KR102088104B1

KR102088104B1 - 개망초 꽃 에센셜 오일을 포함하는 신경 근육 관련 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102088104B1
Application number: KR1020180075159A
Authority: KR
Inventors: 이환명; 황대일; 김도윤; 박수민; 김하빈
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-03-11
Also published as: JP6952898B2; EP3695847A4; EP3695847A1; WO2020004709A1; US20210085588A1; CN111065401A; JP2020537685A; CN111065401B; US11224564B2; KR20200002075A

Abstract

본 발명은 개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보톡스(Botox)를 병용하여 포함하는 신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 미용약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 개망초 꽃 에센셜 오일은 신경세포에서 t-SNARE 단백질 및 v-SNARE 단백질 발현을 억제하여 SNARE 단백질 복합체 형성을 억제하고, 보톡스에 의해 분해된 t-SNARE 단백질 및 v-SNARE 단백질의 재생을 억제함으로써 신경전달물질 분비를 억제하는 효과를 가지며, 이에 따라 보톡스의 효과 유지 기간을 연장시킬 수 있으므로, 개망초 꽃 에센셜 오일을 보톡스 보조제로서 보톡스와 병용하여 신경 근육 관련 질환의 예방, 치료 또는 미용을 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

개망초 꽃 에센셜 오일을 포함하는 신경 근육 관련 질환 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating of neuro muscular diseases comprising essential oil from Erigeron annuus}

본 발명은 개망초(Erigeron annuus) 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보톡스(Botox)를 병용하여 포함하는 신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 미용약학적 조성물에 관한 것이다.

신경전달물질의 배출 시에 신경전달물질(neurotransmitter)을 담고 있는 시냅스 소포(synaptic vesicle)는 시냅스 전막(presynaptic membrane)과 융합되어야 두 경계 간의 통로가 형성될 수 있다. 이 때, 막융합의 근원적인 힘을 제공하는 단백질은 SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)라고 불리는 3종의 단백질 복합체이다.

시냅스 소포와 시냅스전막 간의 막융합에 의해 신경전달물질 배출 통로가 열리게 되는데 표적 막(target membrane)에 부착되어 있는 t-SNARE 복합체와 소포(vesicle)에 부착되어 있는 v-SNARE가 관여한다. t-SNARE는 신탁신(Syntaxin) 1a 단백질과 SNAP-25(Synaptosomal-associated protein 25) 단백질 등의 복합체이며, v-SNARE는 VAMP-2(vesicle-associated membrane protein 2) 등의 단백질로 구성되어 있다. 이들 SNARE 단백질은 꽈배기처럼 꼬여 SNARE 복합체(complex)를 형성한다. 상기 막융합시에는 당분야에 널리 공지되어 있는 지질이중층(lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 서로 강하게 밀어내고 있으므로 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이때 막들간의 반발력을 이겨낼 정도의 강한 힘을 만들어 내는 것이 바로 SNARE 단백질이다. 즉 SNARE 복합체의 형성은 막간 반발력을 극복하는 힘을 제공하며, 신경전달물질의 분비(release)를 포함하는 세포외 배출작용(exocytosis)에 매개하게 된다.

SNARE 단백질의 파괴 또는 발현 억제에 의한 SNARE 복합체 형성의 감소는 신경세포 말단과 소포체 막융합의 저해를 유도하게 되어 신경전달물질 분비를 감소시키게 된다. 신경전달물질의 분비에 의해 근육의 수축/이완 운동이 조절되어지고 있으나, 이들의 분비 감소는 근육 수축운동을 감소시켜 근육수축에 의한 주름 생성을 억제하고 생성된 주름을 개선할 수 있으며, 신경전달물질의 과다 배출로 인하여 발생하는 다한증 등을 개선할 수 있다. 또한, 신경조절에 의해 축소 또는 확대되는 모공의 경우, 선택적으로 부교감 신경을 억제하면 보상작용으로 교감신경이 작용하여 털에 붙어 있는 근육을 수축시켜 모공을 축소시킬 수 있다. 나아가, 생체 내에서 비만세포(mast cells) 특이적인 SNARE 단백질 복합체 형성을 억제할 경우, 비만세포 탈과립을 억제함으로써 알러지성 질환 및 자가면역성 질환을 치료 및 예방할 수 있다.

