WO2004018518A1

WO2004018518A1 - ヒト固形癌抗原ペプチドとこれをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの利用

Info

Publication number: WO2004018518A1
Application number: PCT/JP2003/005046
Authority: WO
Inventors: Hideaki Shimada; Takaki Hiwasa; Takeshi Tomonaga; Kazuyuki Matsushita; Fumio Nomura; Masaki Takiguchi; Takenori Ochiai
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2003-04-21
Publication date: 2004-03-04
Also published as: AU2003235316A1; WO2004018679A1; JPWO2004018679A1

Abstract

この出願の発明は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17および19の各塩基配列からなるポリヌクレオチドが発現するヒト固形癌抗原ペプチドと、被験者の血清中に、前記の抗原ペプチドと結合する抗体が存在するか否かを試験する固形癌診断方法を提供する。またこの出願の発明は、前記の抗原ペプチドと結合する抗体と、この抗体と結合する抗原ペプチドが被験者の生体試料中に存在するか否か試験する固形癌診断方法を提供する。

Description

明細書ヒト固形癌抗原ペプチドとこれをコードするポリヌクレオチド

並びにそれらの利用

^J 技術分野この出願の発明は、ヒト固形癌の抗原ペプチドと、このペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらを用いた固形癌診断方法おょぴ固形癌治療方法に関するものである。

背景技術食道癌、胃癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頸部癌、骨 *軟部肉腫、尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、卵管癌等の固形癌はいずれも悪性の腫瘍であり、特に進行性の固形癌は治療が困難であり、多くの場合に致命的となる。従って、固形癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。従来、固形癌の診断には、 a; -fetoprotein、 CEA、 SCC-Ag _¾ CA19-9、 CYFR21- 1 等の癌組織特異的血清マーカ一による診断、並びに治療経過の診断が行われている。この方法は大がかりな設備を必要とせず、被験者への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験者に対しても広範囲に実施することが可能である。従来の腫瘍マーカーは、進行癌を中心として陽性率は 15- 30%程度である。そこで、複数の腫瘍マーカ一を併用することによって、偽陰性率を下げるェ夫がされている。例えば、 CEA単独の陽性率は 16%、 SCC-Ag単独の陽性率は 18%であるが、これらを併用することによって、陽性率は 26%になる。しかしながら、早期癌はもとより、進行癌であっても過半数の症例では、全ての腫瘍マ —力一が陰性であることによって、.診断や治療に支障をきたしているのが現状である。一方、固形癌の治療方法としては、癌組織の外科的な切除や全身性の抗癌剤投与等が行われている。しかしながら、前記のとおり、進行性に移行した固形癌の場合にはこれらの治療法も効果は少なく、また早期に発見した場合であっても、これらの治療法は患者の身体的負担がきわめて大きいという問題を有している。なお、抗原タンパク質マーカ一を用いた分子生物学的診断方法としては、例えば特開平 7-51065号公報、再表 00/060073号公報、特表 2000-51 1536号公報等に記載された発明も知られている。また、担癌患者の腫瘍細胞の _mRNA から作製したタンパク質を患者の自己血清でスクリーニングする SEREX 法、 serological identification of antigens by recombinant expression cloning) 力 S報告され (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 1 1810- 1 1813, 1995、米国特許 No. 5698396号）、悪性黒色腫、腎癌、食道癌、大腸癌、肺癌等において IgG 抗体が認識する癌抗原を、上記 SEREX 法により単離した報告もなされてレる（Int. J. Cancer 72 : 965-971 , 1997、 Cancer Res. 58: 1034- 1041， 1998、 Int. J. Cancer 29:652-658, 1998、 Int. J. Oncol. 14:703-708， 1999, Cancer Res. 56:4766-4772, 1996、 Hum. Mol. Genet 6 :33-39 , 1997) 。また、特開 2001-33378.2号公報には、 SEREX法によって特定した悪性黒色腫抗原タンパク質とそれをコードする DNA配列、並びにこれらを使用した悪性黒色腫の診断方法が開示されている。前記のとおり、固形癌の早期診断のための方法として、癌組織特異的な抗原夕ンパク質マ一カーを用いた分子生物学的診断方法の有効性が指摘されており、そのための新しい抗原夕ンパク質マーカーも幾つか提案されている。しかしながら. その診断精度をさらに向上させるためには、抗原性の高いタンパク質マーカーをより多く準備し、それらを組合せて使用することが不可欠である。また、それらの抗原タンパク質マーカーは固形癌組織で優性に発現するため、癌組織のみを標的とする治療法への応用も期待される。この出願の発明は、'以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、固形癌の診断と治療に有効な新規抗原べプチドを提供することを課題としている。またこの出願の発明は、前記の抗原ペプチドをコードする遺伝子材料と、抗原ぺプチドに対する抗体を提供することを課題としている。さらにこの出願の発明は、前記のペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体等を用いた固形癌診断方法、並びに固形癌治療方法を提供することを課題としている

発明の開示この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（1)から（18)の発明を提供する。

(1) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17 および 19 の各塩基配列を有するポリヌクレオチドが発現するヒト固形癌抗原べプチド。

(2) 前記発明（1)の抗原べプチドをコードするポリヌクレオチド。

(3) 前記発明（2)のポリヌクレオチドの発現制御領域を構成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。

(4) 前記発明（1)の抗原ペプチドと結合する抗体。

(5) 被験者の血清中に、前記発明（1)の抗原ペプチドのそれぞれと結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が 1 種類以上存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト JP2003/005046

4 固形癌診断方法。 (6) 1 種類以上の抗原ペプチドを固定化したプレートまたはメンブレン上において被験者血清の抗体と抗原べプチドとの結合を試験する前記発明 (5)の診断方法。

