KR100784187B1 - 세포자멸 유도제 및 세포자멸 유도방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 c-myc 유전자를 표적으로서 세포자멸을 안정적이고도 확실하게 유도하기 위한 새로운 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 FBP 단백질과 상호작용하는 단백질, 또는 이 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 세포자멸 유도제 및 전기 세포자멸 유도제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포자멸 유도방법이다.

세포자멸, 세포자멸 유도제, 세포자멸 유도방법

Description

세포자멸 유도제 및 세포자멸 유도방법{Apoptosis Inducing Agent and Method of Inducing Apoptosis}

본 발명은 세포자멸 유도제 및 세포자멸 유도방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 그 존재가 숙주동물에 있어서 유해가 되는 세포(예를 들어, 암세포)에 세포자멸을 유도하기 위한 약제와 이 약제를 사용하는 세포자멸 유도 및 암의 치료방법에 관한 것이다.

세포자멸(apoptosis)은 생리적 조건하에서 세포 스스로가 적극적으로 일으키는 세포사이며, 환경악화에 의한 세포사(괴사: necrosis)와 명확하게 구별되고 있다. 이 세포자멸은 세포핵의 염색체응집, 세포핵의 단편화, 세포표층 미융모(microvillus)의 소실, 세포질의 응집 등을 형태학적인 특징으로 하고 있다. 세포자멸이 일어나는 세포는 위축(atrophy)되고, 세포 내용물은 외부에 방출되지 않고 마크로파아지 또는 주위의 세포에 신속하게 합입되기 때문에, 염증이 일어나지 않고 주위의 세포에 영향을 주지 않는다. 따라서, 그 존재가 숙주생물에 있어서 유해한 세포(예를 들어, 암세포 등)에 세포자멸을 유도하여 질환을 치료하는 시도가 많아지고 있다.

지금까지, 세포자멸을 유도하는 수단, 인자로서는 예를 들어, 글루코코르티코이드 처리, 사이토 톡신-T 세포에 의한 세포장해, 호르몬 의존성 조직의 위축, 방사선 조사(照射), 자연살상(NK) 세포, 살상 세포(killer cell), 종양괴사인자(TNF), 림포톡신(LT) 등의 사이토카인류(類) 등이 보고되어 있다(참조: Wyllie, A. H., Nature, 284:555-556, 1986; Wyllie, A. H. et al., Int. Rev. Cytol., 69:251, 1980; Duvall, E. and Wyllie, A. H., Immunology Today, 7:115-119, 1986; Sellins, K. S. et al., J. Immunol., 139:3199, 1987; Yamada, T. et al., Int. J. Radiat. Biol., 53:65, 1988; Schmid, D. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:1881-1885, 1986; John, C. et al., J. Immunol., 129(4):1782-1787, 1982; Howell, D. M. et al., J. Immunol., 140:689-692, 1988; Gillian, B. et al., Eur J. Immunol., 17:689-693, 1987). 또한, 항체(예를 들어, 항 CD3항체, 항 APO-I항체 등)에 있어서도 세포자멸이 유도되는 것이 알려져 있다(참조: Trauth, B. C. et al., Science, 245:301-305, 1989; Smith, C. A. et al., Nature, 337:181-184, 1989; Tadakuma, T. et al., Eur. J, Immunol., 20:779, 1990). 아울러, 단백질 합성저해제인 시클로헥시미드(cycloheximide)는 급성백혈병 세포에, RNA 합성저해제인 액티노마이신 D(Actinomycin D)는 소장장샘세포(small intestine crypt cell)에, 그리고 둘다는 HL-60 세포에 각각 세포자멸을 유도하는 것도 보고되고 있다(참조: Martin, S. J. et al., J. Immunol., 145:1859-1867, 1990).

세포자멸에 관련된 치료법으로서는, 전기 항 Apo-I항체에 의한 암치료의 시도 이외에 모세포(blast cell)의 활발한 증식에 기인하는 골수이형성증후군(MDS)에 대한 에토포시드(etoposide) 또는 애클라루비신(aclarubicin)의 투여가 검토되어 있다(참조: Shibuya, T., J. Clinical and Experimental Medicine, 160(5):319-323, 1992). 이들 외에도, 세포자멸의 유도방법과 그를 위한 약제조성물의 발명이 알려져 있다(예를 들어, 특개 2001-275681호 공보; 특소 2002-526109호 공보; 특소평 10-508575호 공보; 특개평 9-328425호 공보; 국제공개 제 WO 95-28154호 팜플렛 등).

한편, c-myc 유전자에 의해 코딩되는 c-Myc 단백질은 세포의 증식과 분화, 세포주기라고 하는 세포의 생명활동에 극히 중요할 뿐만 아니라, 세포의 종양화(형질전환)에도 깊이 관여하고 있다. 많은 암 조직에서 c-Myc 단백질의 발현증대가 관찰되며, c-myc 유전자 도입에 의한 세포의 종양화에서도 관찰된다. 또한, 이 c-Myc 단백질은 세포자멸과도 관계하고 있고, c-Myc 단백질의 세포 내의 발현량이 증가하여도 감소하여도 세포자멸이 유도된다(참조: Thompson, E. B. Ann. Rev. Physiol., 60:575-600, 1998). 예를 들어, 사람의 백혈병 세포에서의 글루코코르티코이드를 사용한 실험에서는 세포자멸 유도에 c-myc 유전자의 억제가 필수적이다(참조: Thulasi, R. et al., J. Biol. Chem., 268:18306-18312, 1993; Zhou, F. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 73:195-202, 2000; Thompson, E. A. et al., Cancer Res., 51:5544-5550, 1991; Helmberg, A. et al., EMBO J., 14:452-60, 1995). B 세포를 사용한 계(system)에서는 세포자멸을 유도하는 화학물질은 모두 c-myc 유전자의 발현억제와 깊이 관련되어 있다(참조: McCormack, J. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 81:5546-5550, 1984; Sonenshein, G. E., J. Immunol, 158:1994-1997, 1997; Fischer, G. et al., J. Exp. Med., 179:221-228, 1994; Wu, M. et al., Mol. Cell. Biol., 16:5015-5025, 1996). 또한, c-myc의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)를 몇 개 종류의 세포에 도입하면 세포자멸이 유도된다(참조: Thompson, E. B., Ann. Rev. Physiol., 60:575-600, 1998). 한편, IL-3 의존성의 골수세포에서 IL-3을 고갈시키거나, 동시에 c-myc 유전자를 강제 발현시키면 세포자멸이 유도된다(참조: Askew, D. S. et al., Oncogene 6:1915-1922, 1991). 또한, 무혈청 배지에서 Rat1 선유아세포(fibroblast)에 c-myc 유전자를 강제 발현시키면 세포자멸이 유도된다(참조: Evan, G. I. et al., Cell, 69:119-128, 1992).

이러한 c-Myc 단백질은 c-myc 유전자의 전사에 의해 생산되며, c-myc 유전자는 많은 전사인자에 의해 엄격히 제어되고 있지만, 그것이 어떻게 전사 제어되고 있는지에 대해서는 불명확한 점이 많다. 예를 들어, 70 내지 80%의 대장암에서 이상이 발견되는 APC(adenomatous polyposis coli) 유전자는 암 발생의 가장 초기에 이상이 일어난다고 한다. APC 단백질은 Wnt/Wingless 시그널 전달경로에 의해 안정화된 β 카테닌(β-catenin)에 결합해서 그 움직임을 억제하고 있다. β 카테닌은 전사인자 Tcf/Lef와 결합해서 c-myc 유전자의 전사를 활성화한다. 따라서, APC 유전자에 이상이 일어나면, β 카테닌의 활성을 억제하지 못하고 c-myc 유전자가 지속적으로 활성화되어 세포의 증식이 일으켜진다고 여겨지고 있다.

c-Myc 단백질의 발현은 Wnt/Wingless 시그널 전달경로 이외에도 많은 전사인자의 영향을 받고 있다. 예를 들어, 사람의 선골수성 백혈병세포(human promyeloid leukemia cell)인 HL60은 DMSO(dimethyl sulfoxide: Me₂SO), 레티노인산(retinoic acid), 포르볼 에스테르(phorbol ester), 비타민 D 유도체 등 여러 가지 화학물질에 의해 분화유도되고, 그 때에는 세포 내 c-Myc 단백질의 발현이 감쇄되는 것이 알려져 있다. 이 사실들은 여러 가지의 분화유도물질이 여러 가지 전사인자를 활성화하고 c-myc 유전자에 영향을 주지만, 최종적으로는 하나의 경로에 집약되어 c-myc 유전자의 전사를 억제하고 있는 것이 시사된다.

