Google Patents

Description

\ RESEARCH CORPORATION, Nev York, New York, Ver. St. v. Amerika.

Graspollen antigeen en werkwijze voor het wijzigen van de antigene eigenschappen van een graspollen antigeen.

Onderzoekingen hebben kortgeleden geleid tot het karakteriseren van de antigene determinant van antigeen B van Timotheegras-pollen. Het antigeen is opgebouwd uit een flavanoide pigment quercitine, een disaccharide cellobiose en een polypeptide "staart". Antigeen B is de 5 soortnaam voor mengsels, die twee of meer antigeen fragmenten bevatten, die gewoonlijk met antigeen D. , D^, D^, enz. worden aangeduid. Zij verschillen onderling in de lengte van de polypeptide "staart". In antigeen bestaat de "staart" uit een enkel aminozuur, namelijk threonine Zie Malley cs. in Dev.Biol. Stand. (1975), 29 (int.VHO-IABS, Symp.Stand.

10 Control Allergens Adm.Man, (197*0)» 29-*t-0; Kramer-Klein ert cs. in Dev.

Biol, .Stand. (1975), 29 (Int. WHO-IABS, Symp.Stand.Control Allergens Adm. Man, (197*0), 188-96; Malley cs. Immonochemistry (1975) 12, 551-55**;

Malley cs. Journal of Allergy (nr. 2) Februari 1969, 59-6**; Gerard cs. Immunoehemistry 12 (1975) 5**5-9; Malley cs. Journal of Immunology 99 (nr.

15 *0 (1967) 825-830; Sanders son cs. Immunology 20 (1971). 1061-1065 en

Amen cs. Nature 21** (1967), 1302-130**.

In de Amerikaanse Octrooiaanvrage 731Λ1¼ van 12 October 1976 is beschreven dat de verschillende antigeen D fragmenten, die door de vrije carboxylgroep van threonine aan verschillende proteïnen of pep-20 tiden gekoppeld zijn, in belangrijke mate het vrijkomen van histamine uit gesensibiliseerd weefsel inleiden. Voorts wordt echter vermeld, dat deze zelfde antigeen D fragmenten indien ze via het suikergedeelte aan verschillende proteïnen en peptiden zijn gekoppeld, aanleiding geven tot een van de dosis afhankelijke afremming van het vrijkomen van histamine 25 uit gesensibiliseerd weefsel.

Deze onderzoekingen doen in sterke mate veronderstellen dat quercitine het grootste deel van de antigene determinant van antigeen B vertegenwoordigt.

Antigeen B en de verschillende fragmenten ervan kunnen 7906183 2 . , -5 worden voorgesteld met de structuurformule van het formuleblad, vaar in 6 glucose en T threonine of een peptide, dat via het threoninenolekuul aan genoemde structuur gebonden is, voorstelt.

Antigeen D^ heeft genoemde structuur, waarin de peptide-5 staart zodanig is, dat het moleculairgewicht circa 5000 bedraagt. Anti geen Dg heeft een moleculairgewicht van ongeveer 2500. In antigeen D^ is T alleen threonine.

Het quercitinegedeelte van de antigeenstructuur is via een etherbinding door middel van 0H-groepen aan' de betreffende moleculen aan 10 de glucosegedeelten gebonden. De threoninebinding aan het glucosegedeelte is eveneens een etherbinding via een OH-groep aan het cellobiosegedeelte en de OH-groep van threonine.