상기 SNARE를 표적으로 하는 대표적인 물질인 보틀리눔 독소(botulinum toxin)는 클로스트리디움 보틀리눔(Clostridium botulinum), C. butyricum, C. baratii 및 C. argentinense의 혐기성 박테리아에서 분비되는 독소로 7가지 종류가 있으며, 이중 보틀리눔 독소 A형과 B형이 정제되어 의학적으로 사용된다. 이 독소는 신경전달물질 배출에 핵심적으로 관여하는 SNARE 단백질을 절단하는 프로테아제(protease)이며, "보톡스(botox)"로 알려진 약물의 주성분이기도 하다.

상기 보톡스는 통상적으로 근육 경련 또는 수축을 유발하는 신호를 본질적으로 차단하여, 마비를 초래하는 효과를 가지며, 이러한 근육-마비 효과는 치료적 효과를 위해 이용되고 있다. 예를 들면, 근육 긴장, 근육 경련, 반측안면경련, 성인 발병 경련성 사경(adult onset spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련, 안면 근육 경련, 뇌성마비, 두통, 편두통, 근육통, 사시, 측두하악관절장애(temperomandibular joint disorder), 신경 통증, 과민성 방광, 절박성 요실금, 비염, 부비동염, 여드름, 근긴장 이상증, 근긴장 이상성 수축, 다한증, 성대 장애, 심근장애 등 많은 신경전달물질의 분비와 관련된 질환 및/또는 근육 관련 질환의 치료에 사용되고 있으며, 주름, 미세 라인(fine line), 찡그린 선(frown lines) 등의 제거와 눈의 확장, 구각 리프팅, 근육양의 감소, 윗 입술로부터 전개되는 라인의 평탄화 등 미용 목적의 시술에도 주로 사용된다. 구체적으로, 보톡스는 그 주성분인 신경독소가 신경세포에 존재하는 SNARE에 특이적으로 작용하여 SNARE 단백질을 절단함으로써 복합체 형성을 저해하여 막융합을 억제함을 통해 신경전달물질의 분비를 차단하므로, 근육의 움직임이나 교감 또는 부교감 신경계를 억제함으로써 상기와 같은 질환의 치료 효과를 나타내는 것으로 알려져있다. 다만, 보톡스의 성분은 독성 물질이므로 부작용을 나타낼 수 있고, 독소 복합체는 환자의 면역계가 중화 항체(neutralizing antibody)를 형성하도록 유도할 수 있어서, 동일한 효과를 달성하기 위해, 후속 투여에서 보다 많은 양의 독소가 요구되므로, 투여량이나 적용 부위를 결정함에 있어 고도의 주의를 기울일 필요가 있다.

이에, 본 발명자들은 보톡스의 신경전달물질 분비 억제 효과를 증가시키고 세포독성 감소 및 안정성을 향상시킬 수 있는 약물을 개발하기 위한 연구를 수행한 결과, 개망초 꽃 에센셜 오일이 보톡스에 의해 분해된 SNARE 단백질의 재생성을 억제함으로써 신경전달물질 분비를 억제하고 보톡스의 효과 유지 기간을 연장시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1803201호 한국등록특허 제10-1753242호

따라서, 본 발명의 목적은 개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보톡스(Botox)를 병용하여 포함하는 신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 미용약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil)을 유효성분으로 포함하는 보톡스(botox) 보조제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보톡스(Botox)를 병용하여 포함하는 신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보톡스(Botox)를 병용하여 포함하는 미용약학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil)을 유효성분으로 포함하는 보톡스(botox) 보조제를 제공한다.