(7) 被験者の生体試料に、前記発明 (4)の抗体のそれぞれと結合する抗原べプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原ペプチドが 1 種類以上存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌診断方法。

(8) 1'種類以上の抗体を固定化したプレートまたはメンブレン上において、抗体と抗原べプチドの結合を試験する前記発明 (7)の診断方法。 (9) 被験者の生体試料における前記発明 (2)のポリヌクレオチドのそれぞれの存在量を試験し、 1 以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徵とするヒト固形癌診断方法。 ( 10) 少なくとも以下の要素：

(a) 前記発明（1 )の抗原ペプチドの 1種類以上；および

(b) 血清中抗体に特異的に結合する標識化抗体、

からなることを特徴とする固形癌診断キット。

( 1 1) 少なくとも以下の要素：

(a) 前記発明（1)の抗原ペプチドの 1 種類以上を固定化したプレートまたはメンブレン；および

(b) 血清中抗体に特異的に結合する標識化抗体、

からなることを特徴とする固形癌診断キット。 ( 12) 少なくとも、前記発明 (4)の抗体および/またはその標識化抗体の 1 種類以上を含むことを特徴とする固形癌診断キット。

( 13) 少なくとも以下の要素：

(a) 前記発明 (4)の抗体の 1種類以上；および

(b) 前記 (a)の抗体を標識した標識化抗体、

からなることを特徴とする固形癌診断キット。

( 14) 少なくとも以下の要素：

(a) 前記発明 (4)の抗体の 1 種類以上を固定化したプレー卜またはメンブレン；および

(b) 前記 (a)の抗体を標識した標識化抗体、

からなることを特徴とする固形癌診断キット。 ( 15) 前記発明（2)のポリヌクレオチドを PCR増幅するためのプライマ一セット。

( 16) 前記発明（3)のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いることを特徴とする固形癌治療方法。 ( 17) 前記発明 (4)の抗体を用いることを特徴とする固形癌治療方法。

( 18) 前記発明（1)の抗原べプチドの発現量を抑制することを特徴とする固形癌治療方法。すなわち、この出願の発明者らは、食道癌、大腸癌、胃癌、乳癌のそれぞれの患者の手術標本の正常部と癌部とにおける発現タンパク質を分析し、表 1 に示した 10種の固形癌特異的な抗原ペプチドを特定した。これらの抗原ペプチドは、配列番号 19 に示したものを除き、いずれも公知のタンパク質であるが、固形癌との関係は知られていない。具体的には、表 1 の抗原ペプチド (A)は、 c-myc遺伝子のプロモ一夕一の 1.5kb 上流に結合する転写因子 FBP ( Far Upstream Binding Protein: EMBO J. 19(5) : 1034- 1044, 2000) と相互作用する転写因子 FIR (FBP Interacting Receptor： Cell 104(3) :343-363, 200 1) として知られているタンパク質であるが、癌との関連性は全く知られていなかった。抗原ペプチド（B)は、動原体タンパク質（centromere-specific protein) の一種である CENP-A (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(9) :3734-3738, 199 1) として知られているタンパク質であるが、この CEMP-A も癌との関連性は全く知られていなかった。抗原ペプチド（C) ~ (J)は SEREX 法によって特定されたものである。抗原ぺプチド（C)は、キイ口ショウジヨウバエゃヒト等に見られるエンドサイト一シスを司る夕ンパク質の 1グループであり、膜貫通性リガンドの multivesicular body 内への蓄積に関与するタンパク葶 HOOK2 である（Genetics 151 (2) :675-684, 1999) 。抗原ペプチド（D)は、 golgi/centrosome に存在し、 cyclic nucleotide phosphodiesterase と相互作用しているタンパク質 myomegarinであり、細胞内の golgi/ centrosome領域への、 cAMPを介した経路の構成要素が局在するためのアンカ一タンパク質として機能することが知られている（Verde, I. et al. J. Biol. Chem. 276: 1 1 189- 1 1 198, 2001 ) 。抗原ペプチド（E)は、中枢神経の発生、発達過程で豊富に発現する makorin ring finger protein(MRFP)ファミリ一の原種 MKRN 1 である（Genomics 66( 1) :76-86, 2000) 。抗原ペプチド（F)は、ヒト成人脳細胞およびヒト胎児脳細胞より調製した 2 種類の cDNA ライブラリ一より同定した 100種類の新規 cDNAの一つがコードするタンパク質であり、その機能は知られていない（Nagase, T. et al. DNA Res. 7:273-281 , 2000) _c 抗原ペプチド（G)は、 2つの Zn フィンガーを含み、タンパク質相互作用、特に細胞骨格の形成、器官形成、エンドサイト一シス等に関与する LIM ドメインタンパク質の一種であり、 PKC の多様なァイソフォームと結合して転写因子の多様化等に関連するとともに、 RET(receptor tyrosine kinase) /PTC2と結合して細胞の有糸分裂誘発活性に不可欠の役割を果たしていることが知られているタン s？ク質 enigmaである（J. Biol. Chem. 271 (22) : 12691 - 12694， 1996) 。抗原ぺプチド（H)は、ほとんどの癌細胞で発現している細胞膜表面糖タンパク質であり、 TROP- 1 とともに癌細胞の増殖を調節すると考えられているタンパク質 P T/JP2003/005046

