JP3501802B2 - ヒト結腸直腸癌において突然変異を起こしている遺伝子 - Google Patents
ヒト結腸直腸癌において突然変異を起こしている遺伝子Info
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- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は癌の診断学および治療学に関する。さらに具
体的には、本発明は腫瘍組織中の野生型MCC遺伝子の変
更の検出に関する。さらに、MCC遺伝子産物の機能を回
復させるための治療方法に関する。
体的には、本発明は腫瘍組織中の野生型MCC遺伝子の変
更の検出に関する。さらに、MCC遺伝子産物の機能を回
復させるための治療方法に関する。
背景技術
クヌーソン（Knudson）の腫瘍形成モデル（Cancer Re
search,vol.45,p.1482,1985）によれば、全ての正常な
細胞には癌抑制遺伝子が存在し、これらの遺伝子が突然
変異により機能しなくなると新生物発生が起こる。網膜
芽腫および結腸直腸癌のケースにおいてこのモデルに関
する証拠が見出だされている。こうした腫瘍に関与する
抑制遺伝子、RBおよびp53およびDCCは、研究された腫瘍
の多くのケースで欠失あるいは変更されていることが見
出だされた（ハンセン（Hansen）とカベニー（Cavene
e）,Cancer Research,vol.47,pp.5518−5527（1987）；
ベーカー（Baker）ら,Science,vol.244,p.217（198
9）；フィアソン（Fearson）ら,Science,vol.247,p.49
（1990））。
search,vol.45,p.1482,1985）によれば、全ての正常な
細胞には癌抑制遺伝子が存在し、これらの遺伝子が突然
変異により機能しなくなると新生物発生が起こる。網膜
芽腫および結腸直腸癌のケースにおいてこのモデルに関
する証拠が見出だされている。こうした腫瘍に関与する
抑制遺伝子、RBおよびp53およびDCCは、研究された腫瘍
の多くのケースで欠失あるいは変更されていることが見
出だされた（ハンセン（Hansen）とカベニー（Cavene
e）,Cancer Research,vol.47,pp.5518−5527（1987）；
ベーカー（Baker）ら,Science,vol.244,p.217（198
9）；フィアソン（Fearson）ら,Science,vol.247,p.49
（1990））。
腫瘍の原因を完全に理解するためには、腫瘍形成過程
に機能する他の抑制遺伝子の同定が必要であろう。これ
らの抑制遺伝子のうちで顕著なものは5q21に位置すると
予想される遺伝子（群）である。細胞遺伝学的研究（ヘ
レラ（Herrera）ら,Am J.Med.Genet.,vol.25,pg.473（1
986））および遺伝子連鎖の研究（レッパート（Lepper
t）ら,Science,vol.238,pg.1411（1987）；ボドマー（B
odmer）ら,Nature,vol.328,pg.614（1987））によっ
て、この染色体領域には家族性腺腫ポリポシス（FAP）
の原因となる遺伝子が存在することが示されている。FA
Pは常染色体優性遺伝病で、この病気に冒された個体に
は数百から数千もの腺腫ポリープができ、そのうちいく
つかは悪性に進行する。さらに、FAPを有しない患者の
腺腫（フォーゲルシュタイン（Vogelstein）ら,N.Engl.
J.Med.,vol.319,pg.525（1988））および癌腫（フォー
ゲルシュタインら,N.Engl.J.Med.,vol.319,pg.525（198
8）；ソロモン（Solomon）ら,Nature,vol.328,pg.616
（1987）；ササキ（Sasaki）ら,Cancer Research,vol.4
9,pg.4402（1989）；デラッター（Delattre）ら,Lance
t,vol.2,pg.353（1989）；およびアシュトン−リカルド
（Achton−Rickardt）ら,Oncogene,vol.4,pg.1169（198
9））からも、この染色体領域がしばしば欠失してい
る。よって、染色体5q21上の予想される抑制遺伝子は、
散発性および家族性の双方の腫瘍の結腸直腸腫瘍形成の
初期段階に機能していると考えられる。しかしながら、
抑制遺伝子の候補となるものは5q21上には同定されてい
ない。従って染色体領域を研究してこのような遺伝子を
同定し、そのような遺伝子のいづれが腫瘍形成過程に関
わっているかを決定することは、当該技術分野において
必要である。
に機能する他の抑制遺伝子の同定が必要であろう。これ
らの抑制遺伝子のうちで顕著なものは5q21に位置すると
予想される遺伝子（群）である。細胞遺伝学的研究（ヘ
レラ（Herrera）ら,Am J.Med.Genet.,vol.25,pg.473（1
986））および遺伝子連鎖の研究（レッパート（Lepper
t）ら,Science,vol.238,pg.1411（1987）；ボドマー（B
odmer）ら,Nature,vol.328,pg.614（1987））によっ
て、この染色体領域には家族性腺腫ポリポシス（FAP）
の原因となる遺伝子が存在することが示されている。FA
Pは常染色体優性遺伝病で、この病気に冒された個体に
は数百から数千もの腺腫ポリープができ、そのうちいく
つかは悪性に進行する。さらに、FAPを有しない患者の
腺腫（フォーゲルシュタイン（Vogelstein）ら,N.Engl.
J.Med.,vol.319,pg.525（1988））および癌腫（フォー
ゲルシュタインら,N.Engl.J.Med.,vol.319,pg.525（198
8）；ソロモン（Solomon）ら,Nature,vol.328,pg.616
（1987）；ササキ（Sasaki）ら,Cancer Research,vol.4
9,pg.4402（1989）；デラッター（Delattre）ら,Lance
t,vol.2,pg.353（1989）；およびアシュトン−リカルド
（Achton−Rickardt）ら,Oncogene,vol.4,pg.1169（198
9））からも、この染色体領域がしばしば欠失してい
る。よって、染色体5q21上の予想される抑制遺伝子は、
散発性および家族性の双方の腫瘍の結腸直腸腫瘍形成の
初期段階に機能していると考えられる。しかしながら、
抑制遺伝子の候補となるものは5q21上には同定されてい
ない。従って染色体領域を研究してこのような遺伝子を
同定し、そのような遺伝子のいづれが腫瘍形成過程に関
わっているかを決定することは、当該技術分野において
必要である。
発明の概要
本発明の目的は、ヒトの新生物組織を診断し予知する
方法を提供することである。
方法を提供することである。
本発明の別の目的は、野生型MCC遺伝子機能を失って
いる細胞に該機能を付与する方法を提供することであ
る。
いる細胞に該機能を付与する方法を提供することであ
る。
本発明のまた別の目的は、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）によってMCC対立遺伝子のヌクレオチド配列を決定す
るキットを提供することである。
R）によってMCC対立遺伝子のヌクレオチド配列を決定す
るキットを提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ヒトMCC遺伝子の突然変
異を検出するための核酸プローブを提供することであ
る。
異を検出するための核酸プローブを提供することであ
る。
本発明の別の目的は、癌になりやすい遺伝的素因を検
出する方法を提供することである。
出する方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、MCC遺伝子産物をコード
するcDNA分子を提供することである。
するcDNA分子を提供することである。
本発明のまた別の目的は、ヒトMCC蛋白質の調製品を
提供することである。
提供することである。
本発明のこれらおよび他の目的は、下記に記載される
１つまたは複数の態様によって達成される。本発明の一
つの態様では、ヒトから組織を単離し；そして該組織の
野生型MCC遺伝子またはその発現産物の変更を検出し、
その変更をその組織の新生物化の指標とする：ことから
成る、ヒト新生物組織を診断または予知する方法が提供
される。
１つまたは複数の態様によって達成される。本発明の一
つの態様では、ヒトから組織を単離し；そして該組織の
野生型MCC遺伝子またはその発現産物の変更を検出し、
その変更をその組織の新生物化の指標とする：ことから
成る、ヒト新生物組織を診断または予知する方法が提供
される。
本発明の別の態様では、野生型MCC遺伝子機能を失っ
ている細胞に該遺伝子を導入してその細胞内で該野生型
遺伝子を発現させる：ことから成る、MCC遺伝子の突然
変異により野生型MCC遺伝子機能を失っている細胞に該
遺伝子機能を付与する方法が提供される。
ている細胞に該遺伝子を導入してその細胞内で該野生型
遺伝子を発現させる：ことから成る、MCC遺伝子の突然
変異により野生型MCC遺伝子機能を失っている細胞に該
遺伝子機能を付与する方法が提供される。
別の態様では、野生型MCC遺伝子機能を失っている細
胞に、該遺伝子のうち、該細胞の非新生物性増殖に必要
なMCC蛋白質部分をコードする部分を導入してその細胞
内で該部分を発現させる：ことから成る、細胞に野生型
MCC遺伝子機能を付与する方法が提供される。合成ペプ
チド又は薬剤を用いてMCC発現が変更した細胞内でMCCの
機能を模倣することもできる。
胞に、該遺伝子のうち、該細胞の非新生物性増殖に必要
なMCC蛋白質部分をコードする部分を導入してその細胞
内で該部分を発現させる：ことから成る、細胞に野生型
MCC遺伝子機能を付与する方法が提供される。合成ペプ
チド又は薬剤を用いてMCC発現が変更した細胞内でMCCの
機能を模倣することもできる。
また別の態様では、ポリメラーゼ連鎖反応によりMCC
遺伝子のヌクレオチド配列を決定するための、一対の一
本鎖プライマーが提供される。該一対の一本鎖DNAプラ
イマーの配列は染色体5qのバンド21に由来し、該一対の
プライマーはMCC遺伝子のコード配列の合成を可能とす
るものである。
遺伝子のヌクレオチド配列を決定するための、一対の一
本鎖プライマーが提供される。該一対の一本鎖DNAプラ
イマーの配列は染色体5qのバンド21に由来し、該一対の
プライマーはMCC遺伝子のコード配列の合成を可能とす
るものである。
本発明のさらに別の態様では、ヒト野生型MCC遺伝子
のコード配列に相補的な核酸プローブが提供される。こ
のプローブは突然変異MCC遺伝子とミスマッチを形成す
ることができ、該ミスマッチは酵素的若しくは化学的切
断または電気泳動移動度の変化によって検出することが
できる。
のコード配列に相補的な核酸プローブが提供される。こ
のプローブは突然変異MCC遺伝子とミスマッチを形成す
ることができ、該ミスマッチは酵素的若しくは化学的切
断または電気泳動移動度の変化によって検出することが
できる。
本発明の別の態様では、ヒト新生物組織の存在を検出
する方法が提供される。本方法は、ヒトから体の組織サ
ンプルを単離し；該サンプルの野生型MCC遺伝子配列ま
たは野生型MCC発現産物の変更を検出し、該変更をヒト
新生物組織の存在の指標とすることから成る。
する方法が提供される。本方法は、ヒトから体の組織サ
ンプルを単離し；該サンプルの野生型MCC遺伝子配列ま
たは野生型MCC発現産物の変更を検出し、該変更をヒト
新生物組織の存在の指標とすることから成る。
本発明のまた別の態様では、血液および胎児組織から
成るグループから選択されるヒトサンプルを単離し；そ
のサンプルの野生型MCC遺伝子のコード配列またはその
発現産物の変更を検出し、該変更を癌になりやすい遺伝
的素因の指標とする：ことから成る、ヒトの癌になりや
すい遺伝的素因を検出する方法が提供される。
成るグループから選択されるヒトサンプルを単離し；そ
のサンプルの野生型MCC遺伝子のコード配列またはその
発現産物の変更を検出し、該変更を癌になりやすい遺伝
的素因の指標とする：ことから成る、ヒトの癌になりや
すい遺伝的素因を検出する方法が提供される。
さらに別の態様では、MCC遺伝子のコード配列を含むc
DNA分子が提供される。
DNA分子が提供される。
さらにまた別の態様では、他のヒト蛋白質を実質的に
含まないヒトMCC蛋白質の調製品が提供される。その蛋
白質のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示されている。
含まないヒトMCC蛋白質の調製品が提供される。その蛋
白質のアミノ酸配列はSEQ ID NO:2に示されている。
本発明は、今まで未知の遺伝子であったMCC遺伝子
が、実際に、染色体5q21上の突然変異による変更の標的
であること、およびこれらの変更が腫瘍形成過程に関与
しているという情報を当該分野に提供する。この情報に