본 발명에 따르면, 개망초 꽃 에센셜 오일은 신경세포에서 t-SNARE 단백질 및 v-SNARE 단백질 발현을 억제하여 SNARE 단백질 복합체 형성을 억제하고, 보톡스에 의해 분해된 t-SNARE 단백질 및 v-SNARE 단백질의 재생을 억제함으로써 신경전달물질 분비를 억제하는 효과를 가지며, 이에 따라 보톡스의 효과 유지 기간을 연장시킬 수 있으므로, 개망초 꽃 에센셜 오일을 보톡스 보조제로서 보톡스와 병용하여 신경 근육 관련 질환의 예방, 치료 또는 미용을 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 신경세포(neuron)에서 근육세포(muscle cell)로의 신경전달물질 분비 메카니즘을 나타낸 모식도이다; (A) 정상적인 신경전달물질 분비 기작, (B) 보톡스(Botox, Botulinum neurotoxin)에 의한 t-SNARE 및 v-SNARE 분해를 통한 신경전달물질 분비 억제 기작, (C) 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab, Ab; 앱솔루트)에 의한 t-SNARE 및 v-SNARE 생성 억제를 통한 신경전달물질 분비 억제 기작.
도 2는 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리 농도에 따른 신경세포인 PC12 세포의 세포생존율(%)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리 농도에 따른 PC12 세포에서의 신경전달물질 방출 관련 SNARE 단백질 SNAP25, Syntaxin 1a, VAMP2 및 Synaptotagmin-1의 단백질 발현을 확인한 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리에 따른 PC12 세포에서의 SNAP25 단백질 발현 억제에 의한 SNAP-25와 Syntaxin 1a 단백질의 복합체(complex) 형성 억제 효과를 확인한 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리에 따른 PC12 세포에서의 아세틸콜린(acetylcholine) 분비량(% of control) 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리에 따른 PC12 세포에서의 노르에피네프린(norepinephrine) 분비량(% of control) 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리에 따른 PC12 세포에서의 도파민(dopamin) 분비량(% of control) 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리 농도에 따른 근육세포인 L6 세포의 세포생존율(%)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리 농도에 따른 혈관평활근세포(Rat aortic smooth muscle cell, RASMC)의 세포생존율(%)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리 농도에 따른 L6 세포에서의 SNAP25, Syntaxin 1a 및 VAMP2의 단백질 발현을 확인한 분석 결과이다.
도 11은 본 발명의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리 농도에 따른 RASMC에서의 SNAP25, Syntaxin 1a 및 VAMP2의 단백질 발현을 확인한 분석 결과이다.
도 12는 대조군(Control), 보톡스 처리군(Botox) 및 보톡스+개망초 꽃 에센셜 오일 병용 처리군(Botox+개망초 꽃 Ab)의 래트(Rat)의 시간 경과(1 내지 20주)에 따른 대퇴부 근육 마비 정도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 대조군(Control), 보톡스 처리군(Botox) 및 보톡스+개망초 꽃 에센셜 오일 병용 처리군(Botox+개망초 꽃 Ab)의 래트(Rat)의 시간경과(1, 10 및 20주)에 따른 발(다리) 근육의 변화를 촬영한 이미지이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 미용약학적 조성물

본 발명은 개망초(Erigeron annuus) 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보톡스(Botox)를 병용하여 포함하는 신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 보톡스는 신경세포막의 t-SNARE(target membrane soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질 및 시냅스 소포막의 v-SNARE(vesicle soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질을 분해하는 역할을 하고, 상기 개망초 꽃 에션셜 오일은 보톡스에 의해 분해된 t-SNARE 단백질 및 v-SNARE 단백질의 재생을 억제하는 역할을 하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 개망초 꽃 에센셜 오일은 휘발성 용제를 이용하여 유기용매 추출법에 의해 추출된 것일 수 있고, 바람직하게는, 유기용매 추출법에 의해 추출된 콘크리트(concrete)를 알코올로 추출하여 불용성 왁스(wax)를 제거한 앱솔루트(absolute, Ab)일 수 있다.

구체적으로, 상기 앱솔루트는 개망초 꽃을 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법으로 추출하여 콘크리트(concrete)를 얻는 단계; 및 상기 얻은 콘크리트를 알코올로 추출하여 불용성 왁스(wax)를 제거하고 앱솔루트(absolute)를 얻는 단계에 의해 추출될 수 있다. 상기 유기용매 추출법과 추출물로부터 앱솔루트를 분리하는 방법은 이 기술 분야에서 보통의 지식을 가진 자가 변형할 수 있는 모든 방법을 포함하는 것이 가능하다.

일반적으로, 신경세포(뉴런, neuron)에서 근육세포(muscle cell)로의 정상적인 신경전달물질 분비 메카니즘(mechanism)을 살펴보면, 신경세포에는 표적 막(target membrane)인 신경세포막(시냅스 전막, presynaptic membrane)에 부착되어 있는 t-SNARE(target membrane soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)과 신경세포 내에 아세틸콜린(acetylcholine) 등의 신경전달물질(neurotransmitter)을 담고 있는 시냅스 소포(synaptic vesicle)의 막 표면에 부착되어 있는 v-SNARE(vesicle soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)의 SNARE 단백질이 존재하며, 상기 t-SNARE 및 v-SNARE의 결합 과정에 의해 SNARE 단백질 복합체(SNARE protein complex)가 형성되면서 시냅스 소포와 시냅스 전막 사이의 막 융합이 일어나 두 경계 간의 통로가 형성되는 기작을 통해 신경전달물질이 근육세포로 분비(release) 된다(도 1A 참조).

