KR20220110218A

KR20220110218A - 화장품 및 의약용 펩타이드 및 조성물

Info

Publication number: KR20220110218A
Application number: KR1020227020097A
Authority: KR
Inventors: 아리아드나 그라우-캄피스타니; 실비아 파스토르; 파트리시아 카룰라; 후안 카를로스 에스쿠데로
Original assignee: 리포트루, 엘스.엘.
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-08-05
Also published as: TW202133874A; WO2021110608A1; CN115175654A; CA3158812A1; US20220389058A1; EP3831358A1; AU2020395867A1; JP2023504461A

Abstract

본 발명은 IL-33의 발현을 조절할 수 있고, 따라서 피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점의 예방, 감소 및/또는 제거에 유용한 펩타이드 및 그의 조성물에 관한 것이다.

Description

화장품 및 의약용 펩타이드 및 조성물

본 발명은 분자 생물학 분야에 관한 것으로, 보다 정확하게는 화장품 및/또는 의약에 적용되는 분자 생물학, 더욱 정확하게는 피부 노화의 징후를 감소, 예방 및/또는 제거할 수 있고, 피부 회춘 및/또는 보다 정확하게는 눈의 피부 결점을 감소, 예방 및/또는 제거할 수 있는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명은 안과 치료 및/또는 눈과 관련된 증상을 치료하는데 유용한 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

지난 수십 년 동안 개인의 미학에 관한 관심이 증가하고 피부 노화 징후의 출현을 지연시키거나 최소화하고자 노력해 왔다.

피부는 인체에서 가장 큰 기관이며 신체 인터페이스에서 그의 위치로 인해 내인적(경시적(chronologic)) 노화와 외인적 노화의 영향을 받으며, 후자는 환경적 요인(예: 자외선, 흡연, 오염 또는 수면 부족)에 의해 일어난다.

이러한 의미에서 가장 흔한 피부 노화 징후 중 일부는 얼굴(안면 피부 노화 징후), 보다 정확하게는 눈 주변, 예를 들어, 아이백(eyebags), 눈꺼풀 결점, 눈 주변 주름 및 다크 서클(안와주위 과색소증)에 있다. 이들은 또한 그들의 존재 및/또는 증가가 더 나이 들어 보이는 외모를 제공하기 때문에 사회에서 더 많은 관심을 야기하는 피부 노화 징후 중 하나이다. 따라서 이러한 모든 징후의 예방 및/또는 치료에 관심이 있다.

가장 중요한 눈꺼풀 결점은 늘어진(droopy) 및/또는 처진(sagging) 눈꺼풀과 관련된 것이다. 일반적으로 나이가 들면서 눈 주위의 피부와 근육이 약해져서 눈꺼풀이 처지기 때문이다. 태양에 대한 노출과 노화의 자연스러운 영향으로 인해 눈 주위의 피부가 더 처질 수 있다. 노화와 관련하여, 나이가 들면 피부가 탄력이 떨어지고, 얼굴이 탱탱해지지 않아 눈가가 늘어지거나 과도하게 늘어지는 경우가 많다. 처진 눈꺼풀은 다양한 원인이나 근본적인 의학적 또는 미용적 장애로 인해 발생할 수 있다. 일반적으로 처진 눈꺼풀은 피부이완증(dermatochalasis), 안검하수증(예: 건막성 안검하수증(aponeurotic ptosis) 및 건막성 안검하수(aponeurotic blepharoptosis)), 안검 외반(ectropion) 및 안검 내반(entropion)으로 인한 것이다(Wendell Damasceno, R. et al. Eyelid aging: pathophysiology and clinical magement, Arq Bras Oftalmol. 2015; 78(5):328-31). 눈꺼풀 결점(바람직하게는 처진 눈꺼풀)은 일반적으로 비염증 기반의 처진 눈꺼풀을 언급할 때 미용 상태로 간주되지만, 염증으로 인한 눈꺼풀 처짐 결점(예: 광범위하게 처진 눈꺼풀)의 경우, 시야 상실, 안구 또는 눈꺼풀 자극 및 두통을 유발할 수 있으므로 의학적 상태가 된다.

당업계에 잘 알려진 바와 같이, 대부분의 피부 노화 징후는 산화 스트레스 및/또는 염증으로 인해 생기거나 유래되며, 이는 차례로 시간적 노화 또는 환경 인자(예: 자외선 또는 수면 부족)에 의해 유발된다.

인터루킨-33(이하, IL-33이라고 함)은 IL-1 패밀리의 구성원이다. 이는 유전자 발현의 세포내 조절자로서의 역할과 세포외 경보 매개체로서의 역할을 수행하는 이중 기능을 갖는 염증 유발 인자이다. 이는 고아 IL-1 패밀리 수용체의 이종이량체 막 결합 수용체인 ST2에 대한 리간드이다.

IL-33은 섬유아세포, 비만 세포, 수지상 세포, 대식세포, 골아세포, 내피 세포 및 상피 세포(예: 각질 세포)를 비롯한 다양한 세포 유형에 의해 발현된다(Martin, N.T. and Martin, M.U. Interleukin 33 is a guardian of barriers and a local alarmin, Nature Immunology (2016) 17, 122-131).

항상성 동안, 핵 IL-33은 폐, 피부 및 위와 같은 상피 장벽 조직에서 높은 수준으로 구성적으로 발현된다. 전장 생체 활성 IL-33은 알레르겐에 노출되거나 바이러스 또는 기생충에 감염되면 조직 손상 및 세포 사멸(또는 세포 스트레스)시 핵에서 세포외로 방출된다. 방출 후, IL-33은 비만 세포 및, 가장 중요하게는 다량의 IL-5 및 IL-13을 분비하는 ILC2를 비롯한 다양한 유형의 면역 세포를 활성화하여 면역 체계에서 '경고를 높인다'. 계획된 세포 사멸(apoptosis) 후, IL-33은 면역계가 불필요하게 경고하는 것을 피하기 위해 카스파제에 의해 비활성화된다. 전장의 IL-33이 활성이지만, 염증성 프로테아제(cathepsin G, elastase)에 의해 더 짧은 '과활성' 성숙한 형태로 처리될 수 있으며, 이는 생체 내에서 중요한 생체활성 형태일 수 있다.

IL-33의 작용 범위와 지속 시간은 ST2에 대한 결합을 억제하는 급속 산화에 의해 조절된다.

최근 몇 년 동안 IL-33은 참여하는 것으로 밝혀진 수많은 신호 전달 과정으로 인해 주목을 받았으며, 따라서 예를 들어, 다음과 같은 여러 미용 및 의료 기능에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다:

- 피부 염증: UV 방사선에 노출되면 각질형성세포와 진피 섬유아세포에서 IL-33 발현이 유도된다(Napier Byrne, S., et al. The immune-modulating cytokine and endogenous alarmin Interleukin-33 is upregulated in skin exposed to inflammatory UVB Radiation. The American Journal of Pathology, 179 (2011), 211-222).

- 피부장벽 : IL-33은 피부장벽 조절 효과가 있다. IL-33의 증가는 필라그린의 발현을 감소시키고, 알레르겐, 박테리아 및 바이러스의 침입을 촉진하는 피부 장벽을 방해한다(Seltmann, J. et.al. IL33 impacts on the skin barrier by downregulating the expression of filaggrin. J Allergy Clin Immunol, Volume 135, Number 6, pages 1659-1661).

- 혈관성: IL-33은 혈관신생 및 혈관 투과성을 촉진한다(Choi, Y. et.al. Interleukin-33 induces angiogenesis and vascular permeability through ST2/TRAF6-mediated endothelial nitric oxide production. Blood, 1 October 2009, volume 114, number 14, pages 3117-3126).

- 색소 침착: IL-33은 멜라닌 세포에서 멜라닌 생합성을 개선함으로써 멜라닌 생성 촉진 활성을 가지고 있다(Zhou, J. et.al. Enhancement of the p38 MAPK and PKA signaling pathways is associated with the pro-melanogenic activity of Interleukin 33 in primary melanocytes. Journal of Dermatological Science, 73 (2014), 110-116).

따라서 IL-33은 각질형성세포 응집력을 감소시키고, 색소침착을 증가시키며, 염증 및 혈관 투과성을 증가시키며, 따라서 위에서 언급한 모든 피부 징후와 관련되어 있다.

수면 부족(최적의 수면 시간보다 짧은 시간, 수면 시간의 완전한 부족 또는 일주기 패턴의 변화)도 피부에 중요한 영향을 미치며, 피부 노화 및/또는 피부 결점의 촉진제이다. 수면 부족과 관련된 일부 피부 속성에는 거칠고 칙칙하고 건조한 피부뿐만 아니라 처진 눈꺼풀과 다크 서클이 있다. 효과는 시각적 특성에 국한되지 않지만, 수면 부족은 피부 질환 악화, 피부 장벽의 완전성 손상, 염증성 사이토카인, 글루코코르티코이드 생성 증가뿐 아니라, 포도당 및 코티솔 수치의 증가와 멜라토닌 수준의 감소와 같은 피부의 건강 및 생리학에 영향을 미칠 수 있다(Kim, M.A. et al. The effect of sleep deprivation on the biophysical properties of facial skin, Journal of cosmetics, dermatological sciences and application (2017) 7, 34-47; and Guan L., Mehra R., Baron E. (2017) Sleep and Aging Skin. In: Farage M., Miller K., Maibach H. (eds) Textbook of Aging Skin. Springer, Berlin, Heidelberg).

포도당 농도의 상승은 피부의 섬유아세포뿐만 아니라 각질형성세포의 증식에 부정적인 영향을 미친다(Kruse, C.R. et al. The effect of local hyperglucemia on skin cells in vitro and on wound healing in euglycemic rats, Journal of Surgical Research (2016) 206, 418-426). 피부 섬유아세포 증식의 손상은 노인의 피부에서 관찰된 상처 치유 지연과 유사한, 상처 치유 지연을 초래한다(Buranasin, P., High glucose-induced oxidative stress impairs proliferation and migration of human gingival fibroblasts, PLoS ONE (2018) 13).

글루코스 농도의 증가가 이러한 각질형성세포의 말단 분화 및 형태의 변화를 초래한다는 증거도 있다(Spravchikov, N. et al. Glucose effects on skin keratinocytes, Diabetes (2001) 50, 1627-1635). 이러한 말단 분화된 세포는 새로운 세포를 생성하는 능력을 상실하고, 사이클린 의존성 키나제 억제제의 상향 조절 및 세포 주기의 양성 매개체의 하향 조절을 통해 말단 상태에서 정지된다.

종종 인슐린 결핍이나 인슐린 저항성을 동반하는 고혈당증은 자가 조절 장애와 미세혈관의 투과성을 증가시킨다.

코티솔과 관련하여, 피부에서 상승된 수준의 글루코코르티코이드는 투과성 장벽 항상성 저하, 각질층 응집력 저하, 상처 치유 감소, 표피의 선천성 면역 저하로 이어지며(Altemus, M., Stress-induced changes in skin barrier function in healthy women, Journal of Investigative dermatology (2001) 117, 309-317), 이 들은 모두 차례로 피부의 내재적 노화를 초래할 수 있다. 또한, 수면 부족은 과도한 글루코코르티코이드 분비를 유발하여 피부 노화를 촉진하는 생리적 스트레스를 일으킬 수 있다. 과잉 글루코코르티코이드는 또한 지질 합성을 억제하여 층판체의 생성 및 분비를 저하시켜 표피 장벽에 추가 손상을 줄 수 있다.

피부 세포는 막 결합 및 핵 멜라토닌 수용체를 모두 발현하여, 멜라토닌이 모발 성장 순환, 모발 색소 침착, 흑색종 조절, 항산화 활성 및 피부 세포에 대한 자외선 유발 손상 억제와 같은 여러 필수 기능에서 역할을 할 수 있도록 한다 (Slominski, A., On the role of melatonin in skin physiology and pathology, Endocrine (2005) 27, 137-148). 멜라토닌은 산화 스트레스로 인한 노화 관련 피부 변화를 감소시키고 자외선으로 유발된 피부 노화에 대한 보호를 통해 피부의 외적 노화를 예방하는 것으로 나타났다. 멜라토닌의 조절 장애는 궁극적으로 피부의 완전성에 악영향을 미치고, 피부에 대한 멜라토닌의 자연적인 노화 방지 효과를 방지한다. 이것은 UV 손상으로 인한 피부의 외적 노화와 산화 스트레스로 인한 피부의 내적 노화를 모두 증가시킨다.

또한, 멜라토닌은 항산화제 및 제거제(scavenger) 특성을 가지고 있다(Reiter, R.J., Melatonin as an antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans, Acta Biochim Pol (2003) 50, 1129-1146).

멜라토닌은 또한 각질형성세포에 대한 고혈당증 손상을 감소시켜, 전염증성 사이토카인 수준을 감소시킨다(Song, R., Melatonin promotes diabetic wound healing in vitro by regulating keratinocyte activity, Am J Transl Res (2016) 8, 4682-4693).

최근 몇 년 동안, 피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점을 개선하기 위한 활성 성분의 수가 상당히 증가했다. 이러한 활성 성분의 예로는 레티노이드, 비타민 또는 식물 추출물이 있다(Bradley E.J., Griffiths C.E.M., Sherratt M.J., Bell M. and Watson R.E.B. (2015), Over-the-counter anti-ageing topical agents and their ability to protect and repair photoaged skin. Maturitas, 80, 265-272).

레티노이드의 경우, 주목할만한 것은 레티노산인데, 이는 오늘날 ECM의 여러 분자의 합성 유도를 위한 '황금 표준'이다(for example, collagen, fibronectin or laminin; Varani J., Mitra R.S., Gibbs D., Phan S.H., Dixit V.M., Mitra R., Wang T., Siebert K.J., Nickoloff B.J., Voorhees J.J. (1990), All-Trans Retinoic Acid Stimulates Growth and Extracellular Matrix Production in Growth-Inhibited Cultured Human Skin Fibroblasts. The Journal of Investigative Dermatology, 94, 717-723). 따라서 레티노산은 콜라겐 및 피브로넥틴과 같은 ECM 단백질의 전사 및 합성, 및 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase, 이하에서는 MMP라 함)의 억제를 상향 조절하여 안면 주름의 임상적 외관을 크게 개선할 수 있기 때문에, 노화 징후를 치료하는 가장 강력한 화합물 중 하나로 간주되어 왔다 (Varani J., Mitra R.S., Gibbs D., Phan S.H., Dixit V.M., Mitra R., Wang T., Siebert K.J., Nickoloff B.J., Voorhees J.J. (1990), All-Trans Retinoic Acid Stimulates Growth and Extracellular Matrix Production in Growth-Inhibited Cultured Human Skin Fibroblasts. The Journal of Investigative Dermatology, 94, 717-723). 그러나 레티노산의 사용에는 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어, 레티노산은 피부 자극을 쉽게 유발할 수 있으므로 주의해서 사용해야 하며, 레티노산과 태양 노출을 함께 하는 것은 권장하지 않는다. 레티노이드를 사용할 때의 또 다른 주요 관심사는 특히 산소와 광의 존재 하에서의 불안정성이다(Sorg O., Antille C., Kaya G. and Saurat J-H. (2006), Retinoids in cosmeceuticals. Dermatologic Therapy, 19, 289-296).

항산화제는 또한 피부의 유리 라디칼 농도를 감소시기키 위해 사용되고, 따라서 콜라겐 분해를 방지한다. 상기 항산화제의 예는 아스코르브산(비타민 C로도 알려짐)이다. 아스코르브산은 그의 항산화 효과 외에도 ECM(콜라겐 I 및 III과 엘라스틴)에서 단백질 합성을 유도하는 한편, 표피 분화를 촉진하고 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(MMP1)을 억제한다. 불행하게도, 아스코르브산은 특히 고온, 호기성 조건, 높은 pH 및/또는 광에 노출될 때 극도로 불안정하며 산화된다(Manela-Azulay M., Azulay V., Aguinaga F., Issa M.C. (2017), Vitamins and other Antioxidants. Daily Routine in Cosmetic Dermatology, 1-13).

화학적으로 합성된 화합물 외에도, 광범위한 식물 추출물 및 식물 유래 화합물이 예를 들어, 레스베라트롤(resveratrol, 항산화제)을 포함하는 포도 추출물; 폴리페놀을 포함하는 녹차; 또는 이소플라본을 포함하는 대두와 같은 다양한 용도로 시장에서 발견된다. 그러나 이들 성분의 생체 내 효능 및 조성은 과학적으로 충분히 검증되지 않았다.

히알루론산은 점탄성 특성과 수분 보유 능력으로 인해, 화장품 산업에서 피부를 촉촉하게 유지하고, 탄력을 유지하며 거칠기를 개선하여 주름을 치료하거나 피부 필러로도 사용되었다. 그러나 현재 히알루론산은 수탉 빗(rooster combs)이나 박테리아 추출물과 같은 여러 공급원에서 얻어지며, 결과적으로 이들 제품에는 불순물이 포함될 수 있어 철저히 특성화해야 한다(Kogan G., Solt

s L., Stern R. and Gemeiner P. (2007), Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications. Biotechnological Letters 29, 17-25).

한편, 펩타이드는 피부 노화의 징후를 개선하기 위해 화장품 배합에 혼입될 수도 있다. 생체 활성 펩타이드는 신체의 자체 분자를 모방하고 콜라겐 합성과 같은 과정에 영향을 줄 수 있어 훨씬 더 나은 내약성과 안정성을 갖는다는 장점이 있다. 또한, 광범위한 활성, 화학 및 적응증을 개발할 수 있다(Zhang L. and Falla T.J. (2009), Cosmeceuticals and peptides. Clinics in dermatology, 27, 485-494).