よって、特定の組織の新生物状態、または個体中の癌に
なりやすい素因を評価するために行われる非常に特異的
な分析が可能となる。
が、実際に、染色体5q21上の突然変異による変更の標的
であること、およびこれらの変更が腫瘍形成過程に関与
しているという情報を当該分野に提供する。この情報に
よって、特定の組織の新生物状態、または個体中の癌に
なりやすい素因を評価するために行われる非常に特異的
な分析が可能となる。
図面の簡単な説明
図１は、体細胞変化を示す腫瘍T14のサザンブロット
分析を示す。レーン１および２は患者T14の正常組織か
ら単離されたDNA5μｇを含む；レーン３および４はT14
結腸癌から単離されたDNA5μｇを含む。レーン１および
３はEcoR Iで切断し；レーン２および４はPst Iで切断
した。パネルＡのサザンブロットはコスミド5.71のサブ
クローン（5.71−３）にハイブリダイズさせた。パネル
Ｂ（３時間感光）およびパネルＣ（20時間感光）は、T1
4腫瘍からクローン化した異常な11kb断片でハイブリダ
イズした同じサザンブロットを示す。短剣符はT14の新
規の変更を示す。右側に示されたサイズマーカーは、Hi
nd IIIで切断されたラムダファージDNAおよびHae IIIで
切断されたファイＸファージDNAを表す。
分析を示す。レーン１および２は患者T14の正常組織か
ら単離されたDNA5μｇを含む；レーン３および４はT14
結腸癌から単離されたDNA5μｇを含む。レーン１および
３はEcoR Iで切断し；レーン２および４はPst Iで切断
した。パネルＡのサザンブロットはコスミド5.71のサブ
クローン（5.71−３）にハイブリダイズさせた。パネル
Ｂ（３時間感光）およびパネルＣ（20時間感光）は、T1
4腫瘍からクローン化した異常な11kb断片でハイブリダ
イズした同じサザンブロットを示す。短剣符はT14の新
規の変更を示す。右側に示されたサイズマーカーは、Hi
nd IIIで切断されたラムダファージDNAおよびHae IIIで
切断されたファイＸファージDNAを表す。
図２は、5.71コスミドから予想されるエクソンの配列
を示す。パネルＡは、5.71−５エクソンおよびそれに対
応するラットのエクソンを示す。パネルＢは5.71−３エ
クソンおよびそれに対応するラットのエクソンを示す。
ラットの配列は、ヒトの配列と異なる部分のみ記してあ
る。小文字はエクソンを挟むイントロンを意味する。PC
Rに用いるプライマーは矢印によって表されている。プ
ライマーP2およびP4は、反対向きで、示した配列とは相
補的配列を有する。
を示す。パネルＡは、5.71−５エクソンおよびそれに対
応するラットのエクソンを示す。パネルＢは5.71−３エ
クソンおよびそれに対応するラットのエクソンを示す。
ラットの配列は、ヒトの配列と異なる部分のみ記してあ
る。小文字はエクソンを挟むイントロンを意味する。PC
Rに用いるプライマーは矢印によって表されている。プ
ライマーP2およびP4は、反対向きで、示した配列とは相
補的配列を有する。
図３は、MCC cDNAの塩基配列および予想されるアミ
ノ酸配列を示す。示された配列は７つのオーバーラップ
したクローンからの合成配列を表す。
ノ酸配列を示す。示された配列は７つのオーバーラップ
したクローンからの合成配列を表す。
図４は、PCR−RNaseプロテクション分析を示す。この
分析法はPCR産物に対して行われ、生じた切断産物を変
性ゲル電気泳動によって分離した。パネルＡは、ヌクレ
オチド2305−2405をコードするエクソンの分析結果を示
す。レーン１、２および３は、いかなる変化も示さない
３つの異なる腫瘍から単離されたDNAについて得られた
結果を示す。レーンＴおよびＮは、それぞれ、患者91の
腫瘍または正常細胞から単離されたDNAについて得られ
た結果を示す。パネルＢは、ヌクレオチド1679−1862を
コードするエクソンの分析結果を示す。レーンＴおよび
Ｎは、それぞれ、患者35の腫瘍または正常細胞から単離
されたDNAについて得られた結果を示す。
分析法はPCR産物に対して行われ、生じた切断産物を変
性ゲル電気泳動によって分離した。パネルＡは、ヌクレ
オチド2305−2405をコードするエクソンの分析結果を示
す。レーン１、２および３は、いかなる変化も示さない
３つの異なる腫瘍から単離されたDNAについて得られた
結果を示す。レーンＴおよびＮは、それぞれ、患者91の
腫瘍または正常細胞から単離されたDNAについて得られ
た結果を示す。パネルＢは、ヌクレオチド1679−1862を
コードするエクソンの分析結果を示す。レーンＴおよび
Ｎは、それぞれ、患者35の腫瘍または正常細胞から単離
されたDNAについて得られた結果を示す。
図５は、MCCと、ヒトm3ムスカリン性アセチルコリン
受容体（mAChR）のＧ蛋白質活性化領域との比較を示
す。配列を結ぶ実線は同一アミノ酸を示し；破線は類似
アミノ酸を示す。ドメインＡは、欠失するとＧ蛋白質の
反応性を変える10アミノ酸領域を表す。ドメインＢは、
mAChR−Ｇ蛋白質共役の特異性を媒介できる９アミノ酸
を表す。
受容体（mAChR）のＧ蛋白質活性化領域との比較を示
す。配列を結ぶ実線は同一アミノ酸を示し；破線は類似
アミノ酸を示す。ドメインＡは、欠失するとＧ蛋白質の
反応性を変える10アミノ酸領域を表す。ドメインＢは、
mAChR−Ｇ蛋白質共役の特異性を媒介できる９アミノ酸
を表す。
発明の詳細な説明
本発明で、染色体5q上の今まで未知の遺伝子（本明細
書中ではMCC（Mutated in Colorectal Cancer）遺伝子
と命名）において、腫瘍形成に関連する変異が生じるこ
とが発見された。あるタイプの癌で染色体5q上の対立遺
伝子の欠失がよく見られることは以前から知られていた
が、こうした欠失の標的遺伝子がMCC遺伝子であること
は知られていなかった。さらに、MCC遺伝子における別
のタイプの突然変異が癌と関連していることも知られて
いなかった。MCC遺伝子の突然変異は、挿入や欠失など
の大きな再編成を含むことがある。点突然変異も観察さ
れている。
書中ではMCC（Mutated in Colorectal Cancer）遺伝子
と命名）において、腫瘍形成に関連する変異が生じるこ
とが発見された。あるタイプの癌で染色体5q上の対立遺
伝子の欠失がよく見られることは以前から知られていた
が、こうした欠失の標的遺伝子がMCC遺伝子であること
は知られていなかった。さらに、MCC遺伝子における別
のタイプの突然変異が癌と関連していることも知られて
いなかった。MCC遺伝子の突然変異は、挿入や欠失など
の大きな再編成を含むことがある。点突然変異も観察さ
れている。
本発明の診断学的および予防学的方法によれば、野生
型遺伝子の変更が検出される。本発明の“野生型遺伝子
の変更”とは、欠失を含めたあらゆる形の突然変異を含
んでいる。変更は、挿入、逆位および欠失などの再編
成、または点突然変異によるものでもよい。欠失は遺伝
子全体または遺伝子の一部のみであってもよい。一方の
対立遺伝子のみが変異していても、新生物化状態の初期
であるとされる。しかし、対立遺伝子の両方が変異した
場合、新生物化状態の後期であるとされる。従ってMCC
突然変異を見出だすことは、診断学的情報および予防学
的情報の両方を提供する。MCC対立遺伝子が欠失してい
ないもの（例えば、姉妹染色体上のMCC遺伝子が、MCC欠
損を持つ染色体上に転座したもの）は、挿入、小さな欠
失および点突然変異などの他の突然変異に対してスクリ
ーニングすることができる。腫瘍組織にみつかる突然変
異の多くが、MCC遺伝子産物の発現を減少させるもので
あろうと考えられている。しかし、機能を失った遺伝子
産物を生じる変異もやはり癌状態を引き起こすであろ
う。点突然変異は、遺伝子のプロモーターなどの制御領
域に生じることもあり、これによりmRNAの発現が消失す
るか、または減少する。点突然変異はまた、適切なRNA
プロセッシングを阻害してMCC遺伝子産物の発現を損な
わせることもある。
型遺伝子の変更が検出される。本発明の“野生型遺伝子
の変更”とは、欠失を含めたあらゆる形の突然変異を含
んでいる。変更は、挿入、逆位および欠失などの再編
成、または点突然変異によるものでもよい。欠失は遺伝
子全体または遺伝子の一部のみであってもよい。一方の
対立遺伝子のみが変異していても、新生物化状態の初期
であるとされる。しかし、対立遺伝子の両方が変異した
場合、新生物化状態の後期であるとされる。従ってMCC
突然変異を見出だすことは、診断学的情報および予防学
的情報の両方を提供する。MCC対立遺伝子が欠失してい
ないもの（例えば、姉妹染色体上のMCC遺伝子が、MCC欠
損を持つ染色体上に転座したもの）は、挿入、小さな欠
失および点突然変異などの他の突然変異に対してスクリ
ーニングすることができる。腫瘍組織にみつかる突然変
異の多くが、MCC遺伝子産物の発現を減少させるもので
あろうと考えられている。しかし、機能を失った遺伝子
産物を生じる変異もやはり癌状態を引き起こすであろ
う。点突然変異は、遺伝子のプロモーターなどの制御領
域に生じることもあり、これによりmRNAの発現が消失す
るか、または減少する。点突然変異はまた、適切なRNA
プロセッシングを阻害してMCC遺伝子産物の発現を損な
わせることもある。
組織中の野生型MCC遺伝子の変更を検出するために
は、周囲の正常な組織を含まない組織を単離することが
有効である。組織調製品の腫瘍細胞を濃縮する方法は当
該技術分野において知られている。例えば、組織はパラ
フィンまたはクリオスタット切片から単離でできる。癌
細胞はフローサイトメトリーによっても正常細胞から分
離できる。腫瘍を他の細胞から分離する他の技術同様、
これらの技術は当該技術分野でよく知られている。腫瘍
組織に正常細胞が多く混入していると、それだけ突然変
異の検出が困難となる。
は、周囲の正常な組織を含まない組織を単離することが
有効である。組織調製品の腫瘍細胞を濃縮する方法は当
該技術分野において知られている。例えば、組織はパラ
フィンまたはクリオスタット切片から単離でできる。癌
細胞はフローサイトメトリーによっても正常細胞から分
離できる。腫瘍を他の細胞から分離する他の技術同様、
これらの技術は当該技術分野でよく知られている。腫瘍
組織に正常細胞が多く混入していると、それだけ突然変
異の検出が困難となる。
突然変異の検出は、腫瘍細胞に存在する（両）対立遺
伝子を分子クローン化し、当該分野でよく知られた技術
を用いてその塩基配列を決定することによって達成でき
る。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、腫
瘍組織のゲノムDNA調製品から直接、遺伝子配列を増幅
することもできる。それから、増幅された配列のDNA配
列を決定できる。ポリメラーゼ連鎖反応自体は、当該分
野においてよく知られている。例えば、サイキ（Saik
i）ら、Science,vol.239,p.487,1988;米国特許第4,683,
203号；および米国特許第4,683,195号を参照していただ
きたい。遺伝子を増幅させるために使われる具体的なプ
ライマーについては、後でより詳しく論ずる。当該分野
で知られているリガーゼ連鎖反応を用いても、MCC配列
を増幅することができる。ウー（Wu）ら,Genomics,vol.
4,pp.560−569（1989）を参照していただきたい。さら
に、対立遺伝子に特異的なPCRとして知られている技術
を利用することができる。（ルアノ（Ruano）とキッド
（Kidd）,Nucleic Acids Research,vol.17,p.8392,198
9.）この方法によると、３′末端で特定のMCC突然変異
にハイブリダイズするプライマーが用いられる。この特
定のMCC突然変異が存在しなければ、増幅産物は観察さ
れない。遺伝子の挿入および欠失も、クローン化、塩基
配列決定および増幅によって検出できる。さらに、遺伝
子およびその周囲のマーカー遺伝子に対する制限断片長
多型（RFLP）プローブを用いて、対立遺伝子の変更また
は多型断片中の挿入を調べることができる。当該分野で
知られている挿入および欠失を検出する他の技術を用い
ることもできる。
伝子を分子クローン化し、当該分野でよく知られた技術
を用いてその塩基配列を決定することによって達成でき
る。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、腫
瘍組織のゲノムDNA調製品から直接、遺伝子配列を増幅
することもできる。それから、増幅された配列のDNA配
列を決定できる。ポリメラーゼ連鎖反応自体は、当該分
野においてよく知られている。例えば、サイキ（Saik
i）ら、Science,vol.239,p.487,1988;米国特許第4,683,
203号；および米国特許第4,683,195号を参照していただ
きたい。遺伝子を増幅させるために使われる具体的なプ
ライマーについては、後でより詳しく論ずる。当該分野
で知られているリガーゼ連鎖反応を用いても、MCC配列
を増幅することができる。ウー（Wu）ら,Genomics,vol.
