JPH09501045A - Ｄｃｃ遺伝子産物特異的抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＤＣＣの発現が非常に低いレベルであっても、生物学的な試料中のＤＣＣタンパク質を検出することができる抗体が開示されている。ＤＣＣの変化を検出する免疫学的な方法も開示されている。これらの薬剤及び方法により、個々の試験試料中のこの非常に大きな遺伝子を分析する必要なしにＤＣＣ変異の検出ができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＣＣ遺伝子産物特異的抗体 この発明は米国政府基金（ＮＩＨ ＣＡ−４３４６０）を使用してなされた。 政府はこの発明に対して権利を保有する。 発明の技術分野 この発明は癌の診断の領域に関する。特に、本発明は腫瘍サプレッサー遺伝子 ＤＣＣの発現を決定するための免疫学的な方法及び手段に関する。 発明の背景 ヒトの癌の成長は多段階の過程であると言われてきた（Foulds，Cancer Res.1 7:355-356(1957)；Nowell，Cancer Res．46:2203(1985)）。結腸での腫瘍発生は 分子レベルにおけるこの多段階仮説を調べる優秀なモデル系を提供する（Vogels tein,et al.，New Eng.J.Med．319:525(1988)）。結腸腫瘍は、正常な上皮から 、腺腫と呼ばれる良性の腫瘍を経て、癌として知られる悪性段階に到る組織病理 学的に確認できる状態が連続して進行する（Sugarbaker，Colorectal cancer: P rinciples and practices of Oncology(ed.V.T.Devita,S.Hellman,and S.A.Rose nberg)2nd edition pg.800．J.B.Lippincott，Philadelphia）。現在、この進行 段階で変化する数種の遺伝子が同定されている。この中には癌遺伝子（Ｋ−ｒａ ｓ）（Bos,et al.，Nature 327:293(1987)；Forrester,et al.，Nature 327:293 (1987)）及び腫瘍の進行中に優先順に変異する３つの腫瘍サプレッサー遺伝子（ ｐ５３、ＤＣＣ及びＡＰＣ）（Baker,et al.，Science 244:217(1989)；Fearon, et al.，Science 247:49(1990)；Kinzler,et al.，Science 253:661(1991)；Gro den,et al.，Cell 66:589(1991)）がある。腫瘍サプレッサー遺伝子ＤＣＣ（結 腸癌で失われている；deleted in colorectal carcinoma）は、染色体第１８番 の長い方のアームに位置しており、細胞表面タンパク質をコードしている。 ヒトの腫瘍における特定の染色体の頻繁かつ継続的な異型接合性の消失（ＬＯ Ｈ；loss of heterozygosity）は、失われた領域に含有されている腫瘍サプレッ サー遺伝子の存在と関連していた（Knudson,Cancer Res．45:1437(1985)；Frien d,et al.，Nature 323:643(1986)；Baker,et al.，Science 244:217(1989)）。 この関連性に基づいて、結腸腫瘍ＤＮＡ試料の全ての非−末端動原体性（non-ac rocentric）染色体のアームの異型接合性の消失を分析することによって、結腸 癌の進行において重要な潜在性腫瘍サプレッサー遺伝子の探索が行われた。この 研究から、非常に多くの結腸腫瘍における数種の染色体アームの異型接合性の消 失が明らかになった。その１つ、染色体第１８番の長いアームは、後期の腺腫の およそ４５％及び癌の７５％で失われていた（Vogelstein,et al.，New Eng.J.M ed．319:525(1988)）。消失した重要な領域を更に調べるために、１８ｑの全部 ではなく一部をなくした８種の癌を、染色体第１８番の長いアームの全長にわた る多くのプローブによって広範に調べた。消失した１つの共通の領域は１８ｑ２ １．３に集中していた。結腸癌ＤＮＡ試料の可能な変化をスクリーニングするた めに、この領域に位置することが予め示されていた遺伝子及び名前のないＤＮＡ セグメントのプローブを用いた。１つの名前のないプローブ、ｐ１５−６５によ り、１つの結腸癌における同型接合性の消失が検出された。同型接合性の消失は まれであり、腫瘍サプレッサー遺伝子をコードしている位置における腫瘍におい て報告された（Wolf and Rotter，Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A．82:790(1985)） 。これらの結果から、ｐ１５−６５は潜在性腫瘍サプレッサー遺伝子の中、ある いは少なくとも非常に近くにあることが強く示唆された。 従って、最後には３７０ｋｂの隣接するゲノムＤＮＡを包囲する二方向染色体 歩行の出発点としてｐ１５−６５を用いた。この歩行により、種間サザンブロッ ティング分析のプローブとして用いられる１１７個のEco RI断片が生成した。こ の断片の２４種が、調べた種の少なくとも１種にハイブリダイズした。進化段階 で保存された７種の断片からラット及びヒト同族体のものをクローニングし、配 列決定した。読み取り枠並びにエクソンとなり得る部分を示す５’及び３’のス プライス供与部位の存在について配列を調べた。ｃＤＮＡを増幅するポリメラー ゼ連鎖反応を利用してｍＲＮＡの感度のよい発現アッセイを開発した。