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TROP-2である（Fornaro, M. et al. Int. J. Cancer 62:610-618, 1995) 。抗原べプチド（I)は、細胞の有糸分裂の進展に重要な役割を果たしていることが知られているタンパク質 mitosinである（Zhu, X. et al. Mol. Cell. Biol. 15:5- 17-5029, 1995) 。抗原ペプチド（J)は、この出願の発明者らが新規に見出した cDNA ( CU-EC- l : Chiba University Esophageal Carcinoma- 1 ) である。この CU-EC- l の発現産物は不明であるが、この出願ではその発現産物である抗原ペプチドは「配列番号 19 に示した塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするペプチド」、または「当該ポリヌクレオチドがハイブリダィズするゲノム DNAが発現するペプチド」と定義する。表 1

この出願の発明は、以上のとおりの固形癌抗原ペプチドと、そのペプチドに対する抗体、それらをコードするポリヌクレオチドを基礎とするものである。なお、この発明において、「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖に β -N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、 GTP、 CTP、 UTP；または dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) 力 S 100個以上結合した分子を言い. 「オリゴヌクレオチド」とは 2-99個連結した分子を言う。また、配列表にそれぞれ示した塩基配列およびアミノ酸配列については、 1以 6

8 上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく 1以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含するものである。さらに、「血清中抗体」とは、固形癌患者の血清中に存在し、発明（1)の抗原ペプチドと結合する抗体 IgG を意味する。また、発明 (4)の「抗体」は、発明（1) の抗原べプチドを免疫原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクロ一ナル抗体を意味する。この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の治療方法等に使用可能な薬剤の調製 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 ; Ausubel, F. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。

図面の簡単な説明図 1 は、抗原ペプチド（A :配列番号 2 ) の癌組織および正常組織における発現を分析したウェスタンプロットの結果である。図 2は、抗原べプチド (A)をコードする遺伝子 mRNAの癌組織および正常組織における発現を分析した RT-PCRの結果である。図 3は、抗原ペプチド（B :配列番号 4 ) の癌組織および正常組織における発 T/JP2003/005046

現を分析したウェスタンプロッ卜の結果である。図 4は、抗原べプチド（B)をコードする遺伝子 mRNAの癌組織および正常組織における発現を分析した RT-PCRの結果である。図 5 は、配列番号 5 に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原べプチド（C：配列番号 6) と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンブロット分析の結果である。図 6 は、配列番号 7 に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原べプチド（D：配列番号 8) と、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンブロット分析の結果である。図 7 は、配列番号 9 に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原べプチド（E：配列番号 10) と、患者血清中の抗体との反応性を示したウェス夕ンプロッ卜分析の結果である。図 8は、配列番号 1 1 に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原べプチド（F：配列番号 12) と、患者血清中の抗体との反応性を示したウェス夕ンブロット分析の結果である。図 9は、配列番号 13に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原べプチド（G：配列番号 14) と、患者血清中の抗体との反応性を示したウェス夕ンプロット分析の結果である。図 10 は、配列番号 15 に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（H：配列番号 16) と、患者血清中の抗体との反応性を示したウェスタンプロット分析の結果である。図 11 は、配列番号 17 に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（I :配列番号 18) と、患者血清中の抗体との反応性を示したウェス夕ンブロット分析の結果である。図 12 は、配列番号 19 に塩基配列を示したポリヌクレオチドが発現する抗原ペプチド（J) と、患者血清中の抗体との反応性を示したウエスタンプロット分析の結果である。

発明を実施するための最良の形態発明（1)の抗原ペプチドは、例えば、発明 (2)のポリヌクレオチドを保有する組換え発現べクタ一からインビトロ転写によって RNA を調製し、これを铸型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでぺプチドを発現できる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞からペプチドを発現させることができる。抗原べプチドをインビト口翻訳で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、 RNA ポリメラ一ゼプロモーターを有するベクタ一に揷入して組換え発現べクタ一を作製し、このベクターを、プロモーターに対応する RNA ポリメラーゼを含むゥサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、抗原ペプチドをインビトロで生産することができる。 RNA ポリメラ一ゼプ口モーターとしては、 τ7、 T3、 SP6 などが例示できる。これらの RNA ポリメラ一ゼプロモ一夕一を含むベクタ一としては、 pKAl、 pCDM8、 pT3/T7 18、 ρΤ7/3 19、 pBluescript IIなどが例示できる。抗原ペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、 DNA クロ一ニング部位，夕一ミネーター等を有するベクタ一にポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換 3 005046