4,pp.560−569（1989）を参照していただきたい。さら
に、対立遺伝子に特異的なPCRとして知られている技術
を利用することができる。（ルアノ（Ruano）とキッド
（Kidd）,Nucleic Acids Research,vol.17,p.8392,198
9.）この方法によると、３′末端で特定のMCC突然変異
にハイブリダイズするプライマーが用いられる。この特
定のMCC突然変異が存在しなければ、増幅産物は観察さ
れない。遺伝子の挿入および欠失も、クローン化、塩基
配列決定および増幅によって検出できる。さらに、遺伝
子およびその周囲のマーカー遺伝子に対する制限断片長
多型（RFLP）プローブを用いて、対立遺伝子の変更また
は多型断片中の挿入を調べることができる。当該分野で
知られている挿入および欠失を検出する他の技術を用い
ることもできる。
野生型遺伝子の変更は、その遺伝子の野生型発現産物
の変更に基づいて検出することもできる。そのような発
現産物には、蛋白質産物そのものだけでなくmRNAも含ま
れる。これらの産物の配列をSEQ ID NO:1および２に
示す。点突然変異は、mRNAを増幅し塩基配列を決定する
か、またはmRNAから作られるcDNAの分子クローン化によ
って検出することができる。クローン化したcDNAの配列
は、当該分野で知られるDNAシークエンス技術を用いて
決定することができる。cDNAはポリメラーゼ連鎖反応に
よっても配列決定できるが、これについては後により詳
しく述べる。
の変更に基づいて検出することもできる。そのような発
現産物には、蛋白質産物そのものだけでなくmRNAも含ま
れる。これらの産物の配列をSEQ ID NO:1および２に
示す。点突然変異は、mRNAを増幅し塩基配列を決定する
か、またはmRNAから作られるcDNAの分子クローン化によ
って検出することができる。クローン化したcDNAの配列
は、当該分野で知られるDNAシークエンス技術を用いて
決定することができる。cDNAはポリメラーゼ連鎖反応に
よっても配列決定できるが、これについては後により詳
しく述べる。
本発明においてミスマッチとは、100％相同ではない
もののハイブリダイズした核酸二重鎖のことである。そ
のような不完全な相同性は、欠失、挿入、逆位、置換ま
たはフレームシフト突然変異による。ミスマッチの検出
は、遺伝子またはそのmRNA産物中の点突然変異の検出に
用いることができる。これらの技術は塩基配列決定に比
べると感度が低いが、多くの腫瘍サンプルに対してより
簡単に行える。ミスマッチ切断技術の例として、RNase
プロテクション法があるが、これについては、ウィンタ
ー（Winter）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,p.757
5,1985およびメイヤーズ（Meyers）ら,Science,Vol.23
0,p.1242,1985に詳しく記載されている。本発明におい
てこの方法を実際に行う場合には、ヒト野生型遺伝子の
コード配列に相補的なラベルしたリボプローブを用い
る。リボプローブと腫瘍組織から単離されたmRNAまたは
DNAとを共にアニール（ハイブリダイズ）させ、次い
で、RNA二重鎖構造中のミスマッチを検出できる酵素RNa
se Ａを用いて消化する。RNase Ａによってミスマッ
チが検出されると、ミスマッチ部位が切断される。従っ
て、アニールさせたRNA調製品を電気泳動ゲルマトリク
ス上で分離すると、リボプローブとmRNAまたはDNAとの
二重鎖RNAの全長よりも小さいRNA産物が観察される。リ
ボプローブはMCC mRNAまたは遺伝子の全長である必要
はなく、これらの一部であってもよい。リボプローブが
MCC mRNAまたは遺伝子の一部しか含んでいない場合
は、こうしたプローブを多数用いて、ミスマッチに関し
てmRNA全体の配列を検索することが望ましいであろう。
もののハイブリダイズした核酸二重鎖のことである。そ
のような不完全な相同性は、欠失、挿入、逆位、置換ま
たはフレームシフト突然変異による。ミスマッチの検出
は、遺伝子またはそのmRNA産物中の点突然変異の検出に
用いることができる。これらの技術は塩基配列決定に比
べると感度が低いが、多くの腫瘍サンプルに対してより
簡単に行える。ミスマッチ切断技術の例として、RNase
プロテクション法があるが、これについては、ウィンタ
ー（Winter）ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,p.757
5,1985およびメイヤーズ（Meyers）ら,Science,Vol.23
0,p.1242,1985に詳しく記載されている。本発明におい
てこの方法を実際に行う場合には、ヒト野生型遺伝子の
コード配列に相補的なラベルしたリボプローブを用い
る。リボプローブと腫瘍組織から単離されたmRNAまたは
DNAとを共にアニール（ハイブリダイズ）させ、次い
で、RNA二重鎖構造中のミスマッチを検出できる酵素RNa
se Ａを用いて消化する。RNase Ａによってミスマッ
チが検出されると、ミスマッチ部位が切断される。従っ
て、アニールさせたRNA調製品を電気泳動ゲルマトリク
ス上で分離すると、リボプローブとmRNAまたはDNAとの
二重鎖RNAの全長よりも小さいRNA産物が観察される。リ
ボプローブはMCC mRNAまたは遺伝子の全長である必要
はなく、これらの一部であってもよい。リボプローブが
MCC mRNAまたは遺伝子の一部しか含んでいない場合
は、こうしたプローブを多数用いて、ミスマッチに関し
てmRNA全体の配列を検索することが望ましいであろう。
同様に、酵素的または化学的切断によってミスマッチ
を検出するのに、DNAプローブを用いてもよい。例え
ば、コットン（Cotton）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,v
ol.85,4397,1988;およびシェンク（Shenk）ら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,vol.72,p.989,1975を参照していただ
きたい。また、マッチした二重鎖とミスマッチした二重
鎖の電気泳動度の違いによってミスマッチを検出するこ
ともできる。例えば、カリエロ（Cariello）,Human Gen
etics,vol.42,p.726,1988を参照していただきたい。リ
ボプローブの場合でもDNAプローブの場合でも、突然変
異を含んでいるかもしれない細胞性のmRNAまたはDNAをP
CR（下記参照）を用いてハイブリダイゼーションの前に
増幅させることができる。MCC遺伝子のDNAの変化は、特
に欠失や挿入のような大きな再編成の場合には、サザン
ハイブリダイゼーションを用いて検出することもでき
る。
を検出するのに、DNAプローブを用いてもよい。例え
ば、コットン（Cotton）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,v
ol.85,4397,1988;およびシェンク（Shenk）ら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,vol.72,p.989,1975を参照していただ
きたい。また、マッチした二重鎖とミスマッチした二重
鎖の電気泳動度の違いによってミスマッチを検出するこ
ともできる。例えば、カリエロ（Cariello）,Human Gen
etics,vol.42,p.726,1988を参照していただきたい。リ
ボプローブの場合でもDNAプローブの場合でも、突然変
異を含んでいるかもしれない細胞性のmRNAまたはDNAをP
CR（下記参照）を用いてハイブリダイゼーションの前に
増幅させることができる。MCC遺伝子のDNAの変化は、特
に欠失や挿入のような大きな再編成の場合には、サザン
ハイブリダイゼーションを用いて検出することもでき
る。
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて既に増幅した腫瘍組織
由来のMCC遺伝子のDNA配列は、対立遺伝子特異的なプロ
ーブを用いてスクリーニングすることもできる。これら
のプローブは核酸オリゴマーで、各々既知の突然変異を
もつMCC遺伝子の配列の領域を含んでいる。例えば、一
つのオリゴマーは長さが30ヌクレオチドで、MCC遺伝子
配列の一部に相当している。このような一群の対立遺伝
子特異的なプローブを用いて、PCR増幅産物をスクリー
ニングし、MCC遺伝子において既に同定されている突然
変異の存在を同定できる。対立遺伝子特異的なプローブ
と増幅したMCC配列のハイブリダイゼーションは、例え
ば、ナイロンフィルター上で行うことができる。強いハ
イブリダイゼーション条件下で特定のプローブとハイブ
リダイズすることは、その腫瘍組織に、用いた対立遺伝
子特異的なプローブと同じ突然変異が存在することを示
している。
由来のMCC遺伝子のDNA配列は、対立遺伝子特異的なプロ
ーブを用いてスクリーニングすることもできる。これら
のプローブは核酸オリゴマーで、各々既知の突然変異を
もつMCC遺伝子の配列の領域を含んでいる。例えば、一
つのオリゴマーは長さが30ヌクレオチドで、MCC遺伝子
配列の一部に相当している。このような一群の対立遺伝
子特異的なプローブを用いて、PCR増幅産物をスクリー
ニングし、MCC遺伝子において既に同定されている突然
変異の存在を同定できる。対立遺伝子特異的なプローブ
と増幅したMCC配列のハイブリダイゼーションは、例え
ば、ナイロンフィルター上で行うことができる。強いハ
イブリダイゼーション条件下で特定のプローブとハイブ
リダイズすることは、その腫瘍組織に、用いた対立遺伝
子特異的なプローブと同じ突然変異が存在することを示
している。
MCC mRNAの発現の変更は、当該分野で知られている
どのような技術によっても検出することができる。これ
らには、ノザンブロット分析、PCR増幅およびRNaseプロ
テクション法が含まれる。mRNA発現の減少は野生型MCC
遺伝子の変更を示している。
どのような技術によっても検出することができる。これ
らには、ノザンブロット分析、PCR増幅およびRNaseプロ
テクション法が含まれる。mRNA発現の減少は野生型MCC
遺伝子の変更を示している。
野生型MCC遺伝子の変更は、野生型MCC蛋白質の変更に
関してスクリーニングすることによっても検出すること
ができる。例えば、MCCと免疫反応するモノクローナル
抗体を用いて組織のスクリーニングをすることができ
る。用いた抗体と反応する抗原がないことは、MCCの突
然変異を示していると考えられる。突然変異対立遺伝子
の産物に特異的な抗体を用いて変異MCC遺伝子産物を検
出することもできるだろう。このような免疫学的分析
は、当該技術分野で知られている適当な方法で行うこと
ができよう。これらには、ウェスタンブロット、免疫組
織化学的分析およびELISA分析が含まれる。変更したMCC
蛋白質を検出するいかなる方法も、野生型MCC遺伝子の
変更の検出に利用することができる。蛋白質結合決定法
などの機能的な分析法を用いることもできる。例えば、
MCC蛋白質はＧ蛋白質に結合すると考えられている。よ
って、そのＧ蛋白質に結合する相手に関する分析法を適
用することもできる。さらに、MCCの生化学的機能を検
出する分析法を用いることもできる。MCCはリン脂質代
謝に関与していると考えられている。よって、リン脂質
代謝経路に関与する酵素的産物の分析法を用いてMCC活
性を決定することができる。変異MCC遺伝子産物の発見
は、野生型MCC遺伝子の変更を示す。
関してスクリーニングすることによっても検出すること
ができる。例えば、MCCと免疫反応するモノクローナル
抗体を用いて組織のスクリーニングをすることができ
る。用いた抗体と反応する抗原がないことは、MCCの突
然変異を示していると考えられる。突然変異対立遺伝子
の産物に特異的な抗体を用いて変異MCC遺伝子産物を検
出することもできるだろう。このような免疫学的分析
は、当該技術分野で知られている適当な方法で行うこと
ができよう。これらには、ウェスタンブロット、免疫組
織化学的分析およびELISA分析が含まれる。変更したMCC
蛋白質を検出するいかなる方法も、野生型MCC遺伝子の
変更の検出に利用することができる。蛋白質結合決定法
などの機能的な分析法を用いることもできる。例えば、
MCC蛋白質はＧ蛋白質に結合すると考えられている。よ
って、そのＧ蛋白質に結合する相手に関する分析法を適
用することもできる。さらに、MCCの生化学的機能を検
出する分析法を用いることもできる。MCCはリン脂質代
謝に関与していると考えられている。よって、リン脂質
代謝経路に関与する酵素的産物の分析法を用いてMCC活
性を決定することができる。変異MCC遺伝子産物の発見
は、野生型MCC遺伝子の変更を示す。
突然変異遺伝子またはその遺伝子産物は、血清、大
便、尿および唾液などの他の人体サンプルからも検出す
ることができる。上記の組織中の変異MCC遺伝子または
遺伝子産物の検出に用いたのと同じ技術を他の人体サン
プルに適用することができる。癌細胞は腫瘍から剥がれ
落ち、このような人体サンプル中に現れる。さらに、MC
C遺伝子産物そのものが細胞外空間に分泌され、癌細胞
がなくてもこれらの人体サンプル中に見出だされるかも
しれない。そのような人体サンプルをスクリーニングす
ることによって、多くの種類の癌に対して簡単な初期診
断を行うことが可能となる。さらに、こうした人体サン
プルを変異MCC遺伝子または遺伝子産物に関して試験す
ることによって、化学療法または放射線治療の経過をよ
り簡単にモニターすることができる。
便、尿および唾液などの他の人体サンプルからも検出す
ることができる。上記の組織中の変異MCC遺伝子または