これらの 研究から、結腸粘膜を含むほとんどの正常な組織における２つのエクソン候補の 発現が明らかになった。対照的に、１５から１７種の結腸癌ではこのエクソンの 発現ができなかった。これらのエクソンを含有する遺伝子は（結腸癌で消失(del eted in colorectal carcinoma)しているため）ＤＣＣと名付けられ、この結果 はＤＣＣが染色体１８ｑ上の標的腫瘍サプレッサー遺伝子を示す可能性と一致し ていた（Fearon,et al.，Science 247:49(1990)）。このｃＤＮＡをクローニン グしたところ、神経細胞の接着分子や他の細胞表面糖タンパク質に非常に類似し た独特な細胞質ドメインと細胞外の部分を有する、１４４７個のアミノ酸からな る貫膜タンパク質を予測するＤＣＣの核酸配列が見い出された（図１）。ヒトの 癌の多くの研究が、細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックスの接着を含む細胞 −細胞関係の異常、細胞接触による成長阻害の消失（Todaro and Green，J.Cell Biol．17:299(1963)）、秩序をなくした組織構造（Cotran,et al.，Robbins Pa thologic Basis of Disease 4th Edition pp.244，W.B.Saunders Company，Phil adelphia(1989)）を示していることから、これは興味ある結果であった。 ヒトの腫瘍における推測上の腫瘍サプレッサー遺伝子の体細胞変異は、分析さ れた腫瘍の成長におけるその重要性を示すものとされてきた（Baker,et al.，Sc ience 244:217(1989)）。ＤＣＣ遺伝子は欠失、挿入及び点突然変異を含む種々 のメカニズムで結腸癌において体細胞変異することが示されている（Fearon,eta l.，Science 247:49(1990)）。更なる変異の探索が進行中である。ＤＣＣ遺伝子 の体細胞変異を評価するための更に他の手段及び方法がこの分野で必要とされて いる。 発明の要約 ＤＣＣ遺伝子の体細胞変異を検出するための抗体の調製物を提供することが本 発明の目的である。 ヒトＤＣＣ遺伝子の変異を決定する免疫学的な方法を提供することが本発明の もう１つの目的である。 酵素結合イムノソルベント検定法を実施する際に使用する固相支持体を提供す ることが本発明の更に他の目的である。 ＤＣＣ遺伝子の体細胞変異の決定に有用な抗体を産生するハイブリドーマを提 供することが本発明の更に他の目的である。 本発明のこれら、または他の目的は以下に記載する１つまたはそれ以上の具体 例によって提供される。本発明の１つの具体例において、（１）ＤＣＣタンパク 質の細胞外ドメインまたは細胞質ドメイン上のエピトープと特異的に免疫反応し 、（２）神経細胞接着分子と交差反応しない抗体を実質上含有する抗体調製物が 提 供される。 本発明のもう１つの具体例において、ヒトのＤＣＣ遺伝子の変異を検出するた めの方法が提供される。この方法は以下の段階からなる：組織及び体液からなる 群から選ばれた試料からタンパク質を抽出する；該抽出されたタンパク質をポリ アクリルアミドゲルで分離する；該分離したタンパク質をフィルター上にブロッ ティングする；該フィルターを（１）ＤＣＣタンパク質と特異的に免疫反応し、 （２）神経細胞接着分子と交差反応しない抗体と接触させ、該抗体を該フィルタ ーにブロットされたタンパク質に結合させる；該タンパク質に結合した抗体を検 出する、ここでＤＣＣの大きさを有するタンパク質への抗体の結合がないときは 試料中のＤＣＣ変異の存在が示唆される。 本発明の更に１つの具体例において、ヒトにおけるＤＣＣ変異の存在を決定す る方法が提供される。この方法は以下の段階からなる：ヒトの体試料を（１）Ｄ ＣＣのエピトープに特異的に免疫反応し、（２）神経細胞接着性分子と交差反応 しない最初の抗体と接触させて該体試料の成分を該抗体に結合させる；該体試料 に結合した抗体の量を決定する、ここで該体試料への該抗体の結合がないときは ヒトにおけるＤＣＣ変異の存在が示唆される。 本発明の更に他の具体例において、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩ ＳＡ）の実施に際して利用する固相支持体が提供される。固相支持体は（１）Ｄ ＣＣの細胞外ドメイン内にあるエピトープと特異的に免疫反応し、（２）神経細 胞接着分子と交差反応しない抗体で被覆される。 本発明の更に他の具体例において、ハイブリドーマ細胞が提供される。ハイブ リドーマ細胞は、（１）ＤＣＣの細胞外または細胞内ドメイン内にあるエピトー プと特異的に免疫反応し、（２）神経細胞接着分子と交差反応しない抗体を分泌 する。 本発明はこのようにヒト組織におけるＤＣＣの変異の状態を評価するための免 疫学的な方法及び試薬を提供する。 発明の詳細な説明 ＤＣＣタンパク質に免疫学的に特異的な抗体が単離できることは本発明の発見 である。ＤＣＣはＮＣＡＭｓ（神経細胞接着分子）に実質的に相同性を有するこ とが知られていた；それでもなおＤＣＣと反応するがＮＣＡＭｓと反応しない抗 体が見い出された。こうした抗体は診断に利用することができる。ＤＣＣは正常 結腸上皮の分化した細胞の１つの型であるゴブレット細胞（goblet cells）で発 現していることが決定された。しかしながら、ＤＣＣの発現はある種の結腸腫瘍 の進行段階で失われる。（非−粘液性癌及び末期の腺腫はＤＣＣ発現を消失して いる。）正常な結腸細胞において、ノーザンブロッティングによってＤＣＣに特 異的なｍＲＮＡが検出できなかったのに、抗体が正常結腸細胞におけるＤＣＣ発 現を検出する能力をもっていたことは予想に反することであった。