이러한 사실로부터, c-myc 유전자의 상류 어느 부위가 그 전사에 영향을 주는지를 해석한 결과, c-myc 유전자의 전사개시부위의 1.5kb도 상류의 백수십 개의 염기부위가 c-myc 유전자의 전사에 극히 중요하다라고 하는 것이 밝혀졌으며, FUSE(Far Upstream Element)라고 명명되었다(참조: Avigan, M. et al., J. Biol. Chem., 265:18538-18545, 1990). 다음으로, FUSE에 결한한 단백질이 올리고뉴클레오티드 친화크로마토그래피(oligonucleotide affinity chromatography)에 의해 해석되어, 70kDa의 분자량을 갖는 FBP(FUSE 결합 단백질: FUSE Binding Protein)이 동정되었다. 또한, 이 FBP 단백질은 그 자체가 강력한 전사활성을 가지며, c-myc 유전자를 억제하고 있는 가능성이 나타나고 있다(참조: Bazar, L. et al., J. Biol. Chem., 270:8241-8248, 1995; Duncan, R. et al., Genes Dev., 8:465-480, 1994; Michelotti, G. A. et al., Mol. Cell. Biol., 16:2656-2669, 1996). 게다 가, 이 FBP 단백질에 결합(상호작용)한 단백질로서 FIR(FBP Interacting Repressor)이 동정되고(참조: Liu, J. et al., Mol. Cell, 5:331-341, 2000), 이 FIR은 기본전사인자인 TFIIH의 기능을 억제하는 것에 따라 c-myc 유전자를 전사억제하는 것이 나타나고 있다(참조: Liu, J. et al., Cell, 104:353-363, 2001). 다만, 이 FIR이 세포자멸을 유도하는 것은 전혀 알려지지 않았다.

이처럼, c-Myc 단백질은 세포의 암화와 세포자멸에 깊이 관여하고 있으며, 그 발현을 억제하는 것에 의해 암세포를 사멸시키는 것이 기대되고 있다. 그러나, 상술한 바와 같이, c-Myc 단백질은 그 발현량이 증대하여도 감소하여도 세포자멸이 생기기 때문에, 그 발현억제에 의한 세포자멸 유도는 용이하지 않다. 또한, c-Myc 단백질의 발현억제에 의한 세포자멸 유도의 수단으로서 글루코코르티코이드 또는 c-myc 유전자의 안티센스 사슬(antisense strand)을 사용하는 방법이 제안되고 있지만(참조: Thompson, E. B., Ann. Rev. Physiol., 60:575-600, 1998; Thulasi, R., et al., J. Biol. Chem. 268:18306-18312, 1993; Zhou, F. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 73:195-202, 2000; Thompson, E. A. et al., Cancer Res., 51:5544-5550, 1991; Helmberg, A. et al., EMBO J., 14:452-60, 1995), 부작용과 안정적 효과의 관점에서 임상적 사용에는 바람직하지는 않다.

따라서, 본 발명의 과제는 c-myc 유전자를 표적으로 해서 세포자멸을 안정적이고도 확실하게 유도하기 위한 새로운 수단을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 과제는 상기 세포자멸 유도의 수단을 사용해서 동물 개체 내의 세포, 특히 그 존재가 숙주동물에 있어서 유해가 되는 세포에 세포자멸을 유도 하는 방법을 제공하는 것에 있다.

발명의 개시

본 발명자들은 상기 과제를 해결할 수 있도록 예의 연구를 거듭한 결과, c-myc 유전자의 상류에 있는 전사인자 FUSE(Far Upstream Element)에 결합한 FUSE 결합 단백질(FUSE 결합 단백질: 이하, 「FBP 단백질」이라고 함)과 상호작용하는 FIR(FBP Interacting Repressor) 단백질이 c-Myc 단백질의 발현을 억제함과 동시에, 세포자멸을 유도할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) FBP 단백질과 상호작용하는 단백질을 유효성분으로 함유하는 세포자멸 유도제.

(2) 제 1항에 있어서, FBP 단백질과 상호작용하는 단백질이 서열목록의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 구성된 단백질, 서열목록의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 구성되며, 세포자멸 유도활성을 가지는 단백질, 또는, 이들의 부분 펩티드인 것을 특징으로 하는 세포자멸 유도제.

(3) FBP 단백질과 상호작용하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 세포자멸 유도제.

(4) 제 3항에 있어서, FBP 단백질과 상호작용하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열목록의 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드, 서열목록의 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 엄격한(stringent) 조건하에서 혼성화하면서, 세포자멸 유도활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는, 이들의 부분 단편인 것을 특징으로 하는 세포자멸 유도제.

(5) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내에 도입가능한 형태를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 세포자멸 유도제.

(6) 제 5항에 있어서, 세포 내에 도입가능한 형태가 벡터인 것을 특징으로 하는 세포자멸 유도제.

(7) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료를 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 세포자멸 유도제.

(8) 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 세포자멸 유도제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, c-myc 유전자 발현에 의해 증식하는 세포에 세포자멸을 유도하는 방법.

(9) 제 8항에 있어서, 세포가 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.

(10) 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 세포가 포유동물의 체내에 있는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.

(11) 제 10항에 있어서, 포유동물이 사람인 것을 특징으로 하는 방법.

(12) 서열목록의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 구성된 단백질, 서열목록의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 구성되며, 세포자멸 유도활성을 가지는 단백질, 또는, 이들의 부분 펩티드의 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료방법.

(13) 서열목록의 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드, 서열목록의 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 세포자멸 유도활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는, 이들 단편의 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료방법.

(14) 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 포유동물이 사람인 것을 특징으로 하는 방법.

본 발명을 설명하는데 있어서, 「FBP 단백질과 상호작용하는 단백질(protein that interacts with FBP protein)」이라 함은 FBP 단백질과 결합해서 FBP 단백질의 기능(즉, c-myc 유전자의 전사활성)에 대해 억제적으로 움직이는 단백질을 의미한다.

또한, 「폴리뉴클레오티드가 세포 내에 도입가능한 형태(form of a polynucleotide that allows introduction into a cell)」라 함은 폴리뉴클레오티드가 세포 내에 도입되어 그 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질 또는 펩티드가 발현가능한 형태를 의미한다.

또한, 「단백질(protein)」및「펩티드(peptide)」라 함은 아미드 결합(펩티드 결합)에 의해 서로 결합한 복수개의 아미노산 잔기로 구성된 분자를 의미한다. 「폴리뉴클레오티드(polynucleotide)」라 함은 퓨린 또는 피리미딘(pyrimidine)이 당에 β-N-글라이코사이드 결합한 뉴클레오시드(nucleoside)의 인산 에스테르(ATP, GTP, CTP, UTP; 또는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP)가 100개 이상 결합한 분자를 의미하고, 「올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)」라 함은 2 내지 99개 연결된 분자를 의미한다.

본 발명에서의 그 외의 용어와 개념은 발명의 실시형태의 설명이나 실시예에서 상세하게 규정한다. 또한, 본 발명을 실시하기 위하여 사용한 여러 가지 기술은 특히 그 출전을 명시한 기술을 제외해서는 공지의 문헌 등에 의거하여 당업자이면 용이하고도 확실하게 실시가능하다. 예를 들어, 본 발명의 치료방법 등에 사용가능한 약제의 조제는 Remingon's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990에, 유전공학 및 분자생물학적 기술은 Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995 등에 기재되어 있다.

도 1은 FIR 단백질이 c-myc 전사억제능을 갖는지의 여부를 조사한 CAT 분석(assay)의 결과이다.

도 2는 완전장 FIR 유전자(HA-FIR) 또는 그의 결실변이체(HA-FIR△N77)를 도입한 HeLa 세포에 대하여, c-Myc 단백질의 발현을 면역조직화학염색에 의해 가시화한 형광현미경 사진이다.

도 3은 완전장 FIR 유전자(HA-FIR) 또는 그의 결실변이체(HA-FIR△N77)를 도입한 HeLa 세포에 대하여, 흐름세포측정해석법(flow cytometric analysis)(2색 FACScan 해석)에 의해 c-Myc 단백질의 발현을 정량한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 완전장 FIR 유전자(HA-FIR) 또는 그의 결실변이체(HA-FIR△N77)를 도입한 HeLa 세포에 대하여, 세포자멸 유도를 조사한 형광현미경 사진이다.