体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしている抗原べプチドを微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発 ¾ベクタ一としては、 pUC 系、 pBluescript II、 pET発現システム、 pGEX発現システムなどが例示できる。抗原ペプチドを、真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（A)付加部位等を有する真核細胞用発現べクタ一に挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、抗原ぺプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、 pKAl、 pCDM8、 pSVK3、 pMSG, pSVL、 pBK-CMV、 pBK-RSV、 EBV べク夕一、 pRS、 pcDNA3、 pMSG、 pYES2 などが例示できる。また、 pIND/V5- His、 pFLAG-CMV-2、 pEGFP-Nl、 pEGFP-Cl などを発現ベクターとして用いれば、 Hisタグ、 FLAGタグ、 mycタグ、 HAタグ、 GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として抗原べプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞 COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞 CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカッメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明の抗原べプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAE デキストラン法など公知の方法を用いることができる。抗原ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的べプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析ゃ溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、 SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、逆相クロマ卜グラフィーなどが挙げられる。なお、以上の方法によって得られる組換え抗原ペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、ダル夕チン- S -トランスフェラーゼ（GST) や緑色蛍光蛋白質（GFP) との融合蛋白質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも第 1発明の抗原べプチドの範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、 N末端メチォニンの脱離、ァセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア？ゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。以上の方法により得られた抗原べプチドは、この発明によって提供される固形癌診断方法の材料として使用される。発明 (2)は、発明（1)の抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNA断片、 RNA 断片）である。具体的には、各ペプチド（タンパク質）をコードするゲノム DNA、ゲノム DNAから転写される mRNA、 mRNAから合成される cDNAである。また、 2本鎖であっても 1本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノム DNAや mRNA、 cDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。またさらに、ゲノム DNAの場合には、その発現制御領域（プロモ一夕一、ェンハンサ一、サプレッサー領域）をも含む。これらのポリヌクレオチドは、それぞれ公知の方法によって容易に取得することができる。例えば、 cDNAの場合には、公知の方法（Mol. Cell Biol. 2, 161- 170, 1982； J. Gene 25， 263-269, 1983； Gene, 150， 243-250, 1994) を用いて cDNA を合成し、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17、および 19 のそれぞれの塩基配列に基づいて作製したプローブ DNA を用いて、それぞれの cDNA を単離する方法によって取得することができる。得られた cDNA は、例えば、 PCR (Polymerase Chain Reaction) 法、 NASBN (Nucleic acid sequence based amplification ) 法、 TMA ( Transcription-mediated amplification) 法および SDA ( Strand Displacement Amplification) 法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、この発明によつて提供されるプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離した mRNA を铸型とする RT-PCR法によっても必要量の各 cDNAを得ることができる。またさらに、このポリヌクレオチドには、その一部連続配列からなるオリゴヌクレオチドも含まれる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば前記のポリヌクレオチド（cDNA)を適当な制限酵素で切断することによつても得ることができる。あるいは、 Carruthers ( 1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:41 1 -418; Adams ( 1983 ) J. Am. Chem. Soc. 105:661 ; Belo sov ( 1997 ) Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel ( 1995 ) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers ( 1994 ) Biochemistry 33 :7886-7896; Narang ( 1979 ) Meth. Enzymol. 68:90; Brown ( 1979 ) Meth. Enzymol. 68 : 109 ; Beaucage ( 1981) Tetra. Lett. 22: 1859; 米国特許第 4,458,066号に記載されているような周知の化学合成技術により、 in vitroにおいて合成することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば発明（1)のポリヌクレオチドを単離するためのプローブとして使用することができる。従って、このオリゴヌクレオチドは、標識物質によって標識化されたものも含まれる。標識は、ラジォアイソトープ（RI) 法または非 RI 法によって行うことができるが、非 RI 法を用いることが好ましい。非 RI 法としては、蛍光標識法、ピオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シァニン色素（例えば、 Cy Dye TMシリーズの Cy3、 Cy5 等）、ローダミン 6G 試薬、 N-ァセトキシ - N2-ァセチルァミノフルオレン (AAF) 、 AAIF (AAFのヨウ素誘導体）などを使用することができる。発明 (3)は、前記発明 (2)のポリヌクレオチド（特にゲノム DNA) の発現制御領域を構成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。このようなォリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えば、公知のヒトゲノムデータベースを検索するなどの方法によって取得することができる。この発明 (3)のォリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、例えばこの発明の固形癌治療方法に使用することができる。発明（4)の抗体はポリクロ一ナル抗体またはモノクロ一ナル抗体であり、それ 2003/005046

14 ぞれ発明（1)の抗原べプチドのェピト一プに結合することができる全体分子、おょぴ Fab、 F(ab')₂、 Fv 断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の塲合には、抗原ペプチドやその一部断片を免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現べク夕一を注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラッ卜、ゥサギ、ャギ、ニヮトリなどが用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作製法（「単クロ一ン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、 1990 年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, tmrd edition, Academic Press, 199oノ l従作製することができる。またこの発明 (4)の抗体には、標識物質によって標識化された抗体も含まれる。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、 turnover number が大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常の EIA に用いられる酵素、例えば、ペルォキシダーゼ、 /3—ガラクトシダ一ゼ、アルカリフォスファタ一ゼ、グルコースォキシダーゼ、アセチルコリンエステラ一ゼ、グルコース— 6—リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によつて行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルォキシダ一ゼを使用する場合には， 3, 3'，5, 5'—テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファタ一ゼを用いる場合には、パラニトロフエノール等を用いることができる。放射性同位体としては、 i²⁵ Iや 3 H等の通常の RIA で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルォレツセンスイソチオシァネート ( FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネート（TRITC) 等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。さらにまた、この発明の標識化抗体には、マンガンや鉄等の金属を結合させたものも含まれる。このような金属結合抗体を体内に投与し、 MRI 等によって金属を測定することによって、抗体が結合した抗原べプチドを産生する癌細胞の存在を検出することができる。発明 (5)のヒト固形癌診断方法は、被験者の血清中に、前記発明（1)の抗原ぺプチドのそれぞれと結合する抗体が 1 種類以上存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験者を固形癌患者または固形癌八ィリスク者と判定する。すなわち、発明（1)の各抗原ペプチドは、固形癌患者の血清中の抗体（I_gG) と結合するペプチドであるから、被験者の血清と反応させ、これらの抗原ペプチドと結合する抗体を含む血清を、固形癌患者またはそのハイリスク患者の血清として判定することができる。なおその際に、 2種類以上、好ましくは 5種類以上、さらに好ましくは 10種類の抗原ペプチドについて血清中抗体との結合を判定する。またさらに、すでに知られている他の固形癌マーカーを併用することもできる。具体的な診断は、例えば抗原ペプチドに被験者血清を接触させ、抗原ペプチドと被験者血清中の IgG 抗体とを液相中において反応させる。さらに血清中の IgG抗体と特異的に結合する標識化 IgG抗体を反応させて、標識化 IgG抗体のシグナルを検出すればよい。標識化 IgG 抗体の標識物質は、前記の標識化抗体において例示したような酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレ一シヨンカウンタ一等により測定する。また、蛍光色素を用いる塲合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。シグナルの検出は、例えば、ウェスタンプロット分析を採用することができる。あるいは、抗原ペプチド +血清中抗体 +標識化 IgG 抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマ卜法、固相法等）によって分離し、標識化 IgG 抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。なお、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（10)の診断キットが提供される。発明 (5)の診断方法はまた、抗原ペプチドの 1種類以上をプレートまたはメンプレン上に固定化し、この基板上において被験者血清の抗体との結合を試験する方法（発明 (6) ) として実施することもできる。抗原ペプチドを基板上に固定化することによって、未結合の標識化結合分子を容易に除去することができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明 ( 11)の診断キットが提供される。また特に、数十種類の抗原ペプチドを固定化したメンプレンを用いるプロテインアレイ法では、 0.01ml 程度の被験者血清を用いて多種類の抗体の発現を短時間で解析することができる。この出願の発明 (7)の診断方法は、被験者の生体試料中に、前記発明 (4)の抗体、またはその標識化抗体と結合する抗原ペプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原べプチドが存在する被験者を固形癌患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体または標識化抗体は、大腸癌細胞で発現している抗原べプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原べプチドを含む生体試料を、固形癌患者またはそのハイリスク患者の試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは 2 種類以上、好ましくは 5種類以上、さらに好ましくは 10種類の抗体について試料中の抗原べプチドとの結合を判定する。また、生体試料としては、血液や血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。この発明（7)の診断方法における一つの態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、発明 (4)の標識化抗体と生体試料とを接触させて標識化抗体と抗原べプチドを結合させ、この結合体を前記発明（5) と同様の方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（12)の診断キットが提供される。 5046