本発明の抗体 は結腸試料のＤＣＣ発現を調べるために利用することができる。ＤＣＣ発現がな いことは、結腸腫瘍の段階を示すと共に、予後が良くないことと関連している。 ＤＣＣの読み取り枠（ＯＲＦ）の５’−末端には、膜結合性タンパク質で見ら れるシグナル配列を思わせる２５個のアミノ酸からなる最初の疎水性の配列があ り、次に神経細胞接着分子（ＮＣＡＭｓ）及び他の関連細胞表面糖タンパク質に 非常に相同性のある７２５個のアミノ酸が続く。ＤＣＣタンパク質はまた、４個 の免疫グロブリン様Ｃ２ドメイン及び６個のフィブロネクチンタイプIIIドメイ ンからなる１１００個のアミノ酸の細胞外ドメイン、及び３２４個のアミノ酸の 細胞内（細胞質）ドメインを有する。細胞質ドメインは、Genbankデータベース のいずれの配列に対しても顕著な相同性を有していない。 ＤＣＣ ｃＤＮＡ配列の種々の部分を含有する細菌融合タンパク質に対してポ リクローナル抗体を作成した。ラクトパーオキシダーゼ法によって細胞表面タン パク質をヨウ素標識し、次いで抗−ＤＣＣ抗体で免疫沈降させてＤＣＣの細胞表 面標識を実証した。ＤＣＣを高レベルに発現する形質転換細胞系の免疫細胞化学 から、細胞−細胞接触領域に強い染色を示す分散した染色パターンが示された。 このことから、高濃度のタンパク質がこれらの細胞接着部位に局在することが示 唆される。 本発明の１つの観点に従って抗体を提供する。診断上有用な２種の型の抗体を 調製した。一方の型はＤＣＣタンパク質の細胞外ドメイン、すなわちアミノ酸２ ６−１１２６（配列ＩＤ ＮＯ：２）上のエピトープと特異的に免疫反応するが 、 神経細胞接着分子と交差反応しない。他方の型はＤＣＣの細胞内ドメイン、すな わちアミノ酸１１２３−１４４７（配列ＩＤ ＮＯ：２）の中にあるエピトープ と特異的に免疫反応するが、やはり神経細胞接着分子と交差反応しない。細胞外 ドメイン部分をコードするＤＣＣ遺伝子の一部は塩基対１１９５−２８５４（配 列ＩＤ ＮＯ：１）からなる。もう１つの部分は塩基対１−３１８９（配列ＩＤ ＮＯ：１）を含有する。ＤＣＣのこれらの部分または他の部分を含有するキメ ラ遺伝子を構築することができる。融合タンパク質を発現させ、既知の方法に従 って精製することができる。融合タンパク質は動物を免疫化してポリクローナル またはモノクローナル抗体を作らせるために利用することができる。本発明に従 い、the American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville, MD 20852(ATCC)にそれぞれＨＢ１１２８９及び１１２９９として寄託されたハイ ブリドーマ細胞系ＡＦ５及びＡＦ１は、２種のモノクローナル抗体を作成する。 これらの細胞系と同じエピトープ特異性を有する抗体を分泌する他の細胞系を単 離することができる。これらはイソタイプを交換した変異型の抗体、抗−抗−イ ディオタイプ抗体、あるいは独立して得られる抗体のいずれでも良い。例として Spira et al.，(1985)“体細胞変異を通してのより良いモノクローナル抗体の作 成（The Generation of Better Monoclonal Antibodies Through Somatic Mutat ions）”，Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine(ed.Spring er)，pp.77-78，Plenum Press,N.Y.参照。 本発明に従って、多くの異なる免疫学的アッセイが可能となる。こうしたアッ セイの１つはタンパク質が試験試料から抽出されるウエスタンブロットである。 試験試料は癌性または正常な組織、あるいは血清、血液、尿、喀痰、唾液、ふん 便等の体液のいずれでも良い。ＤＣＣタンパク質に特異的に免疫反応する抗体の いずれも利用することができる。もしＤＣＣの大きさを有するタンパク質がウエ スタンブロットで存在しなければ、ヒトの試料提供者におけるＤＣＣの変異が示 唆される。ＤＣＣは分子量が１５３ｋｄであると予想されているが、１８０ｋｄ 及び１９０ｋｄのタンパク質のような種々のより大きなバンドが観察されている 。この大きさの変化はＮ−グリコシル化によるものである。 他の免疫学的アッセイの型も利用できる。これらには免疫組織化学、ＥＬＩＳ Ａ、免疫沈降がある。体試料は、ＤＣＣのエピトープと特異的に免疫反応し、神 経細胞接着分子と交差反応しない抗体との免疫反応性を調べられる。体試料とし ては末梢血単核細胞のような固定した細胞試料、固定または凍結した組織切片、 細胞または組織の抽出物、血清、血液、尿、喀痰、唾液、ふん便等の体液がある 。体試料及び抗体は抗体−抗原複合体が形成し、かつ安定である条件下で接触さ せる。こうした条件はこの分野では既知である。あるアッセイ条件のもとではＤ ＣＣの細胞外ドメイン内にあるエピトープに結合する抗体を用いる必要があるか も知れない。他のアッセイ条件においては、ＤＣＣの細胞内ドメイン内にあるエ ピトープに結合する抗体を用いる必要があるかも知れない。組織切片の免疫組織 化学では後者の型の抗体が好ましいように思われる。調べる組織試料に隣接する 正常組織を集めて調べることもまた必要であるかも知れない。隣接した正常組織 で抗−ＤＣＣ抗体への結合が示された場合には、試験した組織試料における結合 の欠如はＤＣＣ変異を示すものとして確認することができる。 ＥＬＩＳＡアッセイの場合には、抗体または体試料のアッセイを行う固相支持 体に付けることができる。