도 5는 완전장 FIR 유전자(HA-FIR) 또는 그의 결실변이체(HA-FIR△N77)를 도입한 HeLa 세포에 대하여, 흐름세포측정해석법(2색 FACScan 해석)에 의해 세포자멸 을 정량한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 FIR 유전자만, FIR 유전자와 c-myc 유전자 둘다를 도입한 HeLa 세포에 대하여, FIR 단백질 및 c-Myc 단백질의 발현을 면역조직화학염색에 의해 가시화한 형광현미경 사진이다.

도 7은 FIR 유전자만, FIR 유전자와 c-myc 유전자 둘다를 도입한 HeLa 세포에 대하여, 세포자멸 유도를 조사한 형광현미경 사진이다.

도 8A는 대장의 종양조직(T) 및 비종양조직(N)의 FIR 단백질 수준을 임뮤노블러팅(immunoblotting)에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 8B는 대장의 종양조직(T) 및 비종양조직(N)의 모든 RNA에 대하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 8C는 실시간(real-time) 정량적 PCR에 의해 검출된 대장의 종양조직(T) 및 비종양조직(N)의 FIR mRNA 발현 수준의 히스토그램을 나타낸 것이다.

도 8D는 FIR과 c-myc mRNA의 대장 종양조직(T)/비종양조직(N) 발현비의 상관을 나타낸 것이다.

도 9는 완전장 FIR 유전자(FIR 야생형), 및 대장암 조직유래의 FIR 변이체(118T-FIR 변이체, 28T-FIR 변이체)를 도입한 HeLa 세포에 대하여, c-Myc 단백질의 발현을 면역조직화학염색에 의해 가시화한 형광현미경 사진이다.

도 10은 완전장 FIR 유전자(FIR 야생형), 및 대장암 조직유래의 FIR 변이체 (118T-FIR 변이체, 28T-FIR 변이체)를 도입한 HeLa 세포에 대하여, 세포자멸 유도를 조사한 형광현미경 사진이다.

도 11은 자궁경부암(HeLa), 식도암(T.Tn) 세포의 생존률을 MTT 분석에 의해 측정한 그래프를 나타낸 것이다.

도 12는 FIR 아데노바이러스 벡터(adenovirus vector) 감염 후의 대장암(SW480, DLD1), 자궁경부암(HeLa), 식도암(T.Tn) 세포주에서의 핵내 및 세포질 내의 FIR 단백질 발현을 임뮤노블러팅에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본원은 2003년 4월 21일에 출원된 일본국특허출원 2003-116299호의 우선권을 주장한 것이며, 상기 특허출원의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

1. 세포자멸 유도제

본 발명의 세포자멸 유도제는 유효성분으로서 FBP 단백질과 상호작용하는 단백질, 또는 FBP 단백질과 상호작용하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내에 도입가능한 형태로 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 FBP 단백질, 바람직하게는 사람의 FBP 단백질과 상호작용하는 단백질로서는, 사람의 FIR 단백질(참조: Liu, J. et al., Mol. Cell, 5:331-341, 2000; Liu, J. et al., Cell, 104:353-363, 2001; GenBank/NM_14281), 사람의 SIA HBP1(siah binding protein 1: GenBank/BC008875), 사람의 SIAHBP1의 전사변이체1(GenBank/NM_078480), 사람의 SIAHBP1의 전사변이체2(GenBank/NM_014281) 등을 예로 들 수 있지만, 이들 중에서도 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 사람의 FIR 단백질이 특히 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 사람의 FIR 단백질에는 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에서 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 세포자멸 유도활성을 가지는 단백질도 포함된다.

상기에서, 결실, 치환 또는 부가되어도 좋은 아미노산의 개수로서는, 바람직하게는 1개 내지 수개이다. 예를 들어, 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열의 1개 내지 10개, 바람직하게는 1개 내지 5개의 아미노산이 결실되어도 무방하고, 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열에 1개 내지 10개, 바람직하게는 1개 내지 5개의 아미노산이 부가되어도 무방하고, 또는, 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열의 1개 내지 10개, 바람직하게는 1개 내지 5개의 아미노산이 다른 아미노산에 치환되어도 무방하다.

아미노산의 결실, 부가 및 치환은 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 해당 기술분야에 공지된 방법으로 변이시켜 수행할 수 있다. 유전자에 변이를 도입하려면, Kunkel 법 또는 Gapped duplex 법 등의 공지된 방법 또는 이에 준하는 방법을 수행할 수 있으며, 예를 들어, 부위특이적 돌연변이유발을 이용한 변이도입용 키트(예를 들어, Mutant-K(TAKARA사 제품)나 Mutant-G(TAKARA사 제품)) 등을 이용하거나, TAKARA사의 LA PCR in vitro Mutagenesis 시리즈 키트를 이용하여 변이를 도입한다.

상기에서, 「세포자멸 유도활성(apoptosis-inducing activity)」이라 함은 세포를 수축시켜 핵을 단편화시키는 활성을 의미하며, 이 활성은 예를 들어, 유전자를 HeLa 세포 등에 도입하여 과잉 발현시켜 그 세포의 형태변화의 관찰, FACS 분석에 의해 확인할 수 있다.

또한, 「세포자멸 유도활성을 가지는(having apoptosis-inducing activity)」이라 함은 서열번호 2에 있어서의 아미노산 서열을 가지는 단백질이 유지되는 상기 활성과 실질적으로 동등하다는 것을 의미한다.

상기 단백질 중의 부분 아미노산 서열을 포함하는 펩티드('부분 펩티드'라고도 한다)도 본 발명의 범위에 포함된다. 부분 펩티드를 구성하는 아미노산 개수는 적어도 10개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 보다 바람직하게는 80개 이상이다.

상기 단백질 또는 그의 부분 펩티드는 필요에 따라서 염의 형태, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 산 부가염의 형태에서 제공될 수 있다. 그와 같은 염으로서는 무기산(예를 들어, 염산, 인산, 브롬화수소산(hydrobromic acid), 황산)의 염, 유기산(예를 들어, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레인산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산)의 염 등을 들 수 있다.

상기 단백질은 공지된 아미노산 서열(예를 들어, FIR 단백질의 경우는 서열번호 2의 아미노산 서열)에 의거하여 화학합성하는 방법과, 발현벡터에서의 시험관내(in vitro) 전사와 발현벡터에 의한 형질전환 세포의 발현산물로 분리정제하는 방법 등에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 단백질을 시험관내 번역(in vitro translation)에서 발현시키는 경우에는, RNA 중합효소 프로모터(polymerase promoter)를 갖는 발현벡터를 프로모터에 대응하는 RNA 중합효소를 포함하는 토끼 망상적혈구 용해물(reticulocyte lysate)이나 소맥배아 추출물 등의 시험관내 번역계에 첨가하면, 단백질을 시험관내에서 생산할 수 있다. RNA 중합효소 프로모터로서는 T7, T3, SP6 등을 예로 들 수 있다. 이들 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pT3/T7 18, pT7/3 19, pBluescript II 등을 예로 들 수 있다. 또한, 단백질을 대장균 등의 미생물에서 발현시키는 경우에는 미생물 중에서 복제가능한 오리진(origin), 프로모터, 리보솜 결합부위, DNA 클로닝 부위(cloning site), 종결유전자(terminator) 등을 가지는 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 재조합해서 발현벡터를 구축한다. 이 발현벡터에서 숙주세포를 형질전환하면, 단백질을 발현하는 형질전환체 세포를 수득할 수 있으며, 이 형질전환체를 배양하면, 그 배양물에서 목적의 단백질을 대량생산할 수 있다. 대장균용 발현벡터로서는 pUC계, pBluescript II, pET 발현시스템, pGEX 발현시스템 등을 예로 들 수 있다. 또한, 단백질을 진핵세포에서 발현시키는 경우에는, 상기 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 프로모터, 스플라이싱 영역(splicing region), 폴리(A) 부가부위 등을 가지는 진핵세포용 발현벡터에 삽입해서 재조합 벡터를 작제한다. 이 벡터를 진핵세포 내에 도입하면, 목적의 단백질을 발현하는 형질전환 진핵세포를 수득할 수 있다. 발현벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pYES2 등을 예로 들 수 있다. 진핵세포로서는 사람의 태아신장세포(human embryonic kidney cell) HEK293, 원숭이 신장세포 COS7, 차이니즈 햄스터 난소세포 CHO 등의 포유동물 배양세포, 또는 사람의 장기에서 분리된 초대 배양세포 등을 사용할 수 있다. 출아효모(budding yeast), 분열효모(fission yeast), 누에세포(silkworm cell), 아프리카 발톱개구리 알세포(Xenopus egg cell) 등도 사용할 수 있다. 발현벡터를 세포에 도입하려면, 전기천공법(electroporation), 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등 공지된 방법을 이용할 수 있다. 형질전환 세포에서 발현시킨 단백질을 분리정제하기 위해서는, 공지된 분리조작방법을 조합해서 수행할 수 있다. 예를 들어, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파처리, 효소처리, 염석, 용매침전법, 투석, 원심분리, 한외여과, 겔여과, SDS-PAGE, 등전압전기영동(isoelectric focusing), 이온교 환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화크로마토그래피, 역상크로마토그래피 등을 들 수 있다.