De aard van de allergische reactie of response bij mensen en dieren is niet geheel duidelijk. Volgens een theorie is er bij de al-15 lergische response ten opzichte van een vreemd antigeen, zoals het anti geen van graspollen, spraCe van de wisselwerking van tenminste twee verschillende celtypen. Een hiervan wordt gewoonlijk met T-cel of Thymus afgeleid lymphocyte genoemd en de tweede een B-cel, dat vil'zeggen een van beenmerg afComstig lymphocyte. E1C van deze twee cellen, de T en de 20 B lymphocyten, vertegenwoordigen verschillende delen van het proteïne, dat de allergische response veroorzaakt. Het B-lymphocyte vertegenwoordigt de antigene determinant, terwijl de T-lymphocyte een ander deel van het proteïne vertegenwoordigt, dat drager determinant wordt genoemd. Om te bereiken dat de immune response, waarvan bij allergische ziekten sprake 25 is, wordt onderdrukt, kan het probleem worden aangepakt voor het ont staan van antilichasm te onderdrukken door differentiatie van B-cel te blokkeren of door de T-cel populatie te beïnvloeden. Het B-lymphocyte vormt in feite het antilichaam. T-cellen vormen niet het circulerende an-tilichaam, waarvan bij allergische ziekten sprake is, maar regelt de pro-30 duktie ervan. Een subpopulatie van T-cellen, die het maken van antilicha- men ondersteunt, zijn de zogenoemde hulp T-cellen. Zij werken effectief met het B-lymphocyte samen of hebben een wisselwerking ermee, zodat an-tilichamen ontstaan. Een andere subpopulatie van T-cellen, de "suppressor” T-cel of Tg-cel, onderdrukt op effectieve wijze de werking van hulp T-35 cellen, waardoor zij niet met B-lymphocyten kunnen deelnemen en anti- 7906183 i- * 3 lichamen vormen.

De uitvinding heeft ten doel oa een werkwijze te verschaffen Voor het wijzigen van de antigene eigenschappen van Timotheegrasanti-geen B en/of de verschillende fragmenten ervan, zodat een produkt wordt 5 verkregen, dat geen antigene eigenschappen hezit maar in staat is om T-cellen te aktiveren.

De uitvinding herust op de ontdekking, dat het querciti-negedeelte van graspollen antigeen met de structuur formule van het formuleblad, waarin G glucose voorstelt en T threonine of een peptide, dat 10 aan de structuur is gebonden via een threoninemolekuul, aan oxydatieve omstandigheden wordt blootgesteld, zodat de dihydroxy aromatische ringen van het quercitinegedeelte worden gehergroepeerd en ringsplitsing ondergaan, zodat een produkt ontstaat, dat nagenoeg geen antigene eigenschappen bezit, maar in staat is om T-ceUen te aktiveren en T^-cellen te induceren.

15 Fig. 1 tot en met U zijn grafische voorstellingen van de antigene eigenschappen van het via oxydatie gemodificeerde antigeen van de uitvinding.

De werkwijze van de uitvinding kan worden toegepast op elk quercitinegedeelte, dat antigeen of antigeenfragment, zoals antigeen B, 20 antigeen D, antigeen D^, Dg, D^, enz. bevat.

Met de werkwijze ontstaat een gemodificeerd antigeen, dat tot een preparaat in de vorm van een eenheidsdosis kan worden verwerkt, zodat een immunotherapeutisch preparaat ontstaat voor het afremmen van allergische reakties bij mensen en dieren, die voor genoemde antigenen ge-25 voelig zijn.

Het is békend, dat hydroxy aromatische ringen onder invloed van oxydatie splitsen en vervolgens worden gehergroepeerd, al'-naar gelang van de reaktieomstandigheden. Het is ook bekend, dat bepaalde oxy-daties op verschillende manieren invloed op allerlei aminozuren hébben.

30 Het is bekend dat tyrosine en methionine in de polypeptide "staart" van antigeen B of D aanwezig zijn. Voorts is bekend, dat oxydatieve omstandigheden, die voldoende sterk zijn om ringsplitsing in het quercitinegedeelte te bewerkstelligen ook invloed zullen hebben op het gehalte aan tyrosine en methionine van de polypeptide "staart". Het is echter gebleken, 35 dat modificatie van deze twee resten en een minimum aan andere aminozuur- 7906183 • k resten, aanwezig in de staart, geen invloed zullen hébben op het vermogen van het gemodificéerde antigeen om aktieve T-cellen te induceren.

Bij elke oxydatieve reaktie, waarbij hergroepering en ringsplitsing van de hydroxy aromatische ringen van het quercitinegedeel-5 te mogelijk zijn, terwijl de polypeptide "staart” geen belangrijke modifi catie ondergaat, zal een produkt ontstaan, dat nagenoeg geen antigene eigenschappen heeft, maar zijn vermogen heeft behouden om T-cellen te ak- tiveren en T -cellen te induceren, s x Splitsing van de hydroxy aromatische ringen door foto- 10 oxydatie is zeer efféktief gebleken voor het bereiden van het gemodifi ceerde antigeen van de uitvinding. Het zal duidelijk zijn, dat de oxyda-tiesnelheid en de aangetaste resten afhankelijk zijn van veel variabelen, waaronder de pH, concentratie van het fotosensibiliseermiddel, de grootte van het vat en de intensiteit en duur van het aan licht blootstellen van 15 het monster.

