PL215160B1 - Kompozycja, zastosowanie sondy polinukleotydowej, zastosowanie przeciwciala, przeciwcialo, koniugat, zastosowanie przeciwciala i koniugatu, zestaw do wykrywania ekspresji albo nieprawidlowej ekspresji, sposób diagnozowania nowotworu in vitro okreslania regresji, przebiegu albo poczatku nowotworu - Google Patents

Description

Kompozycja, zastosowanie sondy polinukleotydowej, zastosowanie przeciwciała, przeciwciało, koniugat, zastosowanie przeciwciała i koniugatu, zestaw do wykrywania ekspresji albo nieprawidłowej ekspresji, sposób diagnozowania nowotworu in vitro określania regresji, przebiegu albo początku nowotworu (73) Uprawniony z patentu:

(30) Pierwszeństwo:

13.03.2002, DE, 10211088.3

GANYMED PHARMACEUTICALS AG, Mainz, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono:

22.08.2005 BUP 17/05 (72) Twórca(y) wynalazku:

UGUR SAHIN, Mainz, DE

OZLEM WRECI, Mainz, DE MICHAEL KOSLOWSKI, Koln, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

31.10.2013 WUP 10/13 (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Magdalena Augustyniak

PL 215 160 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja której składniki opierają się na antygenie TPTE związanym z nowotworem.

Przedmiotem wynalazku jest także, zastosowanie sondy polinukleotydowej, która swoiście hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym antygen TPTE związany z nowotworem i/lub przeciwciała swoiście wiążącego się z antygenem TPTE związanym z nowotworem, a także, zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem TPTE związanym z nowotworem i sprzężonego ze środkiem terapeutycznym albo diagnostycznym. Ponadto, przedmiotem wynalazku jest przeciwciało, które wiąże się specyficznie z białkiem TPTE i koniugat, oraz zastosowanie przeciwciała i koniugatu. Dodatkowo przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania ekspresji albo nieprawidłowej ekspresji antygenu TPTE związanego z nowotworem, zastosowanie przeciwciała wiążącego się z TPTE i sprzężonego ze środkiem terapeutycznym albo diagnostycznym, a także sposób diagnozowania nowotworu in vitro oraz sposób in vitro określania regresji, przebiegu albo początku nowotworu.

Pomimo interdyscyplinarnych podejść i wyczerpującego wykorzystania klasycznych procedur terapeutycznych rak wciąż znajduje się wśród wiodących przyczyn zgonu. Nowsze koncepcje terapeutyczne mają na celu włączenie układu immunologicznego pacjenta do kompleksowej koncepcji leczenia poprzez użycie rekombinowanych szczepionek nowotworowych i innych szczególnych środków, takich jak terapia przeciwciałem. Warunkiem wstępnym do sukcesu takiej strategii jest rozpoznanie specyficznych dla nowotworu lub związanych z nowotworem antygenów lub epitopów przez układ immunologiczny pacjenta, którego funkcje efektorowe muszą być wzmocnione poprzez ingerencję z zewnątrz. Komórki nowotworowe biologicznie różnią się zasadniczo od komórek niezłośliwych, od których pochodzą. Różnice te są spowodowane zmianami genetycznymi nabytymi podczas rozwoju guza nowotworowego i prowadzą w rezultacie, między innymi, także do tworzenia jakościowo i ilościowo zmienionych struktur molekularnych w komórkach rakowych. Tego rodzaju struktury związane z nowotworem, które są rozpoznawane przez specyficzny układ immunologiczny gospodarza dotkniętego nowotworem, określa się jako antygeny związane z nowotworem. Specyficzne rozpoznawanie antygenów związanych z nowotworem angażuje mechanizmy komórkowe i humoralne, które stanowią dwie funkcjonalnie wzajemnie powiązane jednostki: limfocyty T CD4⁺ i CD8⁺ rozpoznają przetworzone antygeny prezentowane na cząsteczkach MHC (głównego układu zgodności tkankowej), odpowiednio klasy II i I, podczas gdy limfocyty B wytwarzają cząsteczki krążących przeciwciał, które wiążą się bezpośrednio do nieprzetworzonych antygenów. Potencjalna kliniczno-terapeutyczna ważność antygenów związanych z nowotworem wynika z faktu, że rozpoznanie antygenów na powierzchni komórek nowotworowych przez układ immunologiczny prowadzi do zapoczątkowania cytotoksycznych mechanizmów efektorowych i, w obecności komórek pomocniczych T, może powodować eliminację komórek rakowych (Pardoll, Nat. Med. 4:525-31, 1998). Odpowiednio, głównym celem immunologii nowotworów jest molekularne zdefiniowanie tych struktur. Natura molekularna tych antygenów była przez długi czas niejasna. Dopiero po rozwinięciu się odpowiednich technik klonowania stało się możliwe przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych cDNA nowotworów w sposób systematyczny poszukując antygenów związanych z nowotworem poprzez analizowanie struktur docelowych cytotoksycznych limfocytów T (CTL, ang. cytotoxic T lymphocytes) (van der Bruggen i wsp., Science 254:1643-7, 1991) lub poprzez zastosowanie jako sond krążących autoprzeciwciał (Sahin i wsp., Curr. Opin. Immunol. 9:70916, 1997). W tym celu przygotowano biblioteki ekspresyjne cDNA ze świeżych tkanek nowotworowych i poddano je ekspresji rekombinowanej, jak białka, w odpowiednich systemach. Immunoefektory wyizolowane od pacjentów, mianowicie klony CTL ze specyficznymi dla nowotworu wzorami trawienia, lub krążące autoprzeciwciała zastosowano do klonowania odpowiednich antygenów.

W ostatnich latach przy użyciu tych podejść zdefiniowano wiele antygenów w różnych nowotworach. Przedmiotem szczególnego zainteresowania tutaj jest klasa antygenów rakowych/jąder (CTA, ang. cancer/testis antigens). CTA i geny je kodujące (geny rakowe/jąder lub CTG) są zdefiniowane przez ich charakterystyczny wzór ekspresji [Tureci i wsp., Mol Med Today. 3:342-9, 1997], Nie znajduje się ich w zdrowych tkankach, poza jądrem i komórkami zarodkowymi, ale ulegają one ekspresji w szeregu ludzkich chorób nowotworowych, nie specyficznie dla typu nowotworu, ale z różną częstością w tkankach nowotworowych bardzo różnego pochodzenia (Chen & Old, Cancer J. Sci. Am. 5:167, 1999). Reaktywności surowicy przeciwko CTA także nie znajduje się w zdrowych kontrolach, ale tylko u pacjentów z nowotworem. Ta klasa antygenów, w szczególności dzięki ich sposobie rozmieszczenia w tkankach, jest szczególnie wartościowa w projektach immunoterapeutycznych i jest testowaPL 215 160 B1 na w obecnych badaniach klinicznych na pacjentach (Marchand i wsp., Int. J. Cancer 80:219-30, 1999; Knuth i wsp., Cancer Chemother. Pharmacol. 46: str. 46-51, 2000).

Jednak, sondy wykorzystane do identyfikacji antygenów w klasycznych sposobach przedstawionych powyżej są immunoefektorami (krążącymi autoprzeciwciałami lub klonami CTL) od pacjentów zazwyczaj mających już zaawansowanego raka. Szereg danych wskazuje na to, że nowotwory mogą prowadzić, na przykład, do tolerancji i braku reakcji ze strony komórek T i że w trakcie przebiegu choroby szczególnie te elementy, które mogą powodować efektywne rozpoznanie immunologiczne, są tracone z repertuaru immunoefektorów. Obecne badania na pacjentach nie dały jeszcze w wyniku żadnego silnego dowodu na faktyczne działanie wcześniej znalezionych i stosowanych antygenów związanych z nowotworem. Odpowiednio, nie można wykluczyć, że białka powodujące spontaniczne odpowiedzi układu immunologicznego są złymi strukturami docelowymi.

Celem niniejszego wynalazku było dostarczenie struktur docelowych do diagnozy i leczenia raka.

Według wynalazku ten cel zostaje osiągnięty przez kompozycję zawierającą jeden albo więcej składników wybranych z grupy składającej się z:

(i) antygenu TPTE związanego z nowotworem albo jego części, która zawiera co najmniej 6 kolejnych aminokwasów, (ii) kwasu nukleinowego kodującego antygen TPTE związany z nowotworem albo jego części, która zawiera co najmniej 6 kolejnych aminokwasów, (iii) przeciwciała, które wiąże się z antygenem TPTE związanym z nowotworem, (iv) antysensownego kwasu nukleinowego, który swoiście hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym antygen TPTE związany z nowotworem, i (v) komórki gospodarza, która wykazuje ekspresję antygenu TPTE związanego z nowotworem albo jego części, która zawiera co najmniej 6 kolejnych aminokwasów, charakteryzującą się tym, że wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego zawierającego sekwencje kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a), do zastosowania jako środek farmaceutyczny.

Korzystnie kwas nukleinowy z punktu (ii) występuje w wektorze ekspresyjnym.

Korzystnie komórka gospodarza wydziela antygen TPTE związany z nowotworem albo jego część.

Korzystnie komórka gospodarza dodatkowo wykazuje ekspresję cząsteczki HLA, która wiąże się z antygenem TPTE związanym z nowotworem albo jego częścią.

Korzystnie komórka gospodarza wykazuje ekspresję cząsteczki HLA i/lub antygenu TPTE związanego z nowotworem albo jego części w sposób rekombinowany.

Korzystnie komórka gospodarza wykazuje endogenną ekspresję cząsteczki HLA.

Korzystnie komórką gospodarza jest komórka prezentująca antygen.

Korzystnie przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne, chimeryczne albo humanizowane, albo fragment przeciwciała.

Korzystnie przeciwciało jest sprzężone ze środkiem terapeutycznym albo diagnostycznym.

Korzystnie kompozycja jest do leczenia nowotworu.

Korzystnie nowotworem jest nowotwór płuc, nowotwór piersi, nowotwór prostaty, czerniak, nowotwór okrężnicy, przerzuty nowotworu okrężnicy, rak komórek nerkowych albo rak szyjki macicy, rak okrężnicy albo rak gruczołu sutkowego.

Korzystnie antygen TPTE związany z nowotworem obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 22-24, 58-61, 81 i 82.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie (i) sondy polinukleotydowej, która swoiście hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym antygen TPTE związany z nowotworem i/lub (ii) przeciwciała swoiście wiążącego się z antygenem TPTE związanym z nowotworem, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do diagnozowania albo monitorowania choroby cechującej się ekspresją albo nieprawidłową ekspresją antygenu TPTE związanego z nowotworem w próbce biologicznej izolowanej od pacjenta, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

PL 215 160 B1 (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem TPTE związanym z nowotworem i sprzężonego ze środkiem terapeutycznym albo diagnostycznym do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, diagnozowania albo monitorowania choroby cechującej się ekspresją albo nieprawidłową ekspresją antygenu TPTE związanego z nowotworem, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

Korzystnie przeciwciało wiążące się z antygenem TPTE związanym z nowotworem jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym albo humanizowanym albo fragmentem przeciwciała.

Korzystnie antygen TPTE związany z nowotworem zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 22-24, 58-61, 81 i 82.

Przedmiotem wynalazku jest także, przeciwciało, które wiąże się specyficznie z białkiem TPTE, przy czym wspomniane białko TPTE jest kodowane przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

Korzystnie białko TPTE zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 22-24, 58-61, 81 i 82.

Korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym albo humanizowanym albo fragmentem przeciwciała.

Przedmiotem wynalazku jest koniugat, charakteryzujący się tym, że jest koniugatem pomiędzy przeciwciałem, które określono powyżej i czynnikiem terapeutycznym albo diagnostycznym.

Korzystnie czynnik terapeutyczny albo diagnostyczny jest toksyną.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało jak określono w powyżej albo koniugat jak określono powyżej do zastosowania terapeutycznego albo diagnostycznego.

Przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania ekspresji albo nieprawidłowej ekspresji antygenu TPTE związanego z nowotworem, charakteryzujący się tym, że obejmuje środki do wykrywania (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen TPTE związany z nowotworem, i/lub (ii) antygen TPTE związany z nowotworem, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

Korzystnie środkami do wykrywania kwasu nukleinowego, który koduje antygen TPTE związany z nowotworem, są cząsteczki kwasów nukleinowych do selektywnej amplifikacji wspomnianego kwasu nukleinowego.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała wiążącego się z TPTE i sprzężonego ze środkiem terapeutycznym albo diagnostycznym do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, diagnozowania albo monitorowania nowotworu dającego przerzuty cechującego się ekspresją albo nieprawidłową ekspresją TPTE, przy czym wspomniany TPTE ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy składający się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego według SEQ ID NR: 19, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

PL 215 160 B1

Korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym albo humanizowanym, albo fragmentem przeciwciała.

Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania nowotworu in vitro, polegający na tym, że obejmuje:

(i) wykrywanie kwasu nukleinowego, który koduje antygen TPTE związany z nowotworem i/lub (ii) wykrywanie antygenu TPTE związanego z nowotworem, w próbce biologicznej izolowanej od pacjenta, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

Korzystnie wykrywanie obejmuje:

(i) kontaktowanie próbki biologicznej ze środkiem wiążącym się swoiście z kwasem nukleinowym kodującym antygen TPTE związany z nowotworem, albo z antygenem TPTE związanym z nowotworem, i (ii) wykrywanie tworzenia się kompleksu pomiędzy środkiem a kwasem nukleinowym, albo antygenem TPTE związanym z nowotworem.

Korzystnie wykrywanie jest porównywane z wykrywaniem w porównywalnej prawidłowej próbce biologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest sposób in vitro określania regresji, przebiegu albo początku nowotworu, polegający na tym, że obejmuje monitorowanie próbki od pacjenta, który ma nowotwór, albo który jest podejrzany o zapadnięcie na chorobę nowotworową, w odniesieniu do jednego albo większej ilości parametrów wybranych z grupy składającej się z:

(i) ilości kwasu nukleinowego, kodującego antygen TPTE związany z nowotworem, i (ii) ilości antygenu TPTE związanego z nowotworem, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

Korzystnie obejmuje oznaczanie parametru(ów) w pierwszej próbce w pierwszym punkcie w czasie i w następnej próbce w drugim punkcie w czasie a przebieg choroby jest oznaczany przez porównanie dwóch próbek.

Korzystnie kwas nukleinowy jest wykrywany albo ilość kwasu nukleinowego jest monitorowana stosując sondę polinukleotydową, która hybrydyzuje swoiście ze wspomnianym kwasem nukleinowym.

Korzystnie sonda polinukleotydowa zawiera sekwencję 6-50 kolejnych nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego antygen TPTE związany z nowotworem.

Korzystnie kwas nukleinowy jest wykrywany albo ilość kwasu nukleinowego jest monitorowana przez selektywną amplifikację wspomnianego kwasu nukleinowego.

Korzystnie antygen TPTE związany z nowotworem jest wykrywany albo ilość antygenu TPTE związanego z nowotworem jest monitorowana stosując przeciwciało wiążące się specyficznie ze wspomnianym antygenem TPTE związanym z nowotworem.

Korzystnie sonda polinukleotydowa, albo przeciwciało jest znakowane w sposób dający się wykryć.

Korzystniej wykrywalny znacznik jest markerem radioaktywnym albo markerem enzymatycznym.

Korzystnie próbka zawiera płyny ustrojowe i/lub tkanki organizmu.

Korzystnie antygen TPTE związany z nowotworem zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR.: 22-24, 58-61, 81 i 82.

W powyższych rozwiązaniach postępowano zgodnie ze strategią identyfikowania i dostarczania antygenów ulegających ekspresji w związku z nowotworem i kwasów nukleinowych kodujących je. Strategia ta oparta jest na fakcie, że w rzeczywistości geny specyficzne dla jądra, a zatem również dla komórek zarodkowych, które zazwyczaj są uśpione w dorosłych tkankach, są ponownie aktywowane w komórkach nowotworowych w sposób przemieszczony i zakazany. Po pierwsze, przeszukiwanie i analiza danych (ang. data mining) wytworzyły listę tak kompletną, jak to tylko jest możliwe, wszystkich

PL 215 160 B1 znanych genów specyficznych dla jądra, które następnie oszacowano pod względem ich nieprawidłowej aktywacji w nowotworach przy użyciu analizy ekspresji z zastosowaniem specyficznej RT-PCR.

Przeszukiwanie i analiza danych jest znanym sposobem identyfikowania genów związanych z nowotworem. W strategiach konwencjonalnych, jednak, transkryptomy bibliotek zdrowych tkanek zazwyczaj odejmuje się elektronicznie od bibliotek tkanek nowotworowych z takim założeniem, że pozostające geny są specyficzne dla nowotworu (Schmitt i wsp., Nucleic Acids Res. 27:4251-60, 1999; Vasmatzis i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:300-4, 1998; Scheurle i wsp., Cancer Res. 60:4037- 43, 2000).

Jednak koncepcja dojścia do przedmiotowego rozwiązania, która okazała się o wiele bardziej skuteczna, oparta jest na wykorzystaniu przeszukiwania i analizy danych do elektronicznego ekstrahowania wszystkich genów specyficznych dla jądra, a następnie oszacowania tych genów pod względem przemieszczonej ekspresji w nowotworach.

Niniejszym ujawniono zatem, w jednym z aspektów, strategii identyfikowania genów ulegających w sposób zróżnicowany ekspresji w nowotworach. Strategia ta łączy przeszukiwanie i analizę danych publicznych bibliotek sekwencji („in silico”) z następującymi później oceniającymi badaniami laboratoryjno-doświadczalnymi („w laboratorium).

Ujawniona połączona strategia oparta na dwóch różnych skryptach bioinformatycznych pozwoliła na zidentyfikowanie nowych członków klasy genów rakowych/jąder (CT, ang. cancer/testis). Zostały one wcześniej sklasyfikowane jako specyficzne wyłącznie dla jąder, komórek zarodkowych lub plemników. Odkrycie, że te geny są nieprawidłowo aktywowane w komórkach nowotworowych, pozwala na stanowienie przez nich nowej jakości w funkcjonalnymi implikacjami. Ujawniono tu zidentyfikowano i dostarczono te geny związane z nowotworem i produkty genetyczne przez niekodowane niezależnie od działania immunogennego.

Antygeny związane z nowotworem tu ujawnione mają sekwencję aminokwasową kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany spośród grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 1-5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39, 40, 54-57, 62, 63, 70, 74, 85-88, ich części lub pochodnej, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje do kwasu nukleinowego z punktu (a) w ostrych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego z punktu (a) lub (b), oraz (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego z punktu (a), (b) lub (c). W korzystnych wykonaniach antygen związany z nowotworem zidentyfikowany i tu ujawnionym ma sekwencję aminokwasową kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 1-5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39, 40, 54-57, 62, 63, 70, 74, 85-88. Ponadto może obejmować sekwencję aminokwasową wybraną spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 6-13, 14-18, 22-24, 30, 34-36, 38, 41, 58-61, 64, 65, 71, 75, 80-84, 89-100, ich części lub pochodnej.

Niniejszy wynalazek na ogół dotyczy zastosowania antygenów związanych z nowotworem zidentyfikowanych według wynalazku lub ich części, kwasów nukleinowych je kodujących lub kwasów nukleinowych skierowanych przeciwko tym kodującym kwasom nukleinowym lub przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom związanym z nowotworem zidentyfikowanym według niniejszego wynalazku lub ich części w leczeniu lub diagnozie. To zastosowanie może dotyczyć pojedynczych, ale także kombinacji dwóch lub więcej tych antygenów, fragmentów funkcjonalnych, kwasów nukleinowych, przeciwciał, itp., w jednym wykonaniu, także w połączeniu z innymi genami i antygenami związanymi z nowotworem w diagnozie, leczeniu i kontrolowaniu postępu choroby.

Korzystnymi chorobami do leczenia i/lub diagnozy są te, w których jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem zidentyfikowanych według wynalazku ulega selektywnej ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji.

Wynalazek także dotyczy kwasów nukleinowych i produktów genetycznych, które ulegają ekspresji w związku z komórką nowotworową i które są wytwarzane w wyniku alternatywnego składania (warianty powstałe w wyniku składania transkryptu) znanych genów lub poprzez zmienioną translację z wykorzystaniem alternatywnych otwartych ramek odczytu. Te kwasy nukleinowe obejmują sekwencje według (SEQ ID NR: 2-5, 20, 21, 31-33, 54-57, 85-88) z listy sekwencji. Ponadto, produkty genetyczne obejmują sekwencje według (SEQ ID NR: 7-13, 23, 24, 34-36, 58-61, 89-100) z listy sekwencji. Warianty powstałe w wyniku składania transkryptu można zastosować według wynalazku jako cele dla diagnozy i leczenia chorób nowotworowych.