또한, 부분 펩티드는 공지된 펩티드 합성법 또는 상기 단백질을 적당한 펩티다제(예를 들어, 트립신, 키모트립신, 알기닐엔도펩티다제(arginylendopeptidase))로 절단하여 제조할 수 있다. 펩티드 합성법으로서는 예를 들어, 고상합성법 또는 액상합성법의 어느 것을 사용해도 무방하다.

또한, 본 발명의 세포자멸 유도제에 사용하는 폴리뉴클레오티드로서는 서열번호 1로 나타내어지는 염기서열을 갖는 사람의 FIR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 사람의 FIR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 서열번호 1에 나타내는 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 세포자멸 유도활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

상기에서, 엄격한 조건(stringent condition)이라 함은 소위 특이적인 하이브리드(hybrid)가 형성되어, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 의미한다. 예를 들어, 상동성이 높은 핵산, 즉, 서열번호 1에서 나타내는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 구성된 DNA의 상보 사슬이 혼성화하여, 그 보다 상동성이 낮은 핵산의 상보 사슬이 혼성화하지 않는 조건을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 나트륨 농도가 150 내지 900mM, 바람직하게는 600 내지 900mM 이며, 온도가 60 내지 68℃, 바람직하게는 65℃에서의 조건을 의미한다.

상기의 각 단백질을 코딩하는 게놈 DNA(genomic DNA), 게놈 DNA의 전사산물인 mRNA, 이 mRNA를 주형으로 합성되는 cDNA 등을 이용할 수 있지만, cDNA가 특히 바람직하다. 이 cDNA는 상기의 공지서열을 이용해서 공지의 방법에 따라 수득할 수 있다. 예를 들어, 공지의 방법(참조: Mol. Cell Biol., 2:161-170, 1982; J. Gene, 25:263-269, 1983; Gene, 150:243-250, 1994)을 이용하여 cDNA 라이브러리(cDNA library)를 합성하고, 상기 공지서열(예를 들어, FIR 단백질을 코딩하는 서열번호 1)의 염기서열에 의거하여 제작한 프로브 DNA(probe DNA)를 이용하여 목적의 cDNA를 분리할 수 있다. 수득된 cDNA는 예를 들어, PCR(Polymerase Chain Reaction)법, NASBN(Nucleic acid sequence based amplification)법, TMA(Transcription-mediated amplification)법 및 SDA(Strand displacement amplification)법 등의 통상 수행되는 유전자 증폭법에 의해 증폭될 수 있다. 또한, 공지 서열에 의거하여 제작한 프라이머 세트(primer set)를 이용하여, 사람 세포에서 분리한 mRNA를 주형으로 하는 RT-PCR법에 의해서도 필요량의 각 cDNA를 수득할 수 있다. 프라이머 세트는 프라이머 설계용의 시판 소프트웨어, 예를 들어, OligoTM[National Bioscience Inc. (미국) 제품), GENETYX[소프트웨어개발(주) (일본) 제품] 등을 사용함으로 제작할 수 있다.

상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 세포 내에 도입가능한 형태로 만들기 위해서는, 예를 들어 이하의 수단을 사용한다.

단백질은 예를 들어, 그 구조나 기능을 변경하지 않고, 약리학적으로 허용되 는 담체용액에 단백질 분자를 혼합해서 제제화하여 세포 내에 도입가능한 형태로 만들 수 있다.

이러한 약제는 예를 들어, 시험관내(in vitro) 세포에 대해서는 마이크로인젝션법(microinjection method)에 의해 세포 내에 도입할 수 있다. 또는, 지질에 의한 세포 내 도입법(BioPORTER(Gene Therapy Systems사, 미국), Chariot(Active Motif사, 미국) 등)을 채용할 수도 있다.

또한, 다른 실시태양으로는 단백질(폴리펩티드)의 N 말단측에 세포막 통과 펩티드를 연결시킨 융합 폴리펩티드를 제조하여 단백질을 세포 내에 도입가능한 형태로 만들 수도 있다. 이 세포막 통과 펩티드를 가지고 단백질은 세포막을 통과해서 세포 내에 받아들여진다. 세포막 통과 펩티드로서는 HIV-TㆍTAT의 PTD(protein transduction domain) 또는 초파리 호메오박스 단백질 안티나페디아(drosophila homeobox protein antennapedia)의 PTD 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, HIV-1ㆍTAT의 경우에는 그 아미노산 서열 및 그의 cDNA의 염기서열이 공지이며(참조: Science, 285:1569-1572, 1999; Genbank Accession NO. U39362 M96155), 그 PTD에 상당하는 영역(HIVㆍTAT의 47 내지 57번 아미노산 서열)을 코딩하는 DNA 단편을 상기 cDNA와 연결해서 융합 DNA 단편을 수득하고, 이 융합 DNA 단편을 대장균 등의 숙주세포에서 발현시켜 N 말단측에 PTD 펩티드를 연결해서 융합 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 안티나페디아의 PTD도 공지이므로(예를 들어, GenBank Accession No. AE001573), PTD를 연결한 융합 폴리펩티드를 쉽게 제조할 수 있다. 또한, 2가 가교제(divalent crosslinking agent)(예를 들어, EDC 또는 β-알라닌 등)를 개입시켜, 폴리펩티드와 PTD 펩티드를 결합시켜 세포막 통과 펩티드를 연결한 융합 폴리펩티드를 제조할 수도 있다.

한편, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 발현벡터에 함입시켜 세포 내에 도입가능한 형태로 만들 수 있다. 발현벡터는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가부위 등을 가지는 공지의 진핵세포용 발현벡터를 사용할 수 있으며, 이 발현벡터의 클로닝 부위(cloning site)에 상기의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 폴리펩티드 발현벡터를 구축할 수 있다.

이 발현벡터는 시험관내(in vitro) 세포(배양세포)에 대해서는, 예를 들어, 전기천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등의 공지된 방법에 의해 세포 내에 도입할 수 있다.

또한, 체내(in vivo) 세포(즉, 동물개체 내의 세포)에 대해서는, 세포 내의 촉진이나 표적세포의 지향성을 높이는 목적으로, 예를 들어, 바이러스성 또는 비 바이러스성의 유전자 도입용 벡터 등의 수단에 의해 세포 내에 도입할 수 있다. 이와 같은 형태로 한 약제는 유전자 치료용으로 생체 내에 도입할 수 있다(예를 들어, 특개 2003-24092호 공보, 특개 2003-501445호 공보 등). 상기에서, 바이러스성 벡터로서는, 예를 들어, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 렌티바이러스(lentivirus) 벡터, AAV(adeno-associated virus) 벡터, 백시니아바이러스(vaccinia virus) 벡터, 사람면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus)(HIV) 벡터, 헤르페스바이러스(herpes virus) 벡터 등을 들 수 있다. 또한, 비 바이러스성 벡터로서는, 리포솜, 인공 지질 매개체 (artificial lipid vehicle), 중공 나노입자(hollow nanoparticle), 덴드리머(dendrimer) 등의 고분자 화합물 등을 예로 들 수 있다. 이 경우, 시판의 도입용 시약(예를 들어, 리포펙틴(lipofectin), 리포펙타민(lipofectamine), DMRIE-C(Invitrogen사 제품), Metafectene, DOTAP(BioTex사 제품), Tfx 시약(Promega사 제품)) 등을 이용할 수 있다.