해당 분야의 광범위한 화합물 및/또는 추출물에도 불구하고, 피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점의 예방, 감소 및/또는 제거를 가능하게 하는 신규한 작용 기전을 갖는 개선된 활성제 및 조성물에 대한 요구가 여전히 존재하며, 보다 정확하게는 IL-33을 표적으로 하고 원하는 미용 및 의학적 효과를 제공하는 새로운 분자(바람직하게는 생체분자)를 찾을 필요가 있다.

본 발명의 발명자들은 광범위하고 철저한 연구 끝에 놀랍게도 IL-33의 발현을 조절할 수 있고(하향조절), 따라서 화장품 및 의약에서 유용한 펩타이드를 발견하였다. 본 발명의 펩타이드는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점, 보다 바람직하게는 안면 피부 노화, 더욱 바람직하게는 피부 노화 징후 및/또는 눈 또는 그 주변의 피부 결점, 훨씬 더 바람직하게는, 아이백(eyebags), 눈꺼풀 결점, 눈 주위의 주름 및 다크 서클(안와주위 과색소증)을 예방, 감소 및/또는 제거할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 또한 놀랍게도 수면 부족에 의해 생성된 피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점을 예방, 감소 및/또는 제거할 수 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 그 활성으로 인해 약물에서도 유용하다.

제1 측면에서, 본 발명은 IL-33의 발현을 조절(하향 조절)할 수 있는 펩타이드에 관한 것이다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점의 예방, 감소 및/또는 치료를 위해 화장품 및 약물에서 유용하다.

또한, 제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물의 화장품으로서의 용도에 관한 것이다.

제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물의 미용 용도에 관한 것이다.

제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물의 사용을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상의 미용 치료 방법에 관한 것이다.

제6 측면에서, 본 발명은 약물로서 사용하기 위한 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

제7 측면에서, 본 발명은 약물의 제조를 위한 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

마지막 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물의 사용을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상의 의학적 치료 방법에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "비환상(non-cyclic) 지방족 그룹" 및 이의 복수형은 당해 기술 분야에서 상기 용어에 대해 주어진 공통 의미를 갖는다. 따라서, 이들 용어는 예를 들어, 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐 및 알키닐 그룹을 가리키며, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "알킬 그룹" 및 그의 복수형은 1 내지 24, 바람직하게는 1 내지 16, 보다 바람직하게는 1 내지 14, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 12개, 훨씬 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 가지며, 단일 결합에 의해 분자의 나머지 부분에 결합되어 있는 포화 선형 또는 분지형 그룹을 말하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-프로필, i-프로필, 이소부틸, tert-부틸, n-부틸, sec-부틸, n-펜틸, n-헥실, 헵틸, 옥틸, 데실, 도데실, 라우릴, 헥사데실, 옥타데실, 아밀, 2-에틸헥실, 2-메틸부틸, 5-메틸헥실 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 알킬 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "알케닐 그룹" 및 이의 복수형은 2 내지 24개, 바람직하게는 2 내지 16개, 보다 바람직하게는 2 내지 14개, 훨씬 더 바람직하게는 2 내지 12개, 심지어 더욱 바람직하게는 여전히 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자와, 공액 또는 비공액의 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 가지며, 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 결합되는 선형 또는 분지형 그룹을 말하며, 예를 들어, 비닐, 올레일, 리놀레일 및 유사한 그룹을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 알케닐 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "알키닐 그룹" 및 그의 복수형은 2 내지 24개, 바람직하게는 2 내지 16개, 더 바람직하게는 2 내지 14개, 더욱 더 바람직하게는 2 내지 12개, 여전히 더 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자와, 공액 또는 비공액의 하나 이상의 탄소 탄소 3중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 3중 결합을 가지며, 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 결합되는 선형 또는 분지형 그룹을 말하며, 예를 들어, 에티닐 그룹, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 3-부티닐, 펜티닐, 예를 들면, 1-펜티닐 및 유사한 그룹을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 알키닐 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "지환족(alicyclic) 그룹" 및 그의 복수형은 당해 기술 분야에서 상기 용어에 주어진 공통 의미를 갖는다. 따라서, 이들 용어는 예를 들어, 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐 또는 사이클로알키닐 그룹을 말하며, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "사이클로알킬" 및 그의 복수형은 3 내지 24개, 바람직하게는 3 내지 16개, 더 바람직하게는 3 내지 14개, 더욱 더 바람직하게는 3 내지 12개, 훨씬 더 바람직하게는 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 가지며 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분에 결합되어 있는 포화 모노 또는 폴리사이클릭 지방족 그룹을 말하며, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 메틸 사이클로헥실, 디메틸 사이클로헥실, 옥타히드로인덴, 데카히드로나프탈렌, 도데카히드로페날렌, 아다만틸 등이 포함되고, 이에 제한되지 않으며, 이는 알킬, 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "사이클로알케닐" 및 그의 복수형은 5 내지 24개, 바람직하게는 5 내지 16개, 더 바람직하게는 5 내지 14개, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 12개, 훨씬 더 바람직하게는 5 또는 6개의 탄소 원자와, 공액 또는 비공액의 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합으로, 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분에 결합되어 있는 비방향족 모노 또는 폴리사이클릭 지방족 그룹을 말하며, 예를 들어, 사이클로펜트-1-엔-1-일 그룹 및 유사한 그룹을 포함하며, 이에 제한되지 않고, 이는 알킬, 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "사이클로알키닐" 및 그의 복수형은 8 내지 24개, 바람직하게는 8 내지 16개, 더 바람직하게는 8 내지 14개, 더욱 더 바람직하게는 8 내지 12개, 훨씬 더 바람직하게는 8 또는 9개의 탄소 원자와, 공액 또는 비공액의 하나 이상의 탄소-탄소 3중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 3중 결합으로, 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분에 결합되어 있는 비방향족 모노 또는 폴리사이클릭 지방족 그룹을 말하며, 예를 들어, 사이클로옥트-2엔-1-일 그룹 등을 포함하며, 이에 제한되지 않고, 이는 알킬, 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "아릴 그룹" 및 그의 복수형은 6 내지 30개, 바람직하게는 6 내지 18개, 더 바람직하게는 6 내지 10개, 더욱 더 바람직하게는 6 또는 10개의 탄소 원자를 가지며, 탄소-탄소 결합에 의해 결합되거나 또는 융합된 1, 2, 3 또는 4개의 방향족 환을 포함하고, 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분에 결합되어 있는 방향족 그룹을 말하며, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 디페닐, 인데닐, 페난트릴 또는 안트라닐 그룹을 포함하고, 이에 제한되지 않는다. 아릴 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "아르알킬 그룹" 및 그의 복수형은 방향족 그룹에 의해 치환되고, 7 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹을 말하며, 예를 들어, -(CH₂)1-6-페닐, -(CH₂)1-6-(1-나프틸), -(CH₂)1-6-(2-나프틸), -(CH₂)1-6-CH(페닐)₂및 유사한 그룹을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 아르알킬 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "헤테로사이클릭 그룹" 및 그의 복수형은 환 원자의 하나 이상, 바람직하게는 환 원자의 1, 2 또는 3개가 탄소와 다른 원소, 예를 들면, 질소, 산소 또는 황이며, 포화 또는 불포화일 수 있는 3 내지 10원 헤테로사이클릴 또는 탄화수소 환을 말한다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로사이클릴은 융합 환계를 포함할 수 있는 사이클릭, 모노사이클릭, 비사이클릭 또는 트리사이클릭계일 수 있고, 헤테로사이클릴 라디칼에서 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있고; 질소 원자는 임의로 4급화될 수 있으며; 헤테로사이클릴 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있거나 방향족일 수 있다. 선호도가 증가함에 따라, 용어 헤테로사이클릭은 5 또는 6원 환과 관련된다. 헤테로사이클릭 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "헤테로아릴알킬 그룹" 및 그의 복수형은 치환 또는 비치환된 방향족 헤테로사이클릴 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 말하며, 알킬 그룹은 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지며 방향족 헤테로사이클릴 그룹은 2 내지 24개의 탄소 원자와 1 내지 3개의 탄소 이외의 원자를 가지고, 예를 들어, -(CH₂)1-6-이미다졸릴, -(CH₂)1-6-트리아졸릴, -(CH₂)1-6-티에닐, -(CH₂)1-6-푸릴, -(CH₂)1-6-피롤리디닐 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 헤테로아릴알킬 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 말하며, 그의 음이온은 할라이드(halide)라고 한다.

본원에 사용된 용어 "유도체" 및 이의 복수형은 화장용으로 허용되는 화합물, 즉 화장품 제조에 사용될 수 있는 관심 화합물에서 유래된 화합물과, 화장용으로 허용되지 않는 유도체를 모두 말하는데, 이들은 화장용으로 허용되는 유도체의 제조에서 유용할 수 있기 때문이다.

본 문서에서 사용된 바와 같이, 용어 "염" 및 그의 복수형은 당업계에 공지된 것 중에서 임의의 유형의 염, 예를 들어, 할라이드염, 히드록시산 염(예, 옥시산 염, 산 염, 염기성 염 및 이중 염), 히드록소염, 혼합 염, 옥시 염 또는 기타 수화된 염을 말한다. 이 용어는 화장용으로 허용되는 염 및 화장용으로 허용되지 않는 염 모두를 포함하는데, 이는 후자가 화장용으로 허용되는 염의 제조에 유용할 수 있기 때문이다.

본 문서에서 사용된 용어 "이성질체" 및 그의 복수형은 광학 이성질체, 거울상 이성질체, 입체 이성질체 또는 부분 입체 이성질체를 말한다. 개개의 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체, 및 이들의 혼합물은 당업계에서 알려진 통상의 기술에 의해 분리될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "용매화물" 및 그의 복수형은 극성, 무극성 또는 양쪽성 용매화물과 같은 당업계에 공지된 임의의 용매화물을 말하고, 관심 대상에 투여되거나 적용될 때(직접 또는 간접적으로) 관심 화합물(본 발명의 펩타이드)을 제공하는 화장용으로 허용되는 임의의 용매화물을 포함한다. 바람직하게는 용매화물은 수화물, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올과 같은 알코올과의 용매화물, 에틸 아세테이트와 같은 에스테르와의 용매화물, 메틸 에테르, 에틸 에테르 또는 THF(테트라히드로푸란)과 같은 에테르와의 용매화물 또는 DMF(디메틸포름아미드)와의 용매화물, 보다 바람직하게는 수화물 또는 에탄올과 같은 알코올과의 용매화물이다.

또한, 본원에서 사용되는 용어 "아미노산" 및 그의 복수형은 천연인지의 여부 또한 D- 및 L-아미노산인지의 여부에 관계없이, 유전자 코드에 의해 코딩된 아미노산뿐만 아니라, 코딩되지 않은 아미노산을 포함한다. 코딩되지 않은 아미노산의 예로는 제한없이, 시트룰린, 오르니틴, 사르코신, 데스모신, 노르발린, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 2-아미노이소부티르산, 6-아미노헥사노산, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 2-아미노벤조산, 4-아미노벤조산, 4-클로로페닐알라닌, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, 사이클로세린, 카르니틴, 시스테인, 페니실아민, 피로글루탐산, 티에닐알라닌, 히드록시프롤린, 알로-이소류신, 알로-트레오닌, 이소니페코트산, 이소세린, 페닐글리신, 스타틴, β-알라닌, 노르류신, N-메틸아미노산, α-아미노산 및 β-아미노산 및 이들의 유도체가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 더 많은 비천연 아미노산이 당업계에 알려져 있다(예를 들어,"Unusual amino acids in peptide synthesis" by D. C. Roberts and F. Vellaccio, The Peptides, Vol. 5(1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds., Academic Press, New York, USA 참조).

본원에 사용된 바와 같이, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질에 관한 "동일성 백분율(percentage of identity)"은 당업계에서 통상 주어지는 의미를 가지며, 따라서, 이들 서열의 최적 정렬 후에 비교되는 두 아미노산 서열간에 동일한 아미노산의 백분율과 관련되며, 여기서 상기 백분율은 단지 통계적이며 두 아미노산 서열간의 차이는 서열 전체에 걸쳐 무작위로 분포된다. "최적 정렬(optimal alignment)"은 아미노산 서열의 정렬이 더 큰 동일성 백분율을 야기하는 것으로 이해된다. 동일성 백분율은 두 개의 비교된 서열에서 아미노산이 동일한 동일 위치의 수를 결정하고, 동일 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누어 얻은 결과에 100을 곱하여 두 서열간의 동일성 백분율을 구함으로써 계산된다. 두 아미노산 서열간의 서열 비교는 수동으로 또는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 알고리즘과 같은 당업계에서 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "다크 서클(dark circles)" 및 "안와주위 과색소증(periorbital hyperchromia)"은 상호교환적으로 사용되며, 당업계에서 일반적으로 갖는 의미를 갖는다. 간단히 말해서, 다크서클 또는 안와주위 과색소증은 일반적으로 눈 주위 멜라닌 침착, 눈 주위의 진피 모세관망의 푸르스름한 색 및 가시성 및 피부와 뺨 하강을 얇아지게 하는 피하 지방 손실을 특징으로 한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, IL33은 단백질 인터루킨-33을 코딩하는 유전자를 말한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, IL-33은 단백질 인터루킨-33을 말한다.

위에서 언급한 바와 같이, 제1 측면에서, 본 발명은 적어도 3개의 아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 6개의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 유전자 IL33 및/또는 단백질 인터루킨-33의 발현을 조절하고, 보다 바람직하게는 유전자 IL33 및/또는 단백질 인터루킨-33의 발현을 하향 조절한다.

또한 본 발명에는 본 발명의 펩타이드의 이성질체, 염, 용매화물 및/또는 유도체 및 이들의 혼합물; 보다 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드의 미용학적으로 및/또는 약학적으로 허용되는 이성질체, 염, 용매화물 및/또는 유도체 및 이들의 혼합물이 포함된다.

본 발명의 펩타이드에 사용되거나 존재하는 아미노산은 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들의 조합인 것으로 고려된다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드에 사용되거나 존재하는 아미노산은 L-아미노산이다.

바람직하게는, 상기 언급된 이성질체는 입체 이성질체이다. 상기 입체 이성질체는 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체인 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 펩타이드는 라세미 혼합물, 부분 입체 이성질체 혼합물, 순수한 거울상 이성질체 또는 순수한 부분 입체 이성질체이다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드에서 상기 6개의 아미노산은 3개의 아르기닌, 1개의 글루타민, 1개의 메티오닌 및 1개의 글루탐산이다.

또한 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 하기 일반식(I)에 따른 서열을 갖는다:

R₁-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-R₂(I)

상기 식에서,

- R₁ 은 H, 치환 또는 비치환된 비환상 지방족, 치환 또는 비치환된 지환족, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬 및 R₅-CO-(여기서, R₅ 는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 치환 또는 비치환된 3 내지 10원의 헤테로사이클릴환, 및 2 내지 24개의 탄소 원자와 1 내지 3개의 탄소 이외의 원자를 가지며 알킬 쇄의 탄소 원자가 1 내지 6개인 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬 중에서 선택됨) 중에서 선택되고,

- R₂ 는 H, -NR₃R₄-, -OR₃ 및 -SR₃ 중에서 선택되며, 여기에서 R₃ 및 R₄ 는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 비환상 지방족 그룹, 치환 또는 비치환된 지환족, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 아르알킬 중에서 선택된다.

R₁은 바람직하게는 H 또는 R₅-CO- 중에서 선택되며, 여기서 R₅는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 치환 또는 비치환된 3 내지 10원의 헤테로사이클릴환, 및 2 내지 24개의 탄소 원자와 1 내지 3개의 탄소 이외의 원자를 가지며 알킬 쇄의 탄소 원자가 1 내지 6개인 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬로 형성된 그룹 중에서 선택된다. 더 바람직하게는, R₁은 H, 아세틸(이하에서는 Ac), tert-부타노일, 헥사노일, 2-메틸헥사노일, 사이클로헥산카르복실, 옥타노일, 데카노일, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일(이하에서는 Pal), 스테아로일, 올레오일 및 리놀레오일 중에서 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, R₁은 Ac이다.

바람직하게는 R₂는 NH₂이다.

따라서, 더 바람직하게는 R₁ 은 Ac이고, R₂ 가 NH₂이다.

바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 그의 서열 내에 Arg-Arg, Arg-Glu, Met-Arg 또는 이들의 조합을 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 그 서열 내에 Arg-Arg, Arg-Glu 및 Met-Arg를 포함한다.

가장 바람직한 실시형태 중 하나에 있어서, 본 발명의 펩타이드의 서열은 다음과 같다:

R₁-Arg-Arg-Gln-Met-Arg-Glu-R₂ (R₁-SEQ ID NO:1-R₂);

R₁-Met-Arg-Arg-Glu-Gln-Arg-R₂(R₁-SEQ ID NO:2-R₂); 또는

R₁-Arg-Glu-Gln-Met-Arg-Arg-R₂(R₁-SEQ ID NO:3-R₂).

상술한 바와 같이, R₁은 바람직하게는 H 또는 R₅-CO- 중에서 선택되며, 여기서 R₅는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 치환 또는 비치환된 3 내지 10원의 헤테로사이클릴환, 및 2 내지 24개의 탄소 원자와 1 내지 3개의 탄소 이외의 원자를 가지며 알킬 쇄의 탄소 원자가 1 내지 6개인 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬로 형성된 그룹 중에서 선택된다. 더 바람직하게는, R₁은 H, 아세틸(이하에서는 Ac), tert-부타노일, 헥사노일, 2-메틸헥사노일, 사이클로헥산카르복실, 옥타노일, 데카노일, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일(이하에서는 Pal), 스테아로일, 올레오일 및 리놀레오일 중에서 선택되고, 훨씬 더 바람직하게는, R₁은 Ac이다.

또한 상기 언급된 바와 같이, R₂는 바람직하게는 NH₂이다.

따라서, 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드의 서열은 다음과 같다:

Ac-Arg-Arg-Gln-Met-Arg-Glu-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂);

Ac-Met-Arg-Arg-Glu-Gln-Arg-NH₂(Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂); 또는

Ac-Arg-Glu-Gln-Met-Arg-Arg-NH₂(Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂).