Bardzo różne mechanizmy mogą powodować wytwarzanie wariantów powstałych w wyniku składania transkryptu, na przykład

PL 215 160 B1

- wykorzystanie różnych miejsc inicjacji transkrypcji,

- wykorzystanie dodatkowych egzonów,

- całkowite lub niecałkowite składanie pojedynczych lub dwóch lub więcej egzonów,

- sekwencje regulujące składanie transkryptu zmienione w wyniku mutacji (delecji lub powstania nowych sekwencji donorowych/akceptorowych),

- niecałkowita eliminacja sekwencji intronów.

Alternatywne składanie genu daje w wyniku zmienioną sekwencję transkryptu (wariant powstały w wyniku składania transkryptu). Transkrypcja wariantu powstałego w wyniku składania transkryptu w regionie jego zmienionej sekwencji daje w wyniku zmienione białko, które może znacząco się różnić strukturą i funkcją od oryginalnego białka. Związane z nowotworem warianty powstałe w wyniku składania transkryptu mogą wytworzyć transkrypty związane z nowotworem i białka/antygeny związane z nowotworem. Można je wykorzystać jako znaczniki molekularne zarówno do wykrywania komórek nowotworowych, jak i do kierowania leczenia na nowotwory. Wykrywanie komórek nowotworowych, na przykład we krwi, surowicy, szpiku kostnym, plwocinie, płynie z płukania oskrzeli, wydzielinach ciała i biopsjach tkanek, można przeprowadzić według wynalazku, na przykład, po ekstrakcji kwasów nukleinowych przy użyciu namnażania techniką PCR z zastosowaniem oligonukleotydów specyficznych dla wariantu powstałego w wyniku składania transkryptu. Według wynalazku wszystkie systemy wykrywania zależne od sekwencji są odpowiednie do wykrywania. Są nimi, oprócz techniki PCR, na przykład, systemy chipów/mikromacierzy genowych, technika Northern, oznaczanie obszarów chronionych przed działaniem RNAzy (RDA) i inne. Wszystkie systemy wykrywania mają taką cechę wspólną, że wykrywanie oparte jest na specyficznej hybrydyzacji do przynajmniej jednej sekwencji kwasu nukleinowego specyficznej dla wariantu powstałego w wyniku składania transkryptu. Jednak komórki nowotworowe można także wykrywać według wynalazku przy użyciu przeciwciał, które rozpoznają specyficzne epitopy kodowane przez wariant powstały w wyniku składania transkryptu. Te przeciwciała można przygotować poprzez użycie do immunizacji peptydów, które są specyficzne dla tego wariantu powstałego w wyniku składania transkryptu. Odpowiednie do immunizacji szczególnie są te aminokwasy, których epitopy różnią się znacznie od wariantu(ów) produktu genetycznego, który(e) jest (są) korzystnie wytworzony(e) w zdrowych komórkach. Wykrywanie komórek nowotworowych przy użyciu przeciwciał można przeprowadzić tutaj na próbce wyizolowanej od pacjenta lub poprzez obrazowanie przy użyciu przeciwciał podanych dożylnie. Oprócz przydatności w diagnostyce warianty powstałe w wyniku składania transkryptu mające nowe lub zmienione epitopy są atrakcyjnymi celami dla immunoterapii. Epitopy tu ujawnione można wykorzystać do kierowania terapeutycznie aktywnych przeciwciał monoklonalnych lub limfocytów T. W biernej immunoterapii przeniesione adaptacyjnie są tutaj przeciwciała lub limfocyty T, które rozpoznają epitopy specyficzne dla wariantu powstałego w wyniku składania transkryptu. Tak, jak w przypadku innych antygenów, przeciwciała można wytworzyć także przy użyciu standardowych technologii (immunizacji zwierząt, strategiach przeszukujących do izolacji przeciwciał rekombinowanych) z wykorzystaniem polipeptydów, które obejmują te epitopy. Inaczej, możliwe jest wykorzystanie do immunizacji kwasów nukleinowych kodujących oligo- lub polipeptydy, które zawierają te epitopy. Znane są różne techniki do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla epitopu in vitro lub in vivo i zostały one opisane szczegółowo, na przykład w (Kessler JH i wsp., 2001, Sahin i wsp., 1997) i podobnie oparte są one na wykorzystaniu oligo- lub polipeptydów, które zawierają epitopy specyficzne dla wariantu powstałego w wyniku składania transkryptu lub kwasów nukleinowych kodujących te oligo- lub polipeptydy. Oligo- lub polipeptydy, które zawierają epitopy specyficzne dla wariantu powstałego w wyniku składania transkryptu, lub kwasy nukleinowe kodujące te polipeptydy także można użyć do wykorzystania jako farmaceutycznie czynne substancje w aktywnej immunoterapii (szczepieniach, terapii szczepionką).

W jednym z aspektów wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik, który rozpoznaje antygen związany z nowotworem zidentyfikowany według wynalazku i który korzystnie jest selektywny dla komórek, które wykazują ekspresję lub nieprawidłową ekspresję antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku. W szczególnych wykonaniach ten czynnik może powodować indukcję śmierci komórki, zmniejszenie wzrostu komórki, uszkodzenie błony komórkowej lub wydzielanie cytokin i korzystnie ma aktywność hamującą nowotwór. W jednym z wykonań czynnikiem tym jest antysensowny kwas nukleinowy, który hybrydyzuje selektywnie do kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem. W dalszym wykonaniu czynnikiem jest przeciwciało, które wiąże się selektywnie do antygenu związanego z nowotworem, w szczególności przeciwciało aktywowane układem dopełniacza, które wiąże się selektywnie do antygenu związa8

PL 215 160 B1 nego z nowotworem. W dalszym wykonaniu czynnik ten obejmuje dwa lub więcej czynników, z których każdy selektywnie rozpoznaje inny antygen związany z nowotworem, przy czym przynajmniej jeden z nich jest antygenem związanym z nowotworem zidentyfikowanym według wynalazku. Rozpoznaniu nie musi bezpośrednio towarzyszyć inhibicja aktywności lub ekspresji antygenu. W tym aspekcie według wynalazku selektywność antygenu ograniczona do nowotworów korzystnie służy jako znacznik do zapoczątkowania mechanizmów efektorowych w tym specyficznym miejscu. W korzystnym wykonaniu tym czynnikiem jest cytotoksyczny limfocyt T, który rozpoznaje antygen na cząsteczce HLA i powoduje lizę komórki oznaczonej w ten sposób. W dalszym wykonaniu czynnikiem jest przeciwciało, które wiąże się selektywnie do antygenu związanego z nowotworem, i w ten sposób zapoczątkowuje naturalne lub sztuczne mechanizmy efektorowe w stosunku do tej komórki. W dalszym wykonaniu czynnikiem jest limfocyt pomocniczy T, który wzmacnia funkcje efektorowe innych komórek specyficznie rozpoznających ten antygen.

W jednym z aspektów wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik, który hamuje ekspresję lub aktywność antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku. W korzystnym wykonaniu tym czynnikiem jest antysensowny kwas nukleinowy, który hybrydyzuje selektywnie do kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem. W dalszym wykonaniu tym czynnikiem jest przeciwciało, które wiąże się selektywnie do antygenu związanego z nowotworem. W dalszym wykonaniu ten czynnik obejmuje dwa lub więcej czynników, z których każdy selektywnie hamuje ekspresję lub aktywność różnych antygenów związanych z nowotworem, z których przynajmniej jeden jest antygenem związanym z nowotworem zidentyfikowanym według wynalazku.

Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji farmaceutycznej, która zawiera czynnik, który po podaniu selektywnie zwiększa ilość kompleksów pomiędzy cząsteczką HLA a epitopem peptydu pochodzącym od antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku. W jednym z wykonań czynnik ten obejmuje jeden lub więcej składników wybranych spośród grupy składającej się z (i) antygenu związanego z nowotworem lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje ten antygen związany z nowotworem lub jego część, (iii) komórki gospodarza, która wykazuje ekspresję tego antygenu związanego z nowotworem lub jego części, oraz (iv) wyizolowanych kompleksów pomiędzy epitopami peptydów pochodzących od tego antygenu związanego z nowotworem a cząsteczką MHC. W jednym z wykonań czynnik ten obejmuje dwa lub więcej czynników, z których każdy selektywnie zwiększa ilość kompleksów cząsteczek MHC i epitopów peptydów różnych antygenów związanych z nowotworem, z których przynajmniej jeden jest antygenem związanym z nowotworem zidentyfikowanym według wynalazku.

Wynalazek ponadto dotyczy kompozycji farmaceutycznej, która zawiera jeden lub więcej składników wybranych spośród grupy składającej się z (i) antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem zidentyfikowany według wynalazku lub jego część, (iii) przeciwciała, które wiąże się do antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku lub jego części, (iv) antysensownego kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje specyficznie do kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem zidentyfikowany według wynalazku, (v) komórkę gospodarza, która wykazuje ekspresję antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku lub jego części, oraz (vi) wyizolowane kompleksy antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku lub jego części i cząsteczki HLA.

Kwas nukleinowy kodujący antygen związany z nowotworem zidentyfikowany według wynalazku lub jego część może występować w kompozycji farmaceutycznej na wektorze ekspresyjnym i w sposób funkcjonalny połączony z promotorem.

Komórka gospodarza występująca w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku może wydzielać antygen związany z nowotworem lub jego część, wykazywać jego ekspresję na powierzchni lub może dodatkowo wykazywać ekspresję cząsteczki HLA, która wiąże się do tego antygenu związanego z nowotworem lub jego części. W jednym z wykonań komórka gospodarza w sposób endogenny wykazuje ekspresję cząsteczki HLA. W dalszym wykonaniu komórka gospodarza wykazuje ekspresję cząsteczki HLA i/lub antygenu związanego z nowotworem lub jego części w sposób rekombinowany. Komórka gospodarza korzystnie nie namnaża się. W korzystnym wykonaniu komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.

Przeciwciało występujące w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych wykonaniach przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub

PL 215 160 B1 humanizowanym, fragmentem naturalnego przeciwciała lub przeciwciałem syntetycznym, z których każde może zostać wytworzone technikami kombinatoryjnymi. Przeciwciało może być sprzężone z czynnikiem użytecznym terapeutycznie lub diagnostycznie.

Antysensowny kwas nukleinowy występujący w kompozycji farmaceutycznej może obejmować sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30, kolejnych nukleotydów z kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem zidentyfikowanym.

W dalszych wykonaniach antygen związany z nowotworem dostarczony przez kompozycję farmaceutyczną według wynalazku albo bezpośrednio, albo poprzez ekspresję kwasu nukleinowego lub jego części wiąże się do cząsteczek MHC na powierzchni komórek, przy czym to wiązanie korzystnie powoduje odpowiedź cytolityczną i/lub indukcję uwalniania cytokin.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może zawierać farmaceutycznie zgodny nośnik i/lub adiuwant. Adiuwant może być wybrany spośród saponiny, GM-CSF, nukleotydów CpG, RNA, cytokiny lub chemokiny. Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku korzystnie stosuje się do leczenia choroby charakteryzującej się selektywną ekspresją lub nieprawidłową ekspresją antygenu związanego z nowotworem. W korzystnym wykonaniu tą chorobą jest rak.

Wynalazek ponadto dotyczy sposobów leczenia lub diagnozowania choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją jednego z większej ilości antygenów związanych z nowotworem. W jednym z wykonań leczenie obejmuje podawanie kompozycji farmaceutycznej według wynalazku.

W jednym z aspektów wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku. Sposób ten obejmuje wykrywanie (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem lub jego część, i/lub (ii) wykrywanie antygenu związanego z nowotworem lub jego części i/lub (iii) wykrywanie przeciwciała przeciwko antygenowi związanemu z nowotworem lub jego części i/lub (iv) wykrywanie limfocytów cytotoksycznych lub pomocniczych T, które są specyficzne dla antygenu związanego z nowotworem lub jego części, w próbce biologicznej wyizolowanej od pacjenta. W szczególnych wykonaniach wykrywanie obejmuje (i) kontakt próbki biologicznej z czynnikiem, który wiąże się specyficznie do kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem lub do jego części, do tego antygenu związanego z nowotworem lub do jego części, do przeciwciała lub do limfocytów cytotoksycznych lub pomocniczych T specyficznych dla antygenu związanego z nowotworem lub jego części, oraz (ii) wykrywanie tworzenia się kompleksu pomiędzy tym czynnikiem a kwasem nukleinowym lub jego częścią, antygenem związanym z nowotworem lub jego częścią, przeciwciałem lub limfocytami cytotoksycznymi lub pomocniczymi T. W jednym z wykonań choroba ta charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych antygenów związanych z nowotworem, a wykrywanie obejmuje wykrywanie dwóch lub więcej kwasów nukleinowych kodujących te dwa lub więcej różnych antygenów związanych z nowotworem lub ich części, wykrywanie dwóch lub więcej antygenów związanych z nowotworem lub ich części, wykrywanie dwóch lub więcej przeciwciał wiążących się do tych dwóch lub więcej antygenów związanych z nowotworem lub do ich części lub wykrywanie dwóch lub więcej rodzajów limfocytów cytotoksycznych lub pomocniczych T specyficznych dla tych dwu lub więcej różnych antygenów związanych z nowotworem. W dalszym wykonaniu próbkę biologiczną wyizolowaną od pacjenta porównuje się z porównywalną prawidłową próbką biologiczną.

W dalszym aspekcie ujawniono sposób określania regresji, przebiegu lub pojawienia się choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku, który to sposób obejmuje monitorowanie próbki od pacjenta, który choruje na tę chorobę lub podejrzewa się, że zachoruje na tę chorobę, pod względem jednego lub więcej parametrów wybranych spośród grupy składającej się z (i) ilości kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem lub jego część, (ii) ilości antygenu związanego z nowotworem lub jego części, (iii) ilości przeciwciał, które wiążą się do antygenu związanego z nowotworem lub jego części, i (iv) ilości komórek cytolitycznych T lub komórek pomocniczych T, które są specyficzne dla kompleksu pomiędzy antygenem związanym z nowotworem lub jego częścią a cząsteczką MHC. Sposób ten korzystnie obejmuje określanie parametru(ów) w pierwszej próbce w pierwszym punkcie czasu i w kolejnej próbce w drugim punkcie czasu i w którym przebieg choroby określa się przez porównanie dwóch próbek. W szczególnych wykonaniach choroba charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych antygenów związanych z nowotworem, a monitorowanie obejmuje monitorowanie (i) ilości dwóch lub więcej kwasów nukleinowych, które kodują te dwa lub więcej różnych antygenów związanych z nowotworem lub ich części, i/lub (ii) ilości tych dwóch lub

PL 215 160 B1 więcej różnych antygenów związanych z nowotworem lub ich części, i/lub (iii) ilości dwóch lub więcej przeciwciał, które wiążą się do tych dwóch lub więcej różnych antygenów związanych z nowotworem lub do ich części, i/lub (iv) ilości dwóch lub więcej cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla kompleksów pomiędzy tymi dwoma lub więcej różnymi antygenami związanymi z nowotworem lub ich częściami a cząsteczkami MHC.

Wykrywanie kwasu nukleinowego lub jego części lub monitorowanie ilości kwasu nukleinowego lub jego części można przeprowadzić przy użyciu sondy polinukleotydowej, która hybrydyzuje specyficznie do tego kwasu nukleinowego lub tej jego części lub można przeprowadzić poprzez selektywne namnażanie tego kwasu nukleinowego lub tej jego części. W jednym z wykonań sonda polinukleotydowa zawiera sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30, kolejnych nukleotydów tego kwasu nukleinowego.

W szczególnych wykonaniach antygen związany z nowotworem, który ma być wykrywany, lub jego część występuje wewnątrz komórki lub na powierzchni komórki. Według wynalazku wykrywanie antygenu związanego z nowotworem lub jego części lub monitorowanie ilości antygenu związanego z nowotworem lub jego części można przeprowadzić przy użyciu przeciwciała wiążącego się specyficznie do tego antygenu związanego z nowotworem lub tej jego części.

W dalszych wykonaniach antygen związany z nowotworem, który ma być wykrywany, lub jego część występuje w kompleksie z cząsteczką MHC, w szczególności cząsteczką HLA.

Wykrywanie przeciwciała lub monitorowanie ilości przeciwciał można przeprowadzić przy użyciu białka lub peptydu wiążącego się specyficznie do tego przeciwciała.

Ujawniono także, iż wykrywanie cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T lub monitorowanie ilości cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla kompleksów pomiędzy antygenem lub jego częścią a cząsteczkami MHC można przeprowadzić przy użyciu komórki prezentującej kompleks pomiędzy tym antygenem lub tą jego częścią a cząsteczką MHC.

Sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd lub komórka, które są stosowane do wykrywania lub monitorowania, korzystnie są znakowane w sposób umożliwiający wykrywanie. W szczególnych wykonaniach wykrywalnym znacznikiem jest znacznik radioaktywny lub znacznik enzymatyczny. Limfocyty T można dodatkowo wykrywać poprzez wykrywanie ich proliferacji, ich wytwarzania cytokin i ich aktywności cytotoksycznej indukowanej specyficzną stymulacją kompleksem MHC i antygenu związanego z nowotworem lub jego części. Limfocyty T można także wykrywać poprzez rekombinowaną cząsteczkę MHC, albo inaczej kompleks dwóch lub więcej cząsteczek MHC, które niosą szczególny fragment immunogeniczny jednego lub więcej antygenów związanych z nowotworem i które mogą zidentyfikować specyficzne limfocyty T przez kontakt ze specyficznym receptorem komórki T.

Ujawniono także sposób leczenia, diagnozowania lub monitorowania choroby poprzez ekspresję lub nieprawidłową ekspresję antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku, który to sposób obejmuje podawanie przeciwciała, które się wiąże do tego antygenu związanego z nowotworem lub jego części i które jest sprzężone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym. Przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych wykonaniach przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem naturalnego przeciwciała.

Ujawniono także sposób leczenia pacjenta chorującego na chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku, który to sposób obejmuje (i) pobranie od tego pacjenta próbki zawierającej komórki immunoreaktywne, (ii) kontakt tej próbki z komórką gospodarza wykazującą ekspresję tego antygenu związanego z nowotworem lub jego części w warunkach, które faworyzują wytwarzanie cytolitycznych komórek T przeciwko temu antygenowi związanemu z nowotworem lub jego części, oraz (iii) wprowadzenie cytolitycznych komórek T do pacjenta w ilości odpowiedniej do Iizy komórek wykazujących ekspresję antygenu związanego z nowotworem lub jego części. Wynalazek podobnie dotyczy klonowania receptora komórki T cytolitycznych komórek T przeciwko antygenowi związanemu z nowotworem. Ten receptor można przenieść do innych komórek T, które tym samym uzyskują pożądaną specyficzność, oraz, tak jak w (iii), można wprowadzić do pacjenta.

W jednym z wykonań komórka gospodarza w sposób endogenny wykazuje ekspresję cząsteczki HLA. W dalszym wykonaniu komórka gospodarza w sposób rekombinowany wykazuje ekspresję cząsteczki HLA i/lub antygenu związanego z nowotworem lub jego części. Komórka gospodarza korzystnie nie namnaża się. W korzystnym wykonaniu komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.

PL 215 160 B1

Ponadto ujawniono sposób leczenia pacjenta chorującego na chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją antygenu związanego z nowotworem, który to sposób obejmuje (i) identyfikowanie kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem zidentyfikowany według wynalazku i który ulega ekspresji w komórkach związanych z tą chorobą,(ii) transfekowanie komórki gospodarza tym kwasem nukleinowym lub jego częścią, (iii) hodowanie transfekowanej komórki gospodarza w celu ekspresji tego kwasu nukleinowego (nie jest to konieczne, kiedy otrzymuje się wysoką wydajność transfekcji) oraz (iv) wprowadzanie komórek gospodarza lub ich ekstraktu do pacjenta w ilości odpowiedniej do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom pacjenta związanym z chorobą. Sposób może ponadto obejmować identyfikowanie cząsteczki MHC prezentującej antygen związany z nowotworem lub jego część, przy czym komórka gospodarza wykazuje ekspresję zidentyfikowanej cząsteczki MHC i prezentującej ten antygen związany z nowotworem lub jego część. Odpowiedź immunologiczna może obejmować odpowiedź komórek B lub odpowiedź komórek T. Ponadto odpowiedź komórek T może obejmować wytwarzanie cytolitycznych komórek T i/lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla komórek gospodarza prezentujących antygen związany z nowotworem lub jego część lub specyficzne dla komórek pacjenta, które wykazują ekspresję tego antygenu związanego z nowotworem lub jego części.