세포자멸은 정상의 발생ㆍ분화에 불가결한 생리적 세포사이며, 정상적인 생체조직의 세포발달 등 개개의 세포에서 일어나고 있다. 그 때문에, 세포자멸이 과잉으로 감소하면, 많은 기능장해의 원인이 되는 것으로 판명되고 있다. 따라서, 본 발명의 세포자멸 유도제는 세포자멸의 감소에 기인하는 질환의 치료 및/또는 예방제로 사용할 수 있다. 세포자멸의 감소에 기인하는 질환으로는 대표적으로 악성종양(예를 들어, 위암, 대장암, 유암, 폐암, 식도암, 전립선암, 간암, 신장암, 방광암, 피부암, 자궁암, 뇌종양, 골육종, 골수종양 등)이지만, 백혈병, 자기면역질환(예를 들어, I형 당뇨병, 다발성경화증, 전신홍반루프스(systemic lupus erythematode), 만성관절류마티스 등), 바이러스 감염질환(HIV 감염 등), 간염 등을 예로 들 수 있고, 이것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 세포자멸 유도제는 각종 제제형태로 조제하고, 경구 또는 비경구적으로 전신 또는 국소투여할 수 있다. 본 제제를 경구투여하는 경우는 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 환제, 내복용 액제, 현탁제, 유제, 시럽제 등에 제제화하는지, 사용할 때에 다시 용해시키는 건조생성물에 하여도 무방하다. 또한, 본 제제를 비경구투여하는 경우는 정맥내 주사제(점적주입을 포함), 근육내 주사제, 복강 내 주사제, 피하 주사제, 좌제 등으로 제제화하고, 주사용 제제의 경우는 단위투여량 앰플 또는 다(多)투여량 용기의 상태로 제공된다.

이 각종 제제들은 제제상 통상 사용되는 부형제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕괴제, 윤활제, 계면활성제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해보조제, 방부제, 교미교취제(flavoring agent), 무통화제, 안정화제, 등장화제 등을 적절히 선택해서, 당업계의 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 세포자멸 유도제의 투여량은 투여대상의 연령, 투여경로, 투여횟수, 증상, 제형 등에 따라 다르지만, 단백질 또는 폴리펩티드의 치료적 유효량(즉, 유효량)은 약 0.001 내지 30mg/kg 체중의 범위, 바람직하게는 약 0.01 내지 25mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 20mg/kg 체중, 보다 더 바람직하게는 약 1 내지 10mg/kg, 2 내지 9mg/kg, 3 내지 8mg/kg, 4 내지 7mg/kg, 또는 5 내지 6mg/kg 체중의 범위이며, 1일 1회 내지 수회로 나눠서 1일 이상 투여된다. 또한, 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유전자 치료 등의 방법에 의해 도입할 경우는 상기의 범위량의 단백질을 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 투여하면 좋다.

2. 세포자멸 유도방법

본 발명의 세포자멸 유도방법은 c-myc 유전자 발현에 의해 증식하는 세포에 상기 세포자멸 유도제를 세포에 접촉시키는 것을 특징으로 한다.

아울러, c-myc 유전자는 거의 모든 동물세포에서 그 증식에 관여하기 때문에, 본 발명의 방법은 실제로는 모든 동물세포의 세포자멸을 유도하기 위해 적용할 수 있지만, 특히, c-myc 유전자의 과잉발현에 의해 암세포화한 세포를 대상으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 시험관내(in vitro) 세포(배양세포)를 대상으로 할 수도 있고, 체내(in vivo) 세포(동물체내의 세포)를 대상으로 할 수 있다. 시험관내(in vitro) 세포를 대상으로 할 경우는, 상술한 바와 같이, 단백질 발현벡터를 전기천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법 등 공지된 방법으로 세포 내에 도입하는 방법, 또한 단백질 그 자체의 용액을 현미주사(microinjecting) 방법이나 지질을 개입시켜 세포에 도입하는 방법, 또는 PTD 펩티드 융합 단백질을 배양세포에 접촉시키는 방법 등에 의해 실시할 수 있다.

체내(in vivo) 세포를 대상으로 할 경우는, 상술한 바와 같이, 폴리뉴클레오티드를 유전자 치료에 준한 방법에 의해 체내세포에 도입하는 방법, 단백질 그 자체의 용액을 체내세포에 현미주사 방법이나 지질을 개입시켜 세포에 도입하는 방법, 또는 PTD 펩티드 융합 단백질 용액을 체내에 투여하는 방법 등에 의해 실시할 수 있다.

체내(in vivo) 세포는 모든 동물개체 내의 세포를 대상으로 할 수 있지만, 특히, 유용동물(가축, 애완동물)의 암치료 등을 목적으로 하는 세포자멸 유도가 바람직하다. 또한, 사람의 암치료를 목적으로 하는 세포자멸 유도가 더욱 바람직하다.

3. 암의 치료방법

본 발명의 암 치료방법은 암에 걸린 포유동물에 대하여 상기 세포자멸 유도제를 암의 치료상 유효한 양으로 투여하는 것을 특징으로 한다.

상기에서, 포유동물로서는 사람, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 돼지 등을 예로 들 수 있다. 「암의 치료상 유효한 양(therapeutically effective dose for cancer)」이라 함은 증식 중의 암세포에 대한 본 제제의 투여에 의해 암세포의 증식의 정지, 종양 사이즈의 축소 또는 소실을 초래하는 양을 의미한다. 구체적인 투여량은 투여경로, 환자의 연령 및 체중, 암의 종류 및 악성도, 전이 또는 재발의 유무 등에 따라 적절히 증감되어야 한다.

투여형태로서는 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 피하, 국소, 종양내, 경구, 경피, 직장내, 질내, 비강내, 설하투여 등을 예로 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 외과수술에 의해 용이하게 접근가능한 각종 장기 내의 고형 종양에 대해서는, 종양 내 또는 그 근방에 정위고정침(stereotaxic needle) 등을 이용해서 국소주입시켜 투여해도 무방하고, 백혈병 등의 비고형 종양, 뇌종양 등의 외과적 수술에 의해 접근하기 어려운 부위의 암, 전이성 암에 대해서는 정맥내 주사로 투여할 수 있다. 그 외에, 암의 종류나 부위에 의해 상술한 투여방법을 적절히 선택해서 사용할 수 있다.

유전자 치료의 형태로서는 표적세포를 체외로 꺼내고 유전자 도입을 수행하 는 체외법(ex vivo법), 체내에 유전자를 도입하는 체내법(in vivo법)이 있지만, 본 발명의 세포자멸 유도제는 어느 치료형태에도 적용된다. 체외법에서는 환자유래의 세포를 일단 체외에서 배양하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 도입처리를 한 후에 환자에게 투여해도 무방하고, 체내법에서는 상기의 폴리뉴클레오티드 도입벡터를 직접 환자체내(예를 들어, 장기조직, 피부, 근육 등)에 투여해도 무방하다.

또한, 암치료는 외과적 수술, 화학요법, 및 방사선치료를 포함하는 공지된 암치료 수단으로 병용하여도 무방하다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하, 본 발명을 실시예를 들어 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 발현 플라스미드(plasmid)의 작제와 암조직 표본시료의 채취

(1) 발현 플라스미드의 작제

완전장 FIRcDNA(서열번호 2) 및 FIR의 전사활성부위인 N 말단측 77개의 아미노산 서열(서열번호 2의 아미노산 서열의 1 내지 77까지의 아미노산 서열)이 결실 된 FIR 변이체를 pCGNM2 벡터 플라스미드(참조: Liu, J. et al., Cell, 104:353-363, 2001)에 클로닝해서, 각각의 발현 플라스미드(HA-FIR과 HA-FIR△N77)를 작제하였다.

또한, 사람의 c-Myc 발현벡터로서, pcDNA3.1-c-myc, GeneStorm^TM Expression-Ready Clones(Invitrogen Co., AL)을 구입하였다.

(2) 사람의 대장균 조직표본의 채취

상술한 바와 같이, 문서에 의한 동의를 얻은 원발성 대장암(primary colorectal cancer)의 환자 15명으로부터 외과적으로 조직을 절제하였다. 절제시료는 종양상 피조직 및 종양으로부터 5 내지 10cm 떨어진 비종양상 피조직에서 수술에 의한 절제 후, 1시간 이내에 채취하였다. 2명의 병리의사가 모든 조직시료가 선암(adenocarcinomas)인 것을 현미경 관찰로 확인하였다. 모든 절제시료는 바로 액체질소 안에 두고, -80℃에서 분석시까지 유지하였다.

실시예 2: FIR에 의한 외래성 c-myc 유전자의 전사억제실험

외래성의 c-myc 프로모터에 대해 FIR이 전사억제능을 갖는지의 여부를 조사하기 위하여, c-myc 프로모터를 Chloramphenicol acetyltransferase(CAT) 유전자의 상류에 가지는 리포터 플라스미드(reporter plasmid)를, 실시예 1에서 작제한 HA- FIR 또는 HA-FIR△N77과 HeLa 세포에 함께 도입시켜 CAT의 발현을 조사하였다.