하기 포함된 실시예로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 유전자 IL33 및 단백질 IL-33의 발현을 하향조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 세포외 기질 관련 유전자의 유리한 조절, 티로시나제 활성 억제 및 단백질 당화 및 지질 과산화에 대한 보호를 제공한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점의 치료를 위한 화장품 및 의약에 유용하며, 보다 정확하게는 다음과 같다:

- 화장품에서, 상기 언급되고 하기 포함된 실시예에서 입증된 활성을 고려할 때, 본 발명의 펩타이드는 적어도 아이백(eyebag), 눈꺼풀 결점, 주름(바람직하게는 눈 주위의 주름) 및 과색소증(바람직하게는 안와주위 과색소증)의 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 피부에서 수면 부족의 영향을 예방, 감소 및/또는 되돌릴 수 있으며, 즉, 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후를 치료할 수 있다.

- 의약에서, 상기 언급되고 하기 포함된 실시예에서 입증된 활성을 고려할 때, 본 발명의 펩타이드는 염증, 혈관신생 및/또는 과다색소침착과 관련된 의학적 증상, 지질 과산화와 관련된 질병, 단백질 당화와 관련된 질병 또는 이들의 조합의 치료에 유용하다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 적어도 눈꺼풀 결점, 보다 바람직하게는 피부 이완증, 안검하수증(예를 들어, 건막성 안검하수증 및 건막성 안검하수), 안검 외반 및 안검 내반의 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 상기 기술 분야에 존재하고 상기 언급된 요구 및 기술적 문제를 해결한다.

또한, 상기 언급된 특정 서열(즉, R₁-Arg-Arg-Gln-Met-Arg-Glu-R₂; R₁-Met-Arg-Arg-Glu-Gln-Arg-R₂; 또는 R₁-Arg-Glu-Gln-Met-Arg-Arg-R₂, 바람직하게는, Ac-Arg-Arg-Gln-Met-Arg-Glu-NH₂; Ac-Met-Arg-Arg-Glu-Gln-Arg-NH₂; 또는 Ac-Arg-Glu-Gln-Met-Arg-Arg-NH₂)과 70% 동일성, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 더 바람직하게는 95%, 더욱 더 바람직하게는 99% 동일성을 가지며 본 발명의 펩타이드에 대해 본원에 기재된 활성을 여전히 나타내는 펩타이드도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 합성 및 생산될 수 있다. 예를 들어, 이들은 화학적 합성(바람직하게는 고체상 펩타이드 합성에 의함), 세포 배양물에서 상기 펩타이드 발현 또는 식물 또는 동물에서 펩타이드의 형질전환 생산에 의해 합성 및 생성될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 환상 펩타이드이다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 이온삼투법에 의해, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는, 인간)의 얼굴, 보다 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용하기에 잘 맞거나 적합하다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 피하, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴, 보다 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용하기에 잘 맞거나 적합하다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 국소적으로(바람직하게는 크림 형태로), 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴에, 더욱 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용하기에 잘 맞거나 적합하다.

제2 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 한 유형의 펩타이드 또는 본 발명의 상이한 펩타이드의 조합 또는 혼합물, 바람직하게는 본 발명의 한 유형의 펩타이드를 포함하는 것으로 고려된다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 화장용 조성물이다. 따라서, 이러한 실시형태에서, 본 발명의 화장용 조성물은 화장용으로 유효한 양의 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함하고, 보다 바람직하게는 본 발명의 화장용 조성물은 0.0001%(g/100mL의 중량/부피, 이하, w/v) 내지 0.05%(w/v)의 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화장용 조성물은 0.0001%(w/v) 내지 0.001%(w/v), 보다 바람직하게는 0.0005%(w/v)의 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다. 또 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화장용 조성물은 0.05%(w/v) 내지 0.001%(w/v)의 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다.

본 발명의 화장용 조성물은 또한 적어도 하나의 추가의 화장품 성분을 포함하는 것으로 고려된다. 상기 추가의 화장품 성분은 적어도 하나의 부형제 및/또는 적어도 하나의 추가의 화장품 활성 성분일 수 있다.

상기 추가의 화장품 성분은 예를 들어, 안정화제, 가용화제, 비타민, 착색제 및 향료와 같은 보조제; 담체; 및/또는 다른 화장품 활성 성분과 같은 일반적으로 당업계에서 사용되는 것들을 포함한다.

상기 추가의 화장품 성분은 조성물의 나머지 성분, 특히 본 발명의 조성물에 포함된 본 발명의 펩타이드와 물리적 및 화학적으로 양립할 수 있어야 한다. 마찬가지로, 상기 추가의 화장품 성분의 성질은 본 발명의 펩타이드 및 조성물의 이점을 허용할 수 없을 정도로 변경해서는 안된다. 상기 추가의 화장품 성분은 예를 들어, 식물 추출물과 같은 천연 또는 합성 유래일 수 있거나, 생체 발효 공정으로부터 유래될 수 있다(예를 들어, CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Eleventh Edition(2006) 참조).

상기 언급된 추가의 화장품 성분은 예를 들어, 멜라닌 합성 억제제, 미백제 또는 탈색제, 노화방지제, NO-신타제 억제제, 항산화제, 대기 오염 방지제 및/또는 유리 라디칼 포획제, 항당화제, 유화제, 보습물질(emollient), 유기 용매, 액상 추진제, 피부 컨디셔너, 예를 들면, 습윤제, 수분 유지 물질(moisture retaining substance), 알파 히드록시산, 보습제(moisturizer), 비타민, 안료 또는 착색제, 염료, 겔화 중합체, 증점제, 계면활성제, 유연제, 기타 주름 방지제, 눈 밑의 백(bag)을 줄이거나 제거할 수 있는 제제, 각질제, 항균제, 항진균제, 살균제, 진피 또는 표피 거대 분자 합성을 자극 하고/하거나 이들의 분해를 방지하거나 억제할 수 있는 제제, 예를 들면, 콜라겐 합성 자극제, 엘라스틴 합성 자극제, 라미닌 합성 자극제, 콜라겐 분해 억제제, 엘라스틴 분해 억제제, 섬유 아세포 증식 자극제, 각질형성세포 증식 자극제, 각질형성세포 분화(keratinocyte differentiation) 자극제, 지질 합성 및 각질층 성분(세라마이드, 지방산 등) 합성 자극제, 피부 이완제(dermorelaxing agents), 글리코사미노글리칸 합성 자극제, DNA 수복제, DNA 보호제, 프로테아좀 활성 촉진제, 항소양제, 민감성 피부 치료제, 재확인제(reaffirming agents), 수렴제, 피지 생성 조절제, 지방 분해 촉진제, 항셀룰라이트제, 진정제, 항염증제, 모세혈관 순환 및/또는 미세 순환에 작용하는 제제, 세포 미토콘드리아에 작용하는 제제, 진피-표피 접합을 개선하기 위한 제제, 방부제, 방향제, 킬레이트제, 식물 추출제, 정유(essential oil), 해양 추출물, 생체 발효 공정에서 유래된 제제, 미네랄염, 세포 추출물 및/또는 솔라 필터(자외선 A 및 B 광선에 대해 활성인 유기 또는 무기 광보호제) 등과 같은 피부 및/또는 모발을 세정하기 위한 케어용 조성물 및/또는 다한증을 예방하기 위한 데오도란트 및/또는 크림에 일반적으로 사용되는 성분을 포함하는 것으로 고려된다.

일 실시형태에 있어서, 추가의 화장품 성분 중 적어도 하나는 본 발명의 펩타이드에 대해 상기 개시된 것과 동일하거나, 유사하거나, 보완적이거나 상이한 화장용 활성을 발휘할 수 있는 화장용 활성 성분 또는 물질이다. 본 발명의 조성물은 다른 주름 방지제 또는 노화 방지제, 예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 성장 인자, 히알루론산 부스터, 장벽 기능제, 조명제, 콜라겐 I, III, IV 및/또는 VI 및 라미닌의 발현 및/또는 합성을 자극하는 제제; 글리코사미노글리칸 또는 히알루론산의 합성 촉진제; 엘라스틴 및 다른 탄성 섬유 관련 단백질의 발현 및/또는 합성을 자극하는 제제; 콜라겐 및/또는 탄성 섬유 분해를 억제하는 제제; 미토콘드리아 관련 단백질(예를 들어, 시르투인 및 아코니타제)의 발현 및/또는 합성을 자극하는 제제; 국소 접착 단백질의 발현 및/또는 합성을 자극하는 제제; 각질형성세포 및/또는 섬유 아세포 증식 및/또는 분화를 자극하는 제제; 항산화제; 대기 오염 방지 및 유리 라디칼 포획제; 항당화제(anti-glycation agent), 해독제; 경시 노화, 환경 노화 및 염증을 감소시키는 제제; 및 멜라닌 생성을 감소시키는 제제 및/또는 티로시나제를 억제하는 제제 및/또는 지질 합성 및 표피 성분(케라틴) 및 보다 구체적으로 각질층 성분(케라틴, 세라마이드, 필라그린, 로리크린 및 SPRR1B)의 합성을 자극하는 제제를 포함하는 것으로 고려된다. 더 바람직하게는, 추가의 화장품 성분 중 적어도 하나는 Argireline®(아세틸 헥사펩타이드-8), Leuphasyl®(펜타펩타이드-3), Inyline®(아세틸 헥사펩타이드-30), Syn-Ake®(트리펩타이드-3) 또는 그의 조합이다.

또한, 본 발명의 화장용 조성물(또는 본 발명의 펩타이드)은 "리브 온(leave on)" 및 "린스 오프(rinse-off)" 제형을 포함하여, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀젼, 페이스트, 겔, 크림, 분말, 스프레이, 로션, 오일, 도포제(liniment), 세럼, 무스, 연고, 바 또는 연필과 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 임의의 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 화장용 조성물은 또한 타월렛(towelette), 하이드로겔, 접착성(또는 비접착성) 패치 또는 안면 마스크와 같은 다양한 유형의 고체 액세서리에 당업계에 공지된 기술에 의해 혼입될 수 있거나, 또는 컨실러(concealer), 메이크업 파운데이션, 로션 또는 메이크업 제거 로션과 같은 다양한 메이크업 라인 제품에 혼입될 수 있다.

본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명의 화장용 조성물 또는 본 발명의 펩타이드는 둘 다 화장 지속 방출 시스템 및/또는 담체, 예를 들면, 리포좀, 밀리입자, 마이크로입자 및 나노입자뿐 아니라, 스펀지, 소포(vesicle), 미셀, 밀리스피어, 마이크로스피어, 나노스피어, 리포스피어, 밀리캡슐, 마이크로캡슐 및 나노캡슐뿐 아니라, 마이크로에멀젼 및 나노에멀젼에 활성 성분의 더 큰 침투를 얻기 위한 목적으로 혼입될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화장용 조성물은 이온삼투법에 의해, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는, 인간)의 얼굴, 더욱 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용하기에 잘 맞거나 적합하다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화장용 조성물은 피하, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는, 인간)의 얼굴, 보다 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용하기에 잘 맞거나 적합하다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 화장용 조성물은 국소적으로(바람직하게는 크림 형태로), 더욱 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴에, 더욱 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용하기에 잘 맞거나 적합하다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 약학 조성물이다. 따라서, 이 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함하고, 보다 바람직하게는 본 발명의 약학 조성물은 0.0001%(w/v) 내지 0.05%(w/v)의 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 0.0001%(w/v) 내지 0.001%(w/v), 보다 바람직하게는 0.0005%(w/v)의 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다. 또 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물은 0.05%(w/v) 내지 0.001%(w/v)의 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다.

약학 조성물은 선택된 경로에 적합한 당업계에 공지된 임의의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 공지된 임의의 수단 및 경로(예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 국소 또는 경구; 후자의 경우, 예를 들어, 식염수 및/또는 생분해성 물질의 형태, 예를 들어, 폴리락트산(PLA)의 중합체, 폴리글리콜산(PGA) 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤 및/또는 콜레스테롤)에 의해 투여하기에 잘 맞거나 적합한 것으로 고려된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 국소적으로, 더욱 바람직하게는 크림 형태로 투여하기에 잘 맞거나 적합하다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 적어도 하나의 추가의 약학 성분을 포함하는 것으로 고려된다. 상기 추가의 약학 성분은 적어도 하나의 부형제 및/또는 적어도 하나의 추가의 약학적 활성 성분일 수 있다.

하기 포함된 실시예로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 유전자 IL33 및 단백질 IL-33의 발현을 하향조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 세포외 기질 관련 유전자의 유리한 조절, 티로시나제 활성의 억제 및 단백질 당화 및 지질 과산화에 대한 보호를 제공한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점의 치료를 위한 화장품 및 약물에 유용하며, 보다 정확하게는 다음과 같다:

- 화장품에서, 상기 언급되고 하기 포함된 실시예에서 입증된 활성을 고려할 때, 본 발명의 펩타이드는 적어도 아이백(eyebags), 눈꺼풀 결점, 주름(바람직하게는 눈 주위의 주름) 및 과색소증(바람직하게는 안와주위 과색소증)의 치료에 유용하다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 피부에서 수면 부족의 영향을 예방, 감소 및/또는 되돌릴 수 있으며, 즉, 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후를 치료할 수 있다.

- 의약에서, 상기 언급되고 하기 포함된 실시예에서 입증된 활성을 고려할 때, 본 발명의 펩타이드는 염증, 혈관신생 및/또는 과다색소침착과 관련된 의학적 질환, 지질 과산화와 관련된 질병, 단백질 당화와 관련된 질병 또는 이들의 조합의 치료에 유용하다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 적어도 눈꺼풀 결점, 보다 바람직하게는 피부 이완증(dermatochalasis), 안검하수증(예를 들어, 건막성 안검하수증(aponeurotic ptosis) 및 건막성 안검하수(aponeurotic blepharoptosis)), 안검 외반 및 안검 내반의 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명의 조성물은 상기 기술 분야에 존재하고 상기 언급된 요구 및 기술적 문제를 해결한다.

이미 위에서 언급한 바와 같이, 제3 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 화장용 조성물의 화장품으로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 펩타이드 및 화장용 조성물은 상술한 바와 같다.

바람직하게는, 화장품으로서의 용도는 염증, 혈관신생, 세포외 기질 손상, 산화 스트레스, 진피 세포 접합의 변경, 세포자멸사(apoptosis) 및/또는 과색소침착과 관련된 미용 상태, 바람직하게는 미용 염증, 미용 혈관신생, 미용적 세포외 기질 손상, 미용적 산화 스트레스, 피부 세포 접합부의 미용적 변화, 미용적 세포자멸사 및/또는 미용적 과색소침착과 관련된 미용 상태의 치료를 위한 것이다.

더욱 바람직하게는, 화장품으로서의 용도는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점의 치료를 위한 것이고, 더욱 바람직하게는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점의 예방, 감소 및/또는 제거를 위한 것이다.

명백한 바와 같이, 상기 언급한 피부 노화의 징후는 피부 노화의 미용적 징후 및/또는 미용적 피부 결점이다.

피부 노화는 경시적 및/또는 환경적 노화로 인한 것이다.

보다 바람직하게는, 상기 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점은 IL-33의 조절장애에 의해 생성된다. 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 및 화장용 조성물은 IL-33을 하향 조절한다(IL33 유전자의 발현 및/또는 인터루킨 33의 발현을 하향 조절한다).

가장 바람직한 실시형태에서, 상기 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점은 아이백, 눈꺼풀 결점, 주름(바람직하게는 눈 주위의 주름), 과색소증(바람직하게는 안와주위 과색소증) 또는 이들의 조합이다.

눈꺼풀 결점은 바람직하게는 처진 눈꺼풀, 보다 바람직하게는 미용 피부이완증, 미용 안검하수, 미용 안검 외반 및 미용 안검 내반, 더욱 바람직하게는 미용 피부이완증, 미용 건막성 안검하수증(aponeurotic ptosis), 미용 건막성 안검하수(aponeurotic blepharoptosis), 미용 퇴행성 안검 외반(nvolutional ectropion), 미용 퇴행성 안검 내반(involutional entropion)이다.

따라서, 바람직하게는, 상기 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점은 아이백(eyebags), 눈 주위 주름, 안와주위 과색소증, 처진 눈꺼풀 또는 이들의 조합, 보다 바람직하게는 아이백, 눈 주위의 주름, 안와주위 과색소증, 미용 피부이완증, 미용적 건막성 안검하수증, 미용적 건막성 안검하수, 미용적 퇴행성 안검 외반 및 미용적 퇴행성 안검 내반 또는 이들의 조합을 포함한다.

가장 바람직한 실시형태에서, 상기 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점은 아이백, 눈 주위의 주름, 안와주위 과색소증 또는 이들의 조합이다.

또 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 화장품으로서의 용도는 피부에서 수면 부족의 영향을 치료하기 위한 것이며, 보다 바람직하게는 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후를 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한 것이다.

수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후는 바람직하게는 처진 눈꺼풀(상기 설명된 바와 같음), 안와주위 과색소증, 손상된 장벽 기능과 관련된 징후 또는 이들의 조합이다.

바람직한 실시형태에서 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후는 안와주위 과색소증이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서, 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후는 손상된 장벽 기능과 관련된 징후, 보다 바람직하게는 변경된 피부 투과성, 피부 염증, 피부의 세포 응집력 결여 또는 이들의 조합, 훨씬 더 바람직하게는 아이백, 주름(바람직하게는 눈 주위의 주름) 또는 이들의 조합이다.

또한, 바람직한 실시형태에서, 화장품으로서의 용도는 대상에 있다. 바람직하게는, 대상은 포유동물, 훨씬 더 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물은 이온삼투법에 의해, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는, 인간)의 얼굴, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용되는 것으로 고려된다.