이러한 과정에서 보톡스(Botox), 즉, 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin) 성분을 신경세포에 투여하게 되면, 보톡스 분자에 의해 신경세포막의 t-SNARE 단백질과 시냅스 소포의 v-SNARE 단백질이 절단(cleave) 및 분해(degrade)되며, 이러한 과정에 의하여 SNARE 단백질 복합체 형성이 억제되고, 신경세포 막과 시냅스 소포가 결합되지 못함으로써 신경전달물질 분비가 억제된다(도 1B 참조).

보톡스에 의해 t-SNARE 단백질 및 v-SNARE 단백질이 분해된 신경세포에 본 발명에 따른 개망초 꽃 에센셜 오일을 투여하게 되면, 신경세포막 및 시냅스소포에서의 t-SNARE 단백질 및 v-SNARE 단백질의 발현(expression)을 억제(inhibition)함으로써 상기 두 SNARE 단백질이 재생되는 것을 억제할 수 있으며, 이에 따라 신경세포막과 시냅스 소포의 결합이 억제됨으로써 신경전달물질의 분비를 억제할 수 있게된다(도 1C 참조).

따라서, 보톡스와 함께 개망초 꽃 에센셜 오일을 병용하여 이용하는 경우, 이러한 메카니즘을 통해 보톡스 단독으로 사용하는 경우보다 보톡스의 장기적 효과(long-term efficacy)를 가져올 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 개망초 꽃 에센셜 오일은 보톡스의 효과 유지 기간을 1.5 내지 10배 연장시키는 것일 수 있고, 바람직하게는 1.5 내지 7배 연장시키는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 1.5 내지 5배 연장시키는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 신경 근육 관련 질환은 근육 긴장, 근육 경련, 반측안면경련, 성인 발병 경련성 사경(adult onset spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련, 안면 근육 경련, 뇌성마비, 두통, 편두통, 근육통, 사시, 측두하악관절장애(temperomandibular joint disorder), 신경 통증, 과민성 방광, 절박성 요실금, 비염, 부비동염, 여드름, 모공확장증, 근긴장 이상증, 근긴장 이상성 수축, 다한증, 성대 장애 및 심근장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 것일 수 있으며, 이외 면역 반응의 경감 또는 강화, 신경전달물질 분비 조절과 관련된 다양한 근육 질환을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보톡스(Botox)를 병용하여 포함하는 미용약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 미용약학적 조성물의 미용 효과는 미세 라인(fine line)의 외형(appearance) 감소, 주름의 외형 감소, 눈의 확장(widening), 구각 리프팅(lifting the corner of the mouth), 근육양의 감소 및 윗 입술로부터 전개되는 라인의 평탄화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

보톡스 보조제

본 발명은 개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil)을 유효성분으로 포함하는 보톡스(botox) 보조제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 보톡스 보조제에 있어서, 상기 개망초 꽃 에션셜 오일은 상기 보톡스에 의하여 분해된 신경세포막의 t-SNARE(target membrane soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질 및 시냅스 소포막의 v-SNARE(vesicle soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질이 다시 생성되는 것을 억제함으로써, SNARE 단백질 복합체 형성 저해 효과, 신경전달물질 전달 효과, 근육 마비 효과 등 보톡스의 효과를 유지할 수 있는 기간을 연장시키는 역할을 하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 보톡스에 의해 유발된 래트(rat)의 대퇴부 근육 마비가 보톡스 단독 처리군(Botox) 보다 보톡스 및 개망초 꽃 에센셜 오일 병용 처리군(Botox+개망초 꽃 Ab)에서 2배 이상의 기간 동안 더 오래 지속되는 것을 확인하여, 보톡스의 신경전달물질 분비 억제 효과 유지 기간이 연장되는 장기적 효과(long-term efficacy)가 있음을 확인하였다(실험예 4, 도 12 및 도 13 참조).

본 발명에서, 상기 보톡스 보조제는 신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용인 것일 수 있다. 상기 신경 근육 관련 질환은 근육 긴장, 근육 경련, 반측안면경련, 성인 발병 경련성 사경(adult onset spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련, 안면 근육 경련, 뇌성마비, 두통, 편두통, 근육통, 사시, 측두하악관절장애(temperomandibular joint disorder), 신경 통증, 과민성 방광, 절박성 요실금, 비염, 부비동염, 여드름, 모공확장증, 근긴장 이상증, 근긴장 이상성 수축, 다한증, 성대 장애 및 심근장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 것일 수 있으며, 이외 면역 반응의 경감 또는 강화, 신경전달물질 분비 조절과 관련된 다양한 근육 질환을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 보톡스 보조제는 미용을 위한 것일 수 있다. 상기 미용을 위한 효과는 미세 라인(fine line)의 외형(appearance) 감소, 주름의 외형 감소, 눈의 확장(widening), 구각 리프팅(lifting the corner of the mouth), 근육양의 감소 및 윗 입술로부터 전개되는 라인의 평탄화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 보톡스 보조제는 보톡스 투여와 동시에 투여하는 것일 수 있다. 또는, 보톡스 투여 1 내지 6주 후에 투여되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 4주 후에 투여되는 것일 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 개망초 꽃 에센셜 오일( 앱솔루트 )의 제조