(1) 방법(CAT 분석)

HeLa 세포를 10% 우태아 혈청(fetal calf serum)을 가한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, Gibco-BRL)에서 배양하고, 전기천공법(electroporation)에 의해 HA-FIR 또는 HA-FIR△N77을, c-myc 프로모터를 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyl transferase: CAT) 유전자의 상류에 가지는 리포터 플라스미드와 함께 도입하였다. 유전자 도입으로부터 48시간 후, 문헌(참조: Tomonaga, T. et al., J. Biol. Chem., 270:4875-4881, 1995)에 기재된 방법에 따라 CAT의 발현을 조사하였다.

(2) 결과

도 1에 CAT 분석의 결과를 나타내었다. FIR은 현저하게 CAT의 발현을 억제하였으나, 아미노 말단을 제거한 변이 FIR은 정상적인 FIR에 비해 CAT의 발현억제가 감소한 것을 알 수 있다(도 1).

실시예 3: FIR에 의한 내재성 c-myc 유전자의 전사억제실험

세포내에 원래 존재하는 c-myc 유전자의 프로모터(내재성의 c-myc 프로모터)가 FIR에 의해 전사억제되는지의 여부를 면역조직화화학염색 및 흐름세포측정해석 법(flow cytometric analysis)에 의해 조사하였다.

(1) 방법

(1-1) 면역조직화학염색

HeLa 세포를 커버 글라스(cover glass)에서 하룻밤 배양하고, Lipofectamine Plus reagent(Gibco BRL)를 이용하여, 플라스미드(HA-FIR 및 HA-FIR△N77)를 형질전이하였다. 플라스미드 도입으로부터 24시간 후, 선행문헌(참조: He, L., et al., Embo J, 19:1034-1044, 2000)에 기재된 방법에 따라 세포를 처리하였다.

커버 글라스 위에 세포를 4%-파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시킨 후, PBS로 세정하고 실온에서 1차 항체와 1시간 반응시켰다. 마우스 항-HA 단클론항체(Santa Cruz Biotechnology, CA), 토끼 항-c-Myc 다클론항체(Upstate Biotechnology, NY), 마우스 항 c-Myc 단클론항체(Oncogene Research Products, CA)를 차단용 완충액(blocking buffer)으로 500배, 1,000배, 500배로 각각 희석한 것을 1차 항체로 사용하였다.

그 후, PBS로 재차 세정하고, 2차 항체[로다민 표지-항 마우스 IgG(rhodamine-labeled anti-mouse IgG)(Roche), 형광물질 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC) 표지-항 토끼 IgG(Sigma)를 각각 상기 차단용 완충액으로 1,000배 및 500배로 희석한 것]를 반응시켰다. 세포핵의 DNA를 디아미디노페닐인돌(diamidinophenylindole: DAPI, 1μg/ml)로 염색하고, 면역형광현미경 (Leica QFISH; Leica Microsystems, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

(1-2) 흐름세포측정해석법(Flow cytometric analysis)

FIR에 의한 c-Myc 발현억제를 정량하기 위하여, 세포를 2색 FACScan 해석(참조: He, L., et al., Embo J., 19:1034-1044, 2000)하였다. 즉, 형질전이 22시간 후, 세포를 트립신처리하고, PBS로 세정한 다음, -20℃의 에탄올로 적어도 2시간 고정하고, 세포를 차가운 PBS로 2회 세정한 다음, 마우스 항-HA 항체 및 토끼 항-c-Myc 항체를 1차 항체로 반응시켰다. PBS로 세정한 다음, 2차 항체[FITC-결합-항-토끼 IgG(Sigma) 및 R-PE-결합-항-마우스 IgG(PharMingen)를 각각 200배로 희석한 것]를 반응시켰다.

각 시료에 대해 10,000개의 세포를 c-Myc-FITC를 FL1 강도, HA-PE를 FL2 강도로 검출하는 흐름 세포측정으로 해석하였다. 형질전이된 세포(PE-양성세포)를 X축으로 잡고, FITC-양성세포(c-Myc 발현세포)를 Y축으로 잡아 표시하였다.

(2) 결과

HA-FIR 및 HA-FIR△N77을 HeLa 세포에 형질전이시키고, 내재성 c-Myc의 발현을 면역조직화학염색에 의해 가시화한 결과를 도 2에 나타내었다.

HA-FIR 발현세포에서는 c-Myc 발현수준이 크게 억제된 것으로 보이고(도 2, 상단의 패널, "▲" 기호), HA-FIR△N77 발현세포에서는 그 억제활성이 약해져 있다(도 2, 하단의 패널, "화살표").

HA-FIR 및 HA-FIR△N77을 HeLa 세포에 형질전이시키고, 내재성 c-Myc의 발현을 흐름세포측정해석법(2색 FACScan 해석)으로 정량한 결과를 도 3에 나타내었다. HA-FIR은 c-Myc 발현을 억제하지만(도 3, 상단, 좌측의 패널), HA-FIR△N77에서는 그러한 작용은 없으며(도 3, 상단, 중앙의 패널), HA 벡터만으로는 억제하지 않았다(도 3, 상단, 우측의 패널).

또한, HA-FIR 양성집단 내에서는, c-Myc 수준이 현저하게 게이트 영역에서 이봉성(二峰性, bimodal)을 이루고(도 3, 상단, 좌측의 패널), c-Myc 수준이 HA-FIR 형질전이 세포에서 급격하게 감소하였다. HA-FIR△N77 또는 HA-tag 형질전이 세포에서는 c-Myc 발현수준이 형질전이 세포 및 비형질전이 세포 사이에서 일정하게 구별할 수 없었다(도 3, 상단의 중앙 및 우측의 패널).

하단의 패널은 상단의 패널에서 기호를 붙인 게이트 영역에서의 c-Myc 발현의 히스토그램을 나타낸다. 게이트 영역에서의 c-Myc의 평균치(Geo-mean)는 HA-FIR에 대해서는 19.4(8.0), HA-FIR△N77에 대해서는 22.6(9.6), HA 공벡터에 대해서는 35.5(30.0)이었다.

이상으로, FIR은 내재성 c-Myc 발현을 억제하고, FIR 아미노 말단 도메인은 그 억제에 필수인 것이 확인되었다.

실시예 4: FIR에 의한 세포자멸 유도

FIR은 내재성의 c-myc 발현을 억제하기 때문에, FIR의 고발현에 의해 세포자 멸을 유도할 수 있는지의 여부를, 전장 FIR, 및 N 말단측의 76 아미노산 서열을 결실한 변이 FIR을 이용하여 조사하였다.

(1) 방법(TUNEL법)

150fmol의 HA-FIR 또는 HA-FIR△N77, 공벡터 플라스미드를 6-well plate 내의 HeLa 세포에 형질전이시키고, 60시간 후에 세포자멸 유도를 조사하였다. 세포자멸은 제조자의 지시에 따라, TUNEL법(Apoptosis Detection System, Fluorescein. Promega, WI, USA)으로 검출하였다. 즉, 커버 글라스 위에서 배양한 HeLa 세포를 4%-파라포름알데하이드로 10분간 얼음 위에서 고정하였다. PBS로 세정한 다음, 세포를 0.5% Triton-X-100의 PBS 용액으로 5분간 투석하였다. PBS로 재차 세정한 다음, FITC 표지-dUTP(MEMSTAIN Apoptosis Kit: Medical & Biological Laboratories, JAPAN)를 포함하는 터미널 디옥시트랜스퍼라제(terminal deoxytransferase)(TdT)에 의한 in situ nick-end labeling을 사용해서 DNA의 뉴클레오솜(nucleosome) 내 단편화를 검출하는 것으로 세포자멸을 가시화하였다.

HeLa 세포를 1unit/ml DNase I(GenHunter Corporation, Nashville, TN)로 처리하고, 이 세포를 양성대조군으로 하였다. DNA는 DAPI III Counterstain(Vysis, Abbott Park, IL)으로 염색하고, 형광현미경(Leica QFISH; Leica Microsystems, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

2색 FACScan 해석을 수행할 즈음에, 세포를 트립신처리 후, -20℃의 에탄올로 적어도 2시간 고정하였다. PBS로 재차 세정한 다음, 세포를 FITC 표지-dUTP를 포함하는 50μl의 TdT 완충용액 내에서 배양하였다. 그 후, 250μg의 DNase-free RNase A를 포함하는 0.5ml의 요오드화 프로피듐(propidium iodide: PI) 용액(PBS로 5μg/ml에 새로 희석)으로 세포를 재현탁하였다.