또한, 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물은 피하로, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴에, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용되는 것으로 또한 고려된다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물은 국소적으로(바람직하게는, 크림 형태로), 더욱 바람직하게는 대상(바람직하게는, 인간)의 얼굴에, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용된다.

또한, 본 발명의 화장품으로서의 용도에 있어서, 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물은 화장용으로 유효한 양으로 사용된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 0.0001%(w/v) 내지 0.05%(w/v)의 농도로 사용된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 0.0001%(w/v) 내지 0.001%(w/v), 보다 바람직하게는 0.0005%(w/v)의 농도로 사용된다. 또 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 0.05%(w/v) 내지 0.001%(w/v)의 농도로 사용된다.

제4 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 화장용 조성물의 미용 용도에 관한 것이다.

바람직하게는, 미용 용도는 염증, 혈관신생, 세포외 기질 손상, 산화 스트레스, 진피 세포 접합의 변경, 세포자멸사 및/또는 과색소침착과 관련된 미용 상태, 바람직하게는 미용 염증, 미용 혈관신생, 미용 세포외 기질 손상, 미용적 산화 스트레스, 피부 세포 접합부의 미용적 변화, 미용적 세포자멸사 및/또는 미용적 과색소침착과 관련된 미용 상태의 치료를 위한 것이다.

보다 바람직하게는, 미용 용도는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점의 치료를 위한 것이고, 더욱 바람직하게는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점의 예방, 감소 및/또는 제거를 위한 것이다.

피부 노화는 경시적 및/또는 환경적 노화로 인한 것이다.

눈꺼풀 결점은 바람직하게는 처진 눈꺼풀, 보다 바람직하게는 미용 피부이완증, 미용 안검하수증, 미용 안검 외반 및 미용 안검 내반, 더욱 바람직하게는 미용 피부이완증, 미용 건막성 안검하수증, 미용 건막성 안검하수, 미용 퇴행성 안검 외반, 및 미용 퇴행성 안검 내반이다.

따라서, 바람직하게는, 상기 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점은 아이백, 눈 주위 주름, 안와주위 과색소증, 처진 눈꺼풀 또는 이들의 조합, 보다 바람직하게는 아이백, 눈 주위의 주름, 안와주위 과색소증, 미용 피부이완증, 미용적 건막성 안검하수증, 미용적 건막성 안검하수, 미용적 퇴행성 안검 외반 및 미용적 퇴행성 안검 내반 또는 이들의 조합을 포함한다.

또 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 미용 용도는 피부에서 수면 부족의 영향의 치료를 위한 것이며, 보다 바람직하게는 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후를 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한 것이다.

수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후는 바람직하게는 처진 눈꺼풀(상기 설명된 바와 같음), 안와주위 과색소, 손상된 장벽 기능과 관련된 징후 또는 이들의 조합이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후는 손상된 장벽 기능과 관련된 징후, 보다 바람직하게는 변경된 피부 투과성, 피부 염증, 피부의 세포 응집력 결여 또는 이들의 조합, 훨씬 더 바람직하게는 아이백, 주름(바람직하게는 눈 주위의 주름) 또는 이들의 조합이다.

또한, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 미용 용도는 대상에 있다. 더욱 바람직하게는, 대상은 포유동물, 더욱 더 바람직하게는 인간이다.

또한, 본 발명의 미용 용도에 있어서, 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물은 화장용으로 유효한 양으로 사용된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 0.0001%(w/v) 내지 0.05%(w/v)의 농도로 사용된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 0.0001%(w/v) 내지 0.001%(w/v), 보다 바람직하게는 0.0005%(w/v)의 농도로 사용된다. 또 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 0.05%(w/v) 내지 0.001%(w/v)의 농도로 사용된다.

제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물의 이를 필요로 하는 대상에서의 사용을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상의 미용 치료 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 방법은 염증, 혈관신생, 세포외 기질 손상, 산화 스트레스, 진피 세포 접합의 변화, 세포자멸사 및/또는 과색소침착과 관련된 미용 상태, 바람직하게는 미용 염증, 미용 혈관신생, 미용 세포외 기질 손상, 미용적 산화 스트레스, 피부 세포 접합부의 미용적 변화, 미용적 세포자멸사 및/또는 미용적 과색소침착과 관련된 미용 상태의 미용적 치료를 위한 것이다.

보다 바람직하게는, 상기 방법은 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점의 미용적 치료, 보다 바람직하게는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점의 예방, 감소 및/또는 제거를 위한 것이다.

피부 노화는 경시적 및/또는 환경적 노화로 인한 것이다.

눈꺼풀 결점은 바람직하게는 처진 눈꺼풀, 보다 바람직하게는 미용 피부 이완증, 미용 안검하수증, 미용 안검 외반 및 미용 안검 내반, 보다 바람직하게는 미용 피부 이완증, 미용 건막성 안검하수증, 미용 건막성 안검하수, 미용 퇴행성 안검 외반 및 미용 퇴행성 안검 내반이다.

따라서, 바람직하게는, 상기 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점은 아이백, 눈 주위 주름, 안와주위 과색소증, 처진 눈꺼풀 또는 이들의 조합, 보다 바람직하게는 아이백, 눈 주위의 주름, 안와주위 과색소증, 미용 피부 이완증, 미용적 건막성 안검하수증, 미용적 건막성 안검하수, 미용적 퇴행성 안검 외반 및 미용적 퇴행성 안검 내반 또는 이들의 조합을 포함한다.

또 다른 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 피부에서 수면 부족의 영향을 미용적으로 치료하기 위한 것이고, 더욱 바람직하게는 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후를 미용적으로 치료하기 위한 것이며, 더욱 더 바람직하게는, 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후의 미용적 예방, 감소 및/또는 제거를 위한 것이다.

또한, 바람직한 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상은 포유동물, 훨씬 더 바람직하게는 인간이다.

바람직하게는, 본 발명의 미용적 치료를 위한 방법에서, 이를 필요로 하는 대상에서 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물의 용도는 이를 필요로 하는 대상에서 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물의 적용에 의한 것이다.

또한, 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물은 피하, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는, 인간)의 얼굴, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용되는 것으로 고려된다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물은 국소적으로(바람직하게는, 크림 형태로), 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴에, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용된다.

또한, 본 발명의 미용 방법에 있어서, 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물은 화장용으로 유효한 양으로 사용된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 0.0001%(w/v) 내지 0.05%(w/v)의 농도로 사용된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 0.0001%(w/v) 내지 0.001%(w/v), 보다 바람직하게는 0.0005%(w/v)의 농도로 사용된다. 또 다른 가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드는 0.05%(w/v) 내지 0.001%(w/v)의 농도로 사용된다.

본 발명에 따른 펩타이드 및 약학 조성물은 상술한 바와 같다.

바람직하게는, 본 발명의 펩타이드 또는 조성물은 치료적으로 유효한 양으로 사용된다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 및 조성물은 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에서 사용하기 위한 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 염증, 혈관신생, 세포외 기질 손상, 산화 스트레스, 진피 세포 접합의 변경, 세포자멸사 및/또는 과다색소침착과 관련된 의학적 상태, 지질 과산화와 관련된 질병, 단백질 당화와 관련된 질병 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한 것이다.

바람직하게는 지질 과산화와 관련된 질병은 죽상 동맥 경화증(atherosclerosis), 염증성 장질환(Bowel Disease), 미숙아 망막증(Retinopathy of Prematurity), 경계성 인격 장애(Borderline Personality Disorder), 천식, 파킨슨병 및 신장 손상이다.

바람직하게는, 단백질 당화와 관련된 질병은 당뇨병(보다 바람직하게는 당뇨병성 혈관병증), 신부전 및 노화 관련 퇴행성 질환이다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 눈꺼풀 결점, 바람직하게는 처진 눈꺼풀, 보다 바람직하게는 피부이완증, 안검하수증, 안검 외반 및 안검 내반, 훨씬 더 바람직하게는 피부이완증, 건막성 안검하수증, 건막성 안검하수, 퇴행성 안검 외반 및 퇴행성 안검 내반의 치료에 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 이온삼투법에 의해, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는, 인간)의 얼굴, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용되는 것으로 고려된다.

또한, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 피하로, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴에, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용되는 것으로 고려된다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 국소적으로(바람직하게는 크림 형태로), 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴에, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 눈 주위에 적용된다.

바람직하게는, 상기 용도는 염증, 혈관신생, 세포외 기질 손상, 산화 스트레스, 진피 세포 접합의 변경, 세포자멸사 및/또는 과색소침착과 관련된 의학적 상태, 지질 과산화와 관련된 질병, 단백질 당화와 관련된 질병 또는 이의 조합의 치료용 약물의 제조를 위한 것이다.

바람직하게는 지질 과산화와 관련된 질병은 죽상 동맥 경화증, 염증성 장질환, 미숙아 망막증, 경계성 인격 장애, 천식, 파킨슨병 및 신장 손상이다.

가장 바람직한 실시형태에서, 상기 용도는 눈꺼풀 결점, 바람직하게는 처진 눈꺼풀, 보다 바람직하게는 피부이완증, 안검하수증, 안검 외반 및 안검 내반, 훨씬 더 바람직하게는 피부이완증, 건막성 안검하수증, 건막성 안검하수, 퇴행성 안검 외반 및 퇴행성 안검 내반의 치료용 약물의 제조를 위한 것이다.

본 발명의 펩타이드 또는 약제학적 조성물은 이온삼투법에 의해, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는, 인간)의 얼굴, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 주위에 적용되는 것으로 고려된다.

또한, 본 발명의 펩타이드 또는 약학 조성물은 피하로, 보다 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴에, 훨씬 더 바람직하게는 눈 내부 및/또는 주위에 적용되는 것으로 고려된다.

바람직한 실시형태에서, 의학적 치료가 필요한 대상은 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다.

바람직하게는, 본 발명의 미용적 치료를 위한 방법에서, 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물의 이를 필요로 하는 대상에서의 용도는 본 발명의 펩타이드 또는 화장용 조성물을 이를 필요로 하는 대상에 적용하는 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 의학적 치료를 위한 방법은 염증, 혈관신생, 세포외 기질 손상, 산화 스트레스, 진피 세포 접합의 변경, 세포자멸사 및/또는 과색소침착과 관련된 의학적 상태, 지질 과산화와 관련된 질병, 단백질 당화와 관련된 질병 또는 이들의 조합의 치료를 위한 것이다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 의학적 치료를 위한 방법은 눈꺼풀 결점, 바람직하게는 처진 눈꺼풀, 보다 바람직하게는 피부 이완증, 안검하수증, 안검 외반 및 안검 내반, 훨씬 더 바람직하게는 피부 이완증, 건막성 안검하수증, 건막성 안검하수, 퇴행성 안검 외반 및 퇴행성 안검 내반의 치료를 위한 것이다.

더 나은 이해를 가능하게 하기 위해, 본 발명은 예로서 제시되는 첨부 도면과, 예시적이고 비제한적인 실시예를 참조하여 아래에서 더 상세하게 설명한다.

도 1은 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂로 처리된 인간 진피 섬유아세포 성체 세포에서의 IL-33 단백질 수준을 나타낸다. 결과는 100%로 설정된 양성 대조군(인터페론-γ 300U/mL로 처리)과 비교하여 백분율로 표시한다. x-축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 세포의 기저 상태, 양성 대조군 및 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 0.005 mg/mL, 0.01 mg/mL 또는 0.05 mg/mL으로 각각 처리된 세포를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드로 처리한 샘플도 Interferon-γ 300U/mL로 처리하였다. y축은 100%로 설정된 양성 대조군에 대한 IL-33의 %(pg/mL)를 나타낸다. **는 p < 0.01을 나타내고, ***는 p < 0.001을 나타낸다.

도 2는 실시예 11에서 얻은 버섯 티로시나아제 활성 억제 결과를 나타낸다. 100%로 설정된 대조군(펩타이드 없음)에 대한 티로시나아제 활성을 측정하였다. 도 2A는 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂로 얻은 티로시나제 활성의 결과를 나타내고, 따라서 x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음을 나타낸다: 대조군 웰(well) 및 400 μM 및 800 μM의 코지산(kojic acid)을 함유하는 웰 및 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂를 각각 0.05 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL 및 2.5 mg/mL 함유하는 웰. 도 2B는 Ac-SEQ ID NO:2-NH₂로 얻은 티로시나제 활성의 결과를 나타내고, 따라서 x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음을 나타낸다: 대조군 웰, 400 μM 및 800 μM의 코지산(kojic acid)을 함유하는 웰 및 Ac-SEQ ID NO:2-NH₂를 각각 0.05 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL 및 2.5 mg/mL 함유하는 웰. 도 2C는 Ac-SEQ ID NO:3-NH₂로 얻은 티로시나제 활성의 결과를 나타내며, 따라서 x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음을 나타낸다: 대조군 웰, 400 μM 및 800 μM의 코지산(kojic acid)을 함유하는 웰 및 Ac-SEQ ID NO:3-NH₂를 각각 0.05 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL 및 2.5 mg/mL 함유하는 웰. 도 2D는 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂로 얻은 결과를 나타내고, 따라서 x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음을 나타낸다: 대조군 웰 및 Ac-SEQ ID NO:4-NH₂ 0.005 mg/mL, 0.025 mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL 및 2.5 mg/mL으로 각각 처리된 웰. 도 2A, 2B, 2C 및 2D에서, y-축은 대조군의 티로시나제 활성을 100%로 설정한 티로시나제 활성의 백분율을 나타낸다. *는 p < 0.05를 나타내고, **는 p < 0.01을 나타내며, ***는 p < 0.001을 나타낸다.

도 3은 실시예 12에서 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂로 처리된 HUVEC에서 관 형성(혈관신생)을 나타낸다. 보다 정확하게는 검은색 컬럼은 기저 상태(기저 상태를 100%로 설정함)와 비교하여 메쉬 수를 백분율로 나타내고; 흰색 컬럼은 기저 상태(기저 상태를 100%로 설정함)와 비교하여 메쉬의 전체 면적을 백분율로 나타낸다. 또한, 이 도면에서 x축의 왼쪽에서 오른쪽으로 2개의 컬럼(검은색 1개, 흰색 1개)의 각 그룹은 다음에 해당한다: 음성 대조군(20μM의 수라민(Suramin)으로 처리); 양성 대조군(IL-33 10ng/mL로 처리); Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 0.01 mg/mL 및 IL-33 10 ng/mL로 처리; Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 0.05 mg/mL 및 IL-33 10 ng/mL로 처리; 및 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 0.1 mg/mL 및 IL-33 10 ng/mL로 처리. y축은 기저 상태(100%로 설정)와 비교하여 (고려하는 컬럼에 따라) 메쉬 수(검은색 컬럼의 경우) 또는 메쉬의 총 면적(흰색 컬럼의 경우)의 백분율을 나타낸다. *는 p < 0.05를 나타내고, **는 p < 0.01을 나타내며, ***는 p < 0.001을 나타낸다.

도 4는 실시예 13의 결과를 나타내며, 이는 100%로 설정된 음성 대조군과 비교한 지질의 과산화이다. x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음에 해당한다: 음성 대조군(항산화 화합물이 없는 지질 기질), 양성 대조군(250μg/mL의 Trolox(안정한 비타민 E 유사체)로 처리하지만 본 발명의 펩타이드로 처리하지 않은 지질 기질) 및 각각 0.01 mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL 또는 0.5 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 처리군. 모든 샘플에는 지질 기질이 있고, 음성 대조군을 제외한 모든 샘플은 지질 과산화제(티오바르비투르산)도 포함했다. 여기 500 nm; 방출 530 nm에서 플레이트를 읽기 전에 37℃에서 2시간 배양을 수행했다. y축은 100%로 설정된 음성 대조군과 비교하여 지질 과산화의 백분율을 나타낸다. *는 p < 0.05를 나타내고; **는 p < 0.01을 나타내며; ***는 p < 0.001을 나타낸다.

도 5는 실시예 14의 결과를 나타내며, 이는 100%로 설정된 음성 대조군과 비교한 단백질의 당화이다. x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음에 해당한다: 음성 대조군(당 기질), 양성 대조군(690㎍/mL의 아미노구아니딘(AG, 대표적인 항당화 화합물)으로 처리된 슈가 기질) 및 각각 0.01mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL 또는 0.5 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 처리군. 모든 샘플에는 당 기질이 있고, 음성 대조군을 제외한 모든 샘플에는 당화제가 포함되었다. 여기 370 nm 및 방출 440 nm에서 플레이트를 읽기 전에 37℃에서 72시간 배양을 수행했다. y축은 100%로 설정된 음성대조군과 비교하여 단백질 당화율을 나타낸다. *는 p < 0.05를 나타내고; **는 p < 0.01을 나타내며; ***는 p < 0.001을 나타낸다.

도 6은 실시예 14의 생체외 결과를 나타내며, 이는 100%로 설정된 음성 대조군(처리되지 않은 외식편)과 비교하여 나타낸 전면 메틸글리옥살(MG)-유도 당화에서 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂의 보호 효과이다. x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음에 해당한다: 음성 대조군(처리되지 않은 외식편), 양성 대조군(크림으로 처리되지 않은 MG) 및 1%(w/v)의 Ac-SEQ ID NO:1-NH2를 함유하는 크림 또는 위약 크림이 포함된 MG. y축은 100%로 설정된 음성 대조군과 비교하여 CML 염색(N(ε)-카르복시메틸-라이신)의 백분율을 나타낸다.

도 7은 실시예 15의 생체외(ex-vivo) 결과를 나타내며, 이는 100%로 설정된 음성 대조군(처리하지 않은 외식편)과 비교하여 나타낸 전면 메틸글리옥살(MG)-유도 피브릴린-1 분해에서 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂의 보호 효과이다. x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음에 해당한다: 음성 대조군(처리하지 않은 외식편), 양성 대조군(크림으로 처리되지 않은 MG) 및 1%(w/v) Ac-SEQ ID NO:1-NH2를 함유하는 크림 또는 위약 크림이 포함된 MG. y축은 100%로 설정된 음성대조군과 비교하여 피브릴린-1 염색 비율을 나타낸다.