Ujawniony tu sposób leczenia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją antygenu związanego z nowotworem tu zidentyfikowanym, który to sposób obejmuje (i) identyfikowanie komórek od pacjenta, które wykazują ekspresję nieprawidłowych ilości antygenu związanego z nowotworem, (ii) izolowanie próbki tych komórek, (iii) hodowanie tych komórek oraz (iv) wprowadzenie tych komórek do pacjenta w ilości odpowiedniej do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko tym komórkom.

Korzystnie komórki gospodarza stosowane według wynalazku nie namnażają się i są uczynione komórkami nienamnażającymi się. Choroba charakteryzująca się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją antygenu związanego z nowotworem jest w szczególności rakiem.

Niniejszym ujawniono także kwas nukleinowy wybrany spośród grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który obejmuje sekwencję wybraną spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 2-5, 20-21, 31-33, 39, 54-57, 62, 63, 85-88, ich części lub pochodnych, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje do kwasu nukleinowego z punktu (a) w ostrych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego z punktu (a) lub (b), oraz (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego z punktu (a), (b) lub (c). Wynalazek ponadto dotyczy kwasu nukleinowego, który koduje białko lub polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65, 89100, ich części lub pochodnej.

Ponadto ujawniono sekwencje promotorów kwasów nukleinowych. Te sekwencje można funkcjonalnie przyłączyć do innego genu, korzystnie na wektorze ekspresyjnym, i w ten sposób zapewnić ekspresję tego genu we właściwych komórkach.

Ujawniono także rekombinowane cząsteczki kwasu nukleinowego, w szczególności cząsteczki DNA lub RNA, która zawiera kwas nukleinowy według wynalazku.

Wynalazek także dotyczy komórek gospodarza, które zawierają kwas nukleinowy według wynalazku lub rekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą kwas nukleinowy według wynalazku.

Komórka gospodarza może także zawierać kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę HLA. W jednym z wykonań komórka gospodarza w sposób endogenny wykazuje ekspresję cząsteczki HLA. W dalszym wykonaniu komórka gospodarza w sposób rekombinowany wykazuje ekspresję cząsteczki HLA i/lub kwasu nukleinowego według wynalazku lub jego części. Korzystnie komórka gospodarza nie namnaża się. W korzystnym wykonaniu komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.

Niniejszym ujawniono także oligonukleotydy, które hybrydyzują do zidentyfikowanego kwasu nukleinowego i które można zastosować jako sondy genetyczne lub jako cząsteczki „antysensowne. Cząsteczki kwasów nukleinowych w postaci starterów oligonukleotydowych lub próbek współzawodniczących, które hybrydyzują do zidentyfikowanego kwasu nukleinowego lub jego części, można zastosować do znajdywania kwasów nukleinowych, które są homologiczne do tych zidentyfikowanych kwasów nukleinowych. Namnażanie techniką PCR, hybrydyzacja Southern i Northern mogą być zastosowane do znajdywania homologicznych kwasów nukleinowych. Hybrydyzację można przeprowadzić w łagodnych warunkach, korzystniej o średniej ostrości, a najkorzystniej w ostrych warunkach. Określenie „ostre warunki według wynalazku dotyczy warunków, które pozwalają na specyficzną hybrydyzację pomiędzy polinukleotydami.

PL 215 160 B1

W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy białka lub polipeptydu, który jest kodowany przez kwas nukleinowy wybrany spośród grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego wybraną spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 2-5, 20-21, 31-33, 39, 54-57, 62, 63, 85-88, ich części lub pochodnej, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje do kwasu nukleinowego z punktu (a) w ostrych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego z punktu (a) lub (b), oraz (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego z punktu (a), (b) lub (c). W korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy białka lub polipeptydu, który zawiera sekwencję aminokwasową wybraną spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65, 89-100, ich części lub pochodnej.

Niniejszym ujawniono fragment immunogenicznego antygenu związanego ze zidentyfikowanym nowotworem. Ten fragment korzystnie wiąże się do ludzkiego receptora HLA lub do ludzkiego przeciwciała. Fragment korzystnie obejmuje sekwencję przynajmniej 6, w szczególności przynajmniej 8, przynajmniej 10, przynajmniej 12, przynajmniej 15, przynajmniej 20, przynajmniej 30 lub przynajmniej 50 aminokwasów.

Ujawniono także czynnik, który wiąże się do antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku lub jego części. Korzystnie czynnikiem tym może być przeciwciało. W dalszych wykonaniach przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym, humanizowanym lub przeciwciałem, wytworzonym technikami kombinatoryjnymi lub jest fragmentem przeciwciała. Ponadto, wynalazek dotyczy przeciwciała, które wiąże się selektywnie do kompleksu (i) antygenu związanego z nowotworem zidentyfikowanego według wynalazku lub jego części oraz (ii) cząsteczki MHC, do której ten antygen związany z nowotworem zidentyfikowany według wynalazku lub ta jego część wiąże się, przy czym to przeciwciało nie wiąże się do samego (i) lub (ii). Przeciwciało według wynalazku może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych wykonaniach przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem naturalnego przeciwciała.

Ujawniono także koniugat pomiędzy czynnikiem, który wiąże się do antygenu związanego ze zidentyfikowanym nowotworem lub do jego części, lub przeciwciałem i czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym. W jednym z wykonań czynnik terapeutyczny lub diagnostyczny jest toksyną.

Ujawniono także zestaw do wykrywania ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji antygenu związanego ze zidentyfikowanym nowotworem, który to zestaw zawiera środki do wykrywania (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem lub jego część, (ii) antygenu związanego z nowotworem lub jego części, (iii) przeciwciał, które wiążą się do antygenu związanego z nowotworem lub jego części, i/lub (iv) komórek T, które są specyficzne dla kompleksu pomiędzy antygenem związanym z nowotworem lub jego częścią a cząsteczką MHC. W jednym z wykonań środki do wykrywania kwasu nukleinowego lub jego części są cząsteczkami kwasów nukleinowych do selektywnego namnażania tego kwasu nukleinowego, które obejmują 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30, kolejnych nukleotydów tego kwasu nukleinowego.

Szczegółowy opis wynalazku.

Geny tu opisywane wykazują ekspresję w komórkach nowotworowych w sposób selektywny lub zaburzony i które są antygenami związanymi z nowotworem.

Geny te lub ich pochodne są korzystnymi strukturami docelowymi dla podejść terapeutycznych. W swoim zamyśle, te podejścia terapeutyczne mogą mieć na celu hamowanie aktywności selektywnie ulegającego ekspresji produktu genetycznego związanego z nowotworem. Jest to użyteczne, jeśli ta odpowiednia zaburzona selektywna ekspresja jest ważna pod względem funkcjonalnym w patogeniczności nowotworu i jeśli temu połączeniu towarzyszy selektywne zniszczenie odpowiednich komórek. Inne koncepcje terapeutyczne rozważają antygeny związane z nowotworem jako znaczniki, które indukują mechanizmy efektorowe mające potencjał niszczący komórki selektywnie względem komórek nowotworowych. Tutaj funkcja samej cząsteczki docelowej i jej rola w rozwoju nowotworu są zupełnie nie związane.

„Pochodna kwasu nukleinowego oznacza według wynalazku, że w tym kwasie nukleinowym występują pojedyncze lub wielokrotne podstawienia, delecję i/lub addycje nukleotydów. Ponadto, określenie „pochodna obejmuje także chemiczną derywatyzację kwasu nukleinowego na zasadzie nukleotydowej, na cukrze lub na fosforanie. Określenie „pochodna obejmuje także kwasy nukleinowe, które zawierają nukleotydy i analogi nukleotydów nie występujące naturalnie.

Według wynalazku kwas nukleinowy korzystnie jest kwasem deoksyrybonukleinowym (DNA) lub rybonukleinowym (RNA). Kwasy nukleinowe obejmują według wynalazku genomowy DNA, cDNA, mRNA, cząsteczki wytworzone w sposób rekombinowany i syntetyzowane chemicznie. Według

PL 215 160 B1 wynalazku kwas nukleinowy może występować jako cząsteczka jednoniciowa lub dwuniciowa i liniowa lub kowalencyjnie koliście zamknięta.

Kwasy nukleinowe opisane według wynalazku korzystnie zostały wyizolowane. Określenie „wyizolowany kwas nukleinowy oznacza według wynalazku, że kwas nukleinowy był (i) namnożony in vitro, na przykład przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), (ii) wytworzony w sposób rekombinowany przez klonowanie, (iii) oczyszczony, na przykład przez cięcie i frakcjonowanie na żelu elektroforetycznym, lub (iv) syntetyzowany, na przykład poprzez syntezę chemiczną. Wyizolowany kwas nukleinowy jest kwasem nukleinowym, którym można manipulować technikami rekombinowanego DNA.

Kwas nukleinowy jest „komplementarny do innego kwasu nukleinowego, jeżeli dwie sekwencje są zdolne do hybrydyzacji i utworzenia stabilnego dupleksu z sobą nawzajem, przy czym hybrydyzację korzystnie przeprowadza się w warunkach, które pozwalają na specyficzną hybrydyzację pomiędzy polinukleotydami (ostre warunki). Ostre warunki są opisane, na przykład, w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook i wsp., red., wydanie drugie, wydawnictwo Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989 lub Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel i wsp., red., John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork, i odnoszą się, na przykład, do hybrydyzacji w 65°C w buforze do hybrydyzacji (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% poliwinylopirolidon, 0,02% albumina surowicy wołu, 2,5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0,5% SDS, 2 mM EDTA). SSC jest 0,15 M chlorkiem sodu/0,15 M cytrynianem sodu, pH 7. Po hybrydyzacji błonę, na którą się przenosi DNA, przemywa się, na przykład, 2 x SSC w temperaturze pokojowej, a następnie 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS w temperaturach do 68°C.

Komplementarne kwasy nukleinowe mają przynajmniej 40%, w szczególności przynajmniej 50%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80%, przynajmniej według wynalazku 90%, a korzystnie przynajmniej 95%, przynajmniej 98% lub przynajmniej 99%, identycznych nukleotydów.

Kwasy nukleinowe kodujące antygeny związane z nowotworem mogą, występować same lub w połączeniu z innymi kwasami nukleinowymi, w szczególności heterologicznymi kwasami nukleinowymi. W korzystnych wykonaniach kwas nukleinowy jest połączony funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi ekspresję lub sekwencjami regulatorowymi, które mogą być homologiczne lub heterologiczne względem tego kwasu nukleinowego. Sekwencja kodująca i sekwencja regulatorowa są „funkcjonalnie połączone ze sobą, jeżeli są one połączone ze sobą kowalencyjnie w taki sposób, że ekspresja lub transkrypcja tej sekwencji kodującej jest pod kontrolą lub pod wpływem tej sekwencji regulatorowej. Jeżeli sekwencja kodująca ma ulegać translacji na funkcjonalne białko, przy czym sekwencja regulatorowa jest połączona funkcjonalnie do tej sekwencji kodującej, wtedy w wyniku indukcji tej sekwencji regulatorowej następuje transkrypcja tej sekwencji kodującej nie powodując przesunięcia ramki odczytu w sekwencji kodującej albo ta sekwencja kodująca nie jest zdolna ulegać translacji na pożądane białko lub peptyd.

Określenie „sekwencja kontrolująca ekspresję lub „sekwencja regulatorowa obejmują według wynalazku promotory, wzmacniacze i inne elementy kontrolujące, które regulują ekspresję genu. W szczególnych wykonaniach wynalazku sekwencje kontrolujące ekspresję można regulować. Dokładna struktura sekwencji regulatorowych może różnić się w zależności od funkcji struktury lub typu komórki, ale na ogół obejmują sekwencje nie ulegające transkrypcji na końcu 5' i nie ulegające translacji na końcu 5', które są zaangażowane, odpowiednio, w inicjację transkrypcji i translacji, takie jak sekwencja TATA, sekwencja, którą rozpoznaje enzym przyłączający czapeczkę, sekwencja CAAT itp. Bardziej szczegółowo, sekwencje regulatorowe nie ulegające transkrypcji na końcu 5' obejmują region promotora, który zawiera sekwencję promotora do kontroli transkrypcji funkcjonalnie przyłączonego genu. Sekwencje regulatorowe mogą także obejmować sekwencje wzmacniające lub usytuowane na lewo sekwencje aktywatora.

Zatem, z jednej strony, antygeny związane z nowotworem tutaj przedstawione można połączyć z dowolnymi sekwencjami kontrolującymi ekspresję i promotorami. Z drugiej strony, jednak, promotory produktów genetycznych związanych z nowotworem przedstawionych tutaj można, według wynalazku, połączyć z innymi genami. Pozwala to na zastosowanie selektywnej aktywności tych promotorów.

Według wynalazku kwas nukleinowy może ponadto występować w połączeniu z innym kwasem nukleinowym, który koduje polipeptyd kontrolujący wydzielanie białka lub polipeptydu kodowanego przez ten kwas nukleinowy przez komórkę gospodarza. Według wynalazku kwas nukleinowy może także występować w połączeniu z innym kwasem nukleinowym, który koduje polipeptyd, powodując zakotwiczenie kodowanego białka lub polipeptydu w błonie komórkowej komórki gospodarza lub kierowanie do poszczególnych organelli tej komórki.

PL 215 160 B1

W korzystnym wykonaniu rekombinowana cząsteczka DNA jest według wynalazku wektorem, jeśli to konieczne z promotorem, który kontroluje ekspresję kwasu nukleinowego, na przykład kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem według wynalazku. Określenie „wektor jest tutaj stosowane w swoim najbardziej ogólnym znaczeniu i obejmuje dowolny pośredniczący nośnik kwasu nukleinowego, który umożliwia, na przykład, wprowadzenie tego kwasu nukleinowego do komórek prokariotycznych i/lub eukariotycznych oraz, jeśli to konieczne, integrację z genomem. Wektory tego typu korzystnie są replikowane i/lub ulegają ekspresji w komórkach. Pośredniczący nośnik można zaadoptować, na przykład, do zastosowania w elektroporacji, w bombardowaniu mikropociskami, w podaniu przy użyciu liposomów, w przeniesieniu z pomocą agrobakterii lub w insercji poprzez wirusy DNA lub RNA. Wektory obejmują plazmidy, fagmidy lub genomy wirusowe.

Kwasy nukleinowe kodujące antygen związany z nowotworem zidentyfikowany według wynalazku można zastosować do transfekcji komórek gospodarza. Kwasy nukleinowe oznaczają tutaj zarówno rekombinowany DNA, jak i RNA. Rekombinowany RNA można przygotować poprzez transkrypcję in vitro matrycy DNA. Ponadto, można go zmodyfikować przed użyciem przez sekwencje stabilizujące, przyłączenie czapeczki i poliadenylację. Według wynalazku, określenie „komórka gospodarza dotyczy dowolnej komórki, która może być transformowana lub transfekowana egzogennym kwasem nukleinowym. Określenie „komórki gospodarza obejmuje według wynalazku komórki prokariotyczne (np. E. coli) lub eukariotyczne (np. komórki dendrytyczne, komórki B, komórki CHO, komórki COS, komórki K562, komórki drożdży i komórki owadzie). Szczególnie korzystne są komórki ssacze, takie jak komórki od ludzi, myszy, chomików, świń, kóz, naczelnych. Komórki mogą pochodzić od wielu różnorakich typów tkanek i obejmować komórki pierwotne i linie komórkowe. Szczególne przykłady obejmują keratynocyty, leukocyty krwi obwodowej, komórki macierzyste szpiku kostnego i zarodkowe komórki macierzyste. W dalszych wykonaniach komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem. Kwas nukleinowy może być obecny w komórce gospodarza w postaci pojedynczej kopii lub dwóch lub więcej kopiach i, w jednym z wykonań, ulega ekspresji w komórce gospodarza.

Według wynalazku, określenie „ekspresja jest stosowane w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i obejmuje wytwarzanie RNA oraz RNA i białka. Obejmuje ono także częściową ekspresję kwasów nukleinowych. Ponadto, ekspresję można przeprowadzić przejściowo lub trwale. Korzystne systemy ekspresji w komórkach ssaczych obejmują pcDNA3.1 i pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), które zawierają selektywny znacznik, taki jak gen niosący oporność na G418 (a zatem umożliwiający selekcję stabilnie transfekowanych linii komórkowych), oraz sekwencje wzmacniacza-promotora wirusa cytomegalii (CMV).

W tych przypadkach w których cząsteczka HLA prezentuje antygen związany z nowotworem lub jego część, wektor ekspresyjny może także obejmować sekwencję kwasu nukleinowego kodującą tą cząsteczkę HLA. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca cząsteczkę HLA może występować na tym samym wektorze ekspresyjnym co kwas nukleinowy kodujący antygen związany z nowotworem lub jego część lub obydwa kwasy nukleinowe mogą występować na różnych wektorach ekspresyjnych. W tym drugim przypadku dwa wektory ekspresyjne można transfekować razem do komórki. Jeżeli komórka gospodarza nie wykazuje ekspresji ani antygenu związanego z nowotworem lub jego części, ani cząsteczki HLA, obydwa kwasy nukleinowe je kodujące transfekuje się do komórki albo na tym samym wektorze ekspresyjnym, albo na różnych wektorach ekspresyjnych. Jeżeli komórka wykazuje już ekspresję cząsteczki HLA, może być transfekowana do komórki tylko sekwencja kwasu nukleinowego kodująca antygen związany z nowotworem lub jego część.

Wynalazek obejmuje także zestawy do namnażania kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem. Takie zestawy obejmują, na przykład, parę starterów do namnażania, które hybrydyzują do kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem. Startery korzystnie zawierają sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30, kolejnych nukleotydów kwasu nukleinowego i nie parują ze sobą, żeby nie powstawały dimery starterów. Jeden ze starterów będzie hybrydyzował do jednej nici kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem, a drugi starter będzie hybrydyzował do nici komplementarnej w takim ułożeniu, które pozwala na namnażanie kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem.

Cząsteczki „antysensowne lub „antysensowne kwasy nukleinowe można zastosować do regulowania, w szczególności do zmniejszania, ekspresji kwasu nukleinowego. Określenie „cząsteczka antysensowna lub „antysensowny kwas nukleinowy dotyczy według wynalazku oligonukleotydu, który jest oligorybonukleotydem, oligodeoksyrybonukleotydem, zmodyfikowanym oligorybonukleotyPL 215 160 B1 dem lub zmodyfikowanym oligodeoksyrybonukleotydem i który hybrydyzuje w warunkach fizjologicznych do DNA obejmującego szczególny gen lub do mRNA tego genu, hamując tym samym transkrypcję tego genu i/lub translację tego mRNA. Według wynalazku, określenie „cząsteczka antysensowna obejmuje także konstrukt, który zawiera kwas nukleinowy lub jego część w orientacji przeciwnej względem jego naturalnego promotora. Antysensowny transkrypt kwasu nukleinowego lub jego część mogą tworzyć dupleks z naturalnie występującym mRNA określającym enzym i tym samym zapobiegać akumulacji lub translacji mRNA na aktywny enzym. Inną możliwością jest zastosowanie rybozymów do inaktywowania kwasu nukleinowego. Antysensowne oligonukleotydy korzystnie mają sekwencje 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30, kolejnych nukleotydów docelowego kwasu nukleinowego i korzystnie są w pełni komplementarne do docelowego kwasu nukleinowego lub do jego części.

W korzystnych wykonaniach antysensowny oligonukleotyd hybrydyzuje do miejsca N-końcowego lub od strony końca 5', takiego jak miejsce inicjacji translacji lub miejsce promotora. W dalszych wykonaniach antysensowny oligonukleotyd hybrydyzuje do nie ulegającego translacji regionu od końca 5' lub miejsca składania mRNA.

W jednym z wykonań oligonukleotyd składa się z rybonukleotydów, deoksyrybonukleotydów lub ich kombinacji, przy czym koniec 5' jednego nukleotydu i koniec 3' drugiego nukleotydu są połączone ze sobą wiązaniem fosfodiestrowym. Te oligonukleotydy można zsyntetyzować w sposób konwencjonalny lub wytworzyć w sposób rekombinowany.

W korzystnych wykonaniach oligonukleotyd jest „zmodyfikowanym oligonukleotydem. Tutaj, oligonukleotyd można zmodyfikować na bardzo różne sposoby, nie osłabiając ich zdolności do wiązania przez nie cząsteczki docelowej, żeby zwiększyć, na przykład, ich stabilność lub skuteczność terapeutyczną. Określenie „zmodyfikowany oligonukleotyd oznacza oligonukleotyd, w którym (i) przynajmniej dwa z nukleotydów są połączone ze sobą przez syntetyczne wiązanie międzynukleozydowe (tj. wiązanie międzynukleozydowe, które nie jest wiązaniem fosfodiestrowym) i/lub (ii) grupa chemiczna, która zwykle nie jest znajdywana w kwasach nukleinowych jest kowalencyjnie połączona z oligonukleotydem. Korzystne syntetyczne wiązania międzynukleozydowe są tiofosforanami, fosfonianami alkilu, ditiofosforanami, estrami fosforowymi, tiofosfonianami alkilu, fosforoamidami, karbaminianami, węglanami, triestrami fosforanów, acetamidami, estrami karboksymetylu i peptydami.