遺伝子産物の検出に用いたのと同じ技術を他の人体サン
プルに適用することができる。癌細胞は腫瘍から剥がれ
落ち、このような人体サンプル中に現れる。さらに、MC
C遺伝子産物そのものが細胞外空間に分泌され、癌細胞
がなくてもこれらの人体サンプル中に見出だされるかも
しれない。そのような人体サンプルをスクリーニングす
ることによって、多くの種類の癌に対して簡単な初期診
断を行うことが可能となる。さらに、こうした人体サン
プルを変異MCC遺伝子または遺伝子産物に関して試験す
ることによって、化学療法または放射線治療の経過をよ
り簡単にモニターすることができる。
本発明の診断方法は、MCCが腫瘍形成に関与している
あらゆる腫瘍に対して応用することができる。染色体ア
ーム5qの欠失は、白血病およびリンパ腫の他に肺癌、乳
癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、肝臓癌、肉腫、胃癌およ
び前立腺癌においても観察されている。よって、これら
の癌にはMCCが関与していると考えられる。本発明の診
断方法は、臨床医が適切な治療方法を決定するのに有用
である。例えば、MCC対立遺伝子の両方が変更している
腫瘍に対しては、MCC対立遺伝子の片方のみが変更して
いる腫瘍に対するよりも厳しい治療法を施す必要があ
る。
あらゆる腫瘍に対して応用することができる。染色体ア
ーム5qの欠失は、白血病およびリンパ腫の他に肺癌、乳
癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、肝臓癌、肉腫、胃癌およ
び前立腺癌においても観察されている。よって、これら
の癌にはMCCが関与していると考えられる。本発明の診
断方法は、臨床医が適切な治療方法を決定するのに有用
である。例えば、MCC対立遺伝子の両方が変更している
腫瘍に対しては、MCC対立遺伝子の片方のみが変更して
いる腫瘍に対するよりも厳しい治療法を施す必要があ
る。
本発明のプライマーの対は、ポリメラーゼ連鎖反応を
用いたMCC遺伝子の塩基配列決定に有用である。一対の
一本鎖DNAプライマーは、染色体5q上のMCC遺伝子内もし
くはその周囲の配列にアニールし、MCC遺伝子そのもの
のDNA合成の増幅を引き起こすことができる。これらの
プライマーの完全なセットによって、MCC遺伝子のコー
ド配列、即ち、エクソンのヌクレオチドの全てを合成す
ることができる。プライマーのセットは、イントロンと
エクソンの両方を合成できるものが望ましい。対立遺伝
子特異的なプライマーを用いることもできる。このよう
なプライマーは特定のMCC突然変異対立遺伝子にのみア
ニールし、従って、その突然変異対立遺伝子が存在する
もののみを鋳型として増幅する。
用いたMCC遺伝子の塩基配列決定に有用である。一対の
一本鎖DNAプライマーは、染色体5q上のMCC遺伝子内もし
くはその周囲の配列にアニールし、MCC遺伝子そのもの
のDNA合成の増幅を引き起こすことができる。これらの
プライマーの完全なセットによって、MCC遺伝子のコー
ド配列、即ち、エクソンのヌクレオチドの全てを合成す
ることができる。プライマーのセットは、イントロンと
エクソンの両方を合成できるものが望ましい。対立遺伝
子特異的なプライマーを用いることもできる。このよう
なプライマーは特定のMCC突然変異対立遺伝子にのみア
ニールし、従って、その突然変異対立遺伝子が存在する
もののみを鋳型として増幅する。
増幅された配列の以降のクローン化を容易にするため
に、プライマーの５′末端に制限酵素部位の配列を持た
せてもよい。よって、プライマーの全てのヌクレオチド
は、制限酵素部位の形成に必要な数ヌクレオチドを除
き、MCCの配列またはMCCに隣接する配列に由来する。こ
のような酵素および部位は当該分野でよく知られてい
る、プライマー自身は、当該技術分野でよく知られた技
術を用いて合成することができる。一般的には、市販さ
れている合成機を用いてプライマーを合成することがで
きる。図３に示すMCCオープンリーディングフレームの
配列に基づいて特定のプライマーを設計することは、当
業者にとって十分できることである。
に、プライマーの５′末端に制限酵素部位の配列を持た
せてもよい。よって、プライマーの全てのヌクレオチド
は、制限酵素部位の形成に必要な数ヌクレオチドを除
き、MCCの配列またはMCCに隣接する配列に由来する。こ
のような酵素および部位は当該分野でよく知られてい
る、プライマー自身は、当該技術分野でよく知られた技
術を用いて合成することができる。一般的には、市販さ
れている合成機を用いてプライマーを合成することがで
きる。図３に示すMCCオープンリーディングフレームの
配列に基づいて特定のプライマーを設計することは、当
業者にとって十分できることである。
本発明により提供される核酸プローブは様々な用途が
ある。これらのプローブは、既に記載した点突然変異を
検出するための、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダ
イゼーションおよびRNaseプロテクション法に用いるこ
とができる。これらのプローブはPCR増幅産物の検出に
用いることができる。これらはまた、他の技術を用いた
MCC遺伝子またはmRNAに関するミスマッチの検出にも用
いることができる。ミスマッチの検出には、酵素（例え
ばS1ヌクレアーゼ）、化学物質（例えば、ヒドロキシル
アミン、四酸化オスミウムおよびピペリジン）、または
全体にマッチしたハイブリッドに対するミスマッチハイ
ブリッドの電気泳動度の変化のいづれを用いてもよい。
これらの技術は当該分野において知られている。コット
ン、上記、シェンク、上記、メイヤーズ、上記、ウィン
ター、上記、およびノバック（Novack）ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,vol.83,p.586,1986を参照していただきた
い。イントロンに対するプローブも企図されているが、
一般的に、プローブはMCC遺伝子のコード配列に相補的
である。核酸プローブの完全なセットを用いて、野生型
MCC遺伝子の変更を検出するキットを構成することがで
きる。このキットによってMCC遺伝子全体にハイブリダ
イズさせることができる。プローブは互いにオーバーラ
ップまたは隣接していてもよい。
ある。これらのプローブは、既に記載した点突然変異を
検出するための、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダ
イゼーションおよびRNaseプロテクション法に用いるこ
とができる。これらのプローブはPCR増幅産物の検出に
用いることができる。これらはまた、他の技術を用いた
MCC遺伝子またはmRNAに関するミスマッチの検出にも用
いることができる。ミスマッチの検出には、酵素（例え
ばS1ヌクレアーゼ）、化学物質（例えば、ヒドロキシル
アミン、四酸化オスミウムおよびピペリジン）、または
全体にマッチしたハイブリッドに対するミスマッチハイ
ブリッドの電気泳動度の変化のいづれを用いてもよい。
これらの技術は当該分野において知られている。コット
ン、上記、シェンク、上記、メイヤーズ、上記、ウィン
ター、上記、およびノバック（Novack）ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,vol.83,p.586,1986を参照していただきた
い。イントロンに対するプローブも企図されているが、
一般的に、プローブはMCC遺伝子のコード配列に相補的
である。核酸プローブの完全なセットを用いて、野生型
MCC遺伝子の変更を検出するキットを構成することがで
きる。このキットによってMCC遺伝子全体にハイブリダ
イズさせることができる。プローブは互いにオーバーラ
ップまたは隣接していてもよい。
mRNAのミスマッチの検出にリボプローブを用いる場
合、そのリボプローブはヒト野生型MCC遺伝子のmRNAに
相補的である。よってリボプローブは、センス鎖と反対
方向なのでMCC蛋白質をコードしていないアンチセンス
プローブである。リボプローブは一般的に、当該分野で
知られている方法によって、放射活性物質、発色物質、
または蛍光物質でラベルされる。DNAのミスマッチの検
出にリボプローブを用いる場合、それはセンス、アンチ
センスいづれの方向でもよい。同様に、DNAプローブを
用いてもミスマッチを検出することができる。
合、そのリボプローブはヒト野生型MCC遺伝子のmRNAに
相補的である。よってリボプローブは、センス鎖と反対
方向なのでMCC蛋白質をコードしていないアンチセンス
プローブである。リボプローブは一般的に、当該分野で
知られている方法によって、放射活性物質、発色物質、
または蛍光物質でラベルされる。DNAのミスマッチの検
出にリボプローブを用いる場合、それはセンス、アンチ
センスいづれの方向でもよい。同様に、DNAプローブを
用いてもミスマッチを検出することができる。
核酸プローブはMCC遺伝子の突然変異対立遺伝子に相
補的であってもよい。これらのプローブは、ミスマッチ
よりもハイブリダイゼーションに基づいて、他の患者に
同様の突然変異が生じているかを検出するのに有用であ
る。これらについては先に論じており、対立遺伝子特異
的プローブと命名してある。上述のように、MCCプロー
ブを、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーショ
ンに用いて、欠失および挿入などの大きな染色体変化を
検出することもできる。このプローブは、腫瘍および正
常組織からMCC遺伝子のcDNAクローンを選択するのにも
用いることができる。さらに、このプローブを用いて、
組織中のMCC mRNAを検出し、野生型MCC遺伝子の変更に
よって発現が低下しているかを判断することもできる。
図３に示すMCCコード配列（SEQ ID NO:1）に基づいて
特定のプローブを設計することは、当業者にとって十分
できることである。
補的であってもよい。これらのプローブは、ミスマッチ
よりもハイブリダイゼーションに基づいて、他の患者に
同様の突然変異が生じているかを検出するのに有用であ
る。これらについては先に論じており、対立遺伝子特異
的プローブと命名してある。上述のように、MCCプロー
ブを、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーショ
ンに用いて、欠失および挿入などの大きな染色体変化を
検出することもできる。このプローブは、腫瘍および正
常組織からMCC遺伝子のcDNAクローンを選択するのにも
用いることができる。さらに、このプローブを用いて、
組織中のMCC mRNAを検出し、野生型MCC遺伝子の変更に
よって発現が低下しているかを判断することもできる。
図３に示すMCCコード配列（SEQ ID NO:1）に基づいて
特定のプローブを設計することは、当業者にとって十分
できることである。
本発明によれば、突然変異MCC対立遺伝子を持つ細胞
に野生型MCCの機能を与える方法も提供される。このよ
うな機能を付与することによって、受容細胞の新生物増
殖が抑圧される。野生型MCC遺伝子または遺伝子の一部
をベクターに繋いで染色体外に止まる形で細胞に導入す
ることができる。そのような状態では、この遺伝子は染
色体外の位置から細胞によって発現されるであろう。突
然変異MCC対立遺伝子を持つ細胞に遺伝子の一部を導入
し発現させる場合、遺伝子のこの部分はMCC蛋白質のう
ち細胞の非新生物的増殖に必要な部分をコードしている
べきである。野生型MCC遺伝子またはその一部が、細胞
内に存在する内在性の突然変異MCC遺伝子と組み換えを
起こすような形で、突然変異細胞に導入されるほうがよ
り好適である。そのような組み換えには、MCC遺伝子の
突然変異を修正する二重組み換え事象が必要とされる。
組み換え用の遺伝子導入ベクターも染色体外に維持され
る遺伝子導入ベクターも当該分野において知られてお
り、適当なベクターを用いることができる。例えば、電
気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法およびウイルスによ
る形質導入などは当該分野において知られており、どの
方法を選択するかは日常的作業の範囲である。野生型MC
C遺伝子で形質転換された細胞は、癌の鎮静およびその
ような鎮静を促進する薬剤治療を研究するためのモデル
系として利用することができる。
に野生型MCCの機能を与える方法も提供される。このよ
うな機能を付与することによって、受容細胞の新生物増
殖が抑圧される。野生型MCC遺伝子または遺伝子の一部
をベクターに繋いで染色体外に止まる形で細胞に導入す
ることができる。そのような状態では、この遺伝子は染
色体外の位置から細胞によって発現されるであろう。突
然変異MCC対立遺伝子を持つ細胞に遺伝子の一部を導入
し発現させる場合、遺伝子のこの部分はMCC蛋白質のう
ち細胞の非新生物的増殖に必要な部分をコードしている
べきである。野生型MCC遺伝子またはその一部が、細胞
内に存在する内在性の突然変異MCC遺伝子と組み換えを
起こすような形で、突然変異細胞に導入されるほうがよ
り好適である。そのような組み換えには、MCC遺伝子の
突然変異を修正する二重組み換え事象が必要とされる。
組み換え用の遺伝子導入ベクターも染色体外に維持され
る遺伝子導入ベクターも当該分野において知られてお
り、適当なベクターを用いることができる。例えば、電
気穿孔法、リン酸カルシウム共沈法およびウイルスによ
る形質導入などは当該分野において知られており、どの
方法を選択するかは日常的作業の範囲である。野生型MC
C遺伝子で形質転換された細胞は、癌の鎮静およびその
ような鎮静を促進する薬剤治療を研究するためのモデル
系として利用することができる。
MCC活性を持つポリペプチドを、MCC遺伝子が突然変異