도 8은 0.1 mg/mL 및 0.5 mg/mL의 멜라토닌과 비교하여 항과산화 활성에 대해 얻은 데이터의 그래픽 표현을 보여준다. x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음에 해당한다: 음성 대조군(항산화 화합물이 없는 지질 기질), 양성 대조군(250μg/mL의 Trolox(안정한 비타민 E 유사체)로 처리했으나, 본 발명의 펩타이드로 처리하지 않은 지질 기질), 0.1 mg/mL 멜라토닌, 0.5 mg/mL 멜라토닌.

도 9는 0.1 mg/mL 및 0.5 mg/mL의 멜라토닌에 대한 항당화 활성에 대해 얻은 데이터의 그래픽 표현을 보여준다. x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 다음에 해당한다: 음성 대조군(슈가 기질), 양성 대조군(690㎍/mL의 아미노구아니딘(AG, 대표적인 항당화 화합물)으로 처리된 슈가 기질), 0.1mg/mL 멜라토닌, 0.5 mg/mL 멜라토닌.

도 10은 기저 세포(A) 및 D18ChAH(B)로 24시간 처리한 후 HDLMVEC 상의 에미린(emilin)-1 발현에 대한 형광 현미경으로 얻은 면역형광 이미지를 보여준다(녹색: 에미린-1, 적색: 팔로이딘(phalloidin), 청색: 핵).

도 11은 기저 세포(A) 및 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂(B)로 24시간 처리한 후 HDLMVEC 상의 인테그린 α9β1 발현에 대한 형광 현미경으로 획득한 면역형광 이미지를 나타낸다(녹색: 인테그린 α9β1, 적색: 팔로이딘, 청색: 핵).

도 12는 처리 6시간 후 HEKa 세포에서 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 또는 0.01 mg/mL의 멜라토닌에 의한 항균성 선천 면역 반응과 관련된 유전자의 조절을 보여준다. x축은 폴드 변화 대 기저를 나타낸다.

도 13은 펩타이드를 포함하는 조성물 및 위약 조성물에 의한 아이백 부피 감소의 그래프 표현을 나타낸다. x축의 왼쪽에서 오른쪽으로의 컬럼은 T7일 및 T14일에 해당한다.

실시예

약어:

아미노산에 사용되는 약어는 Eur. J. Biochem.(1984)138:937에 요약된 1983 IUPAC-IUB 생화학 명명법 공동위원회 권장 사항(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature recommendations)을 따른다.

Ac, 아세틸; Arg, 아르기닌; Boc, tert-부틸옥시카르보닐; C-terminal, 카르복시-말단; DCM, 디클로로메탄; DIEA, N,N'-디이소프로필에틸아민; DIPCDI, N,N'-디이소프로필카르보디이미드; DMF, N,N-디메틸포름아미드; equiv, 당량; ESI-MS, 전자분무 이온화 질량 분석법; Fmoc, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐; Glu, 글루탐산; Gln, 글루타민; hiPSC, 인간 유도 만능 줄기 세포; HOBt, 1-히드록시벤조트리아졸; HPLC, 고성능 액체 크로마토그래피; HRP, 양고추냉이 퍼옥시다제; INCI, 화장품 성분의 국제 명명법; MBHA, p-메틸벤즈히드릴아민; Me, 메틸; MeCN, 아세토니트릴; MeOH, 메탄올; Met, 메티오닌; N-terminal, 아미노-말단; Palm, 팔미토일; Pbf, 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐; PFA, 파라포름알데히드; PMA, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트; PMSF, 페닐메탄술포닐; RT, 실온; tBu, tert-부틸; TFA, 트리플루오로아세트산; TIS, 트리이소프로필실란; TMB, 테트라메틸벤지딘; Trt, 트리페닐메틸 또는 트리틸.

실시예에 포함된 화학 합성 절차와 관련하여, 모든 합성 공정은 다공성 폴리에틸렌 디스크가 장착된 폴리프로필렌 주사기 또는 다공성 플레이트가 장착된 Pyrex^® 반응기에서 수행되었다. 모든 시약과 용매는 합성 품질이었으며 추가 처리 없이 사용되었다. 용매와 가용성 시약은 흡입에 의해 제거되었다. Fmoc 그룹을 피페리딘-DMF(2:8, v/v)로 제거했다(적어도 1Х1 분, 2Х10 분, 5 mL/g 수지)(Lloyd Williams P. et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC, 1997, Boca Raton(Fla., USA)). 탈보호, 커플링 및 다시 탈보호 단계 사이의 세척은 10ml 용매/수지 g을 사용하여 매회 DMF(3Х1 분) 및 DCM(3Х1 분)으로 수행했다. 커플링 반응은 3ml 용매/수지 g으로 실시했다. 커플링 제어는 닌히드린 테스트를 수행하여 실시했다(Kaiser E. et al., Anal. Biochem., 1970, 34: 595598). 모든 합성 반응 및 세척은 RT에서 수행했다.

실시예 1. 펩타이드 합성 및 제조

- Fmoc-(X)_m-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-Rink-MBHA-수지(여기서, AA₁은 L-Arg; AA₂는 L-Arg; AA₃은 L-Gln; AA₄는 L-Met; AA₅는 L-Arg; AA₆은 L-Glu)의 수득

가중치를 규정화했다. 0.52 mmol/g의 관능화를 갖는 Fmoc-Rink-MBHA 수지 4.8 g(2.5 mmol)을, Fmoc 그룹을 제거하기 위해 당업계에 알려진 일반 프로토콜에 따라 피페리딘-DMF로 처리했다. 3.19 g의 Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(7.5 mmol; 3 equiv)를 DIPCDI(1.17 mL; 7.5 mmol; 3 equiv) 및 HOBt(1.01 g; 7.5 mmol; 3 equiv)의 존재 하에 DMF를 용매로서 사용하여 1시간 동안 탈보호된 수지에 혼입시켰다.

다음에는, 수지를 당업계에 알려진 일반적인 방법에 기술된 바와 같이 세척하고 Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 반복하여 다음 아미노산을 커플링 했다. 이전에 기술된 프로토콜에 따라, 4.86 g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 equiv); 이어서 2.78 g의 Fmoc-L-Met-OH(7.5 mmol; 3 equiv); 이어서 4.58 g의 Fmoc-L-Gln(Trt)-OH(7.5 mmol; 3 equiv); 이어서 4.86g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 equiv) 및 이어서 4.86 g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 equiv)를 차례로 커플링하고, 각 커플링은 1.01 g의 HOBt(7.5 mmol; 3 equiv) 및 1.17 mL의 DIPCDI(7.5 mmol; 3 equiv)의 존재 하에 수행했다. 이미 언급한 바와 같이, 각 아미노산 첨가 단계 사이에, Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 수행하였다.

합성 후에, 펩타이드 수지를 DCM으로 세척(각각 3분 동안 5회)하여 진공 하에 건조시켰다.

- Fmoc-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-Rink-MBHA-수지(여기서, AA₁은 L-Met; AA₂는 L-Arg; AA₃은 L-Arg; AA₄는 L-Glu; AA₅는 L-Gln; AA₆은 L-Arg임)의 수득

가중치를 규정화했다. 0.52 mmol/g의 관능화를 갖는 Fmoc-Rink-MBHA 수지 4.8 g(2.5 mmol)을, Fmoc 그룹을 제거하기 위해 당업계에서 알려진 기술된 일반 프로토콜에 따라 피페리딘-DMF로 처리했다. 4.86 g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 equiv)를 DIPCDI(1.17 mL; 7.5 mmol; 3 equiv) 및 HOBt(1.01 g; 7.5 mmol; 3 equiv)의 존재 하에 DMF를 용매로서 사용하여 1시간 동안 탈보호된 수지에 혼입시켰다.

다음에는, 수지를 당업계에 알려진 일반적인 방법에 기술된 바와 같이 세척하고 Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 반복하여 다음 아미노산을 커플링 했다. 이전에 기술된 프로토콜에 따라, 4.58 g의 Fmoc-L-Gln(Trt)-OH(7.5 mmol; 3 equiv); 이어서 3.19 g의 Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(7.5 mmol; 3 equiv); 이어서 4.86 g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 equiv); 이어서 4.86 g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 equiv) 및 이어서 2.78 g의 Fmoc-L-Met-OH(7.5 mmol; 3 equiv)를 차례로 커플링하고, 각 커플링은 1.01 g의 HOBt(7.5 mmol; 3 equiv) 및 1.17 mL의 DIPCDI(7.5 mmol; 3 equiv)의 존재 하에 수행했다. 이미 언급한 바와 같이, 각 아미노산 첨가 단계 사이에, Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 수행하였다.

- Fmoc-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-Rink-MBHA-수지(여기에서, AA₁은 L-Arg; AA₂는 L-Glu; AA₃은 L-Gln; AA₄는 L-Met; AA₅는 L-Arg; AA₆은 L-Arg임)의 수득

가중치를 규정화했다. 0.52 mmol/g의 관능화를 갖는 Fmoc-Rink-MBHA 수지 4.8 g(2.5 mmol)을 Fmoc 그룹을 제거하기 위해 당업계에 공지된 일반 프로토콜에 따라 피페리딘-DMF로 처리하였다. 4.86 g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 당량)를 DIPCDI(1.17 mL; 7.5 mmol; 3 당량) 및 HOBt(1.01 g; 7.5 mmol; 3 당량)의 존재 하에 DMF를 용매로 사용하여 1시간 동안 탈보호된 수지에 혼입하였다.

그 다음, 수지를 당업계에 공지된 일반적인 방법에 기재된 바와 같이 세척하고 Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 반복하여 다음 아미노산을 커플링시켰다. 이전에 기술된 프로토콜에 따라, 4.86 g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 당량); 이어서 2.78 g의 Fmoc-L-Met-OH(7.5 mmol; 3 당량); 이어서 4.58g의 Fmoc-L-Gln(Trt)-OH(7.5 mmol; 3 당량); 이어서 3.19 g의 Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(7.5 mmol; 3 당량) 및 이어서 4.86 g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5 mmol; 3 당량)를 순차적으로 커플링하였고, 각각의 커플링은 1.01 g의 HOBt(7.5 mmol; 3 당량) 및 1.17 mL의 DIPCDI(7.5 mmol; 3 당량)의 존재 하에 수행하였다. 이미 위에서 언급한 바와 같이, 각 아미노산 첨가 단계 사이에, Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 수행하였다.

합성 후, 펩타이드 수지를 DCM으로 세척하고(각각 3분씩 5회) 진공 하에 건조시켰다.

실시예 2. 실시예 1에 따라 합성된 펩타이드의 Fmoc N-말단 보호 그룹의 제거

실시예 1에서 수득한 펩티딜 수지의 N-말단 Fmoc 그룹을 DMF(1Х1 분+2Х10 분) 중의 20%(부피/부피, 이하 v/v) 피페리딘으로 탈보호했다(Lloyd Williams P. et al.(1997) "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins" CRC, Boca Raton(Fla., USA)). 펩티딜 수지를 DMF(5Х1 분), DCM(4Х1 분)으로 세척하여 진공 하에 건조시켰다.

실시예 3. 실시예 2에 따라 얻은 펩티딜 수지 상에 R₁ 아세틸 그룹을 도입시키기 위한 방법

실시예 2에 따라 얻은 펩티딜 수지 1 mmol(1 당량)을 25 당량의 DIEA의 존재 하에 용매로서 DMF 5mL를 사용하여 25 당량의 아세트산 무수물로 처리했다. 이를 정치시켜 30분간 반응시킨 후에 펩티딜 수지를 DMF(5Х1 분), DCM(4Х1 분)으로 세척하여 진공 하에 건조시켰다.

실시예 4. 실시예 2 및 3에 따라 수득된 펩티딜 수지의 중합체 지지체로부터의 절단 공정.

가중치를 규정화했다. 실시예 2 또는 3에서 얻어진 건조된 펩티딜 수지 200 mg을 TFA/TIS/H₂O(90:5:5) 5mL로 실온에서 교반하면서 2시간 동안 처리하였다. 여액을 모아 냉 디에틸 에테르 50mL(8 내지 10배)를 사용하여 침전시켰다. 에테르성 용액을 감압 및 실온에서 증발 건조시켜, 침전물을 H₂O 중 50%(v/v) MeCN에 재용해시키고 동결건조시켰다.

실시예 5. 실시예 4에 따라 합성 및 제조된 펩타이드의 특성화.

실시예 4에 따라 얻은 펩타이드의 HPLC 분석은 역상 칼럼(150x4.6 mm, XBridge Peptide BEH C18, 3.5μm, Waters, USA)을 사용하여 시마즈 장치(Kyoto, Japan)로 1.25 mL/분의 유속으로 H₂O(+0.045% TFA) 중의 MeCN(+0.036% TFA) 구배로 수행하고 검출은 220nm에서 수행하였다. 모든 펩타이드는 80%를 초과하는 순도를 나타냈다. 수득된 펩타이드의 동일성은 이동상으로서 MeOH를 사용하고 0.2 mL/분의 유속으로 Water ZQ 4000 검출기에서 ESI-MS로 확인하였다. 얻어진 결과는 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1- NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2- NH₂ 및 Ac-SEQ ID NO: 3- NH₂가 정확하고 효과적으로 합성되었음을 입증했다.

실시예 6. Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 함유하는 얼굴의 화장용 조성물(cosmetic facial composition)의 제조.

하기 표 1에 따른 얼굴 화장용 조성물을 제조하였다. 이를 위해 상 A의 성분을 적절한 용기에 용해시키고 혼합물을 70-75℃로 가열했다. 다른 용기에서 상 B의 성분을 함께 혼합하고 혼합물을 70-75℃로 가열했다. 다음으로, 상 C(TEGOLON 12-10(INCI: 나일론-12))를 완전히 용해될 때까지 교반하면서 상 B에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 70-75℃로 가열하였다. 다음으로, 상 A의 용액을 터빈 교반 하에 상 B 및 C의 혼합물에 첨가하여 에멀젼을 형성하였다. 다음으로, 상 D를 혼합물에 천천히 첨가하면서 균질한 에멀젼이 얻어질 때까지 교반을 유지하였다. 마지막으로 혼합물을 약 30℃에서 교반하면서, Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂(INCI: 물(Aqua), 글리세린, 카프릴릴 글리콜, Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂) 화합물을 함유하는 시판의 제형을 천천히 첨가했다.

표 1. 실시예 6에서 제조된 얼굴 화장용 조성물.

상	성분	중량% (g/100g)
A	물	q. s. (적당량) 100
A	이나트륨 EDTA	0.15
A	황산 마그네슘	1.5
A	글리세린	2.5
B	카프릴/카프르산 트리글리세라이드(Caprylic/Capric triglyceride)	8
B	이소노닐/이소노나노에이트	15
B	폴리글리세릴-4 디이소스테아레이트/폴리히드록시스테아레이트/세바케이트	3
B	버스타틸(Verstatil) TBO (INCI: 트리에틸 시트레이트, 카프릴릴 글리콜, 벤조산): 트리에틸 시트레이트 카프릴릴 글리콜 벤조산	0.455 0.37 0.175
B	합성 밀랍(Synthetic beeswax)	3
C	나일론(Nylon)-12	2
D	BRB SG 516 (INCI: 디메티콘, 디메티콘/비닐 디메티콘 크로스폴리머) 디메티콘 디메티콘/비닐 디메티콘 크로스폴리머	1.7 0.3
E	Ac-SEQ ID NO: 1- NH₂ 의 시판 제형(INCI: 물 (Aqua), 글리세린, 카프릴릴 글리콜, Ac-SEQ ID NO:1-NH₂): 물(Aqua) 글리세린 카프릴릴 글리콜 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂	0.9445 0.05 0.005 0.0005

실시예 7. HEKa(인간 표피 각질형성세포, 성인) 및 HDFa(인간 진피 섬유아세포, 성인) 세포에서의 IL33 발현 조절에 대한 분석

펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂ 및 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂를 HEKa 세포(3가지 펩타이드 모두) 및 HDFa(펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂에 대해서만 분석됨)에서 IL33의 발현을 조절하는 능력에 대해 분석하였다.

본 실시예에 사용된 펩타이드는 실시예 1 내지 5에 따라 제조하였다.

펩타이드의 스톡 용액을 물에서 1 mg/mL로 제조하였다. 작업 용액은 해당 보충 배지의 스톡 용액으로부터 지정된 농도로 새로 준비했다.

미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군 샘플로 사용했다.

RNA(ribonucleic acid) 추출 및 RT-qPCR(역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응)을 수행했다. 간단히 말해서, HDFa 및 HEKa 세포를 4 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 이중으로(n=2) 접종하여, 표준 배양 조건(HDFa 세포의 경우, 1%(v/v) LSGS가 보충된 106 배지; HEKa 세포의 경우, 1%(v/v) EDGS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지 Epilife; 37℃, 95% 실내 습도, 5% CO₂)에서 24시간 유지했다. 이후, 세포를 0.01 mg/mL 농도의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂ 또는 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂로 24시간 동안 처리하였다. 미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군으로 사용하였다.

세포를 최종적으로 용해하여, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen RNeasy Mini 키트를 사용하여 RNA 추출을 위해 복제물을 함께 모았다. 정제된 RNA를 사용하여 증폭을 위한 템플릿 역할을 하는 시판의 키트 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용한 역전사에 의해 상응하는 cDNA(상보적 데옥시리보핵산)를 생성했다. StepOne 플러스 Real-Time PCR 기기를 사용하여 IL33(+ GAPDH -글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제- 하우스키핑 유전자로 사용) 및 2x 유전자 발현 마스터 믹스에 대한 적절한 TaqMan 분석 프로브로 RT-qPCR을 수행했다. 증폭에는 95℃에서 15초(변성) 및 60℃에서 1분(어닐링 및 확장)의 40주기가 포함된다(Arya, M., Shergill, I.S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., Patel, H.R. (2005) Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev. Mol. Diagn.; 5(2):209-19; and Jozefczuk, J. and Adjaye, J. (2011) Quantitative real-time PCR-based analysis of gene expression. Methods Enzymol. 500; 99-109).