Het zal echter duidelijk zijn, dat elke oxydatiemethode, waarbij hergroepering en splitsing van de hydroxyd aromatische ringen van quercitine in het antigeen of fragmenten ervan het gevolg zijn, terwijl een aanzienlijke modificatie van de peptide staart wordt vermeden, vol-20 gens de uitvinding kan worden gebruikt.

Zo kunnen chloramine-T (natrium-p-tolueensulfonchloor-amine), lactoperoxydase en kaliumpermanganaat ook doelmatig worden gebruikt als oxydatiemiddelen voor het modificeren van het quereitinege-deelte van het antigeen of de antigeenfragmenten.

25 Voorbeeld I

Timothy pollenextrakt (WST) en gezuiverd antigeen B,

AgB werden volgens Malley cs. (J.Immunolog. 99 (1967), 825 bereid. De proteïneconcentratie van deze antigeenpreparaten werd door nesslerisatie (zie Campbell cs., Methods in Immunology, uitgegeven bij W A. Benjamin, 30 N.Y. (1963), blz. 53).bepaald.

Het AgB werd met 8 molair ureum behandeld, zoals door Takatsu en Ishizaka in Cell Immunol. 2£ (1975), 276 is beschreven; dat wil zeggen, dat 2 gram ureum.werd toegevoegd aan 2,5 ml van een 1^-ige oplossing van AgB in 0,1 molaire Tris-HCl buffer (pH 8,0). Na een incu-35 batietijd van 18 uur bij kamertemperatuur werd de proteineoplossing tegen 7906183 t' * 5 fosfaat gebufferde zoutoplossing gedialyseerd, weer op zijn oorspronkelijke volume gebracht (2,5 al) door negatieve druk en op zijn aktiviteit tot reagine binding onderzocht door de radioallergosorbens (RAST) inhi-bitiemethode.

5 Fotooxydatie van antigeen B

3 Mg AgB (0,U ml) en 2 ml 0,2 molaire fosfaatbuffer (pH

9) werden in 10 ml serumflesjes overgebracht. De flesjes werden met alu-miniumfoelie af gedekt, zodat geen licht kon binnenkomen. In ëlk flesje werd 0,5 ml methyleenblauw gefotosensibiliseerde 0,2 mg/ml in 0,2 mo-10 laire fosfaatbuffer (pH 9) overgebracht en het reaktiemengsel werd met 0 verzadigd, doordat het gas 8-10 minuten zachtborrelend in de oplossing werd geleid. De serumflesjes werden onmiddelijk met een stop afgesloten en 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Het aluminiumfoelie werd van de flesjes verwijderd en de inhoud van de flesjes werd aan twee 150 Watt 15 lampen, die op 3,8 cm van de flesjes waren opgesteld, gedurende wisselen de perioden bij 37°C blootgesteld. De monsters werden uit de flesjes verwijderd en tegen gedestilleerd water in Spectropor membranen (porie-grootte 6000-8000 molekulairgewicht) (spectrum Medical Industries, Ine.

Los Angeles, California) U8 uur gedialyseerd.

20 Aminozuur analyse

Monsters van 3 mg AgB en gefotoöxydeerd antigeen B (/X-AgB) (0,5 uur, 1 uur en 2 uur fotooxydatie) werden in Pyrex digestie-buizen (13 x 100 mm) tot droog gelyophyliseerd. Elk monster werd in 5*7 Normaal HC1 weer gesuspendeerd en met stikstofgas behandeld; het gas werd 25 10 minuten in elke buis geleid; daarna werd elke buis door een zuurstof- fakkel gesloten en 20 uur tot 110°C verhit. De aminozuuranalyse van elk monster werd volgens Spackman cs. (Anal.Chem. 30 (1958), 1190) met een aminozuuranalyseerapparaat volgens Beekman, model 120 C uitgevoerd. Het tryptophangehalte werd volgens Speis en Chambers (Anal.Chem. 2\_ (19^9), 30 12^9) bepaald. De resultaten staan in tabel A.