を起こしたか、または失われてしまった細胞に適用する
ことができる。MCC蛋白質の配列は図３（SEQ ID NO:
2）に開示されている。例えば、既知の発現ベクターを
用いて、cDNA配列を細菌内で発現させることによって、
蛋白質を生産することができる。また、脳などのMCCを
生産している哺乳動物細胞からMCCを抽出することがで
きる。さらに、合成化学の技術を適用してMCC蛋白質を
合成することも可能である。このような技術のいづれに
よっても、本発明の図３に示す配列（SEQ ID NO:2）
を有するMCC遺伝子産物を含む調製品を提供することが
できる。この調製品は他のヒト蛋白質を実質的に含まな
い。これは、微生物中で、若しくはin vitroで合成する
ことによって最も容易に達成される。活性MCC分子は、
例えば、マイクロインジェクションまたはリポソームの
利用によって細胞に導入することができる。また、この
ような活性分子を能動的にまたは拡散によって細胞に取
り込ませることができる。MCC遺伝子産物を細胞外に適
用するだけで、腫瘍の増殖に影響を与えるのに十分であ
る場合もある。MCC活性を有する分子を付与すると、新
生物状態が部分的に改善される。MCC活性を有する他の
分子、例えば、ペプチド、薬剤または有機化合物なども
そのような改善効果を与えるのに用いることができる。
を起こしたか、または失われてしまった細胞に適用する
ことができる。MCC蛋白質の配列は図３（SEQ ID NO:
2）に開示されている。例えば、既知の発現ベクターを
用いて、cDNA配列を細菌内で発現させることによって、
蛋白質を生産することができる。また、脳などのMCCを
生産している哺乳動物細胞からMCCを抽出することがで
きる。さらに、合成化学の技術を適用してMCC蛋白質を
合成することも可能である。このような技術のいづれに
よっても、本発明の図３に示す配列（SEQ ID NO:2）
を有するMCC遺伝子産物を含む調製品を提供することが
できる。この調製品は他のヒト蛋白質を実質的に含まな
い。これは、微生物中で、若しくはin vitroで合成する
ことによって最も容易に達成される。活性MCC分子は、
例えば、マイクロインジェクションまたはリポソームの
利用によって細胞に導入することができる。また、この
ような活性分子を能動的にまたは拡散によって細胞に取
り込ませることができる。MCC遺伝子産物を細胞外に適
用するだけで、腫瘍の増殖に影響を与えるのに十分であ
る場合もある。MCC活性を有する分子を付与すると、新
生物状態が部分的に改善される。MCC活性を有する他の
分子、例えば、ペプチド、薬剤または有機化合物なども
そのような改善効果を与えるのに用いることができる。
ヒトMCC蛋白質と免疫反応性の抗体の調製品も本発明
により提供される。この抗体は、ポリクローナルでもモ
ノクローナル抗体でもよく、天然MCC蛋白質、MCC融合蛋
白質または突然変異MCC蛋白質に対して作製することが
できる。抗体は、MCCエピトープ、好適には他のヒト蛋
白質に存在しないエピトープに免疫反応するべきであ
る。本発明の好適な態様においては、抗体は、ポリアク
リルアミドゲルのウェスタンまたはイムノブロットのMC
C蛋白質と反応するほかに、溶液からMCC蛋白質を免疫沈
降させる。別の好適な態様においては、抗体は、免疫組
織化学的技術を用いて、パラフィンまたは冷凍組織切片
中のMCC蛋白質を検出する。抗体の作製および精製に関
する技術は当該技術分野においてよく知られており、本
発明の調製品を得るには、そのような技術のいづれを用
いてもよい。
により提供される。この抗体は、ポリクローナルでもモ
ノクローナル抗体でもよく、天然MCC蛋白質、MCC融合蛋
白質または突然変異MCC蛋白質に対して作製することが
できる。抗体は、MCCエピトープ、好適には他のヒト蛋
白質に存在しないエピトープに免疫反応するべきであ
る。本発明の好適な態様においては、抗体は、ポリアク
リルアミドゲルのウェスタンまたはイムノブロットのMC
C蛋白質と反応するほかに、溶液からMCC蛋白質を免疫沈
降させる。別の好適な態様においては、抗体は、免疫組
織化学的技術を用いて、パラフィンまたは冷凍組織切片
中のMCC蛋白質を検出する。抗体の作製および精製に関
する技術は当該技術分野においてよく知られており、本
発明の調製品を得るには、そのような技術のいづれを用
いてもよい。
癌になりやすい素因の確認は、ヒトの正常組織をMCC
遺伝子の突然変異に関して試験することによって行うこ
とができる。例えば、生殖細胞にMCC突然変異を受け継
いだ人は癌になりやすいと考えられる。これはその人の
体のどの組織のDNAを試験しても判断することができ
る。最も簡単には、採血をして血液細胞からDNAを抽出
することができる。さらに、胎児の細胞、または羊水を
MCC遺伝子の突然変異に関して試験することによって、
胎児診断を行うことができる。野生型MCC対立遺伝子の
変更は、例えば、点突然変異によるものでも欠失による
ものでも、上記のいづれの方法によっても検出すること
ができる。
遺伝子の突然変異に関して試験することによって行うこ
とができる。例えば、生殖細胞にMCC突然変異を受け継
いだ人は癌になりやすいと考えられる。これはその人の
体のどの組織のDNAを試験しても判断することができ
る。最も簡単には、採血をして血液細胞からDNAを抽出
することができる。さらに、胎児の細胞、または羊水を
MCC遺伝子の突然変異に関して試験することによって、
胎児診断を行うことができる。野生型MCC対立遺伝子の
変更は、例えば、点突然変異によるものでも欠失による
ものでも、上記のいづれの方法によっても検出すること
ができる。
本発明のcDNA分子はイントロンを含まない、MCC遺伝
子のコード分子である。これらの分子は、MCC mRNAを
鋳型として用い、逆転写酵素によって作製することがで
きる。これらの分子は、当該分野において知られている
ベクターおよび細胞系列において増殖させることができ
る。このような分子はSEQ ID NO:1に示す配列を有す
る。このcDNAは、本明細書に開示された配列に基づい
て、合成化学の技術を用いて作製することもできる。
子のコード分子である。これらの分子は、MCC mRNAを
鋳型として用い、逆転写酵素によって作製することがで
きる。これらの分子は、当該分野において知られている
ベクターおよび細胞系列において増殖させることができ
る。このような分子はSEQ ID NO:1に示す配列を有す
る。このcDNAは、本明細書に開示された配列に基づい
て、合成化学の技術を用いて作製することもできる。
MCCとヒトm3ムスカリン性アセチルコリン受容体（mAC
hR）との間に短い相同領域が同定された。この相同性は
19残基に大まかに規定され、そのうちカルボキシル末端
の６アミノ酸（KELAGL）が一致していた（図５およびSE
Q ID NO:11参照）。他にも多くの蛋白質が広い領域に
わたるもっと高い相同性を有している（但し、６アミノ
酸が連続して一致するものはほとんど無い）ので、当
初、この相同性が有意であるか分からなかった。しか
し、突然変異を探索していくうちに、mAChRのサブタイ
プによるＧ蛋白質の活性化を制御する配列要素に関する
研究が公表された（レヒライター（Lechleiter）ら、EM
BO J.,p.4381（1990））。m3 mAChRの21アミノ酸残基
の領域をm2 mAChRの対応する領域の21アミノ酸と置換
すると、Ｇ蛋白質特異性が完全に媒介されることが示さ
れた。これらの21残基は、MCCとm3 mAChRの相同性を示
す19アミノ酸とオーバーラップしていた（図５）。KELA
GLモチーフのアミノ末端の２アミノ酸を含む10残基（図
５、ドメインＡ）を欠失させると、Ｇ蛋白質を介する反
応のキネティクスおよび大きさが完全に変更した。さら
に、KELAGLモチーフのカルボキシル末端の４アミノ酸を
含む９残基サブドメイン（図５、ドメインＢ）は、m2
mAChRに転移させると、m3 Ｇ蛋白質経路の活性化を規
定するのに十分であった。
hR）との間に短い相同領域が同定された。この相同性は
19残基に大まかに規定され、そのうちカルボキシル末端
の６アミノ酸（KELAGL）が一致していた（図５およびSE
Q ID NO:11参照）。他にも多くの蛋白質が広い領域に
わたるもっと高い相同性を有している（但し、６アミノ
酸が連続して一致するものはほとんど無い）ので、当
初、この相同性が有意であるか分からなかった。しか
し、突然変異を探索していくうちに、mAChRのサブタイ
プによるＧ蛋白質の活性化を制御する配列要素に関する
研究が公表された（レヒライター（Lechleiter）ら、EM
BO J.,p.4381（1990））。m3 mAChRの21アミノ酸残基
の領域をm2 mAChRの対応する領域の21アミノ酸と置換
すると、Ｇ蛋白質特異性が完全に媒介されることが示さ
れた。これらの21残基は、MCCとm3 mAChRの相同性を示
す19アミノ酸とオーバーラップしていた（図５）。KELA
GLモチーフのアミノ末端の２アミノ酸を含む10残基（図
５、ドメインＡ）を欠失させると、Ｇ蛋白質を介する反
応のキネティクスおよび大きさが完全に変更した。さら
に、KELAGLモチーフのカルボキシル末端の４アミノ酸を
含む９残基サブドメイン（図５、ドメインＢ）は、m2
mAChRに転移させると、m3 Ｇ蛋白質経路の活性化を規
定するのに十分であった。
このMCCとmAChRのＧ蛋白質活性化領域との結び付き
は、従来のＧ蛋白質の癌との関係についての研究の観点
から興味深い。例えば、結腸直腸癌においてしばしば突
然変異を起こしているRAS癌遺伝子（フォーゲルシュタ
インら、N.Engl.J.Med.,vol.319,pg.525（1988）；ボス
（Bos）ら、Nature vol.327,pg.293（1987））は、Ｇ蛋
白質ファミリー（ブルネ（Bourne）ら、Nature、vol.34
8,pg.125（1990））のメンバーであり、in vitro形質転
換抑制因子であり（ノダ（Noda）ら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,vol.86,pg.162（1989））、ホルモンにより形成
される腫瘍で突然変異の生じている遺伝子である（カン
ジス（Candis）ら、Nature,vol.340,pg.692（1989）；
リヨンズ（Lyons）ら、Science,vol.249,pg.655（199
0））。さらに、神経繊維芽細胞腫に関与する遺伝子
（おそらく癌抑制遺伝子）は、RASのGTPase活性を活性
化することが示されている（スー（Xu）ら、Cell,vol.6
3,pg.835（1990）；マーチン（Martin）ら、Cell,vol.6
3,pg.843（1990）；バレスター（Ballester）ら、Cell,
vol.63,pg.851（1990））。Ｇ蛋白質と直腸癌の別の興
味深い結び付きは、薬剤スリンダクに関するものであ
る。この薬剤はFAP患者の良性結腸癌の増殖を阻害する
ことが示されており、これは、そのシクロオキシゲナー
ゼ阻害剤としての活性によるものと思われる（ワッデル
（Waddell）ら、J.Surg.Oncology 24（１）,83（198
3）；ワッデルら、Am.J.Surg.,157（１）,175（198
9）；シャルノー（Charneau）ら、Gastroenterologie C
linique at Biologique 14（２）,153（1990））。シク
ロオキシゲナーゼは、アラキドン酸をプロスタグランジ
ンおよび他の生理活性物質に変換するのに必要とされ
る。Ｇ蛋白質はホスホリパーゼA2活性を制御することが
知られており、ホスホリパーゼA2はリン脂質からアラキ
ドン酸を生成する（ロール（Role）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,vol.84,pg.3623（1987）；クラチ（Kurach
i）ら、Nature,vol.337,pg.555（1989））。それ故、我
々は、野生型MCC蛋白質がＧ蛋白質と相互作用すること
によって機能し、リン脂質代謝に関与していると考えて
いる。
は、従来のＧ蛋白質の癌との関係についての研究の観点
から興味深い。例えば、結腸直腸癌においてしばしば突
然変異を起こしているRAS癌遺伝子（フォーゲルシュタ
インら、N.Engl.J.Med.,vol.319,pg.525（1988）；ボス
（Bos）ら、Nature vol.327,pg.293（1987））は、Ｇ蛋
白質ファミリー（ブルネ（Bourne）ら、Nature、vol.34
8,pg.125（1990））のメンバーであり、in vitro形質転
換抑制因子であり（ノダ（Noda）ら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,vol.86,pg.162（1989））、ホルモンにより形成
される腫瘍で突然変異の生じている遺伝子である（カン
ジス（Candis）ら、Nature,vol.340,pg.692（1989）；
リヨンズ（Lyons）ら、Science,vol.249,pg.655（199
0））。さらに、神経繊維芽細胞腫に関与する遺伝子
（おそらく癌抑制遺伝子）は、RASのGTPase活性を活性
化することが示されている（スー（Xu）ら、Cell,vol.6
3,pg.835（1990）；マーチン（Martin）ら、Cell,vol.6
3,pg.843（1990）；バレスター（Ballester）ら、Cell,
vol.63,pg.851（1990））。Ｇ蛋白質と直腸癌の別の興
味深い結び付きは、薬剤スリンダクに関するものであ
る。この薬剤はFAP患者の良性結腸癌の増殖を阻害する
ことが示されており、これは、そのシクロオキシゲナー