얻어진 데이터는 ΔΔCt 방법을 사용하여 분석되었으며, 이는 미처리된 기본 샘플과 비교하여 처리된 샘플에서 배수 변화로서 표적 유전자 발현 값을 제공한다. 두 샘플 모두 하우스키핑 유전자 GAPDH(글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제)의 상대적인 발현으로 규정화되었다.

분석 단계에는 다음이 포함된다:

1. 각 상태에 대한 평균 Ct 계산

2. ΔCT 테스트 샘플과 ΔCT 미처리 샘플을 계산

3. ΔΔCT 계산: ΔΔCT = ΔCT 테스트 샘플-ΔCT 미처리 샘플

4. 2^-ΔΔCT로 비율 구하기

이 분석에서, 테스트된 모든 펩타이드에 대해 HEKa 세포에서 IL33 유전자 발현의 명확한 하향조절이 관찰되었다:

- Ac-SEQ ID NO: 1- NH₂: 기본 대조군과 관련하여 처리된 세포에서 -4.58배 변화.

- Ac-SEQ ID NO: 2- NH₂: 기본 대조군과 관련하여 처리된 세포에서 -3.77배 변화.

- Ac-SEQ ID NO: 3- NH₂: 기본 대조군과 관련하여 처리된 세포에서 -3.93배 변화.

또한, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂에 대해 IL33 발현의 하향조절이 HDFa 세포에서도 관찰되었다(기본 대조군과 관련하여 -1.22배 변화 처리된 세포).

본 실시예의 결과는 IL33의 발현을 하향조절하는 본 발명의 펩타이드의 유용성을 입증하고, 따라서 위에서 설명된 바와 같이, 주로 염증 및 추가로 피부 장벽의 개선을 제공하고, 혈관신생의 감소 및 색소 침착의 감소를 제공한다. 따라서, 이 실시예의 결과는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점, 보다 바람직하게는 아이백, 눈꺼풀 결점, 눈 주위의 주름 및 다크 서클(안와주위 과색소증)을 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한 본 발명의 펩타이드의 유용성을 입증한다.

실시예 8. HDFa 세포에서 단백질 IL-33 생산의 분석.

성인 인간 진피 섬유아세포에서 IL-33 생산을 조절하는 능력에 대해 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 분석하였다.

펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 실시예 1 내지 5에 따라 제조하였다.

성인 인간 진피 섬유아세포(HDFa)를 상응하는 성장 배지 중 1x10⁵ cells/mL 농도로 24웰 플레이트에 접종하여, 표준 배양 조건에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 그 때, IL-33-유도 자극(IFNγ, 300 U/mL)의 존재 하에 3가지 상이한 농도(0.005, 0.01 및 0.05 mg/mL)의 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂를 첨가하였다. 자극이 없는 세포도 기본 그룹으로 포함되었다. 양성 대조군은 300 U/mL의 IFNγ로 처리하였으나, 본 발명의 펩타이드로는 처리하지 않았다. 24시간 후, 컨디셔닝된 배지를 수집하여, 단백질 추출을 위해 세포를 처리했다.

세포 용해물 중의 IL-33 수준을 시판되는 ELISA 키트(DuoSet ELISA. R&D)로 분석하였다. 흡광도는 자동화된 분광 광도계 플레이트 판독기로 측정하였다.

이 실시예에서 얻은 결과는 도 1에 요약되어 나타나며, 여기서 IFNγ(300 U/mL)는 HDFa 세포에서 단백질 IL-33의 생산 증가를 유도하고, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂는 IFNγ(300 U/mL)에 노출된 HDFa 세포에 의해 생성된 IL-33 단백질 수준을 용량 의존적 방식으로 감소시킨다(즉, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1- NH₂의 농도가 증가함에 따라 IL-33 단백질 수준의 더 큰 감소가 관찰됨).

본 실시예의 결과는 본 발명의 펩타이드가 IL-33 발현의 하향조절을 통해 염증을 감소시키는 데 유용함을 입증하고, 따라서 위에서 설명한 바와 같이, 피부 장벽의 개선, 혈관신생의 감소 및 색소 침착의 감소를 제공한다. 따라서, 이 실시예의 결과는 피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점, 보다 바람직하게는 아이백, 눈꺼풀 결점, 눈 주위의 주름 및 다크 서클(안와주위 과색소증)을 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한 본 발명의 펩타이드의 유용성을 입증한다. .

실시예 9. 인간 표피 각질형성세포, 성인(이하, HEKa)에서 유전자 발현 조절의 분석.

표피 세포 응집과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 능력에 대해 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂ 및 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂를 분석하였다(분석된 유전자에 대해 표 2를 참조).

펩타이드의 스톡 용액을 물에서 1 mg/mL로 제조하였다. 작업 용액은 해당 보충 배지 중의 스톡 용액으로부터 지정된 농도로 새로 준비했다.

미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군 샘플로 사용했다.

RNA(ribonucleic acid) 추출 및 RT-qPCR(역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응)을 수행했다. 간단히 말해서, HEKa 세포를 4 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 이중으로(n=2) 접종하여, 표준 배양 조건(1%(v/v) EDGS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지 Epilife; 37℃, 95% 실내 습도, 5% CO₂)에서 24시간 유지했다.

이후, 세포를 0.01 mg/mL 농도의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂ 또는 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂로 24시간 동안 처리하였다. 미처리 세포를 기저 또는 음성 대조군으로 사용하였다.

세포를 최종적으로 용해하여, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen RNeasy Mini 키트를 사용하여 RNA 추출을 위해 복제물을 함께 모았다. 정제된 RNA를 사용하여 증폭을 위한 템플릿 역할을 하는 시판의 키트 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용한 역전사에 의해 상응하는 cDNA(상보적 데옥시리보핵산)를 생성했다. StepOne 플러스 Real-Time PCR 기기를 사용하여 표 1에 나타낸 유전자(+ GAPDH -글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제- 하우스키핑 유전자로 사용) 및 2x 유전자 발현 마스터 믹스에 대한 적절한 TaqMan 분석 프로브의 패널로 RT-qPCR을 수행했다. 증폭에는 95℃에서 15초(변성) 및 60℃에서 1분(어닐링 및 확장)의 40주기가 포함된다(Arya, M., Shergill, I.S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., Patel, H.R. (2005) Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev. Mol. Diagn.; 5(2):209-19; and Jozefczuk, J. and Adjaye, J. (2011) Quantitative real-time PCR-based analysis of gene expression. Methods Enzymol. 500; 99-109).

표 2. 실시예 9에서 분석된 유전자(약어 및 완전한 이름).

약어	유전자
JUP	접합 플라코글로빈(Junction Plakoglobin)
OCLN	오클루딘(Occludin)
DSP	데스모플라킨(Desmoplakin)
CLDN1	클라우딘(Claudin) 1
CLDN4	Claudin 4
DSC2	데스모콜린(Desmocollin) 2
CDSN	코르네오데스모신(Corneodesmosin)
PCDH1	프로토카데린(Protocadherin) 1
TJP1	단단한 접합 단백질(Tight Junction Protein) 1
PKP2	플라코필린(Plakophilin) 2
PPL	페리플라킨(Periplakin)

분석 단계에는 다음이 포함된다:

1. 각 상태에 대한 평균 Ct 계산

2. ΔCT 테스트 샘플과 ΔCT 미처리 샘플을 계산

3. ΔΔCT 계산: ΔΔCT = ΔCT 테스트 샘플-ΔCT 미처리 샘플

4. 2^-ΔΔCT로 비율 구하기

이 분석의 결과는 표 3-5에도 요약되어 있다.

표 3. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 처리된 HEKa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	Ac-SEQ ID NO: 1- NH₂ (배수 변화)
JUP	1.42
OCLN	1.98
DSP	1.28
CLDN1	1.57
CLDN4	2.64
DSC2	1.23
CDSN	1.46
PCDH1	2.41
TJP1	1.25
PKP2	1.72
PPL	1.54

표 4. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂로 처리된 HEKa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	Ac-SEQ ID NO: 2- NH₂ (배수 변화)
OCLN	1.58
CLDN4	1.51
PCDH1	2.14
TJP1	1.34
PKP2	1.42

표 5. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂로 처리된 HEKa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화

약어	Ac-SEQ ID NO: 3- NH₂ (배수 변화)
JUP	1.23
OCLN	1.99
DSP	1.28
CLDN1	1.5
DSC1	1.41
CLDN4	1.90
DSC2	1.43
PCDH1	2.48
TJP1	1.43
PKP2	1.86
PPL	1.52

표 3-5에서 쉽게 도출할 수 있는 바와 같이:

- 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1- NH₂는 긴밀한 접합 및 장벽 기능과 관련된 주요 유전자를 분명히 상향조절했다: JUP, OCLN, DSP, CLDN1, CLDN4, DSC2, CDSN, PCDH1, TJP1, PKP2 및 PPL.

- 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 2- NH₂는 긴밀한 접합 및 장벽 기능과 관련된 주요 유전자를 분명히 상향조절했다: OCLN, CLDN4, PCDH1, TJP1 및 PKP2.

펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 3- NH₂는 긴밀한 접합 및 장벽 기능과 관련된 주요 유전자를 분명히 상향 조절했다: JUP, OCLN, DSP, CLDN1, DSC1, CLDN4, DSC2, PCDH1, TJP1, PKP2 및 PPL.

따라서, 본 발명의 펩타이드(Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂ 및 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂에 의해 예시됨)는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점을 감소, 예방 및/또는 제거하고, 보다 정확하게는, 이 실시예의 결과는 각질형성세포간의 긴밀한 접합을 개선하고, 이들간의 응집력을 개선하고, 따라서 피부의 탄력(firmness)을 개선하고, 주름을 감소시키는 본 발명의 펩타이드의 유용성을 입증한다.

실시예 10. 성인의 1차 인간 진피 섬유아세포에서 유전자 발현 조절의 분석.

콜라겐 및 세포외 기질의 생산과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 능력에 대해 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂ 및 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂를 분석하였다(분석된 유전자에 대해 표 6을 참조).

미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군 샘플로 사용했다.

RNA(ribonucleic acid) 추출 및 RT-qPCR(역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응)을 수행했다. 간단히 말해서, HDFa 세포를 4 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 이중으로(n=2) 접종하여, 표준 배양 조건(1%(v/v) LSGS가 보충된 106 배지; 37℃, 95% 실내 습도, 5% CO₂)에서 24시간 유지했다. 이후, 세포에 0.01 mg/mL 농도의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 24시간 및 48시간 동안 처리하였다. 미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군으로 사용하였다.

세포를 최종적으로 용해하여, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen RNeasy Mini 키트를 사용하여 RNA 추출을 위해 복제물을 함께 모았다. 정제된 RNA를 사용하여 증폭을 위한 템플릿 역할을 하는 시판의 키트 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용한 역전사에 의해 상응하는 cDNA(상보적 데옥시리보핵산)를 생성했다. StepOne 플러스 Real-Time PCR 기기를 사용하여 표 5에 나타낸 유전자(+ GAPDH -글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제- 하우스키핑 유전자로 사용) 및 2x 유전자 발현 마스터 믹스에 대한 적절한 TaqMan 분석 프로브의 패널로 RT-qPCR을 수행했다. 증폭에는 95℃에서 15초(변성) 및 60℃에서 1분(어닐링 및 확장)의 40주기가 포함된다(Arya, M., Shergill, I.S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., Patel, H.R. (2005) Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev. Mol. Diagn.; 5(2):209-19; and Jozefczuk, J. and Adjaye, J. (2011) Quantitative real-time PCR-based analysis of gene expression. Methods Enzymol. 500; 99-109).

표 6. 실시예 10에서 분석된 유전자(약어 및 완전한 이름).

약어	유전자
COL3A1	콜라겐 III형 알파 1 쇄
MMP1	매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix Metalloproteinase) 1
MMP3	매트릭스 메탈로프로테이나제 3
FBN1	피브릴린(Fibrillin) 1
TIMP2	메탈로프로테이나제 2의 조직 억제제
LAMA1	라미닌 서브유닛 알파(Laminin Subunit Alpha) 1

얻어진 데이터는 ΔΔCt 방법을 사용하여 분석하였으며, 이는 미처리된 기본 샘플과 비교하여 처리된 샘플에서 배수 변화로서 표적 유전자 발현 값을 제공한다. 두 샘플 모두 하우스키핑 유전자 GAPDH(글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제)의 상대적인 발현으로 규정화했다.

분석 단계에는 다음이 포함된다:

1. 각 상태에 대한 평균 Ct 계산

2. ΔCT 테스트 샘플과 ΔCT 미처리 샘플을 계산

3. ΔΔCT 계산: ΔΔCT = ΔCT 테스트 샘플-ΔCT 미처리 샘플

4. 2^-ΔΔCT로 비율 구하기

이 분석의 결과는 표 7 내지 10에 요약되어 나타난다.

표 7. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 처리된 HDFa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	배수 변화
COL3A1	1.32
TIMP2	1.35
LAMA1	1.16

표 8. 48시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 처리된 HDFa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	배수 변화
MMP1	-1.30
MMP3	-1.69

표 9. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂로 처리된 HDFa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화

약어	배수 변화
MMP1	-1.21
FBN1	1.20

표 10. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂로 처리된 HDFa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	배수 변화
MMP1	-1.46
MMP3	-1.30
FBN1	1.29

표 7 및 8로부터 쉽게 유도될 수 있는 바와 같이, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂에 대해:

- 24시간째: LAMA1, COL3A1 및 TIMP2의 상향 조절이 관찰되었음.

- 48시간째: MMP1 및 MMP3의 하향조절이 관찰되었음.

표 9로부터 쉽게 유도될 수 있는 바와 같이, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂에 대해:

- 24시간째: FBN1의 상향조절과 MMP1의 하향조절이 관찰되었음.

표 10으로부터 쉽게 유도될 수 있는 바와 같이, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂에 대해:

- 24시간째: FBN1의 상향조절과 MMP1 및 MMP3의 하향조절이 관찰되었음.

따라서, 본 발명의 펩타이드(Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂ 및 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂에 의해 예시됨)는 ECM 합성 및 유지와 관련하여 유전자의 유리한 조절을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점을 감소, 예방 및/또는 제거할 수 있으며, 보다 정확하게는 이 실시예의 결과는 본 발명의 펩타이드가 피부의 탄력을 개선하고 주름을 감소시키는 데 유용함을 입증한다.

실시예 11. 티로시나제 활성의 분석.

티로시나제 활성을 조절하는 능력에 대해 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1- NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2- NH₂, Ac-SEQ ID NO: 3- NH₂ 및 Ac-Arg-Arg-Gln-Met-Glu-Glu-NH₂(Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂)를 분석하였다.

간략하게, 상이한 농도의 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂(0.05, 0.25, 0.5 및 2.5 mg/mL), Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂(0.05, 0.25, 0.5 및 2.5 mg/mL), Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂(0.05, 0.25, 0.5 및 2.5 mg/mL) 및 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂(0.005, 0.025, 0.05, 0.25, 0.5 및 2.5 mg/mL) 및 양성 대조군 코지산(400 및 800 μM)을, L-DOPA(PBS 중 L-3,4 디히드록시페닐알라닌 2.5 mg/mL)를 첨가하기 전에 30분 동안 재조합 버섯 티로시나제와 함께 인큐베이션했다. 실온에서 2시간 반응 후 마이크로플레이트 리더 Multiskan FC(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 각 웰의 450 nm에서의 흡광도를 측정했으며, 이는 반응 혼합물 중의 도파크롬(dopachrome)의 양에 정비례한다.

흡광도 값은 100%로 설정된 비처리 웰(대조군)에 대해 규정화하여 테스트된 각 상태에 대한 활성 백분율을 얻었다.

이 실시예에서 얻은 결과는 도 2(2A~2D)에 요약되어 나타난다.

상기 도면에서 직접 유도할 수 있는 바와 같이, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂(도 2A)는 시험된 모든 농도에서 티로시나제를 억제했지만, 이 효과는 0.25 mg/mL 이상에서 용량 의존적으로 증가하였다.

그 측면에서, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂(도 2B)는 0.05 mg/mL 이상에서 용량 의존적 방식으로 티로시나제 활성의 억제를 나타내었다.

펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂(도 2C)는 0.25 mg/mL 이상의 농도에서 티로시나제 활성의 용량 의존적 억제를 나타냈다.

그 측면에서, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂(도 2D)(본 발명의 펩타이드가 아님)는 시험된 임의의 농도에서 티로시나제 활성을 억제하지 않았다. 반대로, 농도 0.05 mg/mL 이상에서는 용량 의존적으로 티로시나제 활성을 증가시켰다.

최신 기술에서 다크 서클은 무엇보다도 멜라닌 침착으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 티로시나제 활성의 억제가 멜라닌 침착을 감소시킨다는 것도 확립되어 있다(MI Ryung Roh, Kee Yang Chung: Infraorbital Dark Circles: Definition, Causes, and Treatment Options, Dermatological Surgery, 35:8:August 2009).

이들 결과는 과색소침착, 바람직하게는 눈의 안와주위 과색소증의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 펩타이드(Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂, Ac-SEQ ID NO: 2-NH₂ 및 Ac-SEQ ID NO: 3-NH₂에 의해 예시됨)의 유용성을 입증하지만, 티로시나제 활성을 억제하는 대신에 상기 활성을 유지하거나 증가시키는 유사한 펩타이드(Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂)는 아니다.

실시예 12. 혈관신생에 대한 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂의 효과.

시험관내에서 혈관 형성을 조절하는 능력에 대해 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 분석하였다.

이 경우 인간 제대 정맥 혈관 내피세포(HUVEC, Human umbilical vein endothelial cells)를 사용하여 튜브 형성 분석을 수행했다. 간단히 말해서, 40μL의 겔트렉스를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하고 30분 동안 응고되도록 두었다. 그 후 8000개의 세포를 다음과 함께 각 웰에 적용했다:

- 완전 배지(기본 대조군).