Określenie „zmodyfikowany oligonukleotyd obejmuje także oligonukleotydy mające kowalencyjnie zmodyfikowaną zasadę i/lub cukier. „Zmodyfikowane oligonukleotydy obejmują, na przykład, oligonukleotydy z resztami cukrowymi, które są kowalencyjnie związane do grup organicznych o małej masie cząsteczkowej innych niż grupa hydroksylowa w pozycji 3' i grupa fosforanowa w pozycji 5'. Zmodyfikowane oligonukleotydy mogą obejmować, na przykład, resztę 2'-O-alkilowanej rybozy lub inny cukier zamiast rybozy, taki jak arabinoza.

Korzystnie, białka i polipeptydy tu w wynalazku zostały wyizolowane. Określenia „wyizolowane białko lub „wyizolowany polipeptyd oznaczają, że białko lub polipeptyd zostały wydzielone ze swojego naturalnego środowiska. Wyizolowane białko lub polipeptyd mogą być w zasadniczo oczyszczonym stanie. Określenie „zasadniczo oczyszczony oznacza, że białko lub polipeptyd jest zasadniczo wolny od innych substancji, które mu towarzyszą w naturze lub in vivo.

Takie białka lub polipeptydy mogą być zastosowane, na przykład, w wytwarzaniu przeciwciał oraz w oznaczeniach immunologicznych i diagnostycznych lub jako środki terapeutyczne. Białka lub polipeptydy tu opisane można wyizolować z próbek biologicznych, takich jak tkanka lub homogenaty komórek, i można także poddać rekombinowanej ekspresji w wielu różnych pro- lub eukariotycznych systemach ekspresyjnych.

Dla celów niniejszego wynalazku „pochodne białka lub polipeptydu lub sekwencji aminokwasowej obejmują warianty z insercją aminokwasu, warianty z delecją aminokwasu i/lub warianty z podstawieniem aminokwasu.

Warianty z insercją aminokwasu obejmują fuzje amino- i/lub karboksyterminalne, a także insercje pojedynczego lub dwóch lub więcej aminokwasów do szczególnej sekwencji aminokwasowej. W przypadku wariantów sekwencji aminokwasowej mających insercję jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest wstawiona do szczególnego miejsca w sekwencji aminokwasowej, chociaż możliwa jest także losowa insercja z odpowiednim przeszukaniem otrzymanych produktów. Warianty z delecją aminokwasu charakteryzują się usunięciem jednego lub więcej aminokwasów z sekwencji. Warianty z podstawieniem aminokwasu charakteryzują się tym, że przynajmniej jedna reszta została usunięta, a inna reszta została wstawiona w jej miejsce. Korzystne są modyfikacje występujące w sekwencji

PL 215 160 B1 aminokwasowej w pozycjach, które nie są konserwowane pomiędzy homologicznymi białkami lub polipeptydami. Korzystne jest zastąpienie aminokwasów innymi mającymi podobne właściwości, takie jak hydrofobowość, hydrofilowość, elektroujemność, objętość łańcucha bocznego itp. (podstawienia konserwatywne). Podstawienia konserwatywne, na przykład, dotyczą wymiany jednego aminokwasu innym aminokwasem wymienionym poniżej w tej samej grupie, co aminokwas, który ma być podstawiony:

1. małe alifatyczne, niepolarne lub nieznacznie polarne reszty: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)

2. ujemnie naładowane reszty i ich amidy: Asn, Asp, Glu, Gln

3. dodatnio naładowane reszty: His, Arg, Lys

4. duże alifatyczne, niepolarne reszty: Met, Leu, Ile, Val (Cys)

5. duże aromatyczne reszty: Phe, Tyr, Trp.

Ze względu na ich szczególny udział w architekturze białek trzy reszty są pokazane w nawiasach. Gly jest jedyną resztą bez łańcucha bocznego, a zatem dodaje giętkości łańcuchowi. Pro ma niezwykłą geometrię, która mocno usztywnia łańcuch. Cys może tworzyć mostek dwusiarczkowy.

Warianty aminokwasowe opisane powyżej można łatwo przygotować z pomocą znanych technik syntezy peptydów, takich jak, na przykład, poprzez syntezę na fazie stałej (Merrifield, 1964) i podobne sposoby lub poprzez manipulacje rekombinowanym DNA. Techniki do wprowadzenia mutacji polegającej na podstawieniu we wcześniej określonych miejscach w DNA, które ma znaną lub częściowo znaną sekwencję, są dobrze znane i obejmują, na przykład, mutagenezę M13. Manipulacje sekwencjami DNA do otrzymywania białek mających podstawienia, insercje lub delecje są opisane szczegółowo, na przykład, w Sambrook i wsp. (1989).

Według wynalazku, „pochodne białek lub polipeptydów obejmują także pojedyncze lub wielokrotne podstawienia, delecje i/lub addycje dowolnych cząsteczek związanych z enzymem, takich jak węglowodany, lipidy i/lub białka lub polipeptydy. Określenie „pochodna rozciąga się także na wszystkie funkcjonalne ekwiwalenty chemiczne tych białek lub polipeptydów.

Część lub fragment antygenu związanego z nowotworem ma właściwości funkcjonalne polipeptydu, od którego pochodzi. Takie właściwości funkcjonalne obejmują oddziaływanie z przeciwciałami, oddziaływanie z innymi polipeptydami lub białkami, selektywne wiązanie się kwasów nukleinowych i aktywność enzymatyczną. Szczególną właściwością jest zdolność do tworzenia kompleksu z HLA i, jeśli to konieczne, wytworzenia odpowiedzi immunologicznej. Ta odpowiedź immunologiczna może być oparta na stymulowaniu komórek cytotoksycznych lub pomocniczych T. Część lub fragment antygenu związanego z nowotworem korzystnie obejmuje sekwencję przynajmniej 6, w szczególności przynajmniej 8, przynajmniej 10, przynajmniej 12, przynajmniej 15, przynajmniej 20, przynajmniej 30 lub przynajmniej 50, kolejnych aminokwasów antygenu związanego z nowotworem.

Część lub fragment kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem dotyczy części kwasu nukleinowego, który koduje przynajmniej antygen związany z nowotworem i/lub część lub fragment tego antygenu związanego z nowotworem, jak to określono powyżej.

Izolacja i identyfikacja genów kodujących antygeny związane z nowotworem umożliwia także diagnozę choroby charakteryzującej się ekspresją jednego lub więcej antygenów związanych z nowotworem. Sposoby te obejmują określanie jednego lub więcej kwasów nukleinowych, które kodują antygen związany z nowotworem, i/lub określanie kodowanych antygenów związanych z nowotworem i/lub peptydów od nich pochodzących. Kwasy nukleinowe można określić w sposób konwencjonalny, włączając w to łańcuchową reakcję polimerazy lub hybrydyzację znakowaną sondą. Antygeny związane z nowotworem lub peptydy od nich pochodzące można określić przeszukując antysurowice pacjenta pod względem rozpoznawania antygenu i/lub peptydów. Można je także określić przeszukując komórki T pacjenta na specyficzność względem odpowiedniego antygenu związanego z nowotworem.

Niniejszy wynalazek umożliwia także izolowanie białek wiążących się do antygenów związanych z nowotworem opisanych tutaj, włączając w to przeciwciała i partnerów wiążących się w komórce do tych antygenów związanych z nowotworem.

Według wynalazku, szczególne wykonania muszą wiązać się z dostarczeniem „dominujących negatywnych polipeptydów pochodzących od antygenów związanych z nowotworem. Dominujący negatywny polipeptyd jest nieaktywnym wariantem białka, który poprzez oddziaływanie z maszynerią komórkową wypiera aktywne białko z jego oddziaływań z maszynerią komórkową lub który współzawodniczy z aktywnym białkiem, w ten sposób zmniejszając efekt tego aktywnego białka. Na przykład, dominujący negatywny receptor, który wiąże się do ligandu, ale nie wytwarza żadnego sygnału jako odpowiedzi na wiązanie się do ligandu, może zmniejszyć efekt biologiczny tego ligandu. Podobnie, dominująca negatywna katalitycznie nieaktywna kinaza, która zwykle oddziaływuje z białkami doceloPL 215 160 B1 wymi, może zmniejszyć fosforylację tych białek docelowych jako odpowiedź na sygnał komórkowy. Podobnie, dominujący negatywny czynnik transkrypcyjny, który wiąże się do miejsca promotora w regionie kontrolnym genu, ale nie zwiększa transkrypcji tego genu, może zmniejszyć efekt prawidłowego czynnika transkrypcyjnego zajmując miejsca wiązania promotora bez zwiększania transkrypcji.

Wynikiem ekspresji dominującego negatywnego polipeptydu w komórce jest zmniejszenie funkcji aktywnych białek. Specjalista w tej dziedzinie może przygotować dominujące negatywne warianty białka, na przykład, konwencjonalnymi sposobami mutagenezy i poprzez oszacowanie dominującego negatywnego efektu tego wariantu polipeptydu.

Wynalazek także obejmuje substancje, takie jak polipeptydy, które wiążą się do antygenów związanych z nowotworem. Takie substancje wiążące można zastosować, na przykład, w oznaczeniach przesiewających w celu wykrycia antygenów związanych z nowotworem i kompleksów antygenów związanych z nowotworem z ich wiążącymi się partnerami oraz w oczyszczaniu tych antygenów związanych z nowotworem i ich kompleksów z ich wiążącymi się partnerami. Takie substancje można także zastosować do hamowania aktywności antygenów związanych z nowotworem, na przykład, przez wiązanie się do takich antygenów.

Wynalazek zatem obejmuje substancje wiążące, takie jak, na przykład, przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, które są zdolne selektywnie wiązać się do antygenów związanych z nowotworem. Przeciwciała obejmują przeciwciała poliklonalne i monoklonalne, które są wytwarzane w sposób konwencjonalny.

Wiadomo, że tylko niewielka część cząsteczki przeciwciała, paratop, jest zaangażowana w wiązanie się przeciwciała do jego epitopu (por. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, wydanie siódme, Blackwell Scientific Publications, Oksford). Regiony pFc' i Fc są, na przykład, efektorami komplementarnej kaskady, ale nie są zaangażowane w wiązanie antygenu. Przeciwciało, z którego usunięto enzymatycznie region pFc' lub które zostało wytworzone bez regionu pFc', określane jako fragment F(ab')2, niesie obydwa miejsca wiązania kompletnego przeciwciała. Podobnie, przeciwciało, z którego usunięto enzymatycznie region Fc lub które zostało wytworzone bez tego regionu Fc, określane jako fragment Fab, niesie jedno miejsce wiązania antygenu z nietkniętej cząsteczki przeciwciała. Ponadto, fragmenty Fab składają się z kowalencyjnie związanego łańcucha lekkiego przeciwciała i części łańcucha ciężkiego tego przeciwciała, określanych jako Fd. Fragmenty Fd są głównymi determinantami specyficzności przeciwciała (pojedynczy fragment Fd może być związany z nawet dziesięcioma różnymi łańcuchami lekkimi bez zmiany specyficzności przeciwciała) oraz, kiedy są izolowane, fragmenty Fd zachowują zdolność do wiązania epitopu.

Usytuowane w obrębie części przeciwciała wiążącej antygen są regiony determinujące dopasowanie (CDR), które oddziałują bezpośrednio z epitopem antygenu i regionami zrębowymi (FR), które zachowują strukturę trzeciorzędową paratopu. Zarówno fragment Fd łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego immunoglobulin IgG zawiera cztery regiony zrębowe (FR1 do FR4), które są rozdzielone w każdym przypadku trzema regionami determinującymi dopasowanie (CDR1 do CDR3). Regiony CDR, a w szczególności CDR3, a jeszcze bardziej szczególnie, region CDR3 łańcucha ciężkiego, są odpowiedzialne w dużym stopniu za specyficzność przeciwciała.

Wiadomo, że regiony inne niż CDR ssaczego przeciwciała można zastąpić podobnymi regionami przeciwciał o tej samej lub różnej specyficzności, zachowując specyficzność epitopu oryginalnego przeciwciała. Umożliwiło to rozwój przeciwciał „humanizowanych, w których inne niż ludzkie CDR są kowalencyjnie przyłączone do ludzkich regionów FR i/lub Fc/pFc', aby wytworzyć funkcjonalne przeciwciało.

WO 92/04381, na przykład, opisuje wytwarzanie i zastosowanie humanizowanych mysich przeciwciał RSV, w których przynajmniej część mysich regionów FR została zastąpiona regionami FR pochodzenia ludzkiego. Przeciwciała tego typu, włączając w to fragmenty nietkniętych przeciwciał ze zdolnością do wiązania antygenu, często określa się jako przeciwciała „chimeryczne.

Wynalazek dostarcza także fragmenty F(ab')2, Fab, Fv i Fd przeciwciał, przeciwciała chimeryczne, w których regiony Fe i/lub FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub łańcuch lekki-CDR3 zastąpiono homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami, przeciwciała z chimerycznym fragmentem F(ab')2, w których regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub łańcuch lekki-CDR3 zastąpiono homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami, przeciwciała z chimerycznym fragmentem Fab, w których regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub łańcuch lekki-CDR3 zastąpiono homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami, oraz przeciwciała z chimerycznym fragmentem Fd, w których

PL 215 160 B1 regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 zastąpiono homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami. Wynalazek obejmuje także przeciwciała „o pojedynczym łańcuchu.

Wynalazek obejmuje także polipeptydy, które wiążą się specyficznie do antygenów związanych z nowotworem. Substancje wiążące polipeptyd tego typu mogą być dostarczone, na przykład, poprzez biblioteki zdegenerowanych peptydów, które można łatwo wytworzyć w roztworze w formie immobilizowanej lub jako biblioteki fagowe. Podobnie jest możliwe przygotowanie bibliotek kombinatoryjnych peptydów z jednym lub więcej aminokwasami. Można przygotować również biblioteki peptoidów i syntetycznych reszt niepeptydowych.

W identyfikowaniu peptydów wiążących tu ujawnionych szczególnie skuteczne mogą być biblioteki fagowe. W związku z tym, na przykład, przygotowuje się bibliotekę fagową (przy użyciu, na przykład, fagów M13, fd lub lambda), która prezentuje wstawki o długości od 4 do około 80 reszt aminokwasowych. Następnie wybiera się fagi, które niosą wstawki, które wiążą się do antygenu związanego z nowotworem. Ten proces można powtarzać przez dwa lub więcej cykli ponownej selekcji fagów wiążących się do antygenu związanego z nowotworem. W wyniku powtarzanych rund otrzymuje się zatężenie fagów niosących szczególne sekwencje. Analizę sekwencji DNA można przeprowadzić w celu identyfikacji sekwencji polipeptydów ulegających ekspresji. Można określić najmniejszą liniową część sekwencji wiążącej się do antygenu związanego z nowotworem. Można także zastosować „system dwuhybrydowy drożdży do identyfikowania polipeptydów, które wiążą się do antygenu związanego z nowotworem. Antygeny związane z nowotworem tu opisane lub ich fragmenty można zastosować do przeszukiwania bibliotek peptydowych, włączając w to biblioteki fagowe, w celu identyfikacji i wybrania peptydowych partnerów wiążących antygenów związanych z nowotworem. Takie cząsteczki można zastosować, na przykład, do testów przesiewających, protokołów oczyszczania, do ingerencji w funkcję antygenu związanego z nowotworem i do innych celów znanych specjaliście w tej dziedzinie.

Przeciwciała opisane powyżej i inne cząsteczki wiążące można zastosować, na przykład, do identyfikacji tkanek, które wykazują ekspresję antygenu związanego z nowotworem. Przeciwciała można także sprzęgać do specyficznych substancji diagnostycznych do obrazowania komórek i tkanek wykazujących ekspresję antygenów związanych z nowotworem. Można je także sprzęgać do substancji użytecznych terapeutycznie. Substancje diagnostyczne obejmują, w sposób nieograniczający, siarczan baru, kwas jocetamowy, kwas jopanowy, ipodan wapnia, diatrizoesan sodu, diatrizoesan megluminy, metrizamid, tyropanoesan sodu i radioaktywne substancje diagnostyczne, włączając w to emitery pozytonów, takie jak fluor-18 i węgiel-11, emitery promieniowania gamma, takie jak jod-123, technet-99m, jod-131 i ind-111, nuklidy do magnetycznego rezonansu jądrowego, takie jak fluor i gadolin. Według wynalazku, określenie „substancja użyteczna terapeutycznie oznacza dowolną cząsteczkę terapeutyczną, która, co jest pożądane, jest selektywnie kierowana do komórki, która wykazuje ekspresję jednego lub więcej antygenów związanych z nowotworem, włączając w to czynniki przeciwrakowe, związki znakowane radioaktywnym jodem, toksyny, leki cytostatyczne lub cytolityczne, itd.; czynniki przeciwrakowe obejmują, na przykład, aminoglutetymid, azatioprinę, siarczan bleomycyny, busulfan, karmustynę, chlorambucil, cisplatynę, cyklofosfamid, cyklosporynę, cytarabidynę, dakarbazynę, daktynomycynę, daunorubin, doksorubicynę, taksol, etopozyd, fluorouracyl, interferon-α, lomustynę, merkaptopurynę, metotreksat, mitotan, chlorowodorek prokarbazyny, tioguaninę, siarczan winblastyny i siarczan winkrystyny. Inne czynniki przeciwrakowe są opisane, na przykład, w Goodman i Gilman, „The Pharmacological Basis of Therapeutics, wydanie ósme, 1990, McGraw-Hill, Inc., w szczególności Rozdział 52 (Czynniki przeciwnowotworowe (Paul Calabresi i Bruce A. Chabner). Toksyny mogą być białkami, takimi jak przeciwwirusowe białko szkarłatki, toksyna cholery, toksyna krztuśca, rycyna, gelonina, abryna, egzotoksyna błonicy lub egzotoksyna Pseudomonas. Przyłączone toksyny mogą także być radionuklidami emitującymi promieniowanie o wysokiej energii, takimi jak kobalt-60.

Określenie „pacjent oznacza według wynalazku człowieka, osobnika z rodzaju naczelnych nie będącego człowiekiem lub inne zwierzę, w szczególności ssaka, takiego jak krowa, koń, świnia, owca, koza, pies, kot, lub gryzonia, takiego jak mysz i szczur. W szczególnie korzystnych wykonaniach pacjentem jest człowiek.

Według wynalazku, określenie „choroba odnosi się do dowolnego stanu patologicznego, w którym antygeny związane z nowotworem ulegają ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji. „Nieprawidłowa ekspresja oznacza według wynalazku, że ekspresja jest zmieniona, korzystnie zwiększona, w porównaniu ze stanem u zdrowych osobników. Wzrost ekspresji odnosi się do wzrostu o przynajmniej 10%, w szczególności przynajmniej 20%, przynajmniej 50% lub przynajmniej 100%. W jednym z wykonań

PL 215 160 B1 antygen związany z nowotworem ulega ekspresji tylko w tkance chorego osobnika, podczas gdy ekspresja u zdrowego osobnika ulega represji. Jednym z przykładów takiej choroby jest rak, w szczególności nasieniak, czerniak, potworniak, glioma, rak okrężnicy i odbytnicy, rak piersi, rak prostaty, rak macicy, rak jajników i rak płuc.

Według wynalazku, próbką biologiczną może być próbka tkanki i/lub próbka komórek i może być otrzymana w sposób konwencjonalny, taki jak poprzez biopsję tkanki, włączając w to trepanobiopsję, oraz poprzez pobranie krwi, aspiratu z oskrzeli, moczu, kału lub innych płynów ciała, do zastosowania w różnych sposobach tutaj opisanych.

Według wynalazku, określenie „komórka immunoreaktywna oznacza komórkę, która może dojrzewać do komórki immunologicznej (takiej jak komórka B, pomocnicza komórka T lub cytolityczna komórka T) przy odpowiedniej stymulacji. Komórki immunoreaktywne obejmują hematopoetyczne komórki macierzyste CD34⁺, niedojrzałe i dojrzałe komórki T oraz niedojrzałe i dojrzałe komórki B. Jeżeli pożądana jest produkcja komórek cytolitycznych lub pomocniczych T rozpoznających antygen związany z nowotworem, komórki immunoreaktywne są poddawane kontaktowi z komórką wykazującą ekspresję antygenu związanego z nowotworem w warunkach, które sprzyjają wytwarzaniu, różnicowaniu się i/lub selekcji cytolitycznych komórek T i pomocniczych komórek T. Różnicowanie się prekursorów komórek T na komórki cytolityczne T po ekspozycji na antygen jest podobne do wyboru klonów przez układ immunologiczny.