本発明の１つの観点に従って、典型的にはミクロタイ ターディッシュまたはディップスティックである固相支持体は、ＤＣＣと特異的 に免疫反応する抗体で被覆される。固相支持体は免疫学的なアッセイで典型的に 利用されるプラスティック、ガラス、または他の重合性物質等のいずれの物質で も良い。支持体の形態はシート、ウェル、チューブ、ビーズ、ファブリック等で 良い。 実施例 実施例１ この実施例ではポリクローナル抗−ＤＣＣ抗体の調製について記載する。 ＤＣＣ ｃＤＮＡの選択された部分を用いて、ＤＣＣの重複しないエピトープ を含有する細菌融合タンパク質に対する２種のウサギのポリクローナル抗体を作 成した。一方は細胞外ドメインの１．６５ｋｂの部分（ヌクレオチド５９１−１ ２３９、配列ＩＤ ＮＯ：１）に対して作られ、他方は全細胞質ドメイン（ヌク レオチド３３０９−４４５３、配列ＩＤ ＮＯ：１）に対して作られた。細菌融 合タンパク質はＤＣＣ ｃＤＮＡの非−重複部分でｐＡＴＨベクター（Kinzler, et al.，Molecular and Cellular Biology，10:649-642，1990）内に構築した。 融合タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで単離し、ウサギに皮下注射 した。ｐＧＥＭＥＸ発現ベクター中の構築物から得られた細菌融合タンパク質を 用いて抗血清をアフィニティー精製した。実施例２ この実施例では検出し得るレベルのＤＣＣ遺伝子産物を発現する細胞系及び組 織のスクリーニングについて、またその細胞における存在部位の決定について記 載する。 組織培養細胞系を³⁵Ｓ−メチオニンで４時間３７℃で代謝的に標識した。細胞 を変性条件下でＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ Tris(ｐＨ７．５)及び０．５％ＳＤ Ｓ）に溶解させた。アフィニティー精製した抗−ＤＣＣ抗体及びプロテインＡセ ファロースビーズでおよそ２００×１０⁶の放射性カウントが免疫沈降した。試 料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。 ウエスタンブロットのために、細胞系及び組織をLaemmli's試料緩衝液に溶解 させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに１レーンあたり１００−２００μｇの タンパク質をのせた。タンパク質をセミドライエレクトロブロットトランスファ ー（semi-dry electroblot transfer）装置を用いてニトロセルロースに移した 。フィルターを１０％ヤギ血清及び１０％脱脂粉乳含有トリス緩衝生理食塩水で ブロックし、アフィニティー精製した抗−ＤＣＣ抗体と共に室温で１２０分間イ ンキュベートした。Amersham社の増幅化学ルミネッセンス系を検出のために用い た。 免疫組織化学のために凍結組織を７μｍの厚さの凍結切片とした。切片を１０ ％緩衝ホルマリン中で室温で３０分間固定した。０．３％Ｈ₂Ｏ₂とのインキュベ ーションで内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックし、Biogenexからの抗原検 索系（antigen retrieval system）を用いてシグナル強度を増大させた。切片を ヤギ血清でブロックし、続いて抗−ＤＣＣ抗体３ｎｇ／μｌと共にインキュベー トした。検出のために、Vector Laboratories社のVectastain Elite試薬と組み 合わせてヤギ抗−ウサギビオチン化二次抗体を用いた。 免疫沈降による３２種の細胞系の最初のスクリーニングにおいて、ＤＣＣ発現 は１種の細胞系、非−精上皮腫こう丸生殖細胞腫瘍である５７７ＭＦにおいての み検出された。抗体は共に代謝的に標識された５７７ＭＦ細胞由来のおよそ１８ ０ｋｄのタンパク質を沈降させ、これがＤＣＣ遺伝子産物を示す強い証拠を提供 している。完全な長さのＤＣＣ ｃＤＮＡ配列からはおよそ１５３ｋｄの未修飾 貫膜分子が予測される。この配列からはまたＤＣＣがＮ−グリコシル化されてい る可能性が示唆され（Fearon,et al.，Science 247:49(1990)）、５７７ＭＦで 観察されるより大きな見かけの分子量を説明することが可能である。免疫沈降に よって調べられた結腸癌細胞系の全ては陰性であり、ＤＣＣ ＲＮＡがＲＮａｓ ｅの保護のために検出できなかったが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって検 出された先のＲＮＡ発現アッセイの結果と一致している。 細胞表面をヨウ素化して標識された５７７ＭＦ細胞の免疫沈降によって、ＤＣ Ｃタンパク質が細胞表面に存在することが証明された。ＤＣＣ産物の細胞におけ る存在部位を更に研究するために、完全長のＤＣＣ ｃＤＮＡを含有する構成的 発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＤＣＣ抗体で染色した。染色 パターンはＤＣＣが膜上に分散していることに一致した。更に、細胞−細胞接着 部位で、シグナル強度の増加が示された。この染色パターンは細胞接着に関与す ることが知られる分子を発現する細胞系において報告されている。これらの研究 から、ＤＣＣは細胞表面分子であることが示され、細胞−細胞接着の部位に集中 している可能性が示唆される。 ＤＣＣ発現の組織分布はウエスタンブロット分析で調べた。逆転写ポリメラー ゼ連鎖反応による正常組織の発現研究から、最高レベルの発現は脳で起きている ことが明らかになった。