ゼ阻害剤としての活性によるものと思われる（ワッデル
（Waddell）ら、J.Surg.Oncology 24（１）,83（198
3）；ワッデルら、Am.J.Surg.,157（１）,175（198
9）；シャルノー（Charneau）ら、Gastroenterologie C
linique at Biologique 14（２）,153（1990））。シク
ロオキシゲナーゼは、アラキドン酸をプロスタグランジ
ンおよび他の生理活性物質に変換するのに必要とされ
る。Ｇ蛋白質はホスホリパーゼA2活性を制御することが
知られており、ホスホリパーゼA2はリン脂質からアラキ
ドン酸を生成する（ロール（Role）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,vol.84,pg.3623（1987）；クラチ（Kurach
i）ら、Nature,vol.337,pg.555（1989））。それ故、我
々は、野生型MCC蛋白質がＧ蛋白質と相互作用すること
によって機能し、リン脂質代謝に関与していると考えて
いる。
以下に示す実施例は、単なる例示であって、上記に広
く記載された本発明の範囲を制限するものではない。
く記載された本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１
本実施例は、結腸直腸癌において染色体5q21に生じる
体細胞遺伝子再編成の検出を示す。
体細胞遺伝子再編成の検出を示す。
我々は、制限断片の長さにおける多型性（RFLP）マー
カーを用いて散発性癌の30％以上に起こる対立遺伝子の
損失をマッピングした。我々は、よく見られる損失領域
がコスミド5.71によって検出されるRFLPに集中している
らしいということを見いだした。
カーを用いて散発性癌の30％以上に起こる対立遺伝子の
損失をマッピングした。我々は、よく見られる損失領域
がコスミド5.71によって検出されるRFLPに集中している
らしいということを見いだした。
コスミド5.71の部分をサブクローン化し、150の結腸
直腸癌から成るパネルをサザンブロット分析によってス
クリーニングする際のプローブとして使用した。我々
は、正常個体由来のDNAで見られる20kbのEcoR I断片に
加えて、11kbのEcoR I断片を含む腫瘍を１つ（T14）発
見した。この11kb断片は同じ患者の正常細胞から単離し
たDNAには存在しなかった（図１、パネルＡ）。
直腸癌から成るパネルをサザンブロット分析によってス
クリーニングする際のプローブとして使用した。我々
は、正常個体由来のDNAで見られる20kbのEcoR I断片に
加えて、11kbのEcoR I断片を含む腫瘍を１つ（T14）発
見した。この11kb断片は同じ患者の正常細胞から単離し
たDNAには存在しなかった（図１、パネルＡ）。
（T14腫瘍のEcoR I断片をラムダDASHベクター腕（Str
atagene）に連結し、連結したものをパッケージングしC
600大腸菌株に感染させた後、5.71配列からのプローブ
を用いてハイブリダイズするクローンを同定することに
より）、新たなEcoR I断片をクローン化し、腫瘍T14か
らのDNAについてのサザンブロットのプローブに用い
た。この11kbクローンは、予想通り、腫瘍中の異常な11
kb EcoR I断片及び正常な20kb EcoR I断片にハイブリ
ダイズした（図１、パネルＢ）。さらに、11kbクローン
は、他の制限エンドヌクレアーゼ（Pst I［図１、パネ
ルＣ］;Hind IIIとEcoR Vを含む）で消化しても、腫瘍T
14の新たな断片を検出した。
atagene）に連結し、連結したものをパッケージングしC
600大腸菌株に感染させた後、5.71配列からのプローブ
を用いてハイブリダイズするクローンを同定することに
より）、新たなEcoR I断片をクローン化し、腫瘍T14か
らのDNAについてのサザンブロットのプローブに用い
た。この11kbクローンは、予想通り、腫瘍中の異常な11
kb EcoR I断片及び正常な20kb EcoR I断片にハイブリ
ダイズした（図１、パネルＢ）。さらに、11kbクローン
は、他の制限エンドヌクレアーゼ（Pst I［図１、パネ
ルＣ］;Hind IIIとEcoR Vを含む）で消化しても、腫瘍T
14の新たな断片を検出した。
11kbクローンの制限酵素地図および部分的な塩基配列
の決定から、その左端が5.71の配列を含む20kbのEcoR I
断片に由来することが示された。11kb断片の右端は、正
常なゲノムDNAではその左端とつながっていない配列に
由来していた。11kb断片の右端の400bpプローブを用い
たところ、つながっていない配列もまた、染色体５に由
来するものの、11kbの左端から少なくとも100kbは離れ
た場所からのものであることが示された。従って、この
腫瘍では再編成が起こっており、正常では遠く離れたと
ころにある配列の並置が生じている。
の決定から、その左端が5.71の配列を含む20kbのEcoR I
断片に由来することが示された。11kb断片の右端は、正
常なゲノムDNAではその左端とつながっていない配列に
由来していた。11kb断片の右端の400bpプローブを用い
たところ、つながっていない配列もまた、染色体５に由
来するものの、11kbの左端から少なくとも100kbは離れ
た場所からのものであることが示された。従って、この
腫瘍では再編成が起こっており、正常では遠く離れたと
ころにある配列の並置が生じている。
実施例２
本実施例は、結腸直腸癌T14で見いだされた再編成に
より影響を受ける遺伝子の位置づけに関して、我々が行
なった試みを記す。
より影響を受ける遺伝子の位置づけに関して、我々が行
なった試みを記す。
発現しているヒトの遺伝子は哺乳動物種の間で保存さ
れているという仮説に基づき、我々は、5.71コスミドと
相同性をもつ配列をラットのゲノムから検索した。5.71
コスミドのいくつかのサブクローンを、げっ歯類DNAの
サザンブロット分析に使用した。フォーゲルシュタイン
ら、Cancer Research,vol.47,pg.4806（1987）に記載
されているように55度で異種間ハイブリダイゼーション
を行い、45mM 塩化ナトリウム、2mM クエン酸ナトリ
ウム、0.3mM トリス−塩酸 pH7.5、0.1％ ドデシル
硫酸ナトリウム中で55度で45分、洗浄した。低ストリン
ジェントな条件下でクロスハイブリダイズした２つのサ
ブクローン（5.71−５および5.71−３）を同定した。し
かし、これらの保存された配列を用いて、ノザンブロッ
ティング、および３×106個以上の直腸または脳のcDNA
クローンのスクリーニングによるヒトの発現遺伝子を検
出しようという試みは成功しなかった。
れているという仮説に基づき、我々は、5.71コスミドと
相同性をもつ配列をラットのゲノムから検索した。5.71
コスミドのいくつかのサブクローンを、げっ歯類DNAの
サザンブロット分析に使用した。フォーゲルシュタイン
ら、Cancer Research,vol.47,pg.4806（1987）に記載
されているように55度で異種間ハイブリダイゼーション
を行い、45mM 塩化ナトリウム、2mM クエン酸ナトリ
ウム、0.3mM トリス−塩酸 pH7.5、0.1％ ドデシル
硫酸ナトリウム中で55度で45分、洗浄した。低ストリン
ジェントな条件下でクロスハイブリダイズした２つのサ
ブクローン（5.71−５および5.71−３）を同定した。し
かし、これらの保存された配列を用いて、ノザンブロッ
ティング、および３×106個以上の直腸または脳のcDNA
クローンのスクリーニングによるヒトの発現遺伝子を検
出しようという試みは成功しなかった。
実施例３
本実施例は、コスミド5.71RFLPマーカー近傍の発現し
ているヒト遺伝子の同定を示す。
ているヒト遺伝子の同定を示す。
我々は、異種間ハイブリダイズしたヒトのサブクロー
ンを部分的にシークエンスしたが、この配列情報だけで
はエクソンを予想することは不可能であることがわかっ
た。そこで、我々は異種間ハイブリダイズしたラットの
断片をクローン化し、同様にその塩基配列を決定した。
ラムダDASHベクター（Stratagene）のラットゲノムライ
ブラリーを32Pラベルした5.71−３および5.71−５配列
をプローブにスクリーニングした。これらのファージク
ローンのクロスハイブリダイズする制限断片をプラスミ
ドベクターにサブクローン化し、シークエンスして、図
２に示す相同性を導きだした。塩基配列決定は、G.デル
サル（G.Del Sal）,G.マンフィオレッティ（G.Manfiole
tti）およびC.シュナイダー（C.Schneider）,Biotechni
ques 7:514,1989に記載されているように、非修飾T7ポ
リメラーゼを用いて行なった。
ンを部分的にシークエンスしたが、この配列情報だけで
はエクソンを予想することは不可能であることがわかっ
た。そこで、我々は異種間ハイブリダイズしたラットの
断片をクローン化し、同様にその塩基配列を決定した。
ラムダDASHベクター（Stratagene）のラットゲノムライ
ブラリーを32Pラベルした5.71−３および5.71−５配列
をプローブにスクリーニングした。これらのファージク
ローンのクロスハイブリダイズする制限断片をプラスミ
ドベクターにサブクローン化し、シークエンスして、図
２に示す相同性を導きだした。塩基配列決定は、G.デル
サル（G.Del Sal）,G.マンフィオレッティ（G.Manfiole
tti）およびC.シュナイダー（C.Schneider）,Biotechni
ques 7:514,1989に記載されているように、非修飾T7ポ
リメラーゼを用いて行なった。
ラットとヒトの対応する領域の配列を比較したとこ
ろ、サブクローン5.71−３から一つ、サブクローン5.71
−５から一つの推定エクソンが同定された（図２）。こ
れらは、それぞれオープンリーディングクレーム（OR
F）を含んでおり、それぞれ種を超えて保存されたスプ
ライスアクセプター部位とドナー部位に挟まれていた。
ラットおよびヒトのエクソンから予想されるORFは、ア
ミノ酸レベルで96％、ヌクレオチドレベルで89％同一
で、ヌクレオチドの違いの大半はコドンの３文字目によ
るものであった。２つの推定エクソンはゲノムDNA上で2
kb以上、離れている。
ろ、サブクローン5.71−３から一つ、サブクローン5.71
−５から一つの推定エクソンが同定された（図２）。こ
れらは、それぞれオープンリーディングクレーム（OR
F）を含んでおり、それぞれ種を超えて保存されたスプ
ライスアクセプター部位とドナー部位に挟まれていた。
ラットおよびヒトのエクソンから予想されるORFは、ア
ミノ酸レベルで96％、ヌクレオチドレベルで89％同一
で、ヌクレオチドの違いの大半はコドンの３文字目によ
るものであった。２つの推定エクソンはゲノムDNA上で2
kb以上、離れている。
プライマーはこの２つの推定エクソンに由来する。こ
れらのプライマーを用いてcDNAを鋳型としてPCRを行う
と、エクソンが細胞内でRNAスプライシングによってつ
ながっている場合、推定エクソンが検出される。RNA調
製品にゲノムDNAが混入しても、この分析法には影響し
ない。なぜなら、介在イントロンによって、ゲノムDNA
からPCR産物はスプライシングを受けたRNAからの産物よ
りもずっと長くなるからである。
れらのプライマーを用いてcDNAを鋳型としてPCRを行う
と、エクソンが細胞内でRNAスプライシングによってつ
ながっている場合、推定エクソンが検出される。RNA調
製品にゲノムDNAが混入しても、この分析法には影響し
ない。なぜなら、介在イントロンによって、ゲノムDNA
からPCR産物はスプライシングを受けたRNAからの産物よ
りもずっと長くなるからである。
当初、我々は推定エクソンが互いにどのような向きに
なっているのか、わからなかった。それ故、このエクソ
ン連結（exon−connection）計画のために２セットのプ
ライマーを設計した。一つのセット（プライマーP1およ
びP4;図２）では、5.71−５のエクソンが5.71−３のエ
クソンの上流にある場合に、PCR産物が生じるようにし
た。もう一方のセット（プライマーP2およびP3;図２）
では、２つのエクソンがその逆の方向にある場合に、PC
R産物が検出されるようにした。
なっているのか、わからなかった。それ故、このエクソ
ン連結（exon−connection）計画のために２セットのプ
ライマーを設計した。一つのセット（プライマーP1およ
びP4;図２）では、5.71−５のエクソンが5.71−３のエ
クソンの上流にある場合に、PCR産物が生じるようにし
た。もう一方のセット（プライマーP2およびP3;図２）
では、２つのエクソンがその逆の方向にある場合に、PC
R産物が検出されるようにした。
ベーカー（Baker）ら,Cancer Research,vol.50,pg.77
17（1990）に記載されているように、95℃ 0.5分、55
℃ ２分、および70℃ ２分を35サイクルを用いてPCR
を行った。正常なヒトの直腸からのmRNAに由来するcDNA
を鋳型として用いたところ、最初の組合せ（プライマー
P1とP4）によってのみ、PCR産物が生じることがわかっ
た。PCR産物は、ヒトおよびラットのゲノムDNA配列で同
定されたスプライス部位で２つの推定エクソンが直接ス
プライシングを受けた場合に予想されるサイズ（226b
p）とぴったり一致した。PCR産物のクローン化及び塩基
配列の決定から、これが5.71−５エクソンと5.71−３エ
クソンの間で直接スプライシングを受けて生じたもので
あることが確認された。このスプライシングを受けた産
物は、各エクソンからのORFをイン−フレーム（in−fra
me）で融合させたものを産生していた。我々は、これら