각 시료에 대해 10,000개의 세포를 FITC를 FL1 강도, PI를 FP2 강도로 분석하였다. PI-양성세포를 X축으로 잡고, FITC-양성세포(세포자멸 양성세포)를 Y축으로 잡고 표시하였다.

(2) 결과

HA-FIR은 DNA 단편화를 동반하는 세포자멸을 유도하였다(도 4, 상단 좌측의 패널, "화살표"). 한편, HA-FIR△N77 또는 대조군 벡터(HA 공벡터)로 형질전이시킨 세포에서는 대부분의 세포자멸이 일어나지 않았다(도 4, 상단, 중앙 및 우측의 패널).

도 5는 2색 해석에 의해 세포자멸을 정량한 결과를 나타낸다. 각 패널에서의 상부 게이트 영역에 보여지는 세포자멸을 도면에 나타내었다. 10,000개당 세포자멸의 비율은, HA-FIR에서는 16.5%, HA-FIR△N77에서는 6.6%, HA 공벡터에서는 2.0%, 그리고 DNaseI 처리세포(양성조절)에서는 75.6%이었다.

실시예 5: FIR과 c-Myc 공발현에 의한 세포자멸 유도

(1) 방법(TUNEL법)

600ng의 pcDNA3.1-FIR을 6-well plate에 도포한 반 융합(semi-confluent) Hela 세포에 60ng의 c-Myc 발현 플라스미드(pcDNA3.1-c-myc)와 함께, 또는 단독으로 형질전이시켜, 상기와 동일하게 TUNEL법으로 분석하였다.

(2) 결과

c-Myc 발현은 c-myc 플라스미드를 FIR 플라스미드와 함께 형질전이시킨 경우에 현저하게 상승한 것으로 보이고(도 6, 중단, 우측의 패널), FIR 단독을 형질전이한 경우는 현저하게 억제되었다(도 6, 중단, 좌측의 패널). 핵 형광표지상(nuclear fluorescence image)(DAPI 염색)에서는, c-myc 공발현세포(도 6, 하단, 우측의 패널)에 비해 FIR 단독 발현세포에서는 핵이 팽창, 분해되고 있는 것이 확인되었다(도 6, 하단, 좌측의 패널).

또한, 세포자멸의 수는, FIR 단독에 의한 세포자멸은 21.1%로 나타나며, c-myc 발현 플라스미드와 함께 형질전이시킨 경우는 4.2%로 대폭 감소하였다(도 7).

또한, c-myc 플라스미드를 FIR 플라스미드와 여러가지 비율로 함께 형질전이시킨 경우의 세포자멸의 수를 조사한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 이 결과는 FIR에 의한 세포자멸 유도가 c-Myc 억제를 위해 일어나는 것을 나타내고 있다.

표 1

도입 플라스미드
pcDNA3.1-FIR(ng) pcDNA3.1-c-myc(ng) pcDNA3.1벡터(ng)	600 0 0	600 0 60	600 10 50	600 20 40	600 50 10	600 60 0	0 60 0
세포 10,000개당 세포자멸의 비율(%)	17.3	21.1	4.2	5.6	6.7	7.0	7.5

실시예 6: 종양 및 정상조직에서의 FIR 단백질, FIR mRNA의 해석

(1) 방법

(1-1) 단백질 추출 및 임뮤노블러팅

모든 단백질 용해물은 상술한 페어샘플(matched sample)에 의해 이하와 같이 조제하였다: 동결조직시료를 Polytron homogenizer(Kinematica, Switzerland)를 사용해서 용해용 완충용액[7M 우레아, 2M 티오우레아, 2% 3-[3-Cholamidopropyl) dimethylammonio-] 1-propanesulfate(CHAPS), 0.1M 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT), 2% IPG 완충용액(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK), 40mM Tris]로 용해하고, 4℃로 1시간 원심분리하였다(100,000×g). 상등액의 단백질량을 단백질 분석(Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 측정하였다. 단백질은 8%의 아크릴아미드겔로 전기영동하고, tank transfer appratus(Bio-Rad, Hercules, CA) 내의 불화 폴리비닐리덴막(polyvinylidene fluoride membrane, Millpore, Bedford, MA)으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유(skim milk) PBS 용액으로 1시간 차단시켰다. 각각 차단용 완충용액(blocking buffer)으로 1,000배, 500배로 희석한 토끼 항-FIR 다클론항체(항체생산의 가능성을 높이기 위해 2개의 합성펩티드: GDKWKPPQGTDSIKME(30 내지 45)와 EVYDQERFDNSDLSA(528 내지 542)를 동시에 면역시켜 조제한 것) 및 염소 항-β-액틴(actin) 다클론항체(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)를 차단용 완충용액으로 각각 1,000배, 500배로 희석한 것을 1차 항체로 사용하였다. 3,000배로 희석한 염소 항-토끼 IgG 호스래디시페록시다제 결합체(horseradish peroxidase conjugate)(HRP)(Jackson, West Grove, PA) 및 500배로 희석한 토끼 항-염소 IgG HRP(Cappel, West Chester, PA)를 2차 항체로 사용하였다. 막 위의 항원을 ECL^TM detection reagent(Amersham Pharmacia Biotech)로 검출하였다. 로딩(loading) 대조군으로 β-액틴항체를 사용하는 임뮤노블러팅을 수행하였고, 각 밴드의 강도를 NIH Image로 측정하였다.

(1-2) RT-PCR 및 실시간 정량적 PCR

모든 RNA 및 게놈 DNA를 종양 및 비종양 상피조직으로부터 RNeasy^TM Mini Kit 및 DN easy^TMTissues Kit(Qiagen)를 사용해서 추출하였다. cDNA를 모든 RNA로부터 RT-PCR용 1st strand cDNA Synthesis Kit(Roche, Mannheim, Germany)를 사용해서 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 하고, FIR cDNA를 프라이머(앞: 5'-GGCCCCATCAAGAGCATC-3'(서열번호 3), 뒤: 5'-GGGGCTGGGCCAGGGTCAG-3')(서열번호 4) 를 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭하였다. 대조군으로서, GAPDH cDNA를 증폭하였다.

Light Cycler^TM 기기(Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여, FIR cDNA의 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR)을 master mixture[LightCycler^TM-FastStart DNA Master SYBR Green I; FastStart Taq DNA polymerase, dNTP mixture, 완충용액-(LightCycler^TM DNA Master hybridization probes, Roche), 3.0mM MgCl₂, 0.5μM 각 센스 및 안티센스 프라이머, 및 1μl의 cDNA 주형을 LightCycler^TM 캐필러리 내에 포함]로 구성된 20μl 반응혼합물에서 실시하였다. LightCycler^TM 소프트웨어 버젼 3.3(Roche)을 정량적 RT-PCR의 분석을 위해 사용하였다. 프라이머와 LightCycler^TM 조건의 최적화는 Nihon Gene Research Laboratories, Inc.에서 수행하였다.

실시간 정량적 PCR에 의한 FIRcDNA 증폭을 위한 프라이머는 이하와 같다(PCR 산물 사이즈는 275bp):

forward: 5'-GCACCTGGAGTCATCACA-3'(서열번호 5)

reverse: 5'-CGCAGAACCATCACTGTAG-3'(서열번호 6)

이 프라이머들에 의한 PCR 산물을 Light Cycler^TM의 정량 커브를 결정하기 위해 Qiagen PCR product purification kit으로 정제하였다.

FIR 게놈 DNA도 또한 이하의 프라이머를 이용하여 실시간 정량적 PCR에 의해 정량하였다:

forward: 5'-GGAGTCTACAGTGATGGTTC-3'(서열번호 7)

reverse: 5'-TCCTGGTCGTACACTTCA-3'(서열번호 8)

사람의 c-myc cDNA 및 사람의 β-액틴 cDNA에 대한 프라이머는 이하와 같다:

(c-myc용)

forward: 5'-GCCTCAGAGTGCATCGAC-3'(서열번호 9)

reverse: 5'-TCCACAGAAACAACATCG-3'(서열번호 10)

(β-액틴용)

forward: 5'-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3'(서열번호 11)

reverse: 5'-AATGGTGATGACCTGGCCGT-3'(서열번호 12)

(2) 결과

도 8A에 임뮤노블러팅 결과를 나타내었다. 각 밴드의 강도를 NIH Image로 측정하고, FIR 단백질 수준의 (T) 및 (N)간의 β-액틴에 대한 상대평균치를 측정하였다(도면의 하부). Dukes stage를 도 8의 상부에 부기(付記)하였다. FIR 수준은 의외로 대부분의 대장암 조직에서 대응하는 비종양 상피와 비교해서 증가하고 있다(도 8A).