7906183 i t > 6

Tabel A

Effekt van fotooxydatie op de aminozuursamenstelling van antigeen B Aminozuurrest Natief AgBa OX-AgB

0,5 uur 1 uur 2 uur

Aspartinezuur 7 777

Glutaminezuur 8 888

Threonine 5 555

Serine k k k h

Proline i* k 14-

Glycine 3 3 3 3

Alanine 1U 1¼ 1¼

Valine 5 555

Methionine 1 0,5 spoor spoor

Isoleucine 2 222

Leucine H 1+ 1+ J+ fenylalanine 3 333 tyrosine 2 000 tryptofaan 6 333 lysine 6 666 histidine J_ J_ J_ totaal aantal resten 75 69,5 69 69 umolen aminozuur a: cijfers stellen mol protejne voor en zijn tot het dichtsbijzijnde gehele getal afgerond.

7906183 A » 7

Antisera

Konijnen anti-WST serum, bereid zoals al is beschreven (Malley cs. zie hierboven (1967))» bevatte 1,1 mg antilichaam proteïne/ ml tegen AgB. Menselijk reagine serum, gericht tegen Timothy pollen anti-5 genen, verd van 50 patiënten verkregen en bij elkaar gevoegd (van elk 5 ml). Dit mengsel had een Prausnitz-Kuestner (P-K) titer 1:2500. Precipitatieanalyse

Konijnen anti-WST serum (0,5 ml) verd toegevoegd aan 0,5 ml of ΟΧ-AgB met wisselende concentraties (0,03-1mg proteïne). De 10 mengsels werden bij 37°C 30 minuten en bij H°C U8 uur geïncubeerd. De neerslagen werden drie maal met 0,01 molaire cacodyline zoutoplossing buffer (pH 7) uitgewassen en aan de lucht gedroogd; de gedroogde precipi-taten werden volgens Campbell cs. (zie boven, blz. 136) gekwantificeerd.

Het proteïnegehalte van elk neerslag werd door nesslerizatie (zie Campbell 15 cs. hierboven, blz. 53) bepaald. De resultaten zijn in fig. 1 weergegeven.

De opgegeven waarden zijn het gemiddelde van duplobepalingen.

Passieve overdrachtsuroeven

Verdund bijeengevoegd serum (0,1 ml) werd op verschillende plaatsen van de huid van een niet-allergische vrijwilliger intradermaal 20 gespoten en b8 uur later werd elke plaats blootgesteld aan 0,025 al AgB

(0,1 ^ug proteïne/ml). De reakties werden 30 minuten later afgelezen en als volgt ingedeeld; negatief 5-10 mm kring +; 10-15 mm kring 2+; 15-20 mm kring 3+ en meer dan 20 mm kring 1»+. De resultaten staan in tabel B.

Tabel B

25 Passieve overdrachtsresktiwiteit van natief en gefotooxydeerd antigeen B

met een mengsel van menselijk anti-timothy sera

Antigeen Proteïne- P-K reakties8, concentratie 1:100 1:200 1:U00 1:800 1:1000 (yUg/ml) 30 AgB 0,1 k+ U+ 3+ 3+ 2+ 0X-AgBb 10,0 - - - a: Een serummengsel afkomstig van 50 voor Timothy graspollen gevoelige mensen verd in deze proeven gebruikt; de gemiddelde P-K titer van dit se-35 rum was 1:2500. Verdund serum (0,1 ml) werd op verschillende plaatsen in- 7906183 ί X \ 8 tradermaal in de huid van een niet-aUergische vrijwilliger ingespoten. Elke plaats verd aan 0,025 ml antigeen 1+8 uur later blootgesteld, h: de 1 uur en 2 uur monsters.