- 완전 배지 + 20 μM 수라민(Suramin)(튜브 형성 억제제).

- 완전 배지 + 10 ng/mL IL-33.

- 완전 배지 + 10 ng/mL IL-33 + 상이한 농도의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂(더 정확하게는 0.01mg/mL, 0.05mg/mL 또는 0.1mg/mL).

16시간의 인큐베이션 후 세포를 현미경으로 시각화하고 각 웰의 10x에서 사진을 촬영했다. 각각의 웰에 대해, 메쉬의 수와 메쉬의 전체 면적을 혈관 형성(즉, 혈관 신생)의 지표로 분석했다.

결과는 도 3에 요약되어 있다.

상기 도면에서 쉽게 유도할 수 있는 바와 같이, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂는 메쉬 수 및 메쉬의 전체 면적의 양자와 관련하여 테스트된 모든 농도에서 IL-33에 의해 유도된 혈관 형성 또는 혈관 신생을 역전시킬 수 있었다.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 예시되는 바와 같이, 혈관 신생을 억제 및/또는 예방할 수 있으며, 따라서, 혈관 신생 또는 과도한 혈관 형성, 바람직하게는 아이백 및 안와주위 과색소증과 관련된 미용적 형질의 치료에 유용하다.

실시예 13. 지질 과산화에 대해 보호하는 본 발명의 펩타이드의 능력에 대한 분석.

펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH2는 티오바르비투르산 반응성 물질(Thiobarbituric Acid Reactive Substances, 이하, TBARS) 분석에 의해 지질 과산화로부터 보호하는 능력에 대해 분석하였다.

간단히 말해서, 지질 과산화를 위한 기질인 난황 포스파티딜콜린(EYPC)의 작은 단층 소포의 존재 하의 Trolox(양성 대조군), 0.01, 0.05, 0.1 및 0.5 mg/mL의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 37℃에서 티오바르비투르산(TBA) 존재 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 형광 측정법을 사용하여 음성 대조군(난황 포스파티딜콜린의 작은 단층 소포만 있는 샘플)과 비교하여 지질 과산화 %를 평가했다.

이 실시예에서 얻은 결과는 도 4에 요약되어 있다.

상기 도면으로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 시험된 모든 농도에서 항산화 활성을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 예시된 바와 같이 지질 과산화로부터 보호할 수 있었다.

멜라토닌은 또한 강력한 항산화제이기 때문에, 과산화로부터 보호하는 펩티드 능력의 분석도 멜라토닌과 비교되었다.

테스트, 제어, 절차, 재료 및 데이터 분석은 상기 설명한 바와 동일하다.

도 8은 0.1mg/mL 및 0.5mg/mL의 멜라토닌과 비교하여 항과산화 활성에 대해 얻은 데이터의 그래픽 표현을 보여준다.

데이터는 본 발명의 펩타이드가 지질 과산화에 대해 멜라토닌 유사 보호 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

당업계에 공지된 바와 같이, 지질 과산화는 세포막의 변화로 인한 세포 손상 및 사멸과 관련이 있다.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 예시되는 바와 같이, 노화 예방 및/또는 치료를 위한 화장품 및 지질 과산화 관련 질환, 바람직하게는 죽상경화증, 염증성 장질환, 미숙아 망막증, 경계성 인격 장애, 천식, 파킨슨병 및 신장 손상의 예방 및/또는 치료를 위한 의약에 유용하다.

실시예 14. 당화로부터 보호하는 본 발명의 펩타이드의 능력에 대한 분석.

펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 고급 당화 최종 생성물(AGE)의 형성을 감소시키는 능력에 대해 분석하였다.

간략하게, 0.01, 0.05, 0.1 및 0.5 mg/mL의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂를 당화제 및 이의 상응하는 기질과 함께 혼합하였다. 샘플을 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션했다. 형광 측정법을 사용하여 음성 대조군(슈가 기질만 있는 샘플)과 비교하여 단백질 당화의 %를 평가했다.

이 실시예에서 얻은 결과는 도 5에 요약되어 있다.

상기 도면으로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드는 시험된 모든 농도에서 당화제에 의해 생성된 당화를 거의 완전히 역전시킬 수 있었다.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 예시된 바와 같이, 단백질 당화로부터 보호할 수 있었다.

또한, 단백질 당화로부터 보호하는 본 발명의 펩타이드의 능력을 생체외에서도 시험하였다.

간단히 말해서, 40세 여성의 인간 피부 이식편은 습한 5% CO2 분위기의 37℃에서 BEM 배양 배지 중 생존 상태로 유지되었다. 실시예 6에 따른 화장용 조성물은 펩타이드 없이(위약) 1%(w/v) Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 함유하도록 제조하였다. 이들 크림은 외식편당 2μL(2mg/cm²)을 기준으로 국소 적용하고, 0일(D0), 1일, 4일, 6일 및 8일에 작은 주걱을 사용하여 도포하였다. 대조군 외식편은 배양 배지의 재생을 제외하고는 어떠한 처리도 받지 않았다. 당화를 유도하기 위해, 메틸글리옥살(MG) 용액을 관련 배치 "MG"에서 4일, 6일 및 8일에 500μM의 최종 농도로 BEM 배양 배지에 혼입했다(대조군 미처리 외식편을 제외한 모든 샘플). 이식편을 각 시점에서 수집하여 두 부분으로 절단했다. 절반은 완충 포르말린 용액에 고정하고 절반은 -80℃에서 동결했다.

완충 포르말린에 24시간 동안 고정한 후, 샘플을 탈수하고 파라핀에 함침시켰다. Leica RM 2125 Minot형 마이크로톰을 사용하여 5μm 두께의 절편을 만들고 이 절편을 Superfrost® 조직학적 유리 슬라이드에 올려 놓았다.

카르복시.메틸 라이신(Carboxy.methyl lysine, CML) 면역 염색(CML은 산화 스트레스와 화학적 당화의 결과로 단백질과 지질에서 발견되는 고급 당화 최종 생성물(AGE)이며 진행성 당화의 마커로 사용됨)은 PBS-BSA 0.3%(w/v)에서 1:25로 실온에서 1박 동안 희석된 단일클론 항- CML 항체와 함께 실행하여 퍼옥시다제의 기질인 VECTOR® VIP(Vector Laboratories)에 의해 밝혀졌다.

도 6에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂는 배양 9일 후 MG-유도 당화로부터 보호되어, MG-노출된 미처리 외식편과 비교할 때 CML 신호의 현저한 감소(-73%)를 나타낸다. 위약 처리된 외식편은 CML 염색에서 유의한 감소를 나타내지 않았다.

멜라토닌은 또한 당화로부터 보호할 수 있는 강력한 항산화제이기 때문에, 고급 당화 최종 산물(AGE)(당화에 대한 보호)의 형성을 감소시키는 펩타이드 능력의 분석도 멜라토닌과 비교하였다.

도 9는 0.1 mg/mL 및 0.5 mg/mL의 멜라토닌과 비교하여 항당화 활성에 대해 얻은 데이터의 그래픽 표현을 보여준다.

데이터는 본 발명의 펩타이드가 당화에 대한 멜라토닌 유사 보호 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

당업계에 공지된 바와 같이, 당화는 시간이 지남에 따라 자연적으로 발생하는 내인성 노화 기전 중 하나이지만, 당뇨병, 신부전 및 염증 동안 병리학적인 방식으로도 발생한다. AGEs는 수많은 노화 관련 퇴행성 질환에서 조직과 장기에 고도로 축적된다. 이들 독성 부가물(글리코톡신)은 특히 당뇨병 환자 및 오래된 유기체에서 세포 기능 장애와 관련이 있다. 당뇨병 환자에서 AGE 형성 및 축적은 당뇨병성 혈관병증으로 이어지는 혈관 변화를 초래한다.

당화는 또한 세포외 기질 손상(콜라겐 및 탄성 섬유 손상), 염증, 산화 스트레스 및 세포 사멸과 관련이 있으므로 노화와 관련이 있다.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂로 예시되는 바와 같이, 단백질 당화로부터 보호할 수 있고, 따라서 노화의 방지 및/또는 치료를 위한 화장품 및 당화와 관련된 질병, 바람직하게는 당뇨병(더 바람직하게는 당뇨병성 혈관병증), 신부전, 염증 및 노화 관련 퇴행성 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약물에 유용하다.

실시예 15. 생체외 샘플에서 피브릴린-1의 분석.

당화로부터 진피 세포외 기질 구조를 보호하는 능력에 대해 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂를 분석하였다.

간단히 말해서, 40세 여성의 인간 피부 이식편을 습한 5% CO2 분위기 중 37℃에서 BEM 배양 배지 중 생존 상태로 유지했다. 위약 크림 및 실시예 6에 따라 제조된 !% Ac-SEQ ID NO:1-NH₂를 함유하는 크림을 외식편당 2μL(2mg/cm²)의 기준으로 국소 도포하고, 0일째(D0), 1일, 4일, 6일 및 8일에 작은 주걱을 이용하여 도포했다. 대조군 외식편은 배양 배지의 재생을 제외하고는 어떠한 처리도 받지 않았다. 당화를 유도하기 위해, 관련 배치 "MG"(대조군 미처리 샘플을 제외한 모든 샘플)에서 4일, 6일 및 8일에 500μM의 최종 농도로 BEM 배양 배지에 메틸글리옥살(MG) 용액을 혼입했다. 이식편을 각 시점에서 수집하여 두 부분으로 절단했다. 절반은 완충 포르말린 용액에 고정하고, 절반은 -80℃에서 동결했다.

피브릴린 1 면역염색은 PBS, BSA 0.3%(w/v) 및 트윈 20 중에 0.05%(v/v)에서 1:500으로 희석된 단일클론 항피브릴린 1 항체를 사용하여 실온에서 1시간 동안 동결 절편에서 비오틴/스트렙트아비딘 증폭 시스템으로 수행했으며 FITC로 밝혀졌다. 핵은 프로피듐 요다이드(propidium iodide)로 대조 염색하였다.

도 7의 데이터는 9일에 노출되지 않은 대조군과 비교할 때 MG에 대한 노출이 진피에서 피브릴린 1 염색의 유의한 감소를 유도하는 방법을 보여준다. 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂는 이러한 손상으로부터 보호할 수 있었으며, MG에 노출된 미처리 대조군과 비교할 때 9일째에 피브릴린 1 염색(86%)이 유의하게 증가했음을 보여준다.

당업계에 알려진 바와 같이, 피브릴린-1은 옥시탈란 섬유의 주요 성분으로, 진피-표피 접합부를 따라 발견되어 피부의 온전함과 기계적 특성을 유지하는 데 필수적인 기능을 나타낸다(Oxlund et al. , 1980. J Anat. 131: 611-620). 피부-미용 연구에서, 피브릴린-1은 일반적으로 진피의 세포외 기질의 구조적 상태의 바이오마커로 사용된다.

따라서, 본 발명의 펩타이드(Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂에 의해 예시됨)는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점을 감소, 예방 및/또는 제거하고, 보다 정확하게는 이 실시예의 결과는 피부의 온전함과 기계적 성질을 유지하여 피부의 탄력을 향상시키고 주름을 감소시키는 본 발명의 펩타이드의 유용성을 입증한다.

실시예 16. 수면 부족에 대한 반응과 관련된 유전자 발현 분석.

펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂는 HDFa 세포, HEKa 세포 및 HUVEC에서 수면 부족의 결과와 관련된 유전자(분석된 유전자에 대해서는 표 11을 참조)의 발현을 조절하는 능력에 대해 분석하였다.

미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군 샘플로 사용했다.

RNA(ribonucleic acid) 추출 및 RT-qPCR(역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응)을 수행했다. 간단히 말해서, HEKa, HDFa 또는 HUVEC 세포를 4 x 10⁵ 세포/웰(HUVEC 세포의 경우 2 x 10⁵ 세포/웰)의 밀도로 6웰 플레이트에 이중으로(n=2) 접종하고 표준 배양 조건(HDFa 세포의 경우, 1%(v/v) LSGS가 보충된 106 배지, HEKa 세포의 경우, 1%(v/v) EDGS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지 Epilife, HUVEC 세포의 경우, 내피 세포 성장 배지; 37℃, 95% 실내 습도, 5% CO₂)에서 24시간 동안 유지했다.

이후, 세포를 0.01 mg/mL 농도의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂로 24시간 동안 처리하였다. 미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군으로 사용하였다.

세포를 최종적으로 용해하여, 제조업체의 지침에 따라 Qiagen RNeasy Mini 키트를 사용하여 RNA 추출을 위해 복제물을 함께 모았다. 정제된 RNA를 사용하여 증폭을 위한 템플릿 역할을 하는 시판의 키트 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용한 역전사에 의해 상응하는 cDNA(상보적 데옥시리보핵산)를 생성했다. StepOne 플러스 Real-Time PCR 기기를 사용하여 표 10에 나타낸 유전자(+ GAPDH -글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제- 하우스키핑 유전자로 사용) 및 2x 유전자 발현 마스터 믹스에 대한 적절한 TaqMan 분석 프로브의 패널로 RT-qPCR을 수행했다. 증폭에는 95℃에서 15초(변성) 및 60℃에서 1분(어닐링 및 확장)의 40주기가 포함된다(Arya, M., Shergill, I.S., Williamson, M., Gommersall, L., Arya, N., Patel, H.R. (2005) Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev. Mol. Diagn.; 5(2):209-19; and Jozefczuk, J. and Adjaye, J. (2011) Quantitative real-time PCR-based analysis of gene expression. Methods Enzymol. 500; 99-109).

표 11. 실시예 16에서 분석된 유전자(약어 및 완전한 이름).

약어	유전자
IL1RL1	인터루킨(Interleukin) 1 수용체 유사(receptor like) 1 (IL33 수용체)
MTNR1A	멜라토닌 수용체(Melatonin Receptor) 1A
SIGIRR	단일 Ig IL-1 관련 수용체 (IL33 결합 억제제)
SLC2A1	글루코스 트랜스포터(Transporter) 유형 1 (GLUT1)
CXCL8	인터루킨(Interleukin)-8
NFKB1	핵 인자 카파(Nuclear Factor Kappa) B 서브유닛(Subunit) 1

분석 단계에는 다음이 포함된다:

1. 각 상태에 대한 평균 Ct 계산

2. ΔCT 테스트 샘플과 ΔCT 미처리 샘플을 계산

3. ΔΔCT 계산: ΔΔCT = ΔCT 테스트 샘플-ΔCT 미처리 샘플

4. 2^-ΔΔCT로 비율 구하기

이 분석의 결과는 표 12 내지 14에도 요약되어 있다.

표 12. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 처리된 HDFa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	배수 변화
IL1RL1	-1.26

표 13. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 처리된 HEKa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	배수 변화
MTNR1A	2.11
SIGIRR	1.27
SLC2A1	-1.21
CXCL8	-1.33

표 14. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂로 처리된 HUVEC에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	배수 변화
NFKB1	-1.24

따라서, 본 발명의 펩타이드(Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂에 의해 예시됨)는 수면 부족과 관련된 피부 결점 및/또는 피부 노화의 징후를 감소, 예방 및/또는 제거한다. 이것은 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂가 IL-33 수준(ELISA)에 미치는 영향 외에도 IL33 수용체(IL1RL1) 및 IL33 관련 억제제(SIGIRR)의 하향 조절을 유도하여 신호를 조절할 수 있기 때문이다. 다른 염증 관련 유전자(CXCL8 및 NFKB1)의 조절도 관찰되었다.

염증에 대한 이러한 효과와는 별도로, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂는 또한 글루코스 트랜스포터 SLC2A1의 발현을 하향조절하고 멜라토닌 수용체 MNTR1의 발현을 상향조절할 수 있으며, 둘 다 수면 부족에 대한 생리학적 반응에 관여한다.

실시예 17. Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂ 처리에 의해 유도된 유전자 발현 분석

이 실시예에서는 HDFa 세포 및 HEKa 세포에서 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂의 유전자 조절을 분석했다(분석된 유전자에 대해서는 표 15를 참조).

이 실시예에 사용된 펩타이드는 실시예 1 내지 5에 따라 제조되었으며, 필요한 조정이 이루어졌다.

미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군 샘플로 사용했다.

RNA(ribonucleic acid) 추출 및 RT-qPCR(역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응)을 수행했다. 간단히 말해서, HEKa 또는 HDFa 세포를 4 x 10⁵개 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 이중으로(n=2) 접종하고 표준 배양 조건(HDFa 세포의 경우, 1%(v/v) LSGS가 보충된 106 배지; HEKa 세포의 경우, 1%(v/v) EDGS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지 Epilife, 37℃, 95% 실내 습도, 5% CO₂)에서 24시간 동안 유지했다.

이후, 세포를 0.01 mg/mL 농도의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:4-NH₂로 24시간 동안 처리하였다. 미처리 세포를 기본 또는 음성 대조군으로 사용하였다.

표 15. 실시예 17에서 분석된 유전자(약어 및 완전한 이름).

약어	유전자
COL3A1	콜라겐 III형 알파 1 쇄
TIMP2	메탈로프로테이나제 2의 조직 억제제
IL1RL1	인터루킨(Interleukin) 1 수용체 유사 1 (IL33 수용체)
OCLN	오쿨루딘(Occludin)
SIGIRR	단일 Ig IL-1 관련 수용체 (IL33 결합 억제제)
CDSN	코르네오데스모신(Corneodesmosin)
SLC2A1	글루코스 트랜스포터 유형 1 (GLUT1)
TJP1	단단한 접합 단백질(Tight Junction Protein) 1
IL33	인터루킨(Interleukin)-33

분석 단계에는 다음이 포함된다:

1. 각 조건에 대한 평균 Ct 계산

2. ΔCT 테스트 샘플과 ΔCT 미처리 샘플을 계산

3. ΔΔCT 계산: ΔΔCT = ΔCT 테스트 샘플 -ΔCT 미처리 샘플

4. 2^-ΔΔCT로 비율 구하기

이 분석의 결과는 표 16 및 17에도 요약되어 있다.