1 7

液相系での診断の別の方法は、発明 (4)の抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体に標識化抗体（二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体 +抗原ぺプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよレこのような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をピオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、 Fc 領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクロ一ナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は前記発明 (5)と同様とすることができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（13) の診断キットが提供される。発明 (7)の診断方法における別の態様は、抗体と抗原べプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原ぺプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、発明 (4)の抗体を樹脂プレートまたはメンプレン等に固定化し、この固定化抗体に抗原ペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体 +抗原べプチド結合体に別の標識化抗体を結合させて、この標識化抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、「ELISA (enzvme linked immunosorbent assay) 」として仏く用いられている方法である。 2週類の抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、いずれか一方をポリクロ一ナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は前記発明（5)と同様とすることができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、発明（14)の診断キッ卜が提供される。発明（10)〜（14)の診断キットは、前記発明 (5)〜(8)の診断方法を行うための試薬キットである。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗原ぺプチド、抗体およびまたは標識化抗体を用いることを除き、公知公用のキットに用いられている各要素によって構成することができる。発明 (9)の診断方法は、被験者の生体試料における前記発明 (2)のポリヌクレオチドのそれぞれの存在量を試験し、 1 以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を固形癌患者またはそのハイリスク者と判定する。具体的な判定基準としては、被験者のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれと比較して、 10 %以上、好ましくは 30%以上、さらに好ましくは 70%以上、最も好ましくは 100 %以上である場合である。生体試料としては、便や血液、血液細胞（リンパ球等）を対象とすることができる。ポリヌクレオチドの検出、測定は公知の PCR 法や RT-PCR 法、定量的 RT-PCT 法等によって行うことができ、その場合の PCR は発明（15)のプライマ一セットを用いることができる。 . これらのプライマ一セットは、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17、および 19 の各塩基配列に基づき設計し、合成 ·精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、錡型 DNA との間の特異的なァニ —リングを満足させることを考慮し、 15-40 塩基、望ましくは 15-30 塩基である。ただし、 LA (long accurate) PCRを行う場合には、少なくとも 30塩基が効果的である。センス鎖（5，末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる 1 組あるいは 1対（2本）のプライマ一が互いにァニールしないよう、両プライマ —間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、铸型 DNA との安定な結合を確保するため GC含量を約 50 %にし、プライマー内において GC-richあるいは AT-rich が偏在しないようにする。アニーリング温度は Tm ( melting temperature) に依存するので、特異性の高い PCR 産物を得るため、 Tm 値が 55-65でで互いに近似したプライマーを選定する。また、 PCR におけるプライマー使用の最終濃度が約 0. 1〜約 1 Mになるよう調整する等'を留意すうことも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えば OligoTM [ National Bioscience Inc. (米国）製] 、 GENETYX [ソフトウェア開発 (株）（日本）製] 等を用いることもできる。またさらに、発明 (9)の診断方法は、この発明によって提供されるポリヌクレォチドまたはオリゴヌクレオチドを備えた DNAマイクロアレイによっても実施することができる。マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接ォリゴヌクレオチドを合成する方法（オン ·チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明で使用するマイクロアレイは、このいずれの方法でも作製することができる。オン 'チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、 Fodor, S .P.A. Science 25 1 : 767, 199 1 ) 等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、 Lamture, J.B. et al. Nucl. Acids Res . 22 :2 12 1-2 125 , 1994 ; Guo, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22 : 5456- 5465， 1994) 。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスぺーサ—やクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:49 13, 1996) 。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製. し、電極上にはストレブトアビジンを含むァガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでピオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイプリダイゼーシヨンを可能にする方法も知られている（Sosnowski, R. G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1 1 19- 1 123, 1997) 。このマイクロアレイを使用して固形癌を診断する場合には、例えば被験者の細胞から単離した mRNA を铸型として、 cDNA を合成し、 PCR増幅する。その際に、標識 dNTPを取り込ませて標識 cDNA とする。この標識 cDNA をマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキヤプチャ一プローブ（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）にハイプリダイズした cDNAを検出する。ハイブリダィゼーシヨンは、 96穴もしくは 384穴プラスチックプレートに分注して標識 cDNA 水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、 l〜100nl 程度とすることができる。ハイブリダィゼ一シヨンは、室温〜 70での温度範囲で、 6 ~20 時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダィゼーシヨン終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識 cDNA を除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) を用いることが好ましい。緩衝液としては、クェン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クェン酸緩衝液を用いることが好ましい。発明（16)は、発明 (3)のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いて固形癌を治療する方法である。発明 (3)のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレォチド（以下、「プロモー夕一配列」と記載する）は、固形癌細胞で特異的に発現する遺伝子の発現制御領域であるため、このプロモ一夕一配列に抗癌物質をコ一ドするポリヌクレオチドを連結して治療用遺伝子を作製し、これを遺伝子治療等の方法により体内に投与すれば、治療用遺伝子を癌細胞特異的に発現させることが可能となる。抗癌作用を有する物質あるいは抗癌作用を有する物質の前駆物質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば p53、 herpes simplex virus thymidine kinase、 Interleukin-2、 - 12、 - 17、 - 18、 cy to sine deaminase、 uracil phosphonbosyltransferase 等のコー r 9—る] ia伝子 DNA やその cDNA 等を利用することができる。また、このプロモーター配列は、ァデノウィルスやへルぺスウィルスを癌細胞特異的に増殖させて癌細胞を融解させる治療法に使用することもできる。すなわち、例えばアデノウイルスの E 1A 領域の前にプロモータ一配列を挿入することによって、このアデノウイルスは癌細胞においてのみ特異的に増殖し、癌細胞を融解させる。発明 ( 17)は、前記発明 (4)の抗体を用いて固形癌を治療する方法である。発明 (4)の抗体は、癌細胞で特異的に発現する抗原ペプチドに結合するため、この抗体に公知の抗癌物質や抗癌剤を結合させて患者体内に投与することによって、抗癌物質や抗癌剤を癌細胞特異的に作用させることができる。また、抗体が癌細胞に対する殺傷作用を有するものであれば、抗体の単独投与によっても治療効果を得ることができる。発明（18)は、前記発明（1)の抗原べプチドの発現量を制御することによって固形癌を治療する方法に関するものである。すなわち、発明（1)の抗原ペプチドは癌細胞で特異的に発現しているため、その発現が細胞の癌化の原因となっている可能性が高い。そのため、この抗原ペプチドの発現を抑制すれば、細胞の癌化やその進行に対する治療効果が期待される。具体的には、発明 (2)のポリヌクレオチド（特に mRNA) に対するアンチセンス DNA鎖を用いたアンチセンス療法や、 2本鎖 RNAを用いた RNA干渉（RNAi) 法によってこの治療法を行うことがでぎる。