の配列がまさに発現している遺伝子を表わしているもの
と結論し、以降、本明細書中では結腸直腸癌において変
異しているものということから、MCC（mutated in colo
rectal cancer）遺伝子と呼ぶこととした。エクソン連
結法を用いて、我々は、MCCがラットの正常組織の大半
（例えば、直腸、脳、胃、肺、肝臓、腎臓、膀胱、心
臓）で発現していることを見いだした。
17（1990）に記載されているように、95℃ 0.5分、55
℃ ２分、および70℃ ２分を35サイクルを用いてPCR
を行った。正常なヒトの直腸からのmRNAに由来するcDNA
を鋳型として用いたところ、最初の組合せ（プライマー
P1とP4）によってのみ、PCR産物が生じることがわかっ
た。PCR産物は、ヒトおよびラットのゲノムDNA配列で同
定されたスプライス部位で２つの推定エクソンが直接ス
プライシングを受けた場合に予想されるサイズ（226b
p）とぴったり一致した。PCR産物のクローン化及び塩基
配列の決定から、これが5.71−５エクソンと5.71−３エ
クソンの間で直接スプライシングを受けて生じたもので
あることが確認された。このスプライシングを受けた産
物は、各エクソンからのORFをイン−フレーム（in−fra
me）で融合させたものを産生していた。我々は、これら
の配列がまさに発現している遺伝子を表わしているもの
と結論し、以降、本明細書中では結腸直腸癌において変
異しているものということから、MCC（mutated in colo
rectal cancer）遺伝子と呼ぶこととした。エクソン連
結法を用いて、我々は、MCCがラットの正常組織の大半
（例えば、直腸、脳、胃、肺、肝臓、腎臓、膀胱、心
臓）で発現していることを見いだした。
実施例４
本実施例は、ヒトMCC cDNAの脳からの単離および塩
基配列の決定を示す。
基配列の決定を示す。
ヒトcDNAを鋳型に用いて増幅したPCR産物を、次に、
ラベルし、これをプローブとして正常なヒトの脳からの
cDNAライブラリーをスクリーニングした。脳を選んだの
は、エクソン連結分析によって脳においてMCCが高レベ
ルで発現していることが示唆されたからである。U.ガブ
ラー（U.Gubler）およびB.J.ホフマン（B.J.Hoffman）,
Gene 25,263（1983）に記載されたヒト脳mRNAおよびラ
ムダZapベクター（Stratagene）からcDNAライブラリー
を構築した。5.71−３と5.71−５のエクソンを連結させ
たPCR産物（図２参照）を用いて1.5×106個のプラーク
をスクリーニングした。
ラベルし、これをプローブとして正常なヒトの脳からの
cDNAライブラリーをスクリーニングした。脳を選んだの
は、エクソン連結分析によって脳においてMCCが高レベ
ルで発現していることが示唆されたからである。U.ガブ
ラー（U.Gubler）およびB.J.ホフマン（B.J.Hoffman）,
Gene 25,263（1983）に記載されたヒト脳mRNAおよびラ
ムダZapベクター（Stratagene）からcDNAライブラリー
を構築した。5.71−３と5.71−５のエクソンを連結させ
たPCR産物（図２参照）を用いて1.5×106個のプラーク
をスクリーニングした。
一次スクリーニングで1.5×106個のプラークから３つ
のクローンが同定された。次に、これら３つのクローン
の両端を用いてライブラリーを再スクリーニングし、最
終的に７つのオーバーラップcDNAクローンのシリーズを
単離し、順序を決定した。これらのクローンの配列解析
から、これらが4,180bpのMCC mRNAを持ち、2,511bpのO
RFが含まれることが示された（図３）。ORFの最初のメ
チオニン（ヌクレオチド220）の上流にはイン−フレー
ムで終止コドンが存在し、コザック（Kozak）（Nucleic
Acids Research,vol.15,pg.8125（1987））によって定
義されたコンセンサスな開始部位に非常によく一致して
いる。このメチオニンから翻訳が開始されていれば、ヌ
クレオチド220から2707によってコードされる829アミノ
酸からなる産物（93kd）が配列から予想される。ORFは
最低200bpの5'非翻訳配列と1450bpの3'非翻訳配列に挟
まれている。いづれのクローンの3'末端にもポリアデニ
ル化による延長の証拠は見られなかった。cDNAプローブ
はノザンブロットにおいていくつかのサイズのRNA（３
−10kb）を検出したが；これら他の転写産物が、MCC遺
伝子の別のスプライシングの形によるものなのか、ある
いは他の遺伝子座からの類似遺伝子によるものなのかは
不明である。
のクローンが同定された。次に、これら３つのクローン
の両端を用いてライブラリーを再スクリーニングし、最
終的に７つのオーバーラップcDNAクローンのシリーズを
単離し、順序を決定した。これらのクローンの配列解析
から、これらが4,180bpのMCC mRNAを持ち、2,511bpのO
RFが含まれることが示された（図３）。ORFの最初のメ
チオニン（ヌクレオチド220）の上流にはイン−フレー
ムで終止コドンが存在し、コザック（Kozak）（Nucleic
Acids Research,vol.15,pg.8125（1987））によって定
義されたコンセンサスな開始部位に非常によく一致して
いる。このメチオニンから翻訳が開始されていれば、ヌ
クレオチド220から2707によってコードされる829アミノ
酸からなる産物（93kd）が配列から予想される。ORFは
最低200bpの5'非翻訳配列と1450bpの3'非翻訳配列に挟
まれている。いづれのクローンの3'末端にもポリアデニ
ル化による延長の証拠は見られなかった。cDNAプローブ
はノザンブロットにおいていくつかのサイズのRNA（３
−10kb）を検出したが；これら他の転写産物が、MCC遺
伝子の別のスプライシングの形によるものなのか、ある
いは他の遺伝子座からの類似遺伝子によるものなのかは
不明である。
ヌクレオチドデータベース（EMBLバージョン25、Genb
ankバージョン66）の検索から、この配列が以前に報告
されたものではないことが示された。アミノ酸ベース
（P.I.R.バージョン25、SWISS−Proteinバージョン16）
を予想MCC蛋白質（829アミノ酸）で検索しても、顕著な
相同蛋白質は見られなかった。しかし、我々は、Ｇ蛋白
質と共役しているヒトおよびブタのムスカリン性アセチ
ルコリン受容体とMCCとの間に19アミノ酸にわたる相同
性があることに気づいた。
ankバージョン66）の検索から、この配列が以前に報告
されたものではないことが示された。アミノ酸ベース
（P.I.R.バージョン25、SWISS−Proteinバージョン16）
を予想MCC蛋白質（829アミノ酸）で検索しても、顕著な
相同蛋白質は見られなかった。しかし、我々は、Ｇ蛋白
質と共役しているヒトおよびブタのムスカリン性アセチ
ルコリン受容体とMCCとの間に19アミノ酸にわたる相同
性があることに気づいた。
実施例５
本実施例は、結腸直腸癌組織のMCC遺伝子中で体細胞
突然変異が生じることを示す。
突然変異が生じることを示す。
MCCの配列を腫瘍T14のゲノムクローンの配列と比較し
たところ、この腫瘍の再編成の境界がMCC遺伝子の内
側、ヌクレオチド534から676を含むエクソンのすぐ先の
イントロンにあることが判明した。さきに述べたよう
に、新たな11kbの制限断片は、通常では100kb以上も離
れている第５染色体上の配列がつながったために生じ
た。この100kbの間にはMCC遺伝子のエクソンがいくつか
含まれていた。従って、MCC遺伝子は、この腫瘍では遺
伝子変更によって破壊され、再編成したMCC遺伝子から
はいくつかのエクソンが取り除かれた。
たところ、この腫瘍の再編成の境界がMCC遺伝子の内
側、ヌクレオチド534から676を含むエクソンのすぐ先の
イントロンにあることが判明した。さきに述べたよう
に、新たな11kbの制限断片は、通常では100kb以上も離
れている第５染色体上の配列がつながったために生じ
た。この100kbの間にはMCC遺伝子のエクソンがいくつか
含まれていた。従って、MCC遺伝子は、この腫瘍では遺
伝子変更によって破壊され、再編成したMCC遺伝子から
はいくつかのエクソンが取り除かれた。
他のより微妙なMCCの遺伝子変更を検索するために、
我々はポリメラーゼ連鎖反応を用いて結腸直腸癌のMCC
遺伝子のエクソンを増幅した。つぎに、多くのサンプル
を迅速に試験できるよう改変されたRNaseプロテクショ
ンアッセイによって、これらの配列に突然変異が含まれ
ていないか分析した。簡単に述べると、エクソンおよび
周囲のイントロンの配列を決定し、それを用いてエクソ
ンおよびそれを挟むスプライス部位を増幅するためのプ
ライマーを設計する。ついで、PCRを用いて腫瘍からエ
クソンを増幅した。
我々はポリメラーゼ連鎖反応を用いて結腸直腸癌のMCC
遺伝子のエクソンを増幅した。つぎに、多くのサンプル
を迅速に試験できるよう改変されたRNaseプロテクショ
ンアッセイによって、これらの配列に突然変異が含まれ
ていないか分析した。簡単に述べると、エクソンおよび
周囲のイントロンの配列を決定し、それを用いてエクソ
ンおよびそれを挟むスプライス部位を増幅するためのプ
ライマーを設計する。ついで、PCRを用いて腫瘍からエ
クソンを増幅した。
MCC cDNAプローブでヒトゲノムDNAライブラリーをス
クリーニングした後、エクソンの境界部分の配列を導き
だした。ポジティブにハイブリダイズしたクローンを単
離し、小さな断片（0.2−3kb）にサブクローン化して塩
基配列を決定した。エクソンを増幅するプライマーは、
スプライス部位の外側で選択され、その配列は以下の通
りである：ヌクレオチド391−533を含むエクソンに対す
る、5'−GAATTCATCAGCACTTCT−3'（SEQ ID NO:3）およ
び5'−CAGCTCCAAGATGGAGGG−3'（SEQ ID NO:4）、ヌク
レオチド1575−1678を含むエクソンに対する、5'−GGCC
CCATGTGCTTTGTT−3'（SEQ ID NO:5）および5'−AGAGGGA
CTCTGGAGACA−3'（SEQ ID NO:6）、ヌクレオチド1679−
1862を含むエクソンに対する、5'−ATGTTGATTAATCCGTTG
GC−3'（SEQ ID NO:7）および5'−ACCCCAGAGCAGAAGGCT
−3'（SEQ ID NO:8）、ヌクレオチド2305−2405を含む
エクソンに対する、5'−GGCCTAACTGGAATGTGT−3'（SEQ
ID NO:9）および5'−GCCCAGATAAACACCAGC−3'（SEQ ID
NO:10）。PCRは上記の通りに行った。
クリーニングした後、エクソンの境界部分の配列を導き
だした。ポジティブにハイブリダイズしたクローンを単
離し、小さな断片（0.2−3kb）にサブクローン化して塩
基配列を決定した。エクソンを増幅するプライマーは、
スプライス部位の外側で選択され、その配列は以下の通
りである：ヌクレオチド391−533を含むエクソンに対す
る、5'−GAATTCATCAGCACTTCT−3'（SEQ ID NO:3）およ
び5'−CAGCTCCAAGATGGAGGG−3'（SEQ ID NO:4）、ヌク
レオチド1575−1678を含むエクソンに対する、5'−GGCC
CCATGTGCTTTGTT−3'（SEQ ID NO:5）および5'−AGAGGGA
CTCTGGAGACA−3'（SEQ ID NO:6）、ヌクレオチド1679−
1862を含むエクソンに対する、5'−ATGTTGATTAATCCGTTG
GC−3'（SEQ ID NO:7）および5'−ACCCCAGAGCAGAAGGCT
−3'（SEQ ID NO:8）、ヌクレオチド2305−2405を含む
エクソンに対する、5'−GGCCTAACTGGAATGTGT−3'（SEQ
ID NO:9）および5'−GCCCAGATAAACACCAGC−3'（SEQ ID
NO:10）。PCRは上記の通りに行った。
生じたPCR産物を、正常なMCC配列を持つin vitroで作
製したRNAプローブにハイブリダイズさせた。このハイ
ブリッドをRNase Ａで消化することで、DNA−RNAハイ
ブリッド中の一塩基対ミスマッチの部分を切断し、これ
らの切断産物を変性ゲル電気泳動後に視覚化した。各エ
クソンに対しRNaseプロテクション分析を独立に２回
（一方はセンス鎖を、もう一方はアンチセンス鎖をラベ
ルした転写物に用いた）行った。こうした条件下では、
全ての点突然変異の内、約50％が検出可能である。R.M.
メイヤーズとT.マニアティス（Maniatis）,Cold Spring
Harbor Symposia on Quantitative Biology,51,275（1
986）． ウィンターら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.82,pg.7
575（1985）による記載に以下に示す改変を加えて、RNa
seプロテクションアッセイを行った：ハイブリダイゼー
ションを、１μｌの適当なPCR反応液と32Pラベルした転
写物（200,000dpm）を含むハイブリダイゼーション溶液
９μｌ中で、50℃で２時間行った。
製したRNAプローブにハイブリダイズさせた。このハイ
ブリッドをRNase Ａで消化することで、DNA−RNAハイ
ブリッド中の一塩基対ミスマッチの部分を切断し、これ
らの切断産物を変性ゲル電気泳動後に視覚化した。各エ
クソンに対しRNaseプロテクション分析を独立に２回
（一方はセンス鎖を、もう一方はアンチセンス鎖をラベ
ルした転写物に用いた）行った。こうした条件下では、
全ての点突然変異の内、約50％が検出可能である。R.M.