표 16. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂로 처리된 HDFa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	배수 변화
COL3A1	-1.28
TIMP2	-1.26
IL1RL1	-1.12

표 17. 24시간 동안 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂로 처리된 HEKa 세포에서 얻은 처리된 세포와 기본 대조군 사이의 배수 변화.

약어	유전자
OCLN	-1.08
SIGIRR	-1.49
CDSN	-1.04
SLC2A1	-1.07
TJP1	-1.04
IL33	-1.01

따라서, 표 16 및 표 17에 포함된 결과로부터 직접적으로 도출할 수 있는 바와 같이, 앞서 언급한 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 아니지만 매우 유사한 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:4-NH₂는 본 발명의 펩타이드에 대해 유리한 유전자 조절을 보이는 반면, 반대로 유전자 그룹에서는 반대 유전자 조절을 나타내고, 다른 그룹의 유전자에서는 발현 효과 부족을 나타낸다.

따라서, 본 발명의 펩타이드에 대해 위에서 입증된 것과는 반대로 Ac-SEQ ID NO:4-NH₂는 다음을 나타낸다:

- COL3A1 및 TIMP2의 하향 조절을 나타냄. 따라서 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂는 ECM 합성 및 유지와 관련하여 바람직하지 않은 유전자 조절을 보였다. 따라서, 본 발명의 펩타이드와는 반대로, Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂는 피부 노화 징후 및/또는 피부 결점을 감소, 예방 및/또는 제거할 수 없었으며, 보다 정확하게는 이 실시예의 결과는 상기 펩타이드가 피부의 탄력을 개선하고 주름을 감소시킬 수 없었음을 입증한다.

- OCLN, CDSN 및 TJP1 유전자의 약간 하향 조절 또는 조절 부족을 보였으며, 즉 주요 유전자가 밀착 접합 및 장벽 기능과 관련이 있다. 따라서, Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂는 본 발명에 대한 펩타이드에 대해 입증된 것과는 반대로 각질형성세포 사이의 긴밀한 접합을 개선할 수 없고, 따라서 이들 사이의 응집력을 개선할 수 없고, 따라서 피부의 탄력을 개선하고 주름을 감소시킬 수 없다.

- 또한, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂는 SIGIRR의 하향 조절 및 SLC2A1의 약간의 하향 조절 또는 조절 부족을 나타냈다. 따라서 상기 펩타이드는 수면 부족에 대한 반응을 되돌릴 수 없었다.

- 마지막으로, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 4-NH₂는 유전자 IL33 및 IL1RL1의 발현을 조절하거나 변경할 수 없었고, 따라서 IL33과 관련되고 위에서 설명된 모든 반응을 조절할 수 없었다.

실시예 18. 인간 림프 진피 미세혈관 내피 세포(HDLMVEC)에 대한 에미린(emilin)-1 단백질의 발현에 미치는 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 효과의 분석.

이 실시예에서 에미린-1 단백질에 대한 면역형광 분석을 수행했는데, 그 이유는 이 단백질의 발현이 더 나은 림프관 구조 및 조직으로부터의 체액 제거와 관련될 수 있기 때문이다.

HDLMVEC는 5% CO₂가 포함된 가습 분위기에서 16.000 세포/cm²의 밀도와 37℃의 미세혈관 내피 세포 성장(MECG) 배지 중의 커버슬립에서 배양했다. 세포 합류가 약 70-80%일 때, 세포를 MECG 배지 중의 0.05 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 4% 포름알데히드로 고정하여, 트리톤 0.2%로 투과시켰다. 다음으로, 비특이적 항체 결합을 피하기 위해, 샘플을 PBS/BSA 5%로 1시간 동안 차단하였다.

에미린(Emilin)-1을 실온에서 1.5시간 동안 PBS/BSA 1% 중의 1:50 에미린-1 항체로 염색했다. PBS로 적절히 세척한 후, 액틴을 실온에서 1시간 동안 50 μg/mL 팔로이딘(Phalloidin)으로 염색했다. 그 다음, 세포를 PBS로 세척하고 5㎍/mL의 2차 항체 염소 항-토끼 IgG와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 핵을 염색하는 DAPI가 있는 Vectashield를 사용하여 커버슬립을 장착하고 현미경 이미지를 얻을 때까지 샘플을 4℃에서 광으로부터 보호했다.

현미경 이미지는 10x 대물렌즈를 사용하여 획득했다. 각 상태에 대해 2개의 복제물을 염색하고 동일한 설정을 사용하여 각 커버슬립의 서로 다른 10개 필드의 이미지를 획득했다.

도 10은 기저 세포(A) 및 0.05 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂로 처리된 세포(B)에 대한 형광 현미경으로 획득한 이미지를 나타낸다(녹색: 에미린-1, 적색: 팔로이딘, 청색: 핵) .

이미지 J 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석했다. 곧, 임계값을 조정하여 에미린-1 염색을 선택하고 평균 형광성을 측정했다. DAPI 염색을 사용하여 세포 수를 계산했다. 에미린-1 평균 형광 강도를 세포 수로 나누었다. 마지막으로, 모든 데이터는 미처리 세포와 비교하여 에미린-1의 %를 얻기 위해 다음과 같이 규정화했다:

기본에 대한 % = 처리된 웰의 세포당 형광/미처리 웰의 세포당 형광 x 100

처리된 세포와 미처리 세포의 형광을 비교하여 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계 데이터 분석을 수행했다. *, p < 0.05; **, p < 0.01 및 ***, p < 0.001.

표 18. HDLMVEC에 대한 결과 분석 데이터

	% 평균	± SEM	p-값 (양측)	p-값 요약
기저	100.00	25.25	-	-
0.05 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	170.88	21.23	0.0395	*

결과는 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂가 미처리 세포와 비교할 때 처리 24시간 후에 에미린-1의 발현을 70% 이상 유의하게 증가시켰다는 것을 보여준다. 에미린-1이 림프 기능에서 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때, 이러한 결과는 화장품에서의 가능한 적용과 함께 조직으로부터의 유체 제거에서 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂의 잠재적인 역할을 제안한다.

실시예 19. 인간 림프 진피 미세혈관 내피 세포(HDLMVEC)에 대한 인테그린 α9β1 단백질의 발현에 미치는 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 효과의 분석.

인테그린 α9β1(Itg9) 단백질의 발현이 더 나은 림프관 구조 및 조직으로부터의 체액 제거와 관련이 있기 때문에, 이 실시예에서 인테그린 α9β1(Itg9) 단백질에 대해 면역형광 분석을 수행하였다.

HDLMVEC는 5% CO2가 포함된 가습 분위기에서 16.000 세포/cm₂의 밀도와 37℃의 미세혈관 내피 세포 성장(MECG) 배지 중 커버슬립에서 배양했다.

세포 합류가 약 70-80%일 때, 세포를 MECG 배지에서 0.05 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 4% 포름알데히드로 고정하여, 트리톤 0.2%로 투과시켰다. 다음으로, 비특이적 항체 결합을 피하기 위해, 샘플을 PBS/BSA 5%로 1시간 동안 차단하였다.

실온에서 1.5시간 동안 PBS/BSA 1% 중의 1:50 항-Itg9 항체로 Itg9를 염색했다. PBS로 적절히 세척한 후, 액틴을 실온에서 1시간 동안 50 μg/mL 팔로이딘(Phalloidin)으로 염색했다. 그 다음, 세포를 PBS로 세척하고 5㎍/mL의 2차 항체 염소 항-토끼 IgG와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 핵을 염색하는 DAPI가 있는 Vectashield를 사용하여 커버슬립을 장착하고 현미경 이미지를 얻을 때까지 샘플을 4℃에서 광으로부터 보호했다.

현미경 이미지는 10x 대물렌즈를 사용하여 획득했다. 각 상태에 대해 두 가지 독립적인 실험을 수행했으며, 동일한 설정을 사용하여 각 커버슬립의 적어도 13가지 다른 필드의 이미지를 획득했다.

도 11은 기저 세포(A) 및 0.05 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂(B)로 24시간 처리한 후 HDLMVEC에 대한 인테그린 α9β1 발현에 대해 형광 현미경으로 획득한 이미지를 보여준다(녹색: 인테그린(Integrin) α9β1, 적색: 팔로이딘(phalloidin), 청색: 핵).

이미지 J 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석했다. 곧, 임계값을 조정하여 Itg9 염색을 선택하고 평균 형광도를 측정했다. DAPI 염색을 사용하여 세포 수를 계산했다. Itg9 평균 형광 강도를 세포 수로 나누었다.

데이터 규정화 및 통계는 이전에 설명한 대로 수행하였다.

표 19. HDLMVEC에 대한 도 11의 결과 분석에 대한 데이터

	% 평균	± SEM	p-값 (양측)	p-값 요약
기저	100.00	13.92	-	-
0.05 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	153.56	22.10	0.0463	*

결과는 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂가 처리 24시간 후 1차 인간 림프 진피 미세혈관 내피 세포에서 Itg9의 발현을 비처리 세포와 비교할 때 50% 이상 현저히 증가시킨다는 것을 보여준다. Itg9가 림프 기능에서 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때, 이러한 결과는 화장품에서의 가능한 적용과 함께 조직으로부터의 유체 제거에서 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂의 잠재적인 역할을 시사한다.

실시예 20. 인간 피부에서 분리된 1차 인간 표피 각질형성세포(HEKa)에서 선천적 항균 면역 관련 유전자의 발현에 대한 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 및 멜라토닌의 효과에 대한 분석.

테스트, 제어, 절차, 재료 및 데이터 분석은 실시예 16-17에서 설명한 바와 동일하다.

인간 표피 각질형성세포에서 바이러스 면역 반응에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 및 멜라토닌의 가능성을 RT-qPCR에 의해 평가하였다. 결과는 HEKa 세포에 대해 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 펩타이드를 사용한 6시간 처리가 HEKa에서 주요 유전자 IRF3, DEFB4A, S100A7 및 MX1/MXA의 강력한 상향조절을 유도할 수 있음을 보여준다. IRF1, DEFB1, OAS2, ISG15와 같은 다른 유전자도 D18ChAH 처리 시 상향 조절되었다. HEKa 세포에서 멜라토닌의 효과와 관련하여, 0.01 mg/mL에서 6시간 처리 후, 유전자 DEFB1, DEFB4A, S100A7, OAS2, MX1이 상향 조절되었지만, Ac-SEQ ID NO:1-NH₂의 효과에 비해 덜 조절되었다(도 12, 표 20).

도 12는 처리 6시간 후 HEKa 세포에서 0.01 mg/mL의 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 또는 0.01 mg/mL의 멜라토닌에 의한 항균성 선천 면역 반응과 관련된 유전자의 조절을 보여준다.

표 20. 표피 각질형성세포에서 숙주 바이러스 반응에 관여하는 유전자의 선택.

ID	유전자
IRF1	인터페론 조절 인자(Interferon regulatory factor) 1
IRF3	인터페론 조절 인자 3
DEFB1	디펜신 베타(Defensin beta) 1
DEFB4A	디펜신 베타(Defensin beta) 4A
S100A7	S100 칼슘 결합 단백질 A7
OAS2	2'-5'-올리고아데닐산 합성 효소 2
MX1	MX 다이나민 유사 GTPase 1
ISG15	ISG15 유비퀴딘 유사 변경 유전자(modifier)

표 21. 규정화된 발현. 0.01 mg/mL의 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂ 또는 멜라토닌으로 6시간 동안 처리된 인간 표피 각질형성세포에서 분석된 각 유전자에 대한 평균 규정화된 발현, % SEM 및 배수 변화 대 기저.

	배수 변화 대 기저
IRF1 0.01 mg/mL 멜라토닌	1.05
IRF1 0.01 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	1.25
IRF3 0.01 mg/mL 멜라토닌	1.13
IRF3 0.01 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	1.54
DEFB1 0.01 mg/mL 멜라토닌	1.24
DEFB1 0.01 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	1.31
DEFB4A 0.01 mg/mL 멜라토닌	1.35
DEFB4A 0.01 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	1.58
S100A7 0.01 mg/mL 멜라토닌	1.31
S100A7 0.01 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	2.04
OAS2 0.01 mg/mL 멜라토닌	1.34
OAS2 0.01 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	1.39
MX1 0.01 mg/mL 멜라토닌	1.20
MX1 0.01 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	1.93
ISG15 0.01 mg/mL 멜라토닌	0.98
ISG15 0.01 mg/mL Ac-SEQ ID NO:1-NH₂	1.38

펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂는 0.01 mg/mL에서 6시간 처리 후 HEKa에서 유전자 발현을 조절하여, 표피 각질형성세포에서 선천적 항균 면역 반응과 관련된 유전자를 조절한다. 구체적으로, Ac-SEQ ID NO:1-NH₂는 IRF3, DEFB4A, S100A7 및 MX1의 강력한 상향조절을 유도하였다. 더욱이, Ac-SEQ ID NO:1-NH₂를 사용한 처리는 또한 주요 유전자 IRF1, DEFB1, OAS2 및 ISG16을 상향조절하였다. 멜라토닌을 사용한 HEKa의 처리는 유전자 DEFB1, DEFB4A, S100A7, OAS2 및 MX1을 상향 조절했으나, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂의 효과와 비교하여 더 적은 정도로 상향 조절했다.

이러한 모든 결과는 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂가 숙주 항균 및 항바이러스 선천 면역 반응에 관여하는 유전자의 조절자가 될 수 있고, 따라서 침입 및 감염에 대한 표피 장벽의 면역 보호를 증가시킬 수 있음을 강력하게 시사한다. 더욱이, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂는 유전자 발현 조절과 관련하여 멜라토닌 유사 효과를 나타내는 것으로 보인다. 결과적으로, 이 모든 것이 Ac-SEQ ID NO:1-NH₂를 화장품 산업의 관심 화합물로 만든다.

실시예 21. 아이백 부피에 대한 생체내 결과

펩타이드를 포함하는 얼굴 화장용 조성물을 생체내 아이백 부피의 감소에서 플라시보 조성물에 대해 비교하였다.

실시예 6의 동일한 조성물을 이 실시예를 위해 사용하였지만, 펩타이드 Ac-SEQ ID NO: 1-NH₂의 시판하는 제형 3 중량%(g/100g)를 사용하였다. 위약 조성물은 펩타이드를 포함하지 않는다.

도 13은 펩타이드를 포함하는 조성물 및 위약 조성물에 의한 아이백 부피의 감소에 대한 그래프 표현을 나타낸다.

결과는 위약 조성물에서 관찰된 부피 감소와 비교하여 펩타이드를 포함하는 조성물로 7일 후 아이백 부피의 5% 감소 및 14일 후 7% 감소를 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Lipotrue S.L. <120> Peptides and compositions for use in cosmetics and medicine <130> 2019/47325 <160> 5 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 1 Arg Arg Gln Met Arg Glu 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 2 Met Arg Arg Glu Gln Arg 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 3 Arg Glu Gln Met Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 4 Arg Arg Gln Met Glu Glu 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized sequence <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa is selected from Arg or Met <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa is selected from Arg or Glu <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa is selected from Arg or Gln <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa is selected from Met or Glu <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa is selected from Arg or Gln <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa is selected from Arg or Glu <400> 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims

펩타이드가 적어도 3개의 아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 하는, 6개의 아미노산, 이의 이성질체, 염, 용매화물 및/또는 염의 용매화물 및 이들의 혼합물을 포함하는 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 6개의 아미노산이 3개의 아르기닌, 1개의 글루타민, 1개의 메티오닌 및 1개의 글루탐산인 펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 일반식(I)에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드:
R₁-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-R₂(I)
상기 식에서,
R₁ 은 H, 치환 또는 비치환된 비환상 지방족, 치환 또는 비치환된 지환족, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬 및 R₅-CO-(여기서, R₅는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 치환 또는 비치환된 3 내지 10원의 헤테로사이클릴 환, 및 2 내지 24개의 탄소 원자와 1 내지 3개의 탄소 이외의 원자를 가지며 알킬 쇄의 탄소 원자가 1 내지 6개인 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬로 형성된 그룹 중에서 선택됨) 중에서 선택되고,
R₂ 는 H, -NR₃R₄-, -OR₃ 및 -SR₃ 중에서 선택되며, 여기에서 R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 비환상 지방족 그룹, 치환 또는 비치환된 지환족, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 아르알킬 중에서 선택된다.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 그 서열 내에 Arg-Arg를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 그 서열 내에 Arg-Glu를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 그 서열 내에 Met-Arg를 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 서열이
R₁-Arg-Arg-Gln-Met-Arg-Glu-R₂
R₁-Met-Arg-Arg-Glu-Gln-Arg-R₂
R₁-Arg-Glu-Gln-Met-Arg-Arg-R₂
인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드의 서열이
Ac-Arg-Arg-Gln-Met-Arg-Glu-NH₂
Ac-Met-Arg-Arg-Glu-Gln-Arg-NH₂
Ac-Arg-Glu-Gln-Met-Arg-Arg-NH₂
인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 제9항에 따른 조성물의 이를 필요로 하는 대상에 있어서의 화장품으로서의 용도.
제10항에 있어서,
화장품으로서의 용도가 피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 화장품으로서의 용도.
제11항에 있어서,
피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점이 아이백(eyebags), 눈꺼풀 결점, 눈 주위의 주름, 안와주위 과색소증(periorbital hyperchromia) 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 화장품으로서의 용도.
제12항에 있어서,
피부 노화의 징후 및/또는 피부 결점이 수면 부족과 관련되는 것을 특징으로 하는 화장품으로서의 용도.
약물로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 제9항에 따른 조성물.
염증 기반의 처진 눈꺼풀의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 제9항에 따른 조성물.