Niektóre sposoby terapeutyczne są oparte na reakcji układu immunologicznego pacjenta, w wyniku czego następuje Iiza komórek prezentujących antygen, takich jak komórki rakowe, które prezentują jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem. W związku z tym, na przykład, autologiczne cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla kompleksu antygenu związanego z nowotworem i cząsteczki MHC są podawane pacjentowi mającemu anomalię komórkową. Wytwarzanie takich cytotoksycznych limfocytów T in vitro jest znane. Przykład sposobu różnicowania komórek T można znaleźć w WO-A-9633265. Na ogół, próbka zawierająca komórki, takie jak komórki krwi, zostaje pobrana od pacjenta i komórki są poddawane kontaktowi z komórką, która prezentuje kompleks i która może spowodować propagację cytotoksycznych limfocytów T (np. komórek dendrytycznych). Komórka docelowa może być komórką transfekowaną, taką jak komórka COS. Te komórki transfekowane prezentują pożądany kompleks na swojej powierzchni i podczas kontaktowania się z cytotoksycznymi limfocytami T stymulują propagację tych ostatnich. Namnożone klony autologicznych cytotoksycznych limfocytów T są następnie podawane pacjentowi.

W innym sposobie selekcji specyficznych dla antygenu cytotoksycznych limfocytów T stosowane są fluorogeniczne tetramery kompleksów cząsteczka MHC klasy I/peptyd do wykrywania specyficznych klonów cytotoksycznych limfocytów T (Altman i wsp., Science 274:94-96, 1996; Dunbar i wsp., Curr. Biol. 8:413-416, 1998). Rozpuszczalne cząsteczki MHC klasy I są fałdowane in vitro w obecności mikroglobuliny β2 i peptydowego antygenu wiążącego się do tej cząsteczki klasy I. Kompleksy MHC/peptyd oczyszcza się, a następnie znakuje biotyną. Tetramery tworzą się przez zmieszanie biotynylowanych kompleksów peptyd-MHC ze znakowaną awidyną (np. fikoerytryną) w stosunku molowym 4:1. Tetramery są następnie poddawane kontaktowi z cytotoksycznymi limfocytami T, takimi jak te z krwi obwodowej lub węzłów chłonnych. Tetramery wiążą się do cytotoksycznych limfocytów T, które rozpoznają kompleks peptydowy antygen/MHC klasy I. Komórki, które wiążą się do tetramerów, można posortować przy użyciu sortowania komórek kontrolowanego fluorescencyjnie w celu wyizolowania reaktywnych cytotoksycznych limfocytów T. Wyizolowane cytotoksyczne limfocyty T można następnie namnożyć in vitro.

W sposobie terapeutycznym określanym jako transfer adopcyjny (Greenberg, J. Immunol. 136(5):1917, 1986; Riddel i wsp., Science 257:238, 1992; Kast i wsp., Cell 59:603-614, 1989) komórki prezentujące pożądany kompleks (np. komórki dendrytyczne) są połączone z cytotoksycznymi limfocytami T pacjenta, który ma być leczony, w wyniku czego następuje propagacja specyficznych cytotoksycznych limfocytów T. Namnożone cytotoksyczne limfocyty T są następnie podawane pacjentowi mającemu anomalię komórkową charakteryzującą się szczególnymi nieprawidłowymi komórkami prezentującymi specyficzny kompleks. Cytotoksyczne limfocyty T powodują następnie lizę nieprawidłowych komórek, osiągając tym samym pożądany efekt terapeutyczny.

Często z repertuaru komórek T pacjenta tylko komórki T o niskim powinowactwie do specyficznego kompleksu tego typu mogą być namnażane, ponieważ te o wysokim powinowactwie zostały zniszczone podczas rozwoju tolerancji. Alternatywą może być tutaj przeniesienie samego receptora komórek T. W tym przypadku także komórki prezentujące pożądany kompleks (np. komórki dendry20

PL 215 160 B1 tyczne) są połączone z cytotoksycznymi limfocytami T zdrowych osobników. W wyniku tego następuje propagacja specyficznych cytotoksycznych limfocytów T o wysokim powinowactwie, jeżeli donor nie miał wcześniejszego kontaktu ze specyficznym kompleksem. Receptor komórek T o wysokim powinowactwie tych namnożonych specyficznych limfocytów T klonuje się i można go przenieść poprzez transfer genów, na przykład przy użyciu wektorów retrowirusowych, do komórek T innych pacjentów, jak to jest pożądane. Transfer adaptacyjny przeprowadza się następnie przy użyciu tych genetycznie zmienionych limfocytów T (Stanisławski i wsp., Nat Immunol. 2:962-70, 2001; Kessels i wsp., Nat Immunol. 2:957- 61, 2001).

Powyższe aspekty terapeutyczne wynikają z faktu, że przynajmniej niektóre z nieprawidłowych komórek pacjenta prezentują kompleks antygenu związanego z nowotworem i cząsteczki HLA. Takie komórki można zidentyfikować w sposób znany per se. Kiedy tylko zidentyfikuje się komórki prezentujące kompleks, można je połączyć z próbką od pacjenta, która zawiera cytotoksyczne limfocyty T. Jeżeli cytotoksyczne limfocyty T powodują lizę komórek prezentujących kompleks, można przyjąć, że prezentowany jest antygen związany z nowotworem.

Transfer adaptacyjny nie jest jedyną postacią terapii, którą można zastosować według wynalazku. Cytotoksyczne limfocyty T mogą także się tworzyć in vivo w sposób znany per se. Jeden ze sposobów wykorzystuje komórki nie namnażające się wykazujące ekspresję kompleksu. Komórki tutaj stosowane będą tymi, które zwykle wykazują ekspresję kompleksu, takimi jak napromieniowane komórki nowotworowe lub komórki transfekowane jednym lub obydwoma genami koniecznymi do prezentacji kompleksu (tj. peptydu antygenowego i prezentującej cząsteczki HLA). Można zastosować różne typy komórek. Ponadto, możliwe jest zastosowanie wektorów, które niosą jeden lub dwa geny będące przedmiotem zainteresowania. Szczególnie korzystne są wektory wirusowe lub bakteryjne. Na przykład, kwasy nukleinowe kodujące antygen związany z nowotworem lub jego część mogą być funkcjonalnie połączone z sekwencjami promotora i wzmacniacza, które kontrolują ekspresję tego antygenu związanego z nowotworem lub jego fragment w poszczególnych tkankach lub typach komórek. Kwas nukleinowy może być włączony do wektora ekspresyjnego. Wektory ekspresyjne mogą być niezmodyfikowanymi pozachromosomalnymi kwasami nukleinowymi, plazmidami lub genomami wirusowymi, do których można wstawić egzogenne kwasy nukleinowe. Kwasy nukleinowe kodujące antygen związany z nowotworem także mogą być wstawione do genomu retrowirusowego, umożliwiając tym samym integrację kwasu nukleinowego do genomu docelowej tkanki lub docelowej komórki. W tych systemach mikroorganizm, taki jak wirus krowianki, wirus ospy, wirus opryszczki pospolitej, retrowirus lub adenowirus, niesie gen będący przedmiotem zainteresowania i de facto „zaraża komórki gospodarza. Inną korzystną postacią jest wprowadzenie antygenu związanego z nowotworem w postaci rekombinowanego RNA, który może być wprowadzony do komórki, na przykład, poprzez transfer liposomalny lub poprzez elektroporację. Otrzymane komórki prezentują kompleks będący przedmiotem zainteresowania i są rozpoznawane przez autologiczne cytotoksyczne limfocyty T, które następnie się namnażają.

Podobny efekt można osiągnąć przez połączenie antygenu związanego z nowotworem lub jego fragmentu z adiuwantem, aby umożliwić włączenie in vivo do komórek prezentujących antygen. Antygen związany z nowotworem lub jego fragment mogą być prezentowane jako białko, jako DNA (np. na wektorze) lub jako RNA. Antygen związany z nowotworem jest przetwarzany w celu produkcji partnera peptydowego dla cząsteczki HLA, podczas gdy jego fragment może być prezentowany bez konieczności dalszej obróbki. W tym ostatnim przypadku tak jest w szczególności, jeżeli mogą się one wiązać do cząsteczek HLA. Korzystne są postaci do podawania, w których kompletny antygen jest przetwarzany in vivo przez komórkę dendrytyczną, ponieważ może to także wytwarzać odpowiedzi komórek pomocniczych T, które są potrzebne do skutecznej odpowiedzi immunologicznej (Ossendorp i wsp., Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendorp i wsp., J. Exp. Med. 187:693-702, 1998). Na ogół, możliwe jest podanie skutecznej ilości antygenu związanego z nowotworem pacjentowi poprzez, na przykład, wstrzyknięcie doskórne. Jednak wstrzyknięcie można także przeprowadzić dowęzłowo do węzła chłonnego (Maloy i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303, 2001). Można je także przeprowadzić w połączeniu z czynnikami, które ułatwiają wychwyt przez komórki dendrytyczne. In vivo korzystne antygeny związane z nowotworem obejmują te, które reagują z antysurowicami allogenicznego raka lub z komórkami T wielu pacjentów z rakiem. Szczególnym przedmiotem zainteresowania są, jednak, te, przeciwko którym nie istniały wcześniej żadne spontaniczne odpowiedzi immunologiczne. Wyraźnie możliwa jest indukcja przeciwko tym odpowiedziom immunologicznym, które mogą spowodować lizę

PL 215 160 B1 guzów nowotworowych (Keogh i wsp., J. Immunol. 167:787-96, 2001; Appella i wsp., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1:177-84, 1995; Wentworth i wsp., Mol Immunol. 32:603-12, 1995).

Kompozycje farmaceutyczne opisane według wynalazku można także zastosować jako szczepionki do immunizacji. Według wynalazku, określenia „immunizacja lub „szczepienie oznaczają wzrost lub aktywację odpowiedzi immunologicznej na antygen. Możliwe jest zastosowanie modeli zwierzęcych do testowania efektu immunizującego na raka poprzez użycie antygenu związanego z nowotworem lub kwasu nukleinowego kodującego go. Na przykład, ludzkie komórki rakowe można wprowadzić do myszy w celu wytworzenia nowotworu i można podać jeden lub więcej kwasów nukleinowych kodujących antygeny związane z nowotworem. Efekt na komórki rakowe (na przykład zmniejszenie rozmiaru guza nowotworowego) może zostać zmierzony jako miara efektywności immunizacji przez kwas nukleinowy.

Jako część kompozycji do immunizacji można podać jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem lub stymulujących ich fragmentów razem z jednym lub więcej adiuwantami do indukcji odpowiedzi immunologicznej lub do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Adiuwant jest substancją, która zostaje włączona do antygenu lub podana razem z tym ostatnim i która wzmacnia odpowiedź immunologiczną. Adiuwanty mogą wzmocnić odpowiedź immunologiczną przez dostarczenie rezerwuaru antygenów (zewnątrzkomórkowo lub w makrofagach), aktywowanie makrofagów i stymulowanie poszczególnych limfocytów. Adiuwanty są znane i obejmują w sposób nieograniczający monofosforylowy lipid A (MPL, SmithKline Beecham), saponinę, taką jak QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 i QS-L1 (So i wsp., Mol. Cells 7:178-186, 1997), niekompletny adiuwant Freunda, kompletny adiuwant Freunda, witaminę E, montanid, ałun, oligonukleotydy CpG (por. Kreig i wsp., Nature 374:546-9, 1995) i różne emulsje typu woda w oleju przygotowane z biologicznie degradowalnych olei, takich jak skwalen i/lub tokoferol. Korzystnie, peptydy są podawane w mieszaninie z DQS21/MPL. Stosunek DQS21 do MPL typowo wynosi około 1:10 do 10:1, korzystnie około 1:5 do 5:1, a w szczególności około 1:1. Do podania ludziom preparat szczepionki typowo zawiera DQS21 i MPL w zakresie od około 1 μg do około 100 μg.

Można także podać inne substancje, które stymulują odpowiedź immunologiczną pacjenta. Możliwe jest, na przykład, zastosowanie cytokin w szczepieniu ze względu na ich właściwości regulatorowe na limfocyty. Takie cytokiny obejmują, na przykład, interleukinę-12 (IL-12), którą pokazano, że zwiększa działanie ochronne szczepionek (por. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF i IL-18.

Jest szereg związków, które wzmacniają odpowiedź immunologiczną i które dlatego można zastosować w szczepieniu. Te związki obejmują cząsteczki kostymulujące dostarczane w postaci białek lub kwasów nukleinowych. Przykładami takich cząsteczek kostymulujących są B7-1 i B7-2 (odpowiednio, CD80 i CD86), które ulegają ekspresji w komórkach dendrytycznych (DC, ang. dendritic cells) i oddziałują z cząsteczką CD28 ulegającą ekspresji w komórkach T. To oddziaływanie zapewnia kostymulację (sygnał 2) dla komórki T (sygnał 1) stymulowanej antygenem/MHC/TCR, wzmacniając tym samym propagację tych komórek T i funkcję efektorową. B7 oddziałuje także z CTLA4 (CD152) na komórkach T, a badania obejmujące CTLA4 i ligandy B7 pokazują, że oddziaływanie B7-CTLA4 może wzmocnić odporność przeciwnowotworową i propagację CTL (Zheng, P. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6284-6289 (1998)).

B7 typowo nie ulega ekspresji na komórkach nowotworowych, tak że nie są to efektywne komórki prezentujące antygen (APC, ang. antigen-presenting cells) dla komórek T. Indukcja ekspresji B7 będzie umożliwiała komórkom nowotworowym stymulowanie bardziej skutecznie propagacji cytotoksycznych limfocytów T i funkcji efektorowych. Kostymulacja przez połączenie B7/IL-6/IL-12 ujawniła indukcję IFN-gamma i profilu cytokiny Th1 w populacji komórek T, dając w rezultacie bardziej wzmocnioną aktywność komórek T (Gajewski i wsp., J. Immunol. 154:5637-5648 (1995)).

Całkowita aktywacja cytotoksycznych limfocytów T i całkowita funkcja efektorowa wymagają zaangażowania komórek pomocniczych T poprzez oddziaływanie pomiędzy ligandem CD40 na tych komórkach pomocniczych T i cząsteczką CD40 ulegającą ekspresji w komórkach dendrytycznych (Ridge i wsp., Nature 393:474 (1998), Bennett i wsp., Nature 393:478 (1998), Schonberger i wsp., Nature 393:480 (1998)). Mechanizm tego kostymulującego sygnału prawdopodobnie dotyczy wzrostu produkcji B7 i związanej z nią produkcji IL-6/IL-12 przez te komórki dendrytyczne (komórki prezentujące antygen). Zatem oddziaływanie CD40-CD40L uzupełnia oddziaływanie sygnału 1 (antygen/MHC/TCR) i sygnału 2 (B7-CD28).

Będzie się oczekiwać, że zastosowanie przeciwciał anty-CD40 do stymulowania komórek dendrytycznych będzie bezpośrednio wzmacniać odpowiedź antygenów nowotworowych, które są zwykle poza

PL 215 160 B1 zasięgiem odpowiedzi zapalnej lub które są prezentowane przez nieprofesjonalne komórki prezentujące antygen (komórki nowotworowe). W tych sytuacjach sygnały kostymulujące od komórek pomocniczych T i B7 nie są zapewnione. Ten mechanizm mógłby być zastosowany w powiązaniu z terapiami opartymi na komórkach dendrytycznych traktowanych antygenem w sposób pulsowy lub w sytuacjach, w których epitopy komórek pomocniczych T nie zostały określone w znanych prekursorach TRA.

Wynalazek dostarcza także podawania kwasów nukleinowych, polipeptydów lub peptydów. Polipeptydy i peptydy można podawać w sposób znany per se. W jednym z wykonań kwasy nukleinowe są podawane przy użyciu sposobów ex vivo, tj. poprzez pobieranie komórek od pacjenta, modyfikację genetyczną tych komórek w celu włączenia antygenu związanego z nowotworem i ponowne wprowadzenie zmienionych komórek do pacjenta. Obejmuje to na ogół wprowadzanie funkcjonalnej kopii genu do komórek pacjenta in vitro i ponowne wprowadzenie genetycznie zmienionych komórek do pacjenta. Funkcjonalna kopia genu jest pod funkcjonalną kontrolą elementów regulatorowych, które pozwalają genowi na ekspresję w genetycznie zmienionych komórkach. Sposoby transfekcji i transdukcji są znane specjaliście w tej dziedzinie. Wynalazek dostarcza także podawania kwasów nukleinowych in vivo przy użyciu wektorów, takich jak wirusy i liposomy z kontrolowanym kierowaniem się do celu.

W korzystnych wykonaniach wektor wirusowy do podawania kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem jest wybierany z grupy składającej się z adenowirusów, wirusów związanych z adenowirusami, wirusów ospy, włączając w to wirus krowianki i atenuowany wirus ospy, wirus gorączki Semliki Forest, retrowirusy, wirus Sindbis i cząsteczki podobne do wirusa Ty. Szczególnie korzystne są adenowirusy i retrowirusy.

Retrowirusy typowo wykazują niedobór replikacji (tj. są niezdolne do wytworzenia zakaźnych cząsteczek).

Różne sposoby można zastosować w celu wprowadzenia według wynalazku kwasów nukleinowych do komórek in vitro lub in vivo.

Sposoby tego typu obejmują transfekcję osadów kwasu nukleinowego i CaPO4, transfekcję kwasów nukleinowych związanych z DEAE, transfekcję lub infekcję powyższych wirusów niosących kwasy nukleinowe będące przedmiotem zainteresowania, transfekcję za pośrednictwem liposomów, itp. W szczególnych wykonaniach korzystne jest kierowanie kwasu nukleinowego do poszczególnych komórek. W takich wykonaniach nośnik użyty do podawania kwasu nukleinowego do komórki (np. retrowirus lub liposom) może mieć przyłączoną docelową cząsteczkę kontrolną. Na przykład, cząsteczka, taka jak przeciwciało specyficzne dla białka błonowego na powierzchni komórki docelowej lub ligand dla receptora na komórce docelowej, mogą być włączone lub przyłączone do nośnika kwasu nukleinowego. Korzystne wykonania obejmują przeciwciała, które wiążą selektywnie antygen związany z nowotworem. Jeżeli pożądane jest podanie kwasu nukleinowego poprzez liposomy, białka wiążące się do białka błonowego na powierzchni związane z endocytozą mogą być włączone do preparatu liposomów w celu umożliwienia kontroli kierowania się do celu i/lub wychwytu. Takie białka obejmują białka kapsydowe lub ich fragmenty, które są specyficzne dla poszczególnych typów komórek, przeciwciała przeciwko białkom, które ulegają internalizacji, białka kierowane do miejsca wewnątrz komórki, itp.

Kompozycje terapeutyczne według wynalazku można podać w zgodnych farmaceutycznie preparatach. Takie preparaty mogą zwykle zawierać farmaceutycznie zgodne stężenia soli, substancje buforujące, środki konserwujące, nośniki, substancje uzupełniające wzmacniające odporność, takie jak adiuwanty, CpG i cytokiny, oraz, tam, gdzie to konieczne, inne terapeutycznie aktywne związki.

Terapeutycznie aktywne związki według wynalazku można podawać dowolną konwencjonalną drogą, włączając w to wstrzyknięcia i wlewy. Podawanie można przeprowadzić, na przykład, doustnie, dożylnie, dootrzewnowo, domięśniowo, podskórnie lub przezskórnie. Korzystnie, przeciwciała są podawane w terapii przy użyciu aerozolu do płuc. Antysensowne kwasy nukleinowe korzystnie są podawane poprzez powolne podawanie dożylne.

Kompozycje według wynalazku są podawane w skutecznych ilościach. „Skuteczna ilość odnosi się do ilości, która osiąga pożądaną reakcję lub pożądany efekt sama lub razem z dalszymi dawkami. W przypadku leczenia szczególnej choroby lub szczególnego stanu charakteryzującego się ekspresją jednego lub więcej antygenów związanych z nowotworem pożądana reakcja dotyczy hamowania przebiegu choroby. Obejmuje to spowalnianie postępu choroby i, w szczególności, zahamowanie postępu choroby. Pożądana reakcja w leczeniu choroby lub stanu może także być opóźnieniem pojawienia się lub zapobiegnięciem pojawienia się tej choroby lub tego stanu.