メイヤーズとT.マニアティス（Maniatis）,Cold Spring
Harbor Symposia on Quantitative Biology,51,275（1
986）． ウィンターら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.82,pg.7
575（1985）による記載に以下に示す改変を加えて、RNa
seプロテクションアッセイを行った：ハイブリダイゼー
ションを、１μｌの適当なPCR反応液と32Pラベルした転
写物（200,000dpm）を含むハイブリダイゼーション溶液
９μｌ中で、50℃で２時間行った。
90μｌのRNase溶液（0.2M NaCl,0.1M LiCl,20mM Tris
−HCl,pH7.5,1mM EDTA,25μg/ml RNase A）を加えるこ
とでRNase処理を開始し、37℃で１時間インキュベート
した。プロテネースＫ溶液（5mg/mlプロテネースＫを含
む10％SDS溶液）を加えてRNase処理を停止させ、37℃で
１時間インキュベートした。
−HCl,pH7.5,1mM EDTA,25μg/ml RNase A）を加えるこ
とでRNase処理を開始し、37℃で１時間インキュベート
した。プロテネースＫ溶液（5mg/mlプロテネースＫを含
む10％SDS溶液）を加えてRNase処理を停止させ、37℃で
１時間インキュベートした。
次に、溶液をPC9（フェノールとクロロホルムの3:4の
混合液に、0.5M Tris−HCl,pH9.0,10mM EDTA,10mM NaCl
を２の割合だけ加えて平衡化したもの）で一回抽出し、
20μｌの水層を回収し、20μｌのローディングバッファ
ー（0.3％ w/vキシレンシアノール、0.3％ w/vブロモフ
ェノールブルーのホルムアミド溶液）と混合した。次に
この試料を94℃で４分間加熱し、変性ポリアクリルアミ
ドゲルに乗せた。各エクソンにつき、各鎖を標識転写物
として用いて２回のアッセイを独立に行った。
混合液に、0.5M Tris−HCl,pH9.0,10mM EDTA,10mM NaCl
を２の割合だけ加えて平衡化したもの）で一回抽出し、
20μｌの水層を回収し、20μｌのローディングバッファ
ー（0.3％ w/vキシレンシアノール、0.3％ w/vブロモフ
ェノールブルーのホルムアミド溶液）と混合した。次に
この試料を94℃で４分間加熱し、変性ポリアクリルアミ
ドゲルに乗せた。各エクソンにつき、各鎖を標識転写物
として用いて２回のアッセイを独立に行った。
試験した４つのエクソンの内、最初のエクソン（ヌク
レオチド391−533を含む）に関しては、試験した100の
結腸直腸癌の中には変異が見られなかった。ヌクレオチ
ド1575−1678を含むエクソンの解析から、RNaseプロテ
クションパターンに関して同一の変異を持つ腫瘍が５つ
同定された。この５つの腫瘍のうちの２つの変異PCR産
物をクローン化し塩基配列を決定したところ、プロリン
からロイシンへのコード変化をもたらすＣからＴへの変
異がヌクレオチド1676で起きていることが、この変異の
原因であることが示された。この変異が５つの個体で見
られたこと、この変異を示す腫瘍を持つ５人の患者の２
人から単離した正常組織のDNAにもこの変異が存在した
（他の３人については試験していない）ことから、この
変異はおそらく多型によるものと考えられる。
レオチド391−533を含む）に関しては、試験した100の
結腸直腸癌の中には変異が見られなかった。ヌクレオチ
ド1575−1678を含むエクソンの解析から、RNaseプロテ
クションパターンに関して同一の変異を持つ腫瘍が５つ
同定された。この５つの腫瘍のうちの２つの変異PCR産
物をクローン化し塩基配列を決定したところ、プロリン
からロイシンへのコード変化をもたらすＣからＴへの変
異がヌクレオチド1676で起きていることが、この変異の
原因であることが示された。この変異が５つの個体で見
られたこと、この変異を示す腫瘍を持つ５人の患者の２
人から単離した正常組織のDNAにもこの変異が存在した
（他の３人については試験していない）ことから、この
変異はおそらく多型によるものと考えられる。
３つめのエクソン（ヌクレオチド2305−2405）の解析
から、独特なRNaseプロテクションパターンを示す腫瘍
が１つ（T91）同定された。この異常なRNaseプロテクシ
ョンパターンは、同じ個体の正常組織から単離されたDN
Aには見られなかった（図４）。このことは、変更したR
Naseプロテクションパターンが体細胞性突然変異によっ
て生じたものであることを示している。T91腫瘍のPCR産
物をクローン化し塩基配列を決定したところ、アラニン
からバリンへのコード変化をもたらすＣからＴへの変異
がヌクレオチド2312で起きていることが示された。これ
は比較的保存性の高いアミノ酸置換であるが、同じアミ
ノ酸変化がp53癌抑制遺伝子を不活化することが示され
ている。S.J.ベーカーら、Science,vol.244,pg.217（19
89）;S.J.ベーカーら、Science,vol.249,pg.912（199
0）． ４つめのエクソン（ヌクレオチド1679−1862）の解析
から、独特なRNaseプロテクションパターンを示す腫瘍
が１つ（T35）同定された。同じ個体の正常組織から単
離されたDNAの検定から、この変更したRNaseプロテクシ
ョンパターンも体細胞性突然変異によって生じたもので
あることが示された（図４）。T35のPCR産物をクローン
化し塩基配列を決定したところ、アルギニンからグルタ
ミンへのコード変化をもたらすＧからＡへの変異がヌク
レオチド1736で起きていることが示された。
から、独特なRNaseプロテクションパターンを示す腫瘍
が１つ（T91）同定された。この異常なRNaseプロテクシ
ョンパターンは、同じ個体の正常組織から単離されたDN
Aには見られなかった（図４）。このことは、変更したR
Naseプロテクションパターンが体細胞性突然変異によっ
て生じたものであることを示している。T91腫瘍のPCR産
物をクローン化し塩基配列を決定したところ、アラニン
からバリンへのコード変化をもたらすＣからＴへの変異
がヌクレオチド2312で起きていることが示された。これ
は比較的保存性の高いアミノ酸置換であるが、同じアミ
ノ酸変化がp53癌抑制遺伝子を不活化することが示され
ている。S.J.ベーカーら、Science,vol.244,pg.217（19
89）;S.J.ベーカーら、Science,vol.249,pg.912（199
0）． ４つめのエクソン（ヌクレオチド1679−1862）の解析
から、独特なRNaseプロテクションパターンを示す腫瘍
が１つ（T35）同定された。同じ個体の正常組織から単
離されたDNAの検定から、この変更したRNaseプロテクシ
ョンパターンも体細胞性突然変異によって生じたもので
あることが示された（図４）。T35のPCR産物をクローン
化し塩基配列を決定したところ、アルギニンからグルタ
ミンへのコード変化をもたらすＧからＡへの変異がヌク
レオチド1736で起きていることが示された。
配列表
（２）SEQ ID NO:1の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:4181塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:cDNA
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:1:
（２）SEQ ID NO:2の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:829アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（xi） 配列:SEQ ID NO:2:
（２）SEQ ID NO:3の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:3:
（２）SEQ ID NO:4の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:4:
（２）SEQ ID NO:5の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:5:
（２）SEQ ID NO:6の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:6:
（２）SEQ ID NO:7の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:7:
（２）SEQ ID NO:8の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:8:
（２）SEQ ID NO:9の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:9:
（２）SEQ ID NO:10の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（xi） 配列:SEQ ID NO:10:
（２）SEQ ID NO:11の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:24アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類：ペプチド
（iii）ハイポセティカル:YES
（iv） アンチセンス:NO
（ｖ） フラグメント型：中間部フラグメント
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（xi） 配列:SEQ ID NO:11:
（２）SEQ ID NO:12の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:206塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:32..172
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:exon
（Ｂ）存在位置:32..174
（xi） 配列:SEQ ID NO:12:
（２）SEQ ID NO:13の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:47アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（xi） 配列:SEQ ID NO:13:
（２）SEQ ID NO:14の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:206塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名:Rattus rattus
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:exon
（Ｂ）存在位置:32..174
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号CDS
（Ｂ）存在位置:32..172
（xi） 配列:SEQ ID NO:14:
（２）SEQ ID NO:15の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:47アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（xi） 配列:SEQ ID NO:15:
（２）SEQ ID NO:16の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:208塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名：ホモサピエンス
（viii）ゲノム中の位置
（Ａ）染色体／セグメント:5q21
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:35..175
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号exon
（Ｂ）存在位置:34..176
（xi） 配列:SEQ ID NO:16:
（２）SEQ ID NO:17の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:47アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（xi） 配列:SEQ ID NO:17:
（２）SEQ ID NO:18の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:208塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類:DNA（ゲノミック）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv） アンチセンス:NO
（vi） 起源：
（Ａ）生物名:Rattus rattus
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:exon
（Ｂ）存在位置:34..176
（ix） 配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号CDS
（Ｂ）存在位置:35..175
（xi） 配列:SEQ ID NO:18:
（２）SEQ ID NO:19の情報
（ｉ） 配列の特定：
（Ａ）配列の長さ:47アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直線状
（ii） 配列の種類：タンパク質
（xi） 配列:SEQ ID NO:19:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(73)特許権者 000173588
財団法人癌研究会
東京都豊島区上池袋１丁目37番１号
(72)発明者 ヴォーゲルスタイン，バート
アメリカ合衆国メリーランド州21208,
ボルティモア，ブレトン・ウェイ 3700
(72)発明者 キンズラー，ケネス・ダブリュー
アメリカ合衆国メリーランド州21234,
ボルティモア，ハルスティード・ロード
1348
(72)発明者 ホワイト，レイモンド・エル
アメリカ合衆国ユタ州84103，ソルト・
レイク・シティ，エイティーンス・アベ
ニュー 711
(72)発明者 中村 祐輔
東京都清瀬市松山１−43−３
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３月15日， ｖｏｌ．251， ｐ．1366
−1370
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C07K 14/82
C07K 16/32
C12N 15/09 ZNA
ＰｕｂＭｅｄ
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (30)
- 【請求項１】ヒトから単離された腫瘍である可能性が高
い組織において、MCC遺伝子の配列またはその発現産物
の、野生型MCC遺伝子の配列（SEQ ID No:1）からの変更
を、in vitroにおいて検出する方法。 - 【請求項２】発現産物がmRNA分子である、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】野生型MCC mRNAの変更が、該組織由来のmR
NAとMCC遺伝子プローブとのハイブリダイゼーションに
よって検出される、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】前記野生型MCC遺伝子のコード配列の変更
が、MCC遺伝子のコード配列プローブと該組織から単離
されたゲノムDNAとのハイブリダイゼーションによって
検出される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】ヒトの非新生物組織から単離されたゲノム
DNAに対して、MCC遺伝子のコード配列プローブを用いて
サザンハイブリダイゼーションを行い；そして MCC遺伝子プローブの該腫瘍組織と非新生物組織に対す
るハイブリダイゼーションを比較する； ことをさらに含む、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】MCC遺伝子プローブが制限酵素断片長多型
性（restriction fragment length polymorphism）を検
出する、請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】前記野生型MCC遺伝子のコード配列の変更
が、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reactio
n）を用いて該組織中のMCC遺伝子の全体若しくは一部の
配列を決定することによって検出され、決定されたMCC
配列がSEQ ID No:1に示された配列から変異しているこ
とを新生物化の指標とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】分子（１）該組織から単離されたMCC遺伝
子またはMCC mRNAと、分子（２）ヒト前記野生型MCC遺
伝子のコード配列に相補的な核酸プローブとを互いにハ
イブリダイズさせて二本鎖を形成させたときの両分子間
のミスマッチを同定することによって、前記野生型MCC
遺伝子のコード配列の変更を検出する、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項９】MCC遺伝子プローブが、（１）ヌクレオチ
ド2305−2405;および（２）ヌクレオチド1679−1862か
ら成るグループから選択されるエクソンとハイブリダイ
ズする、請求項４に記載の方法。 - 【請求項１０】該組織中のMCC遺伝子配列を増幅し、増
幅されたMCC配列をMCC配列を含む核酸プローブに対して
ハイブリダイズさせることによって、前記野生型MCC遺
伝子のコード配列の変更を検出する、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１１】該組織中のMCC遺伝子の分子クローン化
を行い、クローン化したMCC遺伝子の全体または一部の
塩基配列を決定することによって、前記野生型MCC遺伝
子のコード配列の変更を検出する、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１２】前記野生型MCC遺伝子のコード配列の変
更の検出が、欠失突然変異のスクリーニングを含む、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】前記野生型MCC遺伝子のコード配列の変
更の検出が、点突然変異のスクリーニングを含む、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１４】前記野生型MCC遺伝子のコード配列の変
更の検出が、挿入突然変異のスクリーニングを含む、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１５】ヒトから単離される組織が結腸粘膜に由
来する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】発現産物がタンパク質分子である、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１７】野生型MCCタンパク質の変更がイムノブ
ロッティングによって検出される、請求項16に記載の方
法。 - 【請求項１８】野生型MCCタンパク質の変更が免疫細胞
化学によって検出される、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１９】ポリメラーゼ連鎖反応によってMCC遺伝
子のヌクレオチド配列の決定に用いるための、一対の一
本鎖DNAプライマーであって、該プライマーの配列はSEQ
ID NO:1に記載した配列中の少なくとも18個の連続した
ヌクレオチドを有し、該プライマーをポリメラーゼ連鎖
反応において用いることによりSEQ ID No:1に示される
配列を有するDNAが合成される、上記一対の一本鎖DNAプ
ライマー。 - 【請求項２０】各５′末端に制限酵素部位を有する、請
求項19に記載のプライマー。 - 【請求項２１】MCCイントロンに対応する配列を有す
る、請求項19に記載の一対のプライマー。 - 【請求項２２】ヒト野生型MCC遺伝子（SEQ ID No:1）の
コード配列に相補的な核酸プローブ。 - 【請求項２３】SEQ ID No:1に示される（１）ヌクレオ
チド2305−2405;および（２）ヌクレオチド1679−1862
から成るグループから選択される、エクソンにハイブリ
ダイズする核酸プローブ。 - 【請求項２４】MCC遺伝子のコード配列の全てのヌクレ
オチドと全体としてハイブリダイズする一群の核酸プロ
ーブから構成される、野生型MCC遺伝子（SEQ ID No:1）
の変更を検出するためのキット。 - 【請求項２５】ヒトの体から単離されたサンプルにおけ
る、野生型MCC遺伝子（SEQ ID No:1）のコード配列また
はその発現産物の変更を検出し、該変更をそのヒトの新
生物組織の存在の指標とする； ことから成る、ヒトにおける新生物組織の存在を検出す
る方法。 - 【請求項２６】該体からのサンプルが、血清、大便、尿
および唾液から成るグループから選択される、請求項25
に記載の方法。 - 【請求項２７】血液および胎児組織から成るグループか
ら選択されるヒトから単離されたサンプル中の野生型MC
C遺伝子（SEQ ID No:1）のコード配列またはその発現産
物の変更を検出し、該変更を癌になりやすい素因の指標
とする； ことから成る、ヒトの癌に対する遺伝的素因を検出する
方法。 - 【請求項２８】SEQ ID NO:1に記載のMCC遺伝子のコード
配列を含むcDNA分子。 - 【請求項２９】ヒトMCCタンパク質のアミノ酸配列がSEQ
ID No:2に示すものに対応する、他のヒトタンパク質を
含まないヒトMCCタンパク質の調製品。 - 【請求項３０】SEQ ID NO:2に示されるヒトMCCタンパク
質に対して免疫反応性な抗体の調製品。
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2000
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