개망초 꽃 에센셜 오일은 개망초의 꽃에서 수득하여 사용하였다. 구체적으로 상기 개망초 꽃은 충남 아산에 있는 개망초 군락지에서 자생된 개망초 꽃을 채취하여 사용하였다. 개화된 상태의 개망초 꽃을 채취하여 세척 후, 유기용매 추출법을 이용하여 추출하였다.

즉, 건조하지 않은 개망초 꽃을 헥산(n-hexane)에 침전시킨 후 추출하였고, 추출물을 회전식 증발기(rotary evaporation)를 활용하여 헥산을 증발시켜서 농축 시킴으로써 고형의 콘크리트(concrete)를 획득하였다. 그 다음, 상기 콘크리트를 에틸알코올(ethyl alcohol)에 용해시키고 -20℃에서 보관한 후, 진공 냉각 필터(vacuum cooling filtration)를 거쳐서 불용성 왁스(wax)를 제거하였으며, 다시 회전식 증발기를 활용하여 에탄올을 증발시켜 분리/정제함으로써 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab, Ab; 앱솔루트)을 제조하였다. 그런 다음 상기 제조한 개망초 꽃 에센셜 오일은 4℃의 저온고에서 보관하며 사용하였다.

< 실험예 1> 개망초 꽃 에센셜 오일 처리에 따른 신경세포에서의 SNARE 단백질 발현 분석

1-1. 신경세포(PC12)에 대한 세포독성 분석

신경세포 PC12에 대하여 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)이 갖는 독성을 확인하기 위하여, XTT(2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) 분석방법을 통해 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리 농도에 따른 PC12 세포의 생존율(cell viability)을 확인하였다.

구체적으로, PC12 세포를 96 well microtiter plate에 각 well 당 세포수 1.5×10⁴ cells/100 μL/well이 되도록 분주하여 37℃, 5%, CO₂ 배양기에서 부착 시켰다. 24시간 동안 배양한 후 실시예 1의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)을 각각 0, 10, 20, 30, 40 및 50 μg/mL의 농도로 희석하여, 각 well에 100 μL씩 처리하고 36시간 배양하였다. Ez-cytox와 RPMI1640을 1:1로 혼합하여 각 well 당 20 μL씩 처리한 후 배양기에서 30분간 반응시켰다. ELISA plate reader(Synerge2, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 측정 후, 백분율로 환산하여 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)의 세포 독성에 대한 결과를 확보하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 50μg/mL 농도까지 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.

1-2. SNARE 단백질 발현 분석

실시예 1에서와 같이 제조한 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)이 신경세포(PC12) 내 SNARE 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같이 분석을 실시하였다.

구체적으로, PC12 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 배양하여 사용하였다. PC12 세포를 60 mm dish에 각 dish 당 세포 수 8×10⁵cells/60 mm dish가 되도록 주입하여 37℃, 5%, CO₂ 배양기에서 부착시켰다. 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)은 0 ~ 50 μg/mL 농도로 각 dish에 처리하여 36시간 동안 배양시켰다. 세포 lysis buffer를 이용하여 세포를 용해시킨 후 anti-SNAP25, anti-syntaxin 1a, anti-VAMP2 또는 anti-Syt-1 antibody와 면역블롯(Immuno Blot)법을 활용하여 결과를 확보하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 신경전달물질 방출과 관련된 SNARE 단백질인 SNAP25, Syntaxin 1a, VAMP2 및 Syt-1 단백질 모두 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 농도의존적으로 발현이 억제되었다.

1-3. SNARE 단백질 복합체 형성 분석

실시예 1에서와 같이 제조한 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)이 신경세포(PC12) 내 SNARE 단백질 복합체 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같이 분석을 실시하였다.