PL 215 160 B1

Skuteczna ilość kompozycji według wynalazku będzie zależała od stanu, który ma być leczony, ciężkości choroby, indywidualnych parametrów pacjenta, włączając w to wiek, stan fizjologiczny, rozmiar i wagę, długość trwania choroby, typ terapii towarzyszącej (jeśli występuje), specyficzną drogę podania i podobne czynniki.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku korzystnie są jałowe i zawierają skuteczną ilość terapeutycznie aktywnej substancji w celu wytworzenia pożądanej reakcji lub pożądanego efektu.

Podawane dawki kompozycji według wynalazku mogą zależeć od różnych parametrów, takich jak typ podawania, stan pacjenta, pożądany okres podawania, itd. W przypadku, gdy reakcja u pacjenta jest niewystarczająca przy początkowej dawce, można zastosować wyższe dawki (lub efektywnie wyższe dawki osiągnięte przez inną, bardziej zlokalizowaną drogę podania).

Na ogół, dawki antygenu związanego z nowotworem od 1 ng do 1 mg, korzystnie od 10 ng do 100 μg, są przygotowywane w postaci preparatu i podawane do leczenia lub do wytworzenia lub zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Jeżeli pożądane jest podanie kwasów nukleinowych (DNA i RNA) kodujących antygeny związane z nowotworem, w postaci preparatu przygotowywane są i podawane dawki od 1 ng do 0,1 mg.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są na ogół podawane w farmaceutycznie zgodnych ilościach i w farmaceutycznie zgodnych kompozycjach. Określenie „zgodny farmaceutycznie odnosi się do nietoksycznej substancji, która nie wchodzi w interakcję ze składnikiem aktywnym kompozycji farmaceutycznej. Preparaty tego typu zwykle mogą zawierać sole, substancje buforowe, środki konserwujące, nośniki i, tam, gdzie to konieczne, inne związki aktywne terapeutycznie. W zastosowaniach w medycynie sole powinny być zgodne farmaceutycznie. Jednak, sole, które nie są zgodne farmaceutycznie można zastosować do przygotowania zgodnych farmaceutycznie soli i są objęte wynalazkiem. Farmakologicznie i farmaceutycznie zgodne sole tego typu obejmują w sposób nieograniczający te przygotowane z następujących kwasów: kwasów chlorowodorowego, bromowodorowego, siarkowego, azotowego, fosforowego, maleinowego, octowego, salicylowego, cytrynowego, mrówkowego, malonowego, bursztynowego itp. Zgodne farmaceutycznie sole można także przygotować jako sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, takie jak sole sodowe, sole potasowe lub sole wapniowe.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może obejmować zgodny farmaceutycznie nośnik. Według wynalazku, określenie „zgodny farmaceutycznie nośnik odnosi się do jednego lub więcej zgodnych stałych lub ciekłych wypełniaczy, rozcieńczalników lub substancji okrywających, które są odpowiednie do podawania ludziom. Określenie „nośnik odnosi się do składnika organicznego lub nieorganicznego, naturalnego lub syntetycznego, z którym składnik aktywny jest połączony w celu ułatwienia podania. Składniki kompozycji farmaceutycznej według wynalazku zwykle są takie, że nie pojawia się żadna interakcja, która szkodziłaby w sposób zasadniczy pożądanej skuteczności farmaceutycznej.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać odpowiednie substancje buforujące, takie jak kwas octowy w soli, kwas cytrynowy w soli, kwas borowy w soli i kwas fosforowy w soli.

Kompozycje farmaceutyczne mogą, tam, gdzie to konieczne, zawierać także odpowiednie środki konserwujące, takie jak chlorek benzalkonium, chlorobutanol, paraben i timerozal.

Kompozycje farmaceutyczne zwykle są dostarczone w postaci jednolitych dawek i można je przygotować w sposób znany per se. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być, na przykład, w postaci kapsułek, tabletek, pastylek do ssania, zawiesin, syropów, nalewek lub w postaci emulsji.

Kompozycje odpowiednie do podania pozajelitowego zwykle obejmują jałowy wodny lub niewodny preparat związku aktywnego, który korzystnie jest izotoniczny w stosunku do krwi biorcy. Przykładami zgodnych nośników i rozpuszczalników są roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo stosowane są zwykle jałowe oleje zestalone jako podłoże dla roztworu lub zawiesiny.

Niniejszy wynalazek jest opisany szczegółowo przez poniższe rysunki i przykłady, które są stosowane tylko w celu zilustrowania i nie należy ich rozumieć w sposób ograniczający. Dzięki opisowi i przykładom dla specjalisty w tej dziedzinie dostępne są dalsze wykonania, które podobnie są włączone w zakres wynalazku.

Rysunki:

Fig. 1: Przedstawienie w postaci diagramu klonowania eCT. Strategia obejmuje identyfikowanie genów będących kandydatami (GOI = „geny będące przedmiotem zainteresowania, ang. genes of interest) w bazach danych i testowanie tych genów przy użyciu techniki RT-PCR.

PL 215 160 B1

Fig. 2: Składanie LDH C. Alternatywne składanie prowadzi w rezultacie do nieobecności egzonu 3 (SEQ ID NR:2), dwóch egzonów 3 i 4 (SEQ ID NR:3), egzonów 3, 6 i 7 (SEQ ID NR:4) i egzonu (SEQ ID NR: 5). ORF = otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame), aa = aminokwas (ang. amino acid).

Fig. 3: Przyrównanie możliwych białek LDH-C. SEQ ID NR:8 i SEQ ID NR:10 są skróconymi częściami prototypowego białka (SEQ ID NR: 6). Sekwencje białka SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR:11, SEQ ID NR:12 i SEQ ID NR:13 są dodatkowo zmienione i zawierają tylko epitopy specyficzne dla nowotworu (wydrukowane pogrubioną czcionką). Centrum katalityczne jest otoczone ramką.

Fig. 4: Ilościowe oznaczenie LDH C w różnych tkankach przy użyciu techniki PCR w czasie rzeczywistym. Nie wykryto żadnych transkryptów w zdrowych tkankach innych niż jądra, ale wykryto znaczące poziomy ekspresji w nowotworach.

Fig. 5: Skład egzonów wariantów TPTE. Według wynalazku, wykryto warianty powstałe w wyniku składania transkryptów (SEQ ID NR: 20, SEQ ID NR:21, SEQ ID NR:54, SEQ ID NR:55, SEQ ID NR:56, SEQ ID NR:57), które ulegają ekspresji w tkankach jąder i w nowotworach i które mają przesunięte ramki odczytu i stąd regiony o zmienionej sekwencji.

Fig. 6: Przyrównanie możliwych białek TPTE. Alternatywne składanie prowadzi w rezultacie do zmian w kodowanych białkach, mających w zasadzie zachowaną ramkę odczytu. Przypuszczalne domeny transbłonowe są wydrukowane pogrubioną czcionką, domena katalityczna jest otoczona ramką.

Fig. 7: Przyrównanie wariantów TSBP na poziomie nukleotydów. Różnice w sekwencjach wariantów TSBP odkrytych według wynalazku (SEQ ID NR:31, SEQ ID NR:32, SEQ ID NR:33) względem znanej sekwencji (NM_006781, SEQ ID NR:29) są wydrukowane pogrubioną czcionką.

Fig. 8: Przyrównanie wariantów TSBP na poziomie białka. W białkach kodowanych przez warianty TSBP odkryte według wynalazku (SEQ ID NR:34, SEQ ID NR:35, SEQ ID NR:36) przesunięcia ramek odczytu powodują zasadnicze różnice we wcześniej opisanym białku (SEQ ID NR:30, NM_006781) i są wyróżnione pogrubioną czcionką.

Fig. 9: RT-PCR dla MS4A12. Ekspresję wykryto w tkankach testowanych tylko w rakach jąder, okrężnicy oraz okrężnicy i odbytnicy (raki okrężnicy). W jednej z 6 pokazanych próbek tkanki wątroby przeprowadzono pozytywnie wykrywanie MS4A12, ponieważ do tej próbki wystąpił naciek komórek będących przerzutem raka okrężnicy. Dalsze badania pokazały także wyraźną ekspresję w przerzutach raka okrężnicy.

Fig. 10: RT-PCR dla BRCO1. BRCO1 ulega wyraźnej nadekspresji w nowotworach piersi w porównaniu z ekspresją w zdrowej tkance sutka.

Fig. 11: RT-PCR dla MORC, TPX1, LDHC, SGY-1. Badanie różnych zdrowych tkanek ukazuje ekspresję tylko w jądrze (1 skóra, 2 jelito cienkie, 3 okrężnica, 4 wątroba, 5 płuco, 6 żołądek, 7 pierś, 8 nerka, 9 jajnik, 10 prostata, 11 tarczyca, 12 leukocyty, 13 grasica, 14 kontrola negatywna, 15 jądro). Badanie nowotworów (1-17 nowotwory płuc, 18-29 czerniaki, 30 kontrola negatywna, 31 jądro) ukazuje przemieszczoną ekspresję w tych nowotworach z różnymi częstościami dla poszczególnych eCT.

Fig. 12: Lokalizacja LDHC w mitochondriach w linii komórkowej raka piersi MCF-7. Komórki MCF-7 transfekowano przejściowo plazmidem ekspresyjnym z LDHC. Antygen wykryto przy użyciu przeciwciał specyficznych dla LDHC i pokazano wyraźną kolokalizację z mitochondrialnym enzymem łańcucha oddechowego oksydazą cytochromu c.

Fig. 13: Przewidywana topologia TPTE i komórkowa lokalizacja na powierzchni komórek MCF7. Diagram po lewej stronie pokazuje 4 przypuszczalne domeny transbłonowe TPTE (strzałki). Komórki MCF-7 transfekowano przejściowo plazmidem ekspresyjnym z TPTE. Antygen wykryto przy użyciu przeciwciał specyficznych dla TPTE i pokazano wyraźną kolokalizację z cząsteczkami MHC I usytuowanymi na powierzchni komórek.

Fig. 14: Lokalizacja MS4A12 w błonie komórkowej. Komórki nowotworowe transfekowano przejściowo konstruktem MS4A12 ze znacznikiem GFP i pokazano całkowitą kolokalizację ze znacznikami błony plazmatycznej w konfokalnym mikroskopie immunofluorescencyjnym.

P r z y k ł a d y:

Materiały i metody

Określenia „in silico”, „elektronicznie i „klonowanie wirtualne odnoszą się jedynie do wykorzystania sposobów opartych na bazach danych, które można także zastosować do stymulowania laboratoryjnych procesów doświadczalnych.

Jeśli nie zostało to wyraźnie określone inaczej, wszystkie inne określenia i wyrażenia są stosowane w taki sposób, aby były zrozumiałe dla specjalisty w tej dziedzinie. Wspomniane techniki i sposoby przeprowadza się w sposób znany per se i są one opisane, na przykład, w Sambrook i wsp.,

PL 215 160 B1

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Wszystkie sposoby obejmujące użycie zestawów i odczynników przeprowadzono według informacji producentów.

Strategia oparta na przeszukiwaniu i analizie danych w celu określenia eCT (elektronicznie sklonowanych genów rakowych/jądra, ang. electronically cloned cancer/testis genes).

Połączono dwie strategie in silico, mianowicie przeszukiwanie GenBanku po słowie kluczowym oraz cDNAxProfiler (Fig. 1). Wykorzystując NCBI ENTREZ Search and Retrieval System (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez) przeprowadzono przeszukiwanie GenBanku dla genów będących kandydatami, którym się przypisuje specyficzną ekspresję w tkance jąder (Wheeler i wsp., Nucleic Acids Research 28:10-14, 2000).

Wprowadzając zapytania ze słowami kluczowymi „gen specyficzny dla jąder, „gen specyficzny dla plemników, „gen specyficzny dla spermatogoniów wyekstrahowano z baz danych geny będące przedmiotem zainteresowania (GOI, ang. genes of interest). Przeszukiwanie było ograniczone do części całkowitej informacji z tych baz danych przez użycie słów ograniczających „homo sapiens dla organizmu i „mRNA dla typu cząsteczki.

Lista znalezionych GOI została poprawiona przez zidentyfikowanie różnych nazw dla tej samej sekwencji i wyeliminowanie takich zbędnych indywiduów.

Wszystkie geny będące kandydatami otrzymane przez przeszukiwanie na podstawie słowa kluczowego badano, z kolei, pod względem ich rozmieszczenia w tkankach przy użyciu sposobu „elektronicznej techniki Northern (eNorthern, ang. electronic Northern). eNorthern opiera się na przyrównaniu sekwencji GOI z bazą EST (znaczników sekwencji ulegających ekspresji, ang. expressed sequence tag) (Adams i wsp., Science 252:1651, 1991) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Można określić pochodzenie tkankowe każdego EST, który okazał się być homologiczny do GOI, a w ten sposób suma wszystkich EST tworzy wstępne oszacowanie rozmieszczenia tkankowego GOI. Dalsze badania przeprowadzano tylko z tymi GOI, które nie miały żadnych homologii do EST z innych niż jądro zdrowych tkanek, z wyjątkiem łożyska i tkanki płodowej. To oszacowanie brało także pod uwagę, że domena publiczna zawiera biblioteki źle przypisanego cDNA (Scheurle i wsp., Cancer Res. 60:40374043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm).

Drugim wykorzystywanym sposobem przeszukiwania i analizy danych był cDNA xProfiler z NCBI Cancer Genome Anatomy Project (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler) (Hillier i wsp., Genome Research 6:807-828, 1996; Pennisi, Science 276:1023-1024, 1997). Pozwala to na odniesienie się nawzajem zbiorów transkryptomów mieszczących się w bazach danych przy użyciu operatorów logicznych. Zdefiniowaliśmy zbiór A, do którego były przypisane wszystkie biblioteki ekspresyjne przygotowane z jądra, wyłączając biblioteki mieszane. Wszystkie biblioteki cDNA przygotowane z prawidłowych tkanek innych niż jądro, jajnik lub tkanka płodu były przypisane do zbioru B. Na ogół, wszystkie biblioteki cDNA były wykorzystywane niezależnie od leżących u ich podstaw sposobów przygotowania, ale dopuszczano tylko te o rozmiarze > 1000. Zbiór B został elektronicznie odjęty od zbioru A przy użyciu operatora BUT NOT. Zestaw znalezionych w ten sposób GOI został także poddany badaniom z zastosowaniem techniki eNorthern i zweryfikowany poprzez przeszukanie literatury.

To połączone przeszukiwanie i analiza danych obejmuje wszystkie z około 13 000 genów pełnej długości w domenie publicznej i przewiduje, że z tych genów całkowita liczba 140 genów wykazuje potencjalną ekspresję specyficzną dla jądra. Pośród tych ostatnich było 25 wcześniej znanych genów klasy genów CT, co podkreśla skuteczność naszej strategii.

Wszystkie inne geny najpierw oszacowano w zdrowych tkankach przy użyciu techniki specyficznego RT-PCR. Wszystkie GOI, którym udowodniono, że ulegają ekspresji w innych niż jądro zdrowych tkankach, musiały zostać uznane za wyniki fałszywie pozytywne i zostały wyłączone z dalszych badań. Pozostałe badano w dużej grupie bardzo rozmaitych tkanek nowotworowych. Antygeny opisane poniżej okazały się aktywowane w sposób przemieszczony w komórkach nowotworowych.

Ekstrakcja RNA, przygotowanie cDNA powstałego po odwrotnej transkrypcji z użyciem startera poly-d(T) i analiza RT-PCR

Całkowite RNA wyekstrahowano z materiału natywnej tkanki przy użyciu izotiocyjanianu guanidyny jako czynnika chaotropowego (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-9, 1987). Po ekstrakcji kwaśnym fenolem i strąceniu izopropanolem ten RNA rozpuszczono w wodzie traktowanej DEPC.

Syntezę pierwszej nici cDNA z 2-4 μg całkowitego RNA przeprowadzono w 20 μl mieszaninie reakcyjnej przy użyciu Superscript II (Invitrogen) według informacji producenta. Stosowanym starterem był oligonukleotyd dT(18). Jednorodność i czystość cDNA sprawdzono poprzez namnożenie p53 w 30

PL 215 160 B1 cyklach PCR (starter sensowny CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, starter antysensowny CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, temperatura hybrydyzacji 67°C).

Archiwum pierwszej nici cDNA przygotowano z szeregu zdrowych tkanek i tkanek nowotworowych. Do badań ekspresji namnożono 0,5 μΐ tych cDNA w 30 μΐ mieszaninie reakcyjnej przy użyciu starterów specyficznych dla GOI (zobacz poniżej) i 1 U polimerazy DNA HotStartTaq (Qiagen). Każda mieszanina reakcyjna zawierała 0,3 mM dNTP, 0,3 μΜ każdego startera i 3 μΐ buforu reakcyjnego 10 x. Startery wybrano tak, aby były one usytuowane w dwóch różnych egzonach, a wyeliminowanie zakłócenia w postaci zanieczyszczenia genomowym DNA jako powodu fałszywie pozytywnych wyników potwierdzono przy użyciu testowania nie ulegającego odwrotnej transkrypcji DNA jako matrycy. Po 15 minutach w 95°C w celu aktywacji polimerazy DNA HotStartTaq przeprowadzono 35 cykli PCR (1 min w 94°C, 1 min w poszczególnej temperaturze hybrydyzacji, 2 min w 72°C i końcowe wydłużanie w 72°C przez 6 min).

μl tej reakcji rozdzielano na frakcje i analizowano na żelu agarozowym wybarwionym bro mkiem etydyny.

Następujące startery zastosowano do analizy ekspresji odpowiednich antygenów we wskazanej temperaturze hybrydyzacji. LDH-C ( 67°C) sensowny TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC, antysensowny CAACATCTGAGACACCATTCC

TPTE (64°C) sensowny TGGATGTCACTCTCATCCTTG, antysensowny CCATAGTTCCTGTTCTATCTG

TSBP (63°C) sensowny TCTAGCACTGTCTCGATCAAG, antysensowny TGTCCTCTTGGTACATCTGAC

MS4A12 (66°C) sensowny CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, antysensowny TTCACCTTTGCCAGCATGTAG

BRCO1 (60°C) sensowny CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, antysensowny CACAGAATATGAGCCATACAG

TPX1 (65°C) sensowny TTTTGTCTATGGTGTAGGACC, antysensowny GGAATGGCAATGATGTTACAG

Przygotowanie cDNA powstałego po odwrotnej transkrypcji z użyciem losowych starterów heksamerowych i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym

Ekspresję LDHC oznaczono ilościowo przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym.

Główna zasada ilościowego PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu ABI PRISM Sequence Detection System (PE Biosystems, USA) wykorzystuje aktywność 5'-3' egzonukleazy polimerazy DNA Taq do bezpośredniej i specyficznej detekcji produktów PCR przez uwolnienie fluorescencyjnych barwników reporterowych. Oprócz starterów sensownych i antysensownych w PCR używa się także podwójnie fluorescencyjnie znakowanej sondy (sondy TaqMan), która hybrydyzuje do sekwencji produktu PCR. Sonda jest znakowana na końcu 5' barwnikiem reporterowym (np. FAM) i na końcu 3' barwnikiem wygaszającym (np. TAMRA). Jeżeli sonda jest nietknięta, przestrzenna bliskość barwnika reporterowego do wygaszającego powoduje supresję emisji fluorescencji barwnika reporterowego. Jeżeli sonda hybrydyzuje do produktu PCR podczas PCR, sonda ta jest cięta przez aktywność 5'-3' egzonukleolityczną polimerazy DNA Taq i supresja fluorescencji barwnika reporterowego zostaje zniesiona. Wzrost fluorescencji barwnika reporterowego jako konsekwencja namnażania cząsteczki docelowej jest mierzony po każdym cyklu PCR i wykorzystywany do oznaczania ilościowego. Ekspresja genu docelowego jest oznaczana ilościowo w sposób absolutny lub względem ekspresji genu kontrolnego o stałej ekspresji w badanych tkankach. Ekspresję LDHC obliczono przy użyciu sposobu ΔΔ-C (PE Biosystems, USA) po normalizacji próbek względem 18s RNA jako genu metabolizmu podstawowego. Reakcje przeprowadzono w mieszaninach dupleksów i określono w dwóch powtórzeniach. cDNA syntetyzowano przy użyciu zestawu High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) i starterów heksamerowych według informacji producenta. W każdym przypadku zastosowano 5 μl rozcieńczonego cDNA do PCR w całkowitej objętości 25 pl: starter sensowny (GGTGTCACTTCTGTGCCTTCCT) 300 nM; starter antysensowny (CGGCACCAGTTCCAACAATAG) 300 nM; sonda TaqMan (CAAAGGTTCTCCAAATGT) 250 nM; starter sensowny 18s RNA 50 nM; starter antysensowny 18s RNA 50 nM; próbka 18s RNA 250 nM;12,5 pl TaqMan Universal PCR Master Mix; początkowa denaturacja 95°C (10 min); 95°C (15 sek); 60°C (1 min); 40 cykli. Dzięki namnożeniu produktu 128 pz poza granicę egzonu 1 i egzonu 2 wszystkie warianty LDHC powstałe w wyniku składania transkryptu zostały objęte oznaczeniem ilościowym.