実施例以下、各抗原べプチドについてその固形癌との関連性を調べた実験結果を示してこの出願の発明についてさらに具体的に説明するが、この発明は以下の例によつて限定されるものではない。

実施例第 1発明の抗原ペプチド FIR (配列番号 2 ) の癌組織および正常組織での発現をウェスタンブロットによって分析した。 ( 1)材料と方法

( 1- 1)抗 FIR抗体

事前に FIR ペプチドのアミノ酸配列（配列番号 2 ) から抗原性、疎水性、反応性、ペプチドの特異性をブラストサーチし、特異的抗原性ペプチドとして以下の 2つのべプチドを Fmoc/t-Bocによる固相法で合成した。

NH -CDKWKPPOGTDSIKME-COOH (配列番号 20)

NH -CEVYDOERFDNSDLSA-COOH (配列番号 21)

なお、下線はそれぞれ配列番号 2の 31-45アミノ酸配列および 528-542アミノ酸配列と一致する。

合成したペプチドは、純度を保証するため HPLC により分析し、質量分析装置により分子量を同定した。

この合成ペプチドを用いて、無菌帝王切開を受けたニュージーランド産 S.P.F 基準（無病原菌）のゥサギを常法により免疫し、血清を抽出し、ァフィ二ティ一精製した抗 FIR抗体を作成した。

( 1-2)ウエスタンブロット分析

患者の了解のもと、大腸癌摘出直後の癌部および非癌部組織のそれぞれから凍結標本を採取し、 -80でに保存した。この凍結標本の適量を、 9.5 M Urea, 2% CHAPS, 1% DTT プロテアーゼインヒビ夕一力クテル溶液中でホモジナイズした後、卓上高速遠心器（ベックマン社）で 100,000g にて遠心し、上清（タンパク質溶液）を抽出し、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を同定した。癌部および非癌部組織から得られたタンパク質それぞれ 50 g を 8% Tris/ Glycine SDS-Polyacrylamide gel にて電気泳動した。泳動されたタンパク質を PVDF 膜にトランスファ一し、前記（1-2)の抗体を用いてウェスタンブロットを行った。

(2)結果

結果は図 1に示したとおりである。 8例の大腸癌患者の癌組織（T) および正常組織（N) を比較したところ、癌組織において FIRタンパク質の特異的発現が確認された。実施例 2 抗原ペプチド FIR をコードする遺伝子の転写産物（mRNA) の癌組織および正常組織での転写を RT-PCRによって分析した。

( 1)材料と方法

大腸癌摘出直後の癌部および非癌部組織のそれぞれから採取した凍結標本から、 RNeasy Mini Kit (Qiagen社）を用いて mRNAを抽出した。この mRNA (5 i. g/20 l) を、 1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV, cat no. 1 483 188， Roche社）により cDNAに変換し、これを PCR増幅した。