PC12 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 배양하여 사용하였다. PC12 세포를 60 mm dish에 각 dish 당 세포 수 8 X 10⁵cells/60 mm dish가 되도록 주입하여 37℃, 5%, CO₂ 배양기에서 부착시켰다. 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)은 50 μg/mL 농도로 dish에 처리하여 36시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝난 PC12 세포에 SNARE 복합체 유도물질인 K+ 용액을 처리하여 SNARE 복합체의 형성을 유도하였다. 세포 lysis buffer를 이용하여 세포를 용해시킨 후 SNAP25 antibody를 면역침강반응(immunoprecipitation)하였다. 그 후 anti-syntaxin 1a 또는 anti-SNAP25 antibody와 면역블롯(Immuno Blot)법을 활용하여 결과를 확보하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리에 의해 SNAP25와 syntaxin 1a의 복합체 형성이 억제되는 것을 확인하였다.

< 실험예 2> 개망초 꽃 에센셜 오일 처리에 따른 신경세포에서의 신경전달물질 분비 억제 효과 분석

2-1. 아세틸콜린 분비량 분석

개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)에 대한 신경세포(PC12)에서의 신경전달물질 분비 저해 효과를 확인하기 위하여, NGF(Nerve Growth Factor)를 이용해 분화된 신경세포(PC12)를 사용하여 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 분비량을 측정하였다.

구체적으로, PC12 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 배양하여 사용하였다. PC12 세포를 60 mm dish에 각 dish 당 세포 수 8 X 10⁵cells/60 mm dish가 되도록 주입하여 37℃, 5%, CO₂ 배양기에서 부착시켰다. 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)은 25 및 50 μg/mL 농도로 dish에 처리하여 36시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝난 PC12 세포에 NGF(Nerve Growth Factor) 50 ng/mL을 첨가하여 72시간 동안 37℃, 5%, CO₂ 배양기에서 분화하였다. 분화가 끝난 뒤 SNARE 복합체 유도물질인 K+ 용액을 처리하여 SNARE 복합체의 형성 및 아세틸콜린 방출을 유도하였다. 그 다음, 세포 배양액인 conditioned medium을 tube에 모아서 아세틸콜린 분석 Kit(Amplite, CA, USA) 를 활용하여 결과를 확보하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 25 및 50 μg/mL 처리군 모두 유의성 있게 아세틸콜린의 분비가 억제되었다.

2-2. 노르에피네프린 분비량 분석

개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)에 대한 신경세포(PC12)에서의 신경전달물질 분비 저해 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 샘플을 처리하였으며, 신경전달물질 노르에피네프린(norepinephrine)의 분비량은 노르에피네프린 분석 Kit(IBL international, Germany)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리군에서 농도의존적으로 유의성 있게 노르에피네프린의 분비가 억제되는 것을 확인하였다.

2-3. 도파민 분비량 분석

개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)에 대한 신경세포(PC12)에서의 신경전달물질 분비 저해 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 2-1과 동일한 방법으로 샘플을 처리하였으며, 신경전달물질 도파민(dopamine)의 분비량은 도파민 분석 Kit(Demeditec, Germany)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리군에서 농도의존적으로 유의성 있게 도파민 분비량이 감소하는 것으로 나타났다.

따라서, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)이 신경전달물질인 아세틸콜린, 노르에피네프린 및 도파민의 분비를 억제할 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 3> 개망초 꽃 에센셜 오일 처리에 따른 근육세포 및 혈관평활근세포에서의 SNARE 단백질 발현 분석

3-1. 근육세포 (L6) 및 혈관평활근세포(RASMC)에 대한 세포독성 분석

근육세포(L6) 및 혈관평활근세포(RASMC)에 대하여 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)이 갖는 독성을 확인하기 위하여, XTT(2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) 실험방법을 통해 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 처리 농도에 따른 근육세포(L6) 및 혈관평활근세포(RASMC)의 생존율(cell viability)을 확인하였다.

구체적으로, L6 또는 RASMC 세포를 96 well microtiter plate에 각 well 당 세포수 5×10³ cells/100 μL/well이 되도록 분주하여 37℃, 5%, CO₂ 배양기에서 부착 시켰다. 배양한 후 실시예 1의 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)을 각각 0, 0.1, 1, 10, 50 및 100 μg/mL의 농도로 희석하여, 각 well에 100 μL씩 처리하고 24시간 배양하였다. Ez-cytox와 DMEM을 1:1로 혼합하여 각 well 당 20 μL씩 처리한 후 배양기에서 30분간 반응시켰다. ELISA plate reader(Synerge2, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 측정 후, 백분율로 환산하여 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)의 세포 독성에 대한 결과를 확보하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, L6 세포 및 RASMC 모두 50μg/mL 농도까지 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.