PL 215 160 B1

Klonowanie i analiza sekwencji

Geny pełnej długości i fragmenty genów sklonowano przy użyciu powszechnie znanych sposobów. Sekwencję określono przez namnożenie odpowiednich antygenów przy użyciu polimerazy pfu korygującej błędy (Stratagene). Po zakończeniu PCR przy użyciu polimerazy DNA HotStarTaq ligowano adenozynę do końców amplikonu w celu sklonowania fragmentów do wektora TOPO-TA według informacji producenta. Sekwencjonowanie przeprowadził komercyjny serwis. Sekwencje analizowano przy użyciu powszechnie znanych programów i algorytmów do przewidywania.

P r z y k ł a d 1: Identyfikacja LDH C jako nowego antygenu nowotworowego

LDH C (SEQ ID NR: 1) i jego produkt translacji (SEQ ID NR: 6) opisano jako specyficzny dla jądra izoenzym z rodziny dehydrogenazy mleczanowej. Sekwencja została opublikowana w GenBanku pod numerem dostępu NM_017448. Enzym tworzy homotetramer mający masę cząsteczkową 140 kDa (Goldberg, E. i wsp., Contraception 64(2):93-8, 2001; Cooker i wsp., Biol. Reprod. 48(6):1309-19, 1993; Gupta, G.S., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 34(6):361-85, 1999).

Badania RT-PCR do analizy ekspresji przy użyciu pary starterów (5'-TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC-3',5'-CAACATCTGAGACACCATTCC-3'), które nie namnażają spokrewnionych i powszechnie ulegających ekspresji izoenzymów LDH A i LDH B i które oparte są na sekwencji prototypowej LDH C NM_017448, która została wcześniej opisana jako będąca specyficzną dla jądra, potwierdziły według wynalazku brak ekspresji we wszystkich badanych zdrowych tkankach, ale pokazały, że ostra represja transkrypcji tego antygenu w komórkach somatycznych została zniesiona w przypadku nowotworów; por. Tabela 1. Jak to opisano klasycznie dla genów CT, LDH C ulega ekspresji w szeregu nowotworach.

T a b e l a 1. Ekspresja LDHC w nowotworach

Tkanka	Testowanych ogółem	Pozytywnych	%
Czerniak	16	7	44
Rak sutka	20	7	35
Nowotwór okrężnicy i odbytnicy	20	3	15
Rak prostaty	8	3	38
Rak oskrzeli	17	8	47
Rak komórek nerkowych	7	4	57
Rak jajników	7	3	43
Rak tarczycy	4	1	25
Rak szyjki macicy	6	5	83
Linie komórkowe czerniaka	8	5	63
Linie komórkowe raka oskrzeli	6	2	33

Oczekiwana wielkość namnażanego produktu wynosi 824 pz przy użyciu starterów wymienionych powyżej. Według wynalazku, jednak, obserwowano namnażanie wielu dodatkowych pasm w nowotworach, ale nie w jądrze. Ponieważ wskazuje to na obecność wariantów powstałych w wyniku alternatywnego składania transkryptów, całkowita ramka odczytu została namnożona przy użyciu starterów specyficznych dla LDHC (5'-TAGCGCCTCAACTGTCGTTGG-3',5'-CAACATCTGAGACACCATTCC-3') i zsekwencjonowano niezależne klony pełnej długości.

Przyrównania prototypowej ORF opisanej sekwencji LDH C (SEQ ID NR:1) i sekwencji genomowej chromosomu 11 potwierdzają dodatkowe warianty powstałe w wyniku składania transkryptów (SEQ ID NR:2-5). Alternatywne składanie transkryptów powoduje w rezultacie nieobecność egzonu 3 (SEQ ID NR:2), dwóch egzonów 3 i 4 (SEQ ID NR:3), egzonów 3, 6 i 7 (SEQ ID NR:4) lub egzonu 7 (SEQ ID NR:5) (por. Fig. 2).

Te nowe warianty powstałe w wyniku składania transkryptów są wytwarzane wyłącznie w nowotworach, a nie w jądrze. Alternatywne składanie transkryptów powoduje zmiany w ramce odczytu i daje w rezultacie nowe możliwe ORF kodujące sekwencje aminokwasowe pokazane w SEQ ID

NR:7-13 (ORF dla SEQ ID NR:7: pozycje nukleotydów 59-214 z SEQ ID NR:2 i, odpowiednio, SEQ ID NR:4; ORF dla SEQ ID NR:8 pozycje nukleotydów 289-939 z SEQ ID NR 2,; ORF dla SEQ ID NR:9:

PL 215 160 B1 pozycje nukleotydów 59-196 z SEQ ID NR:3; ORF dla SEQ ID NR:10: pozycje nukleotydów 535-765 z SEQ ID NR:3; ORF dla SEQ ID NR:11: pozycje nukleotydów 289-618 z SEQ ID NR:4; ORF dla SEQ ID NR:12: pozycje nukleotydów 497-697 z SEQ ID NR:4; ORF dla SEQ ID NR:13: pozycje nukleotydów 59-784 z SEQ ID NR:5) (Fig. 2, 3). Oprócz przedwczesnej terminacji możliwe jest także wykorzystanie alternatywnych kodonów start, tak że kodowane białka mogą być skrócone zarówno na N-końcu, jak i C-końcu.

Podczas gdy SEQ ID NR: 8 i SEQ ID NR:10 reprezentują skrócone części białka prototypowego, sekwencja białkowa SEQ ID NR:7, SEQ ID NR:9, SEQ ID NR:11, SEQ ID NR:12 i SEQ ID NR:13 są dodatkowo zmienione i zawierają tylko epitopy specyficzne dla nowotworu (wydrukowane pogrubioną czcionką na Fig. 3). Regiony peptydowe, które mogłyby dawać w rezultacie epitopy specyficzne dla nowotworu, są następujące (ściśle specyficzna dla nowotworu część wytworzona przez ramki odczytu jest podkreślona):

SEQ ID NR:14: GAVGMACAISILLKITVYLQTPE (z SEQ ID NR:7)

SEQ ID NR:15: GAVGMACAISILLKWIF (z SEQ ID NR:9)

SEQ ID NR:16: GWIIGEHGDSSGIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN (z SEQ ID NR:11)

SEQ ID NR:17: MVGLLENMVILVGLYGIKEELFL (z SEQ ID NR:12)

SEQ ID NR:18: EHWKNIHKQVIQRDYME (z SEQ ID NR:13)

Regiony te mogą potencjalnie zawierać epitopy, które mogą być rozpoznawane na cząsteczkach MHC I lub MHC II przez limfocyty T i które dają w efekcie ściśle specyficzną dla nowotworu odpowiedź.

Nie wszystkie z przewidywanych białek posiadają domenę katalityczną dehydrogenazy mleczanowej do zależnego od NADH metabolizowania pirogronianu do mleczanu, co stanowi ostatni etap glikolizy beztlenowej. Ta domena byłaby wymagana do funkcji enzymatycznej jako dehydrogenazy mleczanowej (otoczona ramką na Fig. 3). Dalsze analizy, na przykład przy użyciu algorytmów takich jak TMpred i pSORT (Nakai & Kanehisa, 1992), przewidują różne lokalizacje w komórce dla przypuszczalnych białek.

Według wynalazku poziom ekspresji oznaczono ilościowo przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem zestawu specyficznych starterów. Amplikon występuje w połączeniu pomiędzy egzonem 1 a egzonem 2, a zatem wykrywa wszystkie warianty (SEQ ID NR:1-5). Badanie te także nie wykryły żadnych transkryptów w zdrowych tkankach poza jądrem. Potwierdzają one znaczące poziomy ekspresji w nowotworach (Fig. 4).

Przeciwciała poliklonalne specyficzne dla LDHC wytworzono według wynalazku przez wybranie peptydu z najbardziej N-końcowego regionu MSTVKEQLIEDDENSQ (SEQ ID NR:80). Przeciwciała specyficzne dla LDHC wytworzono w królikach z pomocą tego peptydu. Następujące później badania ekspresji białek potwierdziły selektywną ekspresję LDHC w jądrze i w różnych nowotworach. W dodatku, badania immunohistologiczne według wynalazku ukazały wyraźną kolokalizację LDHC z oksydazą cytochromu c w mitochondriach. Wskazuje to na to, że LDHC odgrywa ważną rolę w łańcuchu oddechowym nowotworów.

P r z y k ł a d 2: Identyfikacja TPTE jako nowego antygenu nowotworowego

Sekwencje transkryptu TPTE (SEQ ID NR:19) i jego produktu translacji (SEQ ID NR:22) opublikowano w GenBanku pod numerem dostępu NM_013315 (Walker, S.M. i wsp., Biochem. J. 360(Pt 2):277-83, 2001; Guipponi M. i wsp., Hum. Genet. 107(2):127-31, 2000; Chen H. i wsp., Hum. Genet. 105(5):399-409, 1999). TPTE opisano jako gen kodujący możliwe transbłonowe fosfatazy tyrozynowe ze specyficzną dla nowotworu ekspresją zlokalizowaną w regionie okołocentromerowym chromosomów 21, 13, 15, 22 oraz Y (Chen, H. i wsp., Hum. Genet. 105:399-409, 1999). Badania na podstawie przyrównania według wynalazku dodatkowo ukazują homologię sekwencji genomowych na chromosomach 3 i 7.

Według wynalazku, startery PCR (5'-TGGATGTCACTCTCATCCTTG-3' i 5'-CCATAGTTCCTGTTCTATCTG-3') wytworzono w oparciu o sekwencję TPTE (SEQ ID NR:19) i zastosowano do analiz RT-PCR (95°min; 94° 1 min; 63° 1 min; 72° 1 min; 35 cykli) w szeregu ludzkich tkanek. Pokazano, że ekspresja w zdrowych tkankach ograniczona jest do jądra. Pokazano według wynalazku, że, jak to opisano dla innych eCT, warianty TPTE są aktywowane w sposób przemieszczony w szeregu tkanek nowotworowych; por. Tabela 2. Według wynalazku zidentyfikowano dalsze warianty TPTE powstałe w wyniku składania transkryptów (SEQ ID NR:20, SEQ ID NR:21, SEQ ID NR:54; SEQ ID NR:55; SEQ ID NR:56; SEQ ID NR:57), które ulegają ekspresji w tkance jądra oraz w nowotworach i które mają przesunięcia ramek odczytu, a zatem regiony o zmienionej sekwencji (Fig. 5).

PL 215 160 B1

T a b e l a 2. Ekspresja TPTE w nowotworach

Tkanka	Testowanych ogółem	Pozytywnych	%
Czerniak	18	9	50
Rak sutka	20	4	20
Nowotwór okrężnicy i odbytnicy	20	0	0
Rak prostaty	8	3	38
Rak oskrzeli	23	9	39
Rak komórek nerkowych	7	0	0
Rak jajników	7	2	29
Rak tarczycy	4	0	0
Rak szyjki macicy	6	1	17
Linie komórkowe czerniaka	8	4	50
Linie komórkowe raka oskrzeli	6	2	33
Linie komórkowe raka sutka	5	4	80

Sekwencja genomowa TPTE składa się z 24 egzonów (numer dostępu NT_029430). Transkrypt opisany w SEQ ID NR:19 zawiera wszystkie z tych egzonów. Wariant powstały w wyniku składania transkryptu opisanego w SEQ ID NR:20 powstaje przez unięcie złożenia transkryptu bez egzonu 7. Wariant powstały w wyniku składania transkryptu opisany w SEQ ID NR:21 pokazuje częściowe włączenie intronu na prawo od egzonu 15. Jak wskazują warianty SEQ ID NR:54, SEQ ID NR:55, SEQ ID NR:56, SEQ ID NR:57, alternatywnie jest także możliwe złożenie transkryptu bez egzonów 18, 19, 20 i 21.

To alternatywne składanie transkryptów powoduje w efekcie zmiany w kodowanym białku przy zachowaniu zasadniczo ramki odczytu (Fig. 6). Na przykład, produkt translacji kodowany przez sekwencję opisaną w SEQ ID NR:20 (SEQ ID NR:23) posiada delecję 13 aminokwasów w porównaniu z sekwencją opisaną w SEQ ID NR:22. Produkt translacji kodowany przez sekwencję opisaną w SEQ ID NR:21 (SEQ ID NR:24) niesie w sobie dodatkową insercję w środkowym regionie cząsteczki i tym samym różni się od innych wariantów o 14 aminokwasów.

Produkty translacji wariantów SEQ ID NR:54, SEQ ID NR:55, SEQ ID NR:56, SEQ ID NR:57, mianowicie białka SEQ ID NR:58, SEQ ID NR:59, SEQ ID NR:60, SEQ ID NR:61, są w podobny sposób zmienione.

Analizy dla przewidywanych domen funkcjonalnych ukazują obecność domeny fosfatazy tyrozynowej dla SEQ ID NR:22, SEQ ID NR:23, SEQ ID NR:24, SEQ ID NR:58, SEQ ID NR:60, ale nie dla SEQ ID NR:59, SEQ ID NR:61. Dla wszystkich wariantów przewiduje się 3-4 domeny transbłonowe (Fig. 6).

Analiza ekspresji antygenu TPTE przy użyciu specyficznych przeciwciał potwierdziła selektywną ekspresję w jądrze w szeregu różnych nowotworów. Ponadto badania nad kolokalizacją ukazały, że według wynalazku TPTE jest usytuowany razem z immunoglobulinami klasy I na powierzchni komórkowej komórek nowotworowych. Wcześniej opisano TPTE tylko jako białko związane z aparatem Golgiego. Dzięki ekspresji TPTE na powierzchni komórkowej komórek nowotworowych ten antygen nowotworowy jest odpowiedni według wynalazku jako doskonała cząsteczka docelowa dla rozwoju diagnostycznych i terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych. Dzięki przewidywanej topologii błonowej TPTE regiony wyeksponowane na zewnątrz komórki są szczególnie odpowiednie do tego celu według wynalazku. Według wynalazku, obejmuje to peptydy FTDSKLYIPLEYRS (SEQ ID NR:81) oraz FDIKLLRNIPRWT (SEQ ID NR:82). W dodatku, pokazano, że TPTE sprzyja migracji komórek nowotworowych. W tym celu komórki nowotworowe, które transfekowano TPTE pod kontrolą eukariotycznego promotora i komórki kontrolne badano w doświadczeniach z migracją w tzw „komorze Boydena, czy wykazują ukierunkowaną migrację. Komórki transfekowane TPTE według wynalazku wykazywały tutaj znaczący (3-krotny) wzrost migracji w 4 niezależnych doświadczeniach. Te dane funkcjonalne wskazują, że TPTE odgrywa ważną rolę w pojawianiu się przerzutów nowotworów. Zatem, procesy, które hamują według wynalazku endogenną aktywność TPTE w komórkach nowotworowych, na przykład przy użyciu antysensownego RNA, różne sposoby interferencji RNA (RNAi) przy użyciu wektorów ekspresyjnych lub retrowirusów oraz przy użyciu małych czą30

PL 215 160 B1 steczek mogłyby powodować w rezultacie zmniejszenie pojawiania się przerzutów, a zatem być bardzo ważne terapeutycznie. Związek przyczynowo-skutkowy pomiędzy aktywnością fosfatazy w nowotworach i zwiększoną migracją oraz zwiększonym tworzeniem się przerzutów ustalono ostatnio dla fosfatazy tyrozynowej PTEN (Iijima i Devreotes Cell 109:599-610, 2002).

P r z y k ł a d 3: Identyfikacja TSBP jako nowego antygenu nowotworowego

Sposób elektronicznego klonowania zastosowany według wynalazku wytworzył TSBP (SEQ ID NR:29) i pochodzące od niego białko (SEQ ID NR:30). Gen został opisany jako gen regulowany specyficznie dla jądra (numer dostępu NM_006781). Przewidywano, że gen koduje białko zasadowe oraz że jest usytuowany na chromosomie 6 blisko sekwencji kodującej kompleks MHC (C6orf10) (Stammers M. i wsp., Immunogenetics 51(4-5):37 3-82, 2000). Według wynalazku pokazano, że wcześniej opisana sekwencja jest nieprawidłowa. Sekwencja według wynalazku jest zasadniczo różna od znanej sekwencji. Według wynalazku sklonowano 3 różne warianty powstałe w wyniku składania transkryptów. Różnice w sekwencjach nukleotydowych wariantów TSBP znalezionych według wynalazku (SEQ ID NR:31, SEQ ID NR:32, SEQ ID NR:33) względem znanej sekwencji (NM_006781, SEQ ID NR:29) są przedstawione na Fig. 7. (różnice przedstawione pogrubioną czcionką). Powodują one przesunięcia ramek odczytu, tak że białka kodowane przez warianty TSBP znalezione według wynalazku (SEQ ID NR:34, SEQ ID NR:35, SEQ ID NR:36) różnią się zasadniczo od wcześniej opisanego białka (SEQ ID NR:30) (Fig. 8).

Według wynalazku potwierdzono, że ten antygen ulega ścisłej represji transkrypcji w zdrowych tkankach (startery PCR 5'-TCTAGCACTGTCTCGATCAAG-3' i 5'-TGTCCTCTTGGTACATCTGAC-3').· Jednak w badanych zdrowych tkankach TSBP ulegał ekspresji oprócz w jądrze także w zdrowej tkance węzłów chłonnych. Według wynalazku wykryto także przemieszczoną aktywację TSBP w nowotworach i dlatego kwalifikuje się go jako znacznik nowotworowy lub antygen związany z nowotworem (Tabela 3).

Chociaż ekspresję TSBP znaleziono w pierwotnej tkance nowotworowej, nie znaleziono jej w stałych liniach komórkowych odpowiednich nowotworów. Ponadto, gen znajduje się w bezpośrednim sąsiedztwie Notch 4, który ulega specyficznej ekspresji w tętnicach i zaangażowany jest w morfogenezę naczyń. Są to znaczące wskazania na to, że jest on znacznikiem specyficznym dla komórek śródbłonka. TSBP może dlatego służyć jako potencjalny znacznik śródbłonka nowotworów i tworzących się nowych naczyń krwionośnych.

Konsekwentnie, promotor TSBP można sklonować do innego produktu genetycznego, którego selektywna ekspresja w węzłach chłonnych jest pożądana.

Analiza ekspresji TSBP, przy użyciu specyficznych przeciwciał, potwierdziła selektywną lokalizację białka w jądrze i węzłach chłonnych, a także w czerniaku i raku oskrzeli. W dodatku, badania immunohistologiczne przy użyciu znakowanego GFP TSBP ukazały wyraźną akumulację okołojądrową.

T a b e l a 3. Ekspresja TSBP w nowotworach

Tkanka	Testowanych ogółem	Pozytywnych	%
Czerniak	12	2	16
Rak sutka	15	0	-
Nowotwór okrężnicy i odbytnicy	15	0	-
Rak prostaty	8	0	-
Rak oskrzeli	7	17	41
Rak komórek nerkowych	7	0	-
Rak jajników	7	0	-
Rak tarczycy	4	0	-
Rak szyjki macicy	6	0	-
Linie komórkowe czerniaka	8	0	-
Linie komórkowe raka oskrzeli	6	0	-

P r z y k ł a d 4: Identyfikacja MS4A12 jako nowego czynnika nowotworowego

MS4A12 (SEQ ID NR:37, numer dostępu NM_017716) i jego produkt translacji (SEQ ID NR:38) zostały opisane wcześniej jako członkowie wielogenowej rodziny spokrewnionej z antygenem CD20

PL 215 160 B1 specyficznym dla komórek B, białkiem HTm4 specyficznym dla komórek hematopoetycznych i łańcuchem β receptora IgE o wysokim powinowactwie. Wszyscy członkowie rodziny charakteryzują się przynajmniej czterema potencjalnymi domenami transbłonowymi i zarówno C-, jak i N-koniec są cytoplazmatyczne (Liang Y. i wsp., Immunogenetics 53(5):357-68, 2001; Liang Y. i Tedder, Genomics 72(2) :119-27, 2001). Według wynalazku przeprowadzono badania RT-PCR na MS4A1 2.Startery wybrano w oparciu o opublikowaną sekwencję MS4A12 (NM_017716) (starter sensowny: CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, starter antysensowny: TTCACCTTTGCCAGCATGTAG). W badanych tkankach wykryto ekspresję tylko w jądrze, okrężnicy (6/8) i rakach okrężnicy i odbytnicy (ang. colon-Ca's) (16/20) i w przerzutach raka okrężnicy (12/15) (Fig. 9).