PGRに使用したプライマ一セットは以下のとおりである。

• フォワードプライマ一： 5'-ggccccatcaagagcatc-3' (配列番号 22)

• リノ一スプライマ— ： 5'-ggggctgggccagggtcag-3' (配列番号 23)

PCR条件は以下のとおりである。

• 95°C / 10分間

• (94で/ 1分間； 54で / 1分間； 72で/ 1分間） X 30

• 72で / 7分間

(2)結果

結果は図 2に示したとおりである。 8例の大腸癌患者の癌組織（T) および正常組織（N) からの FIR mRNA の転写を比較したところ、癌組織細胞において FIR mRNAの特異的発現が確認された。

実施例 3 抗原ペプチド CENP-A (配列番号 4 ) の癌組織および正常組織での発現をゥエスタンブロットによって分析した。 (1)材料と方法

(1- 1)被検組織

市販の抗セントロメァ抗体 [Human ANA Centromere Autoantibody： The Binding Site 社（英国）製] を用いたことを除き、実施例 1と同様の方法により、ウェスタンブロット分析を行った。

(2)結果

結果は図 3に示したとおりである。 1 1 例の大腸癌患者の癌組織（T) および正常組織（N) を比較したところ、癌組織において CENP-A タンパク質の特異的発現が確認された。

実施例 4 抗原ペプチド CENP-A をコードする遺伝子の転写産物（mRNA) の癌組織および正常組織での転写を RT-PCRによって分析した。

( 1)材料と方法

以下のプライマーセットを使用したことを除き、実施例 2と同様の方法により RT-PCRを行った。

• フォワードプライマ一： 5'-taggcgcttcctcccatcaa-3' (配列番号 24) • リバ一スプライマ一： 5，-gccgagtccctcctcaag-3，（配列番号 25) (2)結果

結果は図 4に示したとおりである。 1 1 例の大寢癌患者の癌組織（T) および正常組織（N) からの CENP-A mRNA の転写を比較したところ、癌組織細胞において CENP-A mRNAの特異的発現が確認された。実施例 5

SEREX法により、固形癌抗原ペプチドを同定した。 1 . cDNAライブラリーの作製

ヒト食道癌由来の培養細胞 T.Tn 株は、カナマイシン（100 g/ ml)を添加した 10 %のゥシ胎児血清を含む DMEM 培地で培養した。この細胞株 T.Tn から guanidinium-thiocyanate-pnenoi-chloroiorm 抽出法により卜一タレ RNA(250 g)を単離し、 oligo-dT ( Oligotex-dT30 super, TAKARA社）を用いたポリ（A)セレクションを 2 回行い、 mRNA を精製した。この得られた mRNA ( 5.7 μ- g) を用いて T.Tn 株の cDNA ライブラリ一を構築した。一本鎖 cDNA は、 Xho I リンカープライマーと 5-methyl dCTPを用いて合成した。この一本鎖 cDNAから T4 DNA polymeraseにより平滑末端を有する二本鎖 cDNAを合成し、この二本鎖 cDNAの両端に制限酵素サイト（Eco RI/ λ ΖΑΡ Π) を含むリンカ一を付加した。 cDNA フラグメントをパクテリオファージ（ Stratagene 社）に挿入し、 1 .8 X 10⁶個のクローンからなる cDNA ライブラリ一を作成した。

2 · cDNAライブラリーのスクリーニング

上記で作製した T.Tn株の cDNAライブラリ一の各ファ一ジベクタ一を大腸菌 XL l -Blueに感染させ、 NZYァガ口一スプレート上でプラークを形成させた。各感染大腸菌に対して、 l OmM の IPTG処理により発現誘導し、各 cDNAがコ一ドするペプチドを発現させた。このペプチドをニトロセルロース膜 ( NitroBind: Osmonics社）に転写し、 TBS-T [0.5 %の Tween20を含む TBS ( 20mMの Tris-HCl、 150mMの NaCl； pH7.5) ] で膜を洗浄して吸着したバクテリオファージを除去した後、 1 %のアルブミンを含む TBS-T にて非特異反応を抑制した。このフィルターを 2000 倍希釈した食道癌患者（16 名）の血清と室温でそれぞれ 2時間反応させた。

血清は、患者から単離した後、？ 80でで保存し、使用直前に 1 重量％のアルブミンを含む TBS-T溶液で 500倍に最終的に希釈したものを用いた。この希釈した血清を、大腸菌のライセートと 1： 5 の割合で混合し、 4 :で 8時間放置後, 15,000 回転にて 20 分間遠心し、上清を回収したものを用いた。また、必要に応じて無処理の血清を 2000倍に希釈して用いた。

血清と、上記の発現ペプチドをブロットしたニトロセルロース膜とを室温で 10〜20 時間反応させて血清中の抗体が反応したペプチドを特定した。すなわち、二次抗体として 5000 倍に希釈したアルカリフォスファタ一ゼ標識抗ヒト IgG- F(ab')₂ャギ抗体（Jachson 社）を用いて反応させ、 Nitroblue tetrazolium (Wako社）と 5-Bromo-4-Chloro-3-indolylphospliate (Wako社）を用いた酵素発色反応により標識シグナルを検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニ —をァガロースプレート上から採取し、 SM 緩衝液（lOOmM の NaCl、 lOmM の MgS0₄、 50mMの Tris-HCl； pH7.5) に溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、患者血清中の IgG と反応するファージクローンをスクリーニングし、 16名の患者血清中の IgG と反応するファージクローンをスクリーニングして、陽性クローン 165個を単離した。