ウエスタンブロット分析によって、ヒト脳組織溶解物で およそ１８０ｋｄに、かすかではあるが検出可能なバンドが存在した；しかしな がら、ＤＣＣは他のいずれの組織においても検出されなかった。我々は免疫組織 化学を用いて発現アッセイの感度を増大させようとした。 発現研究から、細胞系及び組織におけるＤＣＣの発現は極めて低いことが示さ れた。しかしながら、これまでの分析は全細胞ｍＲＮＡまたは全細胞タンパク質 で実施されていた。もしもＤＣＣ発現が細胞内または細胞間の配置で局所的に高 濃度で発現しているとすれば、インジツ(in situ)の方法によってより容易に検 出できるだろう。我々は以前のｍＲＮＡ発現データに基づき、中枢神経系由来の 組織においてこの仮説を検証した。凍結したヒト脊髄切片の染色から、脊髄の色 々のレベルにおいて軸索で強い染色が示された。ＤＣＣ発現は有髄及び無髄神経 細胞の双方に存在するように思われた。これに続く脳の実験では同様の特異性が 示され、特に白質の神経路に限定された明白な染色があった。いくつかの神経細 胞体、特に小脳のプルキニエ細胞も染色された。プルキニエ細胞におけるＤＣＣ の発現はＤＣＣアンチセンスＲＮＡプローブを用いてインジツでハイブリダイゼ ーションを行うことによって確かめられた。次に組織にこの技術を応用した。（ 膀胱や子宮内膜を含め）いくつかの組織では時折かすかな細胞の染色が観察され るが、最も著しい染色は結腸及び皮膚において見られた。皮膚においては、より 分化したケラチノサイトのみが染色された。 結腸においては、免疫組織化学的な染色では検出し得るＤＣＣ発現は結腸上皮 細胞の小サブセット、特にゴブレット細胞集団に限定されていた。正常な結腸粘 膜は、線維芽細胞及び炎症細胞を含有する支持性の粘膜固有層によって囲まれた 、陰窩（crypts）と呼ばれる上皮腺様の構造からなる。結腸の陰窩には２種の主 要な分化細胞の型がある：腸細胞と呼ばれ、流体及び電解質の輸送の任のある吸 収細胞；及び第二のものはムチンを製造して分泌する、ゴブレット細胞として知 られる分泌細胞である。ゴブレット細胞は細胞内の頂点に大量のムチンを蓄積す るために最も顕著な細胞型である。しかしながら、これらは円錐の陰窩上皮のお よそ２０−３０％を占めるに過ぎない（Hafez，Cell Growth and Differentiati on 1:617(1990)）。 ゴブレット細胞におけるＤＣＣの発現パターンは特異的である。シグナルは細 胞の塩基性よりの部分及び核上の細胞質空間、尖端のムチンのすぐ下に位置して いる（データは示さない）。ＤＣＣがこれらの切片において細胞膜にあるかどう かを確信をもって決定することは可能ではなかったが、発現パターンはその可能 性を支持するものである。更に、核上の染色は、生成中のタンパク質があること が知られているゴルジ体にある生成中のタンパク質を示している可能性がある（ Bloom and Fawcett，A Textbook of Histology，pg.662，W.B.Saunders,Philade lphia(1975)）。 免疫前の血清では上記の反応細胞のいずれも染色されなかった。特異性を更に 示すコントロールとして、溶解性融合タンパク質を競合剤としてその存在下で分 析を行った。ＤＣＣ抗体と同濃度のＤＣＣ融合タンパク質はゴブレット細胞にお いて抗体によって検出されるシグナルを完全にブロックしたが、無関係な融合タ ンパク質では、抗体の５倍の濃度においても、シグナルを減らすことができなか った。 ＤＣＣ発現が結腸の分化した上皮細胞のサブセットに制限されていることは、 多くの疑問を投げかける。結腸腫瘍発生の観点から言えば、結腸腫瘍は一般にゴ ブレット細胞の形態を失い、進行に従って正常なムチンの産生をしなくなること から、このパターンは興味あるものである（Boland，Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S. A．79:2051(1982)）。実施例３ この実施例では種々の進行段階の結腸腫瘍の組織切片におけるＤＣＣ遺伝子産 物の発現状態を説明する。 結腸直腸の種々の腫瘍におけるＤＣＣタンパク質の発現を調べるために免疫組 織化学を利用した。我々は最初に肥厚したポリープを調べた。これらの腫瘍は、 その名の示すように、新生物ではない過剰に増殖する細胞からなる。これらは比 較的正常な構造パターンと細胞の分化を示す性質を保持している。表皮学的研究 が肥厚ポリープの結腸癌との関連を示唆しているにもかかわらず、これらが癌の 前駆症であるという証拠はほとんどない。これらのポリープでは抗−ＤＣＣ抗体 で比較的強い染色がこれらのポリープ内の上皮細胞の全てにおいて観察された。 更に、それぞれの細胞での染色は、正常結腸上皮のゴブレット細胞で観察される ものとは異なるパターンを有していた。肥厚ポリープの細胞においては、染色は 塩基性よりの領域に限られず、細胞全体にわたって分散しているように見えた。 ポリープに隣接している正常上皮細胞では予想通りゴブレット細胞に制限された ＤＣＣ染色の分布を示した。このように、ＤＣＣ発現は非−新生物ではあるが、 増殖し、分化している細胞においては、減少するよりは増加していた。 我々は次に、一般に結腸癌の直接の前駆症であると考えられている腺腫ポリー プを調べた。早期及び中期の腺腫ではほぼ正常なパターンのＤＣＣ発現がゴブレ ッ ト細胞に限って保持されていた。顕著な異形成を示す２種の末期腺腫では、新生 物上皮において染色が完全になくなり、ＤＣＣタンパク質が検出できないレベル を示した。６種の侵入性結腸癌を次に調べた。このうち４種の癌は検出可能なＤ ＣＣ染色を完全になくしていた。しかしながら、２種の癌ではＤＣＣによって強 く染色された。 