3-2. SNARE 단백질 발현 분석

실시예 1에서와 같이 제조한 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)이 근육세포(L6) 및 혈관평활근세포(RASMC) 내 SNARE 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같이 분석을 실시하였다.

구체적으로 L6 또는 RASMC를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM배지를 이용하여 배양하여 사용하였다. L6 또는 RASMC를 60 mm dish에 각 dish 당 세포 수 2×10⁵cells/60 mm dish가 되도록 주입하여 37℃, 5%, CO₂ 배양기에서 부착시켰다. 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)은 0 ~ 50 μg/mL 농도로 각 dish에 처리하여 36시간 동안 배양시켰다. 세포 lysis buffer를 이용하여 세포를 용해시킨 후 anti-SNAP25, anti-syntaxin 1a 또는 anti-VAMP2 antibody와 면역블롯(Immuno Blot)법을 활용하여 결과를 확보하였다.

그 결과, 도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, 상기 실험예 1-2의 PC12 세포에서의 결과와는 다르게 L6 및 RASMC에서는 신경전달물질 방출과 관련된 SNARE 단백질인 SNAP25, Syntaxin 1a 및 VAMP2 단백질 발현의 변화가 나타나지 않았다.

따라서, 상기와 같은 결과로부터, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)이 근육세포 및 혈관평활근세포에서는 SNARE 단백질 발현에 영향을 미치지 않으며, 신경세포에서 특이적으로 SNARE 단백질의 생성을 억제하는 효과를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)은 기존의 보톡스 효과와 같이 이미 생성된 t-SNARE 단백질 또는 v-SNARE 단백질을 분해 및 제거함으로써 일시적인 신경전달물질 분비를 억제하는 효과를 갖는 것이 아니라, 신경세포의 t-SNARE 및 v-SNARE의 생성을 억제함으로써 신경세포의 막과 시냅스 소포(synaptic vesicle)가 결합하지 못하게 하여 신경전달물질 아세틸콜린, 노르에피네프린 및 도파민의 분비를 억제하는 효과를 나타내는 것임을 확인하였다.

< 실험예 4> 개망초 꽃 에센셜 오일 처리에 따른 보톡스 효능 연장 기간 분석

4-1. 동물 모델 준비

구체적으로, 8주령의 Sprague-Dawley 래트(㈜오리엔트바이오)를 동물실험에 사용하였으며, 실험에 사용된 보톡스는 동결건조 상태인 보톡스(Xeomin, MERZ, Germany)를 0.9% 생리식염수에 25U/mL의 농도로 녹여 사용하였다. 래트를 각각 대조군(Control), 보톡스 처리군(Botox) 및 보톡스와 개망초 꽃 에센셜 오일 병용 처리군(Botox+개망초 꽃 Ab)으로 분류하였다.

먼저, 실험동물의 왼쪽 대퇴부 근육에 대조군, 보톡스, 보톡스와 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)을 투여하였으며, 1주일 간격으로 모든 처리군에 샘플을 새롭게 투여하였다. 대조군(Control)은 0.9% 생리식염수를 투여하였고, 보톡스 처리군(Botox)은, 보톡스 타입 A를 5 유닛 투여하여 래트의 왼쪽 다리를 마비시킨 후 1주일 간격으로 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)을 녹인 용매를 투여하였다. 보톡스와 개망초 꽃 에센셜 오일 병용 처리군(Botox+개망초 꽃 Ab)은 보톡스 타입 A를 5 유닛 투여하여 래트의 왼쪽 다리부분을 마비시킨 후 1주일 간격으로 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 50 μg/mL을 투여하였다.

4-2. 보톡스 효능 연장 기간 분석

개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)이 보톡스 효능 유지 기간에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험예 4-1의 각 처리군에 대하여 래트(rat)의 대퇴부 근육 마비의 지속시간을 육안관찰분석을 통해 비교하였다.

구체적으로, 각 처리군을 투여한 래트를 3일 간격으로 체중과 사료섭취량을 측정하였고, 관찰자 3명이 1주일 간격으로 래트의 왼쪽 발을 관찰하여 근육마비정도를 측정하였다. 근육마비분석은 0~10점으로 나눠서 측정하였으며, 근육마비의 상태에 따라 마비가 많이 진행되면 10점에 가까운 점수를 기록하고 마비가 풀리면 0점에 가까운 점수를 기록하여 나온 평균값을 데이터로 사용하여 그래프를 작성하였다.