3 . 新規抗原の特定

得られた 165個の陽性クローンから、 PCR法によりインサート DNA を増幅し、得られた PCR 産物を、 Big Dye DNA Sequencing Kit (ABI 社）と ABI Prism (Perkin Elmer 社）とを用いて配列決定した。既存デ一夕べ一スを用いて検索した結果、既存遺伝子由来の抗原が 163 種、未知遺伝子由来の抗原が 2 種類であった。既知遺伝子の中には、癌遺伝子関連遺伝子が 3種、および癌抑制遺伝子関連遺伝子 2種が含まれていた。また、 keratin 19のように、既に扁平上皮癌の腫瘍マーカーとして確立しているものや、 BLCAP、 BST2、 E(spl9)など、悪性腫瘍との関連が報告されている遺伝子も含まれていた。

これら、癌閧連遺伝子の発現産物である抗原ペプチドを除き、さらに各種固形癌の患者の血清中抗体と反応する 8種の新規抗原ペプチド（表 1の (C)〜(J)) を特定した。

これら 8種の新規抗原ペプチドをコ一ドする cDNA配列は、それぞれ配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 .15、 17 および 19 の各塩基配列を有している。また、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15および 17の各塩基配列は、それぞれ配列番号 2 4 6 8 10 12 14 16および 18 のアミノ酸配列を有している。

図' 5- 12は、これら 8種の新規抗原べプチドと各患者血清中の抗体との結合反応を調べたウエスタンブロット分析の結果である。この図 5- 12 において、矢印は患者血清中の抗体と特異的に反応したポリペプチドを示す。 IPTG 処理した大腸菌抽出液において検出され、無処理の大腸菌抽出液には検出されないことから導入した cDNA由来のポリべプチドであると確認できる。

4. 固形癌患者血清における抗体陽性率

食道癌患者（50名）から調製した血清に加え、大腸癌患者（16名）、胃癌患者（16名）、乳癌患者（16名）からそれぞれ調製した血清を用い、抗原べプチド（C)〜(J)との結合性を試験した。結果は表 2に示したとおりである。表 2

各種固形癌患者の血清における抗体陽性率（％)

5. 抗原ペプチドの併用効果の確認

この発明の抗原ペプチドの 1 種である myomegalin について、既に使用されている CEA (食道癌に対する陽性率 16%) および SCC-Ag (食道癌に対する陽性率 18%) との併用効果を確認した。食道癌患者（50名）から調製した血清を用いて、各マーカーの組み合わせによる陽性率を試験した。その結果、 myomegalin単独の食道癌血清に対する陽性率は 22%であるが、 CEA と併用した場合は 30% SCC- Agとの併用による陽性率は 32%であった。さらに、 CEA および SCC-Agと myomegalinとを併用した場合の陽性率は 50%と極めて高い結果が得られた。

産業上の利用可能性以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、固形癌の診断用マ一力一として有用な新規抗原ペプチド 10種と、これらを用いた固形癌方法および治療方法が提供される。これによつて、固形癌の早期かつ高精度の診断と治療が可能となる。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 13、 15、 17および 19の各塩基配列を有するポリヌクレオチドが発現するヒト固形癌抗原べプチド。

2. 請求項 1の抗原べプチドをコードするポリヌクレオチド。

3. 請求項 2 のポリヌクレオチドの発現制御領域を構成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド。

4. 請求項 1の抗原ペプチドと結合する抗体。

5. 被験者の血清中に、請求項 1 の抗原ペプチドのそれぞれと結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が 1 種類以上存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒ卜固形癌診断方法。

6. 1 種類以上の抗原ペプチドを固定化したプレートまたはメンブレン上において被験者血清の抗体と抗原ペプチドとの結合を試験する請求項 5 の診断方法。

7. 被験者の生体試料に、請求項 4 の抗体のそれぞれと結合する抗原ペプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原ペプチドが 1 種類以上存在する被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌診断方法。

8. 1 種類以上の抗体を固定化したプレートまたはメンブレン上において、抗体と抗原べプチドの結合を試験する請求項 7の診断方法。

9. 被験者の生体試料における請求項 2 のポリヌクレオチドのそれぞれの存在量を試験し、 1 以上のポリヌクレオチドの存在量が健常者のそれらと比較して多い被験者を固形癌患者または固形癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト固形癌診断方法。

10. 少なくとも以下の要素：

(a) 請求項 1の抗原ペプチドの 1種類以上；および

(b) 血清中抗体に特異的に結合する標識化抗体、

からなることを特徴とする固形癌診断キット。

1 1. 少なくとも以下の要素：

(a) 請求項 1 の抗原ペプチドの 1 種類以上を固定化したプレートまたはメンプレン；および

(b) 血清中抗体に特異的に結合する標識化抗体、

からなることを特徴とする固形癌診断キット。

12. 少なくとも、請求項 4 の抗体およびノまたはその標識化抗体の 1 種類以上を含むことを特徴とする固形癌診断キット。

13. 少なくとも以下の要素：

(a) 請求項 4の抗体の 1種類以上；および

(b) 前記 (a)の抗体を標識した標識化抗体、

からなることを特徴とする固形癌診断キット。

14. 少なくとも以下の要素：

(a) 請求項 4 の抗体の 1 種類以上を固定化したプレートまたはメンブレン；および

(b) 前記 (a)の抗体を標識した標識化抗体、 ―

からなることを特徴とする固形癌診断キット。

15. 請求項 2のポリヌクレオチドを PCR増幅するためのプライマーセット。

16. 請求項 3 のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いることを特徴とする固形癌治療方法。

17. 請求項 4の抗体を用いることを特徴とする固形癌治療方法。

18. W求項 1 の抗原ペプチドの発現量を抑制することを特徴とする固形癌治療方法。