種々の結腸腫瘍におけるＤＣＣ発現とムチン分化との関連は印象的であった。 ムチンを特異的に染色する組織化学的な染色剤であるAlcian Blue（ＡＢ）を上 記数種の組織切片を逆染色するために用いた。ＡＢ染色細胞及びＤＣＣ反応性が 同じ場所に局在していることは正常結腸では明らかであった。肥厚ポリープにお いては、ＡＢ染色の増加はＤＣＣ発現の上昇と関連していた。腺腫ポリープ及び 癌においては、ＤＣＣ反応性はＡＢ染色と正確に関係した。ほとんどの結腸癌は 分化の程度が低く、ＡＢ染色が低いかまたは見られず、ＤＣＣ抗体反応性を示さ なかった。初期及び中期の腺腫はＡＢ及びＤＣＣ抗体で同等に染色された。 ２種のＤＣＣ陽性癌では、粘液を大量に産生するＣＲＣの珍しい型である“粘 液性癌”を示すＡＢ染色が見られた。結果から、全体として（in toto）ほとん どの結腸癌ではムチン産生経路に到る分化の消失に伴ってＤＣＣ発現が失われる ことが示唆されたが、時にこの消失が起こらなかった。この問題を更に評価する ために、我々は結腸癌の４９例のＤＣＣ対立遺伝子及び組織学的な表現型の消失 を遡及的に分析した。これら５０例から７種の粘液性腫瘍が同定され、この１７ 種のうち１種のみでＤＣＣ消失の証拠があった。対照的に、４３例の非−粘液性 腫瘍では、ＤＣＣ ＬＯＨ（異型接合性の消失；loss of heterozygosity）は３ ４例（７９％）で見られた。これらの結果から、少なくとも２種の結腸腫瘍発生 経路があることが示唆される：１つはＤＣＣ消失及びムチン産生細胞に到る分化 能の消失に関連するもの、そしてＤＣＣの変化に関連しないより一般的でない粘 液性型のものである。実施例４ この実施例ではＤＣＣの細胞外部分と特異的に免疫反応するモノクローナル抗 体の産生について説明する。 ワクシニアウイルス内にインビボで組換えるためのプラスミドベクターに含有 される完全長ＤＣＣ ｃＤＮＡに翻訳終止コドンを最初に導入することによって 、読み取り枠がコドン１０６３で分断されるように発現構築物を作成した。この プラスミドによるインビボでの組換えの結果、カルボキシ末端に１個のセリン残 基を付け加えてＤＣＣのアミノ酸１−１０６３（Ｃ−末端の３４個のアミノ酸を 除くほぼ全部の細胞外ドメイン）を発現する組換えウイルス（ｖＡｂＴ ４９２ ）ができた。膜アンカーを欠如し、しかしなおシグナル配列を有した、不完全な ＤＣＣ遺伝子産物が分泌される。 簡潔に言えば、全ＤＣＣコード領域を含有する４．５ｋｂのXhol-EcoRI断片を 、ワクシニアウイルスへのインビボでの組換えのためのHindIII Ｍ挿入ベクター にクローン化した。普遍的な翻訳終止オリゴヌクレオチド（Pharmacia）をヌク レオチド３２１１のBalI部位に挿入した。正確なBalI部位への挿入はAseIによる 制限分析で確かめた。生じたプラスミドは、ワクシニアウイルスの４０ｋプロモ ーターによって発現が調節されるＤＣＣのアミノ酸１−１０６３の配列をコード する。 ＤＣＣタンパク質の細胞外ドメインの発現及び分泌を確かめるために、Vero細 胞を非血清培地中でｖＡｂＴ４９２にＭＯＩ（感染多重度）１０で感染させた。 ２４時間後、培地を収集し、遠心分離で透明にし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した 。ＮＹＣＢＨに感染させたVero細胞（Lyons et al.，Infect．and Immun．58:40 89-4098(1990);ATCCVR-325）を対照として用いた。馴化培地(conditioned mediu m)との比較から、ｖＡｂＴ４９２感染細胞から培地中に見かけの分子質量１５０ ｋＤａの更に別のタンパク質の存在が示された。アミノ酸骨格から計算される分 子量（１１５ｋＤａ）と観察される見かけ分子量との差は、グリコシル化による ものである可能性が大きい。ＤＣＣタンパク質の細胞外ドメイン（ｇｐ１５０^{DC C} ）は馴化培地の主要成分として、精製を行うのに適当なレベルで発現された。 ＤＣＣタンパク質の生化学的な機能は未だ知られていないことから、ｇｐ１５ ０^DCCの定量的なアッセイを開発することは可能ではなかった。従って、精製を 通して、１５０ｋＤａのタンパク質の存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫的ブロッ トによって監視した。 構造的に関連性のある糖タンパク質、ＮＣＡＭがレクチンに結合することが示 されていたため、ｇｐ１５０^DCCの精製における最初の段階としてレクチンアフ ィニティークロマトグラフィーを試みた。ＣｏｎＡ及びコムギ胚芽レクチンのｇ ｐ１５０^DCCへの結合能を調べた。ｇｐ１５０^DCCはいずれのアフィニティーマト リクスに対しても結合したが、結合はＣｏｎＡでより有効であり、特異的であっ た。 ｖＡｂＴ４９２に感染したVero細胞から馴化培地中で１００倍に濃縮されたｇ ｐ１５０^DCCはＣｏｎアガロースカラムに効率的に結合し、これから溶出した。 ｇｐ１５０^DCCの結合は最初にカラムに通した後に完了したように見える。０． ５Ｍのメチル−Ｄ−マンノピラノシドによる溶出の結果、見かけの分子量の小さ いわずかな不純タンパク質と共にｇｐ１５０^DCCが実質的に豊富な画分が得られ た。ｇｐ１５０^DCCが数画分にわたってゆっくり溶出したため、ｇｐ１５０^DCCが カラムに結合して残っていないかを決定するために、溶出に続いて１カラム相当 の量の８Ｍ尿素で洗浄を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、尿素洗浄によって 更なるｇｐ１５０^DCCは検出されなかった。