그 결과, 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 보톡스 처리군(Botox)의 경우, 보톡스에 의해 유발된 대퇴부 근육 마비가 보톡스 처리 5주 후부터 감소하기 시작하여 10주가 지나면 근육 마비 정도가 처음 대비 절반으로 감소하였고, 20주 후에는 근육 마비가 거의 남아있지 않은 것으로 나타났다. 반면, 보톡스 및 개망초 꽃 에센셜 오일 병용 처리군(Botox+개망초 꽃 Ab)의 경우, 12주까지 근육 마비가 처음과 유사한 수준으로 유지되었고, 20주가 지난 후에도 절반 이상 근육 마비가 지속되었다.

즉, 보톡스 처리군(Botox)에 비해 보톡스 및 개망초 꽃 에센셜 오일 병용 처리군(Botox+개망초 꽃 Ab)에서 래트의 대퇴부 근육 마비 기간이 2배 이상으로 현저히 길어진 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과는, t-SNARE 및 v-SNARE 단백질이 보톡스에 의해 분해되고, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab)에 의해 상기 SNARE 단백질의 생성이 저해됨에 따라, 보톡스의 신경전달물질 분비 억제 효과 유지 기간이 연장됨을 의미한다. 이는, 개망초 꽃 에센셜 오일(개망초 꽃 Ab) 및 보툴리눔 독소-함유 조성물의 치료적 용도에 대해 중요한 영향을 가지며, 특히, 본 발명에 따른 조성물을 이용하는 것에 의해, 보툴리눔 독소에 의해 유발된 특정한 미용 또는 치료 효과를 유지하기 위해 요구되는 후속 보톡스 투여의 빈도를 상당히 감소시킬 수 있다. 결과적으로, 감소된 보톡스 적용 빈도는 개체가 보툴리눔 독소에 대한 항체를 생성하는 경향을 감소시키기 때문에, 보다 우수한 장기적 효과(long-term efficacy)를 가져올 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

개망초(Erigeron annuus) 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin)를 병용하여 포함하는,
근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 약물과용 두통(medication overuse headache), 만성 편두통(chronic migraine), 근육통(myalgia), 사시(strabismus), 측두하악장애(temperomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 비염(rhinitis), 여드름(acne), 근긴장 이상증(dystonia), 다한증(hyperhydrosis), 및 성대 육아종(vocal fold granuloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin)는 신경세포막의 t-SNARE(target membrane soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질 및 시냅스 소포막의 v-SNARE(vesicle soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) 단백질을 분해하는 역할을 하고,
상기 개망초 꽃 에션셜 오일은 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin)에 의해 분해된 t-SNARE 단백질 및 v-SNARE 단백질의 재생을 억제하는 역할을 하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 개망초 꽃 에센셜 오일은 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin)의 효과 유지 기간을 1.5 내지 10배 연장시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
삭제
개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil) 및 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin)를 병용하여 포함하는 미용적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 미용적 조성물의 미용 효과는 미세 라인(fine line)의 외형(appearance) 감소, 주름의 외형 감소, 눈의 확장(widening), 구각 리프팅(lifting the corner of the mouth), 근육양의 감소 및 윗 입술로부터 전개되는 라인의 평탄화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미용적 조성물.
개망초 꽃 에센셜 오일(essential oil)을 유효성분으로 포함하는 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin) 보조제.
제7항에 있어서,
상기 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin) 보조제는 근육간대경련(myoclonus), 반측성 안면경련(hemifacial spasm), 경련성 사경(spasmodic torticollis), 열항(anal fissure), 안검경련(blepharospasm), 안면 경련(facial spasm), 뇌성마비(cerebral palsy), 약물과용 두통(medication overuse headache), 만성 편두통(chronic migraine), 근육통(myalgia), 사시(strabismus), 측두하악장애(temperomandibular disorder), 신경 통증(neuralgia), 과민성 방광(overactive bladder), 절박성 요실금(urge urinary incontinence), 비염(rhinitis), 여드름(acne), 근긴장 이상증(dystonia), 다한증(hyperhydrosis), 및 성대 육아종(vocal fold granuloma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경 근육 관련 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경 독소 보조제.
제7항에 있어서,
상기 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin) 보조제는 미용을 위한 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경 독소 보조제.
제7항에 있어서,
상기 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin) 보조제는 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin) 투여와 동시에 투여하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경 독소 보조제.
제7항에 있어서,
상기 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin) 보조제는 보툴리눔 신경 독소(Botulinum neurotoxin) 투여 1 내지 6주 후에 투여하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 신경 독소 보조제.