Radioallergosorbens inhibitie 5 2 Gram ronde stukken Whatman 3 MM papier (diameter 3 mm) werden met CNBr volgens March cs. (Anal.Biochem. 60 (197^)» 1^9) geakti-veerd. De geaktiveerde ronde stukken werden op een gesinterd glas filter met 500 ml koude 0,1 molaire NaHCO^-zoutoplossing buffer (pH 9) uitgewassen en de vochtige stukken werden aan 30 ml van een WST-oplossing 10 (1 mg proteïne/ml) in 0,1 molaire NaHCOzoutoplossing buffer (pH 9) toe gevoegd. Dit mengsel wrd bij U°C 36 uur geroerd en met telkens 500 ml van de volgende koude reagentia uitgewassen: 0,2 molaire NaoC0 , 2 molaire 2 3 ureum, 0,2 molaire NaAc en 0,1 molaire met fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,2). De met WST bedekte ronde stukken papier werden bij 1+°C in 15 met fosfaat gebufferde zoutoplossing bewaard, totdat zij werden gebruikt.

0,1 Ml menselijk reagine serum (1:37,5 verdund, P-K titer 10.000) afkomstig van een voor Timothy gevoelige patient werd bij 37°C 1+5 minuten met 0,1 ml AgB of OX-AgB met vissêèende concentraties (0,5-20 jug proteïne) geïncubeerd. De met WST bedekte papierschijven wer-20 den drooggedept en 1 schijf werd bij elk mengsel voorafgeincubeerd rea gine gevoegd. Na een incubatietijd van 6 uur bij kamertemperatuur werd elke schijf drie maal (3 x 5 ml) uitgewassen en aan elke schijf werd 5000-8000 cpm^ I-anti-IgE toegevoegd. De mengsels werden bij 1+°C 16 uur geïncubeerd. De met WST bedekte schijven werden vier maal (1+ x 5 ml) met 25 RAST-buffer uitgewassen en met een Packard scintillatiesteller (Packard

Instrument Company, Inc., Downers Grove, 111.) geteld 20-30 Procent van 1P«5 het toegevoegde -Ί-anti-IgE werd aan schijven gebonden, toen het rea-gineserum vooraf met normaal menselijk serum werd geïncubeerd. Het percentage inhibitie, dat met AgB en ΟΧ-AgB werd bereikt, werd met onder-30 staande vergelijking verkregen:

% Inhibitie = (1- RAST tellingen met toegevoegde fraktie χ 1QQ

RAST tellingen zonder fraktie

De resultaten staan in fig. 2 weergegeven. De vermelde waarden zijn het gemiddelde van duplobepalingen.

7906183 ------ #- ’ 9 jTrmrnnÏ saties LAF.J muizen (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) werden met WST geïmmuniseerd, zoals al is beschreven (Fairchild cs. J.

Immunol. 115 (1875) 1A6). De immunoginiciteit van ΟΧ-AgB werd onderzocht 5 door im-munisatie van LAF^ muizen met OX-AgB (10-I00^ug), dat aan alumi- niumhydroxyde was geadsorbeerd (Levine cs. Int.Arch.Allergy 3£ (1970) 156). Met wekelijkse tussenpozen werden gedurende 2 weken dieren met OX-AgB geïmmuniseerd waarna zij 3 weken later opnieuw met OX-AgB werden behandeld. Bloedmonsters werden 7 dagen na de eerste injectie 7» 10 en 10 11; dagen na de tweede injecties en 7, 10 en 1 h dagen na de laatste in jecties met OX-AgB verzameld. De serum IgG^ en IgE titers van geïmmuniseerde muizen werden door passieve huidanaphylaxis bepaald, zoals al is beschreven (Fairehild es., zie hierboven). De resultaten zijn in fig. 3 weergegeven. De opgegeven titers zijn het gemiddelde bij tenminste 2 15 dieren bij een serummengsel afkomstig van tenminste 5 muizen. De pijlen geven aan, toen de muizen met AgB of OX-AgB werden geïmmuniseerd.

Fotooxydatie zette het geel gepigmenteerde AgB in een kleurloos materiaal om, waarbij de optische dichtheid bij 280 nm dienovereenkomstig- afnam. Bij vergelijking van de amino zuur samenstelling van 20 AgB en verscheidene ΟΧ-AgB monsters (tabel A) blijkt een volledige vermindering in het tyrosinegehalte van ΟΧ-AgB en een afname in het gehalte aan methionine en tryptophan; de andere aminozuren bleven echter naar verhouding onveranderd, een feit, dat dees veronderstellen, dat de poly-peptidestnuctuur van AgB door fotooxydatie niet sterk werd veranderd.