しかしながら、おそらくカラムから 外れたと思われるＣｏｎＡモノマーを示す〜３０ｋＤａのタンパク質が検出され た。このことから、結合したｇｐ１５０^DCCの全てがメチル−Ｄ−マンノピラノ シド溶液によって効果的に溶出したことが示された。 見かけの分子量が小さい主な不純物からｇｐ１５０^DCCを分離するために、Ｃ ｏｎＡカラムから得た個々のフラクションをＨＰＬＣ分子ふるいクロマトグラフ ィーによって更に精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、１５から１７分のピークが 精製ｇｐ１５０^DCCを示し、低分子量の不純物は十分に分離されたことが説明で きた。ｇｐ１５０^DCC調製物は実質的に精製され、１種のわずかな不純タンパク 質のみを含有するようにみえた。 精製したタンパク質を、ＤＣＣ遺伝子産物の細胞外ドメインであることを実証 するためにＮ−末端配列分析にかけた。最初の１５サイクルで得られた配列はＰ ｈｅ−３２で始まるｃＤＮＡから予想される配列と完全に一致する。このことか ら、Vero細胞における処理されたＤＣＣ遺伝子産物のＮ−末端が特定され、３１ 個のアミノ酸からなるシグナル配列の存在が確認される。この結果は疎水性分析 及びゲノムの構造に基づいて予想されたＮ−末端と一致する。 Ｎ−末端配列分析から得られたデータは、最初のサイクルから得た結果に基づ く全タンパク質を評価するために用いた。処理した物質の比率から推定して、４ ０ローラーボトル調製物から精製したｇｐ１５０^DCCの収量は２５０μｇより多 いと評価された。これによって、モノクローナル抗体の作成のために抗原として 利用するのに十分な量が供給された。 既知の技術により、精製して分泌されたＤＣＣタンパク質断片でマウスを免疫 し、その脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させた。 最初のハイブリドーマはＣｏｎＡで精製したＤＣＣを用いたＥＬＩＳＡでスク リーニングした。陽性のものを全て４８−ウェルのプレートに移し、再増殖させ 、ＣｏｎＡで精製し、ＨＰＬＣ分子ふるいクロマトグラフィーで更に精製したＤ ＣＣを用いたＥＬＩＳＡで再度スクリーニングした。全ての陽性細胞を単一細胞 にクローン化（一次クローニング）し、単一のクローンをＨＰＬＣで精製したＤ ＣＣでスクリーニングした。陽性一次クローンを二次クローニングし、スクリー ニングした。こうして得た３種のクローンがＡＦ５、ＡＥ６、及びＡＦ１であっ た。 完全長または細胞外ＤＣＣでトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞、細胞外Ｄ ＣＣでトランスフェクトしたＣＨＯ Ｋ１細胞、及び完全長ＤＣＣを発現する組 換えワクシニアウイルスに感染したＢＳＣ−４０細胞の溶解物についてのウエス タンブロット及び免疫沈降によって、モノクローナル抗体の性状解析をした。 ウエスタンブロットでは、ＳＷ４８０溶解物それぞれ１００μｇを、組換えワ クシニアウイルスの溶解物６０μｇと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて分離し、ニ トロセルロースに移した。ブロットを未希釈ハイブリドーマ上清でプローブした 。免疫沈降のために、組換えワクシニアウイルスに感染したＣＨＯ Ｋ１細胞及 びＢＳＣ−４０細胞を3⁵Ｓ−メチオニンで代謝的に標識した。次いで精製した抗 体それぞれ５μｇを用いて溶解物を沈降させた。 ５７７ＭＦは、１９０ｋＤのＤＣＣの内在性の型を発現するヒト細胞系である 。精製した抗体それぞれ１０μｇを用いてこれらの細胞の溶解物を免疫沈降させ た。次いで沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移した。ブ ロットを精製抗体１０μｇ／ｍｌでプローブした。この方法において、３種のモ ノク ローナル抗体は全て５７７ＭＦによって産生される１９０ｋＤ ＤＣＣを沈降さ せることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ Ｇ０１Ｎ 33/53 9284−4Ｃ Ｔ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 39/395 9162−4Ｂ Ｃ 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジャロズ，デヴィッド・イー アメリカ合衆国マサチューセッツ州01843, ローレンス，クレストシャー・ドライブ １ (72)発明者 ジョンソン，カレン アメリカ合衆国マサチューセッツ州02172, ウォータータウン，サマー・ストリート 88 (72)発明者 キンズラー，ケネス・ダブリュー アメリカ合衆国メリーランド州21234，バ ルティモア，ハルステッド・ロード 1348 (72)発明者 ヴォーゲルスタイン，バート アメリカ合衆国メリーランド州21208，バ ルティモア，ブレトン・ウェイ 3700 (72)発明者 ザブレッキー，ジェームズ・アール アメリカ合衆国マサチューセッツ州02154, ウォルサム，アーリントン・ロード 18