(T) 및 (N)의 페어샘플에서 조제한 모든 RNA에 대해서 RT-PCR을 수행한 결과를 도 8B에 나타내었다. (T)에서의 FIR mRNA는 (N)의 FIR mRNA보다 일례(케이스번 호 5)를 빼고 높았다. 또한, GAPDH mRNA 수준도 내부대조군으로 나타내었다.

실시간 정량적 PCR에 의해 검출된 (T) 및 (N)의 FIR mRNA 발현수준의 히스토그램을 도 8C에 나타내었다. (T)에서의 FIR mRNA는 (N)의 FIR mRNA보다 유의하게 높았다(t-test에서는 p＜0.0056; Wilcoxon test에서는 p＜0.0008).

또한, 각 대장암 조직에서의 FIR과 c-myc mRNA의 (T)/(N) 발현비는 유의하게 상관하고 있다(도 8D). FIR 발현수준의 평균은 c-myc 발현수준의 평균과 현저하게 관련되어 있으며, Y=0.72+0.22X(Y: FIR 발현비(T/N), X: c-myc 발현비(T/N))로 나타났다. 상관계수는 0.70이며, p 수치는 0.00019이다.

상기 결과에 따라, 대장암에서의 c-Myc의 탈제어는 FIR의 하향조절(downregulation)에 의한 것이 아니고, FIR 기능의 손상에 의한 가능성이 높다고 할 수 있었다. 반대로 말하면, FIR은 c-Myc 증가와 상관된 대장암에서 상향조절(upregulation)되고 있다고 여겨졌다.

실시예 7: FIR의 아미노 말단변이의 검출 및 해석

(1) 방법

FIR의 아미노 말단영역을 이하의 프라이머를 이용해서 PCR에 의해 증폭되었다.

forward(앞): 5'-AGACAGCGGAAGGAGCAAGAGTGG-3'(서열번호 13)

reverse(뒤): 5'-CTGTGCAGCTTCGGGGACCTCATA-3'(서열번호 14)

FIR 아미노 말단영역(NTD)의 PCR 산물을 1% 아가로스겔(agarose gel)에 얹고, pGEM^TM-T Easy vector system(Promega, WI)의 클로닝 전에 Gel Extraction Kit^TM(Qiagen)에 의해 정제되고, DNA 서열결정하였다. 직접적인 DNA 서열은 적어도 4개의 다른 프라이머에서(앞 방향에서 2개, 뒷 방향에서 2개) 확인하였다. 변이가 검출된 경우, DNA 서열결정을 앞, 뒤 두 방향에서 적어도 총 8회 수행하였다. 아울러, pGEM^TM-T Easy 벡터에 클론화한 FIR의 NTD에 변이가 있는 경우, RT-PCR 산물을 직접 서열결정해서 그 정확성을 확인하였다.

(2) 결과

대장암 조직으로부터 분리된 전장 FIRcDNA를 서열결정하였는 바, 놀라게도 FIR의 아미노 말단(위치 1 내지 156의 아미노산)에서 적어도 1개의 변이를 포함하고 있는 예가 몇 가지 확인되었다.

완전장 FIR cDNA(HA-FIR), 및 상기 변이체 중에 2개의 예시, 28T-FIR 변이체(코딩 55에서 G 결손(GGG 내지 GG_)을 가지고, 코딩 59에서 정지하는 변이체)와 118T-FIR 변이체(4개의 점변이(point mutation)를 가지고, 그 중, 코딩 90의 변이는 아미노산 치환변이(His(CGC) 내지 Arg(CAC))를 가지는 변이체) cDNA 클론을 pcDNA3.1 플라스미드에 각각 클로닝하고, Hela 세포에 도입해서 c-Myc 억제활성과 세포자멸 도입에 대해서 조사한 결과를 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다.

FIR-야생형, 118T-FIR 변이체, 28T-FIR 변이체의 발현을 적색으로 염색하였 다(도 9, 상단의 패널). FIR-야생형, 118T-FIR 변이체는 모든 세포에서 발현하고 있는 것으로 나타나고, 28T-FIR 변이체는 핵 내에만 모여 있다. c-Myc를 녹색으로 염색하고(도 9, 중단의 패널), DNA를 DAPI III에서 대비염색하였다(도 9, 하단의 패널). 118T-FIR 변이체 및 28T-FIR 변이체는 둘다 FIR-야생형에 비해 c-Myc 억제활성이 감소하고 있음을 알 수 있다.

또한, 118T-FIR 변이체 및 28T-FIR 변이체는 둘다 세포자멸 유도가 손상되고 있음을 알 수 있다(도 10).

이상으로, 사람의 대장암 조직에서 FIR은 그 아미노 말단영역에서 변이가 생기고 있고, 이 변이가 FIR이 가지는 c-Myc의 억제와 세포자멸 유도의 기능을 손상시키는 원인이 되고 있는 것이 시사되었다.

실시예 8: FIR 아데노바이러스 벡터에 의한 감염실험

FIR 아데노바이러스 벡터(1.01×10¹⁰ifu/ml)를 작성하고, 자궁경부암(HeLa), 식도암(T.Tn)의 각 세포주에 감염시켜 세포증식억제를 MTT 분석에 의해 정량화하였다. 대조군으로 β-갈락토시다제(gallctosidase) 유전자를 발현시키고, FIR 아데노바이러스 벡터와 비교하였다. 세포 수를 50%로 감소시키는 FIR 아데노바이러스 벡터의 MOI를 측정하였는 바, HeLa 세포에서는 191.4(532.8), T.Tn 세포에서는 615.1(1410.6)이었다(괄호 안은 β-갈락토시다제 유전자의 MOI). 도 11에 HeLa 세 포 및 T.Tn 세포의 생존율을 MTT 분석에 의해 측정한 그래프를 나타내었다. c-Myc를 고발현하는 이 암세포들에서 FIR 아데노바이러스 벡터의 항 종양효과가 확인되었다.

또한, FIR 아데노바이러스 벡터 감염 후의 대장암(SW480, DLD1), 자궁경부암(HeLa), 식도암(T.Tn)의 각 암세포주에서의 핵 내 및 세포질 내의 FIR 단백질 발현을 임뮤노블러팅에 의해 분석한 결과를 도 12에 나타내었다. 대장암(SW480, DLD1) 세포, 식도암(T.Tn) 세포에서 FIR 아데노바이러스 벡터의 감염효율에 차이가 인정되었다. T.Tn 세포에서는 FIR 아데노바이러스 벡터의 감염효율이 낮음(단백질 발현량이 낮음)에도 불구하고, 살세포(cell-killing) 효과는 높았다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고해서 본 명세서에 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 의하면, 암치료에 새로운 길을 여는 c-myc 유전자를 표적으로서 세포자멸을 안정적이고도 확실하게 유도하기 위한 새로운 수단이 제공된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

1. 서열목록의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 구성된 단백질을 유효성분으로 함유하는 악성종양 치료제.
2. 삭제
3. 서열목록의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 구성된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 악성종양 치료제.
4. 제 3항에 있어서,

   서열목록의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 구성된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 하기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는

   (a) 서열목록의 서열번호 1로 나타내어지는 폴리뉴클레오티드;

   (b) 서열목록의 서열번호 1로 나타내어지는 폴리뉴클레오티드와 상보적인 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하면서, 세포자멸 유도활성을 가지는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드

   악성종양 치료제.
5. 제 1항에 있어서,

   세포 내에 도입가능한, 상기 단백질을 약리학적으로 허용되는 담체용액에 혼합하여 제제화한 형태를 가지고 있는 것을 특징으로 하는

   악성종양 치료제.
6. 제 3항에 있어서,

   세포내로 도입가능한, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현벡터에 함입시킨 형태를 가지고 있는 것을 특징으로 하는

   악성종양 치료제.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 제 1항에 있어서,

    세포 내에 도입가능한, 상기 단백질의 N 말단측에 세포막 통과 펩티드를 연결시킨 융합 폴리펩티드의 형태를 가지고 있는 것을 특징으로 하는

    악성종양 치료제.

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