25 Het effekt van fotooxydatie op de antigene determinanten van AgB werd onderzocht door AgB en ΟΧ-AgB te vergelijken ten aanzien van hun vermogen om (1) konijnen antilichaam tegen AgB neer te slaan, (2) om P-K reakties op te wekken in de huid van een niet-allergisch individu, dat met IgE-houdend serum, afkomstig van voor Timothy gevoelige 30 patiënten, passief was gesensibiliseerd en (3) om specifieke IgE aan met WST bedekte papieren schijven in de RAST-bepaling af te remmen.

Konijnen anti-Timothy serum, dat 1,1 mg antilichaam pro-teïne/ml tegen AgB bevatte, gaf geen precipiteerbaar antilichaam met OX-AgB (0,5 uur, 1 uur en 2 uur monsters) (zie fig. 1) 35 Uit tabel B blijkt, dat AgB (2,5 mg) zelfs bij een 1:1000 7906183 # „ -ί.

10 verdunning van het reaginemengsel sterke P-K reakties opwekte» Een concentratie van OX-AgB (1 uur en 2 uur monsters), die 100 maal zo groot (250 ng) als de AgB-coneentratie was, deed daarentegen in de huid van de niet-allergische vrijwilliger geen allergische huidreakties ontstaan.

5 Het vermogen met OX-AgB om het hinden van I-anti-IgE

met Timothy reagine af te remmen werd verder onderzocht door de AgB en OX-AgB bindingsafremming in een RAST-onderzoek naar Timothy reagine anti- lichamen te vergelijken (zie fig. 2). In deze onderzoekingen gaf AgB een 125 lineaire, van de dosis afhankelijke afremming van I-anti-IgE binding 10 aan IgE-gebonden, met WST bedekte papieren schijven, maar OX-AgB (1 uur en 2 uur monsters) remden zelfs bij een concentratie van 20 yUg de 12^I-anti-IgE binding niet af. Met ureum behandeld AgB daarentegen gaf 125 een van de dosis afhankelijk afremming van I-anti-IgE gebonden, met WST bedekte schijven, identiek aan die van natief AgB.

15 Een andere manier om het effekt van fotooxydatie op de antigene determinant van AgB te bepalen is om de immunogene eigenschappen van natief en ΟΧ-AgB te vergelijken. LAF^ muizen werden in groepen van 5 dieren geïmmuniseerd met 10 yUg AgB proteïne of 10-100 ^ug OX-AgB proteïne (1 uur monster). Muizen, die met AgB waren geïmmuniseerd, maak-20 ten aanzienlijke hoeveelheden IgG^ en IgE antilichaam, nadat AgB voor een tweede en derde keer was ingespoten. Muizen daarentegen, die met hetzelfde immunisatieschema met 10 of 100 ^ug ΟΧ-AgB proteïne waren geïmmuniseerd, maakten geen IgG^ of IgE antilichaam, dat met AgB of ΟΧ-AgB reageerde (zie fig. 3).

25 Door antigeen opgewekte lymphocyttransformatie werd ge bruikt om de relatieve T-cel aktiverende eigenschappen van AgB en OX-AgB te vergelijken. Zie fig» U, waarin de opgegeven waarden het gemiddelde van quadruplobepalingen (afzonderlijke bepalingen variëren minder dan 10$ van de gemiddelden)·zijn. In het concentratiebereik, dat werd onderzocht 30 (0,1-10 yUg proteïne) gaf AgB een van de dosis afhankelijke toename in door Ag opgewekte uitbreiding van immune LAF^ muizen miltcellen OX-AgB (1 uur en 2 uur monsters) had echter bij 1 yug een piekresponse, die over de rest van de onderzochte concentraties aan ΟΧ-AgB klaarblijkelijk vlak verliep. Deze gegeven wijzen'erop, dat ΟΧ-AgB in sterke mate het door Ag 35 opgewekte uitbreidingsvermogen van natief AgB behoudt.