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）ＤＣＣタンパク質の細胞外ドメイン上のエピトープと特異的に免疫反 応し、（２）神経細胞接着分子と交差反応しない抗体を実質上含有する抗体調製 物。 ２．（１）ＤＣＣの細胞質ドメイン内にあるエピトープと特異的に免疫反応し、 （２）神経細胞接着分子と交差反応しない抗体を必須に含有する抗体調製物。 ３．エピトープが配列ＩＤ ＮＯ：１に示す塩基対１１９５−２８５４を含有す るＤＣＣ遺伝子のセグメントでコードされる請求項１の抗体調製物。 ４．エピトープが配列ＩＤ ＮＯ：２に示すＤＣＣタンパク質のアミノ酸１−１ ０６３の中にある請求項１の抗体調製物。 ５．該抗体がポリクローナルである請求項１の抗体調製物。 ６．該抗体がモノクローナルである請求項１の抗体調製物。 ７．該抗体がポリクローナルである請求項２の抗体調製物。 ８．該抗体がモノクローナルである請求項２の抗体調製物。 ９．抗体がＡＴＣＣにＨＢ１１２９９として寄託された細胞系ＡＦ５によって作 られる請求項１の抗体調製物。 １０．抗体がＡＴＣＣにＨＢ１１２８９として寄託された細胞系ＡＦ１によって 作られる請求項１の抗体調製物。 １１．エピトープが配列ＩＤ ＮＯ：２に示すＤＣＣタンパク質のアミノ酸３３ ６９−４３４１の中にある請求項２の抗体調製物。 １２．下記からなり、ＤＣＣの大きさ（およそ１１５−１９０ｋＤａ）を有する タンパク質に対する抗体の結合がないことは、試料においてＤＣＣ変異が生じて いることを示す、ヒトＤＣＣ遺伝子における変異を検出する方法： 組織及び体液からなる群から選ばれる試料からタンパク質を抽出し； 該抽出されたタンパク質をポリアクリルアミドゲルで分離し； 該分離したタンパク質をフィルター上にブロットし； 該フィルターを、 （１）ＤＣＣタンパク質と特異的に免疫反応し、かつ （２）神経細胞接着分子と交差反応しない抗体と接触させて、 該抗体を該フィルターにブロットしたタンパク質に結合させ； 該タンパク質に結合する抗体を検出する。 １３．抗体がＤＣＣの細胞外ドメイン内にあるエピトープに結合する請求項１２ の方法。 １４．抗体がＡＴＣＣにＨＢ１１２９９として寄託された細胞系ＡＦ５によって 作られる請求項１２の方法。 １５．抗体がＡＴＣＣにＨＢ１１２８９として寄託された細胞系ＡＦ１によって 作られる請求項１２の方法。 １６．抗体がＤＣＣの細胞質ドメイン内にあるエピトープに結合する請求項１２ の方法。 １７．試料が腫瘍組織である請求項１２の方法。 １８．試料が末梢血単核細胞の調製物である請求項１２の方法。 １９．下記の段階からなり、体試料が抗体に結合できないことがヒトにおけるＤ ＣＣ変異の存在を示す、ヒトにおけるＤＣＣ変異の存在を決定する方法： ヒトの体試料を（１）ＤＣＣのエピトープと特異的に免疫反応し、かつ（２） 神経細胞接着分子と交差反応しない最初の抗体と接触させて該体試料の成分を該 抗体に結合させる； 該体試料に結合した抗体の量を決定する。 ２０．該エピトープが細胞外ドメイン内にある請求項１９の方法。 ２１．該エピトープが細胞質ドメイン内にある請求項１９の方法。 ２２．該抗体がＡＴＣＣに受託番号ｎｏ．ＨＢ１１２９９として寄託されたＡＦ ５である請求項１９の方法。 ２３．該抗体がＡＴＣＣに受託番号ｎｏ．ＨＢ１１２８９として寄託されたＡＦ １である請求項１９の方法。 ２４．体試料が組織切片である請求項１９の方法。 ２５．体試料が腫瘍生検の溶解物である請求項１９の方法。 ２６．抗体が固相支持体に結合している請求項１９の方法。 ２７．体試料が固相支持体に結合している請求項１９の方法。 ２８．ＤＣＣの細胞外ドメイン内にあるエピトープと特異的に免疫反応し、神経 細胞接着分子と交差反応しない抗体で被覆された固相支持体からなる、酵素結合 イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を実施するために利用する固相支持体。 ２９．抗体がＡＴＣＣに受託番号ｎｏ．ＨＢ１１２８９として寄託されたＡＦ１ である請求項２８の固相支持体。 ３０．抗体がＡＴＣＣに受託番号ｎｏ．ＨＢ１１２９９として寄託されたＡＦ５ である請求項２８の固相支持体。 ３１．ＤＣＣの細胞内ドメイン内にあるエピトープと特異的に免疫反応し、神経 細胞接着分子と交差反応しない抗体で被覆された固相支持体からなる、酵素結合 イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を実施するために利用する固相支持体。 ３２．ＤＣＣの細胞外ドメイン内にあるエピトープと特異的に免疫反応し、神経 細胞接着分子と交差反応しない抗体を分泌するハイブリドーマ細胞。 ３３．ＤＣＣの細胞内ドメイン内にあるエピトープと特異的に免疫反応し、神経 細胞接着分子と交差反応しない抗体を分泌するハイブリドーマ細胞。 ３４．ＡＦ５（ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．ＨＢ１１２９９）と同じエピトープに結合す る抗体を分泌する請求項３３のハイブリドーマ細胞。 ３５．ＡＦ１（ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．ＨＢ１１２８９）と同じエピトープに結合す る抗体を分泌する請求項３３のハイブリドーマ細胞。 ３６．下記の段階からなり、抗体が組織試料に結合しないことが組織試料におけ るＤＣＣ変異の存在を示す、ヒトにおけるＤＣＣ変異の存在を決定する方法： ヒトの最初の組織切片を（１）ＤＣＣの細胞質内ドメイン内にあるエピトープ と特異的に免疫反応し、かつ（２）神経細胞接着分子と交差反応しない抗体と接 触させて該組織切片の成分を該抗体に結合させる； 該組織試料に結合した抗体の量を決定する。 ３７．更に下記を含み、抗体の正常組織試料への結合の検出があれば、最初の組 織切片におけるＤＣＣ変異の存在が確かめられる、請求項３６の方法： 該ヒトの正常組織切片を該抗体と接触させて該正常組織切片の成分を該抗体に よって該固相支持体に結合させる； 該体試料に結合した抗体の量を決定する。