7908183 * 9- 11

Fotooxydatie van AgB resulteert in een algeheel verlies aan vermogen van ΟΧ-AgB om met konijnen anti-AgB (zie fig. 1) of met menselijke IgB antilichamen (zie tabel B, fig. 2) gericht tegen de antigene determinanten op AgB te reageren. Volledige hydrolyse van ΟΧ-AgB met zuur 5 vees erop, dat de enige duidelijke modificatie van natief AgB vas bij de quercitine- en tyrosinegedeelten (tabel B). Pogingen om de antigene determinant van AgB door denatureren van 8 molaire ureum te modificeren hadden geen resultaat omdat natief en met ureum behandeld AgB identieke dosis-response krommen voor I-anti-IgE binding aan IgE-gebonden, anti-geen geconjugeerde papieren schijven hadden (fig. 2). Deze gegevens, tezamen met gegevens van eerdere onderzoekingen (Malley cs. 1975a, 1975b, 1978), doen veronderstellen, dat het grootste deel van de antigene determinant van AgB niet van zijn driedimensionele polypeptidestructuur afhankelijk is, maar van de aanvezigheid van het pigment quercitine in 15 het antigeenmolekuul afhankelijk is.

Een aantal onderzoekingen (Takatsu cs. Cell Immunol. 20 (1975), 276. Scibienski cs. J.Exp.Med. 136 (1972), 1308, Turkin cs. Proc. lïatl.Acad.Sci. 7¾ ((1977) 398¾) hebben doen veronderstellen, dat door T-en B-cellen bepaalde determinanten kunnen verschillen. De B-cel recep-20 toren combineren met hapteen determinanten en T-cel receptoren worden door wisselwerking met drager determinanten op het antigeen geaktiveerd.

Uit bovenstaand voorbeeld blijkt duidelijk, dat ΟΧ-AgB niet met IgG^ of IgE antilichamen combineert en ook niet de produktie van antilichaam tegen AgB opwekt, een feit, dat doet veronderstellen, dat ΟΧ-AgB geen 25 voor het natieve antigeen specifieke cellen voorbereidt ("Prime”). Uit eerdere onderzoekingen is gebleken (Fairchild cs. J.Immunol. 117 (1976), 2137) dat de door AgB opgewekte uitbreidingsresponse van met AgB geïmmuniseerde muizen zowel een T-als van B-cellen het gevolg was. De drager determinant aan ΟΧ-AgB behoudt een aanzienlijk deel (meer dan %0%) van 30 de uitbreidingsresponse van immune miltcellen ten opzichte van AgB (fig.

3). Bovenstaand voorbeeld wijst erop, dat de drager determinant van 0X-AgB T-cellen, die met natief AgB zijn voor bereid ("Primed") aktiveert.

Voorbeeld II

De volgende werkwijze kan worden gébruikt om een antigeen 35 door oxydatie met chlooramine T te modificeren.

7906183 * I- * 12

Proteïne (1-5 mg) werd in k ml 0,05 molaire fösfaatbuffer (pH 7) opgelost. De proteïneoplossing werd in een 30 ml "bekerglas overgebracht en met een magneetroerder geroerd. Het bekerglas werd in een grote plastic schaal die met ijs was gevuld om de reaktieve componenten koud 5 te houden, gezet. Chlooramine T (100 ^ug-5mg), opgelost in 0,05 molaire fösfaatbuffer (pH 7) werd druppelsgewijs toegevoegd en gedurende verschillende perioden werd gemengd. Om de reaktie tot staan te brengen werd een gelijke gewichtshoeveelheid natriummetabisulfiet toegevoegd, zodat eventueel overgebleven oxydatiemiddel werd geneutraliseerd. Overmaat 10 reaktieve componenten werd verwijderd door de oplossing over een kolom

"Sephadex G25", die in water in evenwicht was gebracht, te leiden. De doorbraakpiek, die het proteïne bevatte, werd verzameld en gelyophyliseerd. Voorbeeld III

Onderstaande werkwijze kan worden gebruikt om een anti-15 geen door oxydatie met lactoperoxydase te modificeren.

Proteïne (1-5 mg) werd in ^ ml 0,01 molaire met fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7) opgelost. 200 ^uG lactoperoxidase en 25 yul 0,03-0,1?S-ig HgOg verden toegevoegd. Het reaktiemengsel werd 10-20 minuten bij 37°C geincubeerd en in deze tijd werden nog twee porties van 20 25 yul HgOg toegevoegd. De reaktie werd tot staan gebracht door 10 vo- lumedelen koude 5 molaire 1-cysteïne-HCl in met fosfaat gebufferde zoutoplossing toe te voegen. Het proteïne werd gewonnen door het mengsel over een kolom ’‘Sephadex G75" te leiden. Het enzyme werd niet door het ’’Sephadex G75” vastgehouden, terwijl antigeen B door het moedermateriaal 25 werd tegengehouden. Fit materiaal werd geëlueerd door de kolom ononder broken met de buffer uit te wassen. Het geëlueerde proteïne werd door lyophiliseren geconcentreerd.

7906183

Claims (12)

1. Werkwijze voor het modificeren van de antigene eigenschappen van een quercitinegedeelte "bevattend graspollen antigeen of fragment ervan, dat de structuurformule van het formuleblad, waarin G glucose en T threonine of een via een threoninemolekuul aan genoemde 5 structuur gebonden peptide voortstelt heeft, met het kenmerk, dat het an tigeen aan zodanige oxydatieomstandigheden wordt blootgesteld, dat de di-hydroxy aromatische ringen hergroepering en ringsplitsing ondergaan, waardoor een produkt ontstaat, dat nagenoeg geen antigene eigenschappen bezit, maar in staat is om T-cellen te aktiveren en T -cellen te doen ont- s 10 staan.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het graspollen antigeen antigeen B, antigeen D, antigeen , antigeen Dg of antigeen D^ is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de 15 oxydatieomstandigheden ook de hergroepering en nngsplitsing van de hy droxy aromatische ring, die in het tyrosine gedeelte van het peptide T aanwezig is, ten gevolge hebben. U. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de mate van de oxydatie voldoende is om een gemodificeerd antigeen te doen 20 ontstaan, dat niet kan reageren met antilichamen, die gericht zijn tegen de antigene determinantstructuur van het uitgangsantigeen.

5. Werkwijze volgens conclusie U, met het kenmerk, dat de oxydatieomstandigheden zodanig zijn, dat aanzienlijke modificatie van het aminozuurgehalte van het antigeen wordt vermeden.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het graspollen wordt gefotooxydeerd.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de fotooxydatie wordt bewerkstelligd, doordat een waterige oplossing van het antigeen met zuurstof wordt verzadigd en deze oplossing vervolgens aan 30 licht wordt blootgesteld.

8. Gemodificeerd graspollen antigeen, zoals kan worden bereid onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 1. 9* Gemodificeerd graspollen antigeen, zoals kan worden 7906183 ik bereid onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 2. 10* Gemodificeerd graspollen antigeen, zoals kan worden bereid onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 5.

11. Gemodificeerd graspollen antigeen, zoals kan worden 5 bereid onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 6.

12. Gemodificeerd graspollen antigeen, zoals kan worden bereid onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 7.

13. Immunotherapeutische werkwijze ter behandeling van graspollen allergie, met het kenmerk, dat aan een individu een hoeveel- 10- heid van het gemodificeerde graspollen antigeen volgens conclusie 8 wordt toegediend, die voldoende is om suppressor T-cellen te doen ontstaan, die een onderdrukking van allergische antilichamen tegen graspollen antigeen ten gevolge hebben. 1¾. Immunotherapeutische werkwijze ter behandeling van 15 graspollen allergie met het 'kenmerk, dat aan een individu een hoeveelheid van het gemodificeerde graspollen antigeen volgens conclusie 9 wordt toegediend, die voldoende is om suppressor T-cellen te doen ontstaan, die een onderdrukking van allergische antilichamen tegen graspollen antigeen ten gevolge hebben.

15. Immunotherapeutisch preparaat, dat geschikt is voor het afremmen van allergische reakties bij mensen en lagere dieren, met het kenmerk, dat het bestaat uit een gemodificeerde graspollen antigeen volgens conclusie 8 en een inerte drager ervoor in de vorm van een eenheids-dosis.

16. Immunotherapeutisch preparaat, dat geschikt is voor het afremmen van allergische reakties bij mensen en lagere dieren, met het kenmerk, dat het uit het gemodificeerde graspollen antigeen volgens conclusie 9 en een inerte drager ervoor in de vorm van een eenheidsdosis bestaat . 7906133