Duży zasięg występowania w przerzutach raka okrężnicy czyni TSBP atrakcyjnym celem diagnostycznym i terapeutycznym. Według wynalazku przewidywany region zewnątrzkomórkowy zawierający sekwencję białkową GVAGQDYWAVLSGKG (SEQ ID NR:83) jest szczególnie odpowiedni do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych i małych chemicznych inhibitorów. Według wynalazku wewnątrzkomórkową lokalizację białka MS4A12 na błonie komórkowej potwierdzono także przez nałożenie fluorescencji przy użyciu znaczników błony plazmatycznej w konfokalnej immunofluorescencji.

T a b e l a 4. Ekspresja MS4A12 w zdrowych tkankach i rakach okrężnicy i odbytnicy oraz przerzutach

Jelito kręte	+
Okrężnica	+
Wątroba	-
Płuco	-
Węzły chłonne	-
Żołądek	-
Śledziona	-
Nadnercze	-
Nerka	-
Przełyk	-
Jajnik	-
Odbytnica	+
Jądro	+
Grasica	-
Skóra	-
Sutek	-
Trzustka	-
PBMC	-
PBMC aktyw.	-
Prostata	-
Tarczyca	-
Jajowód	-
Macica	-
Mózg	-
Móżdżek	-
Nowotwory okrężnicy i odbytnicy	16/20
Przerzuty nowotworów okrężnicy i odbytnicy	12/15

PL 215 160 B1

Zatem, MS4A12 jest usytuowanym w błonie komórkowej antygenem różnicującym dla zdrowych nabłonków okrężnicy, który także ulega ekspresji w nowotworach okrężnicy i odbytnicy oraz przerzutach.

P r z y k ł a d 5: Identyfikacja BRCO1 jako nowego antygenu nowotworowego

BRCO1 i jego produkt translacji nie były wcześniej opisywane. Sposób przeszukiwania i analizy danych według wynalazku wytworzył EST (znacznik sekwencji ulegających ekspresji) AI668620. Badania RT-PCR przy użyciu specyficznych starterów (starter sensowny: CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, starter antysensowny: CACAGAATATGAGCCATACAG) przeprowadzono w celu analizy ekspresji. Według wynalazku specyficzną ekspresję znaleziono w tkance jądra i dodatkowo w zdrowym sutku (Tabela 5). We wszystkich innych tkankach ten antygen ulega represji transkrypcji. Podobnie został wykryty w nowotworach sutka (20 z 20). BRCO1 ulega wyraźniej nadekspresji w nowotworach piersi w porównaniu z ekspresją w zdrowej tkance sutka (Fig. 10).

Wykorzystując kontig EST (złożony z następujących EST: AW137203, BF327792, BF327797, BE069044, BF330665), sklonowano według wynalazku ponad 1500 pz tego transkryptu (SEQ ID NR:39) przy użyciu elektronicznego klonowania o pełnej długości. Sekwencja mapuje do chromosomu 10p11-12. W tym samym regionie, w bezpośredniej bliskości, opisano wcześniej gen dla antygenu różnicującego sutka, NY-BR-1 (NM_052997; Jager, D. i wsp., Cancer Res. 61(5): 2055-61, 2001).

T a b e l a 5. Ekspresja BRCO1 w zdrowych tkankach i nowotworach piersi

Jelito kręte	-
Okrężnica	-
Wątroba	-
Płuco	-
Węzły chłonne	-
Żołądek	-
Śledziona	-
Nadnercze	-
Nerka	-
Przełyk	-
Jajnik	-
Odbytnica	-
Jądro	+
Grasica	-
Skóra	-
Sutek	+
Trzustka	-
PBMC	-
PBMC aktyw.	-
Prostata	-
Tarczyca	-
Jajowód	-
Macica	-
Mózg	-
Móżdżek	-
Rak sutka	++ (20/20)

PL 215 160 B1

Badania nad skojarzonymi parami (rak sutka i sąsiadujące zdrowe tkanki) ukazały nadekspresję BRCO1 w 70% raków sutka w porównaniu ze zdrową tkanką.

Zatem, BRCO1 jest nowym antygenem różnicującym dla zdrowych nabłonków sutka, który ulega nadekspresji w nowotworach piersi.

P r z y k ł a d 6: Identyfikacja TPX1 jako nowego antygenu nowotworowego

Sekwencja TPX1 (numer dostępu NM_003296; SEQ ID NR:40) i jego produktu translacji (SEQ ID NR:41) są znane. Antygen został wcześniej opisany tylko jako specyficzny dla jądra, to znaczy jako element zewnętrznych włókien i element akrosomu plemników. Wcześniej temu antygenowi przypisywano zaangażowanie, jako cząsteczek adhezyjnych, w przyłączenie plemni ków do komórek Sertoliego (O'Bryan, M.K. i wsp. Mol. Reprod. Dev. 58(1):116-25, 2001; Maeda, T. i wsp., Dev. Growth Differ. 41(6):715-22, 1999). Wynalazek ukazuje po raz pierwszy zaburzoną ekspresję TPX1 w guzach litych (Tabela 6). Dzięki zaznaczonej homologii aminokwasów pomiędzy TPX1 a specyficzną dla neutrofili glikoproteiną macierzy SGP 28 (Kjeldsen i wsp., FEBS Lett 380:246-259, 1996) sekwencje białka specyficzne dla TPX1 obejmujące peptyd SREVTTNAQR (SEQ ID NR:84) są odpowiednie według wynalazku do przygotowania cząsteczek diagnostycznych i terapeutycznych.

T a b e l a 6. Ekspresja TPX1 w nowotworach

Tkanka	Testowanych ogółem	Pozytywnych	%
Czerniak	16	1	6
Rak sutka	20	3	15
Nowotwór okrężnicy i odbytnicy	20	0	0
Rak prostaty	8	3	37
Rak oskrzeli	17	2	11
Rak komórek nerkowych	7	1	14
Rak jajnika	7	1	14
Rak tarczycy	4	0	0
Rak szyjki macicy	6	1	16
Linie komórkowe czerniaka	8	2	25
Linie komórkowe raka oskrzeli	6	1	16

P r z y k ł a d 7: Identyfikacja BRCO2 jako nowego nowotworowego produktu genetycznego BRCO2 i jego produkt translacji nie były wcześniej opisywane. Sposób według wynalazku wytworzył EST (znacznik sekwencji uleg ających ekspresji) BE069341, BF330573 i AA601511. Badania RT-PCR przy użyciu specyficznych starterów (starter sensowny: AGACATGGCTCAGATGTGCAG, starter antysensowny: GGAAATTAGCAAGGCTCTCGC) przeprowadzono w celu analizy ekspresji. Według wynalazku znaleziono specyficzną ekspresję w tkance jądrowej i dodatkowo w zdrowym sutku (Tabela 7). We wszystkich innych tkankach ten produkt genetyczny ulegał represji transkrypcji. Podobnie wykryto go w nowotworach sutka. Wykorzystując kontigi EST (złożone z następujących EST: BF330573, AL044891 i AA601511) według wynalazku sklonowano 1300 pz tego transkryptu przez elektroniczne klonowanie o pełnej długości (SEQ ID NR:62). Sekwencja mapuje do chromosomu 10p11-12. W tym samym regionie, w bezpośredniej bliskości, opisano wcześniej gen dla różnicującego produktu genetycznego sutka, NY-BR-1 (NM_052997; Jager, D. i wsp., Cancer Res. 61(5):2055-61, 2001), i tutaj usytuowany jest opisany powyżej w Przykładzie 6 BRCO1. Dalsze analizy genetyczne ukazały według wynalazku, że sekwencja przedstawiona w SEQ ID NR:62 stanowi nie ulegający translacji region na końcu 3' genu NY-BR-1, który nie był wcześniej opisywany.

PL 215 160 B1

T a b e l a 7. Ekspresja BRCO2 w zdrowych tkankach i nowotworach piersi

Tkanka	Ekspresja
Jądro	+
Sutek	+
Skóra	-
Wątroba	-
Prostata	-
Grasica	-
Mózg	-
Płuco	-
Węzły chłonne	-
Śledziona	-
Nadnercze	-
Jajnik	-
Leukocyty	-
Okrężnica	-
Przełyk	-
Macica	-
Mięsień szkieletowy	-
Najądrze	-
Pęcherz moczowy	-
Nerka	-
Rak sutka	+

BRCO2 jest nowym różnicującym produktem genetycznym dla zdrowych nabłonków sutka, który także ulega ekspresji w nowotworach piersi.

P r z y k ł a d 8. Identyfikacja PCSC jako nowego nowotworowego produktu genetycznego PCSC (SEQ ID NR: 63) i jego produkt translacji nie były jeszcze opisywane. Sposób przeszukiwania i analizy danych według wynalazku wytworzył EST (znacznik sekwencji ulegających ekspresji) BF064073. Badania RT-PCR przy użyciu specyficznych starterów (starter sensowny: TCAGGTATTCCCTGCTCTTAC, starter antysensowny: TGGGCAATTCTCTCAGGCTTG) przeprowadzono w celu analizy ekspresji. Według wynalazku znaleziono specyficzną ekspresję w zdrowej okrężnicy i dodatkowo w raku okrężnicy (Tabela 5). We wszystkich innych tkankach ten produkt genetyczny ulega represji transkrypcji. PCSC koduje dwie przypuszczalne ORF (SEQ ID NR:64 i SEQ ID NR:65). Analiza sekwencji SEQ ID NR:64 ukazała strukturalną homologię do cytokin CXC. Dodatkowo sklonowano 4 alternatywne fragmenty cDNA PCSC (SEQ ID NR:85-88). W każdym przypadku, według wynalazku, każdy cDNA zawiera 3 przypuszczalne ORF, które kodują polipeptydy pokazane w SEQ ID NR:89-100.

T a b e l a 8. Ekspresja PCSC w zdrowych tkankach i rakach okrężnicy i odbytnicy

Jelito kręte	+
Okrężnica	+
Wątroba	-
Płuco	-

PL 215 160 B1 cd tabeli 8

Węzły chłonne	-
Żołądek	-
Śledziona	-
Nadnercze	-
Nerka	-
Przełyk	-
Jajnik	-
Odbytnica	+
Jądro	-
Grasica	-
Skóra	-
Sutek	-
Trzustka	-
PBMC	-
PBMC aktyw.	-
Prostata	-
Tarczyca	-
Jajowód	-
Macica	-
Mózg	-
Móżdżek	-
Nowotwory okrężnicy i odbytnicy	19/20
Przerzuty nowotworów okrężnicy i odbytnicy	15/15

Zatem, PCSC jest antygenem różnicującym dla zdrowych nabłonków okrężnicy, który ulega także ekspresji w nowotworach raka okrężnicy i odbytnicy i we wszystkich badanych przerzutach nowotworów. Ekspresja PCSC wykryta we wszystkich przerzutach okrężnicy i odbytnicy według wynalazku czyni ten antygen nowotworowy bardzo interesującym celem dla profilaktyki i leczenia dających przerzuty nowotworów okrężnicy.

P r z y k ł a d 9: Identyfikacja SGY-1 jako nowego antygenu nowotworowego

Sekwencje transkryptu SGY-1 (SEQ ID NR:70) i jego produktu translacji (SEQ ID NR:71) opublikowano w GenBanku pod numerem dostępu AF177398 (Krupnik i wsp., Gene 238, 301-313, 1999). Soggy-1 wcześniej opisano jako członka rodziny białek Dickkopf, które działają jako inhibitory i antagoniści rodziny białek Wnt. Białka Wnt, z kolei, pełnią ważne funkcje w rozwoju zarodkowym. W oparciu o sekwencję SGY-1 (SEQ ID NR:70) wytworzono według wynalazku startery PCR (5'-CTCCTATCCATGATGCTGACG-3' i 5'-CCTGAGGATGTACAGTAAGTG-3') i zastosowano do analiz RT-PCR (95° 15 min; 94° 1 min; 63° 1 min; 72° 1 min; 35 cykli) w szeregu ludzkich tkanek. Pokazano, że ekspresja w zdrowych tkankach była ograniczona do jądra. Jak to opisano dla innych eCT, pokazano według wynalazku, że SGY-1 ulega aktywacji w sposób przemieszczony w szeregu tkanek nowotworowych; por. Tabela 9.

PL 215 160 B1

T a b e l a 9. Ekspresja SGY-1 w nowotworach

Tkanka	Testowanych ogółem	Pozytywnych	%
Czerniak	16	4	25
Rak sutka	20	4	20
Nowotwór okrężnicy i odbytnicy	20	0	0
Rak prostaty	8	1	13
Rak oskrzeli	32	3	18
Rak komórek nerkowych	7	0	0
Rak jajnika	7	4	57
Rak tarczycy	4	0	0
Rak szyjki macicy	6	2	33
Linie komórkowe czerniaka	8	2	25
Linie komórkowe raka oskrzeli	6	2	33
Linie komórkowe raka sutka

P r z y k ł a d 10: Identyfikacja MORC jako nowego antygenu nowotworowego

Sekwencje transkryptu MORC (SEQ ID NR:74) i jego produktu translacji (SEQ ID NR:75) opublikowano w GenBanku pod numerem dostępu XM_037008 (Inoue i wsp., Hum Mol Genet. Jul:8(7) :1201-7, 1999).

MORC początkowo opisano jako zaangażowany w spermatogenezę. Mutacja tego białka w systemie mysim powoduje w rezultacie niedorozwój gonad.

W oparciu o sekwencję MORC (SEQ ID NR:74) wytworzono według wynalazku startery PCR (5'-CTGAGTATCAGCTACCATCAG-3' i 5'-TCTGTAGTCCTTCACATATCG-3') i zastosowano do analiz RT-PCR (95° 15 min; 94° 1 min; 63° 1 min; 72° 1 min; 35 cykli) w szeregu ludzkich tkanek. Pokazano, że ekspresja w zdrowych tkankach jest ograniczona do jądra. Jak to opisano dla innych eCT, pokazano według wynalazku, że MORC ulega aktywacji w sposób przemieszczony w szeregu tkanek nowotworowych: por. Tabela 10.

T a b e l a 10. Ekspresja MORC w nowotworach

Tkanka	Testowanych ogółem	Pozytywnych	%
Czerniak	16	3	18
Rak sutka	20	0	0
Nowotwór okrężnicy i odbytnicy	20	0	0
Rak prostaty	8	0	0
Rak oskrzeli	17	3	18
Rak komórek nerkowych	7	0	0
Rak jajnika	7	1	14
Rak tarczycy	4	0	0
Rak szyjki macicy	6	0	0
Linie komórkowe czerniaka	8	1	12
Linie komórkowe raka oskrzeli	6	1	17

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt LISTA SEKWENCJI <I10> Sahln Dr., Ugur Tflreci or., ózlem Koslowski or., Michael <120> Produkty genetyczne ulegające ekspresji w sposób zróżnicowany w nowotworach I ich zastosowanie <130> 342-3PCT <160> 100

Patent w wersji 3.1 <210> 1 <211> 1171 <212> DNA <213> Homo sapi ens <400> 1 ctgtcgttgg tgtatttttc tggtgtcact tctgtgccrt ccttcaaagg ttctccaaat 60 gtcaactgtc aaggagcagc taattgagaa gctaattgag gatgatgaaa actcccagtg 120 taaaattact attgttggaa ctggtgccgt aggcatggct tgtgctatta gtatcttact 180 gaaggatttg gctgatgaac ttgcccttgt tgatgttgca ttggacaaac tgaagggaga 240 aatgatggat cttcagcatg gcagtctttt ctttagtact tcaaagatta cttctggaaa 300 agattacagt gtatctgcaa actccagaat agttattgtc acagcaggtg caaggcagca 360

Eigagggagaa actcgccttg ccctggtcca acgtaatgtg gctataatga aatcaatcat 420 tcctgccata gtccattata gtcctgattg taaaattctt gttgtttcaa atccagtgga 480 tattttgaca tatatagtct ggaagataag tggcttacct gtaactcgtg taattggaag 540 tggttgtaat ctagactctg cccgtttccg ttacctaatt ggagaaaagt tgggtgtcca 600 ccccacaagc tgccatggtt ggattattgg agaacatggt gattctagtg tgcccttatg 660 gagtggggtg aatgttgctg gtgttgctct gaagactctg gaccctaaat taggaacgga 720 ttcagataag gaacactgga aaaatatcca taaacaagtt attcaaagtg cctatgaaat 780 tatcaagctg aaggggtata cctcttgggc tattggactg tctgtgatgg atctggtagg 840 atccattttg aaaaatctra ggagagtgca cccagtttcc accatggtta agggattata 900

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt tggaataaaa gaagaactct ttctcagtat cccttgtgtc ttggggcgga atggtgtctc 960 agatgttgtg aaaattaact tgaattctga ggaggaggcc cttttcaaga agagtgcaga 1020 aacactttgg aatattcaaa aggatctaat attttaaatt aaagccttct aatgttccac 1080 tgtttggaga acagaagata gcaggctgtg tattttaaat tttgaaagta ttttcattga 1140 tcttaaaaaa taaaaacaaa ttggagacct g 1171 <210> 2 <2X1> 1053 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 2 ctgtcgttgg	tgtatttttc tggtgtcact tctgtgcctt ccttcaaagg	ttctccaaat	60
gtcaactgtc	aaggagcagc taattgagaa gctaattgag gatgatgaaa	actcccagtg	120
taaaattact	attgttggaa -ctggtgccgt aggcatggct tgtgctatta	gtatcttact	180
gaagattaca	gtgtatctgc aaactccaga atagttattg tcacagcagg	tgcaaggcag	240
caggagggag	aaactcgcct tgccctggtc caacgtaatg tggctataat	gaaatcaatc	300
attcctgcca	tsgtceatta tagtcctgat tgtaaaattc ttgttgtttc	aaatccagtg	360
gatattttga	catatatagt ctggaagata agtggcttac ctgtaactcg	tgtaattgga	420
agtggttgta	atctagactc tgcccgtttc cgttacctaa ttggagaaaa	gttgggtgtc	480
caccccacaa	gctgccatgg ttggattatt ggagaacatg gtgattctag	tgtgccctta	540
tggagtgggg	tgaątgttgc tggtgttgct ctgaagactc tggaccctaa	attaggaacg	600
gattcagata	aggaacactg gaaaaatatc cataaacaag ttattcaaag	tgcctatgaa	660
attatcaagc	tgaaggggta taectcttgg gctattggac tgtctgtgat	ggatctggta	720
ggatccattt	tgaaaaatct taggagagtg cacccagttt ccaccatggt	taagggatta	780
tatggaataa	aagaagaact ctttctcagt atcccttgtg tcttggggcg	gaatggtgtc	840
tcagatgttg	tgaaaattaa cttgaattct gaggaggagg cccttttcaa	gaagagtgca	900
gaaacacttt	ggaatattca aaaggatcta atattttaaa ttaaagcctt	ctaatgttcc	960
actgtttgga	gaacagaaga tagcaggctg tgtattttaa attttgaaag	tattttcatt	1020
gatcttaaaa	aataaaaaca aattggagac ctg		1053

<210>	3
<211>	879
<212>	DNA
<213>	Homo sapisns

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt <400» 3 ctgtcgttgg tgtatttttc tggtgtcact gtcaactgtc aaggagcagc taattgagaa taaaattact attgttggaa ctggtgccgt gaagtggata ttttgacata tatagtętgg attggaagtg gttgtaatct agactctgcc ggtgtccacc ccacaagctg ccatggttgg cccttatgga gtggggtgaa tgttgctggt ggaacggatt csgataagga acactggaaa tatgaaatta tcaagctgaa ggggtatacc ctggtaggat ccattttgaa aaatcttagg ggattatatg gaataaaaga agaactcttt ggtgtctcag atgttgtgaa aattaacttg agtgcagaaa cactttggaa tattcaaaag tgttccactg tttggagaac agaagnagc tteattgatc ttaaaaaata aaaacaa«tt <210> 4 <211» 811 <212» ONA <213» Homo sapiens <400» 4 ctgtcgttgg tgtatttttc tggtgtcact gtcaactgtc aaggagcagc taattgagaa taaaattact attgttggaa ctggtgccgt gaagattaca gtgtatctgc aaactccaga caggagggag aaactcgcct tgccctggtc attcctgcca tagtccacta tagtcctgat gatattttga catatatagt ctggaagata agtggttgta atctagactc tgcccgttte caccccacaa gctgccatgg ttggattatt tggaataaaa gaagaactct ttctcagtat agatgttgtg aaaattaact tgaattctga aacactttgg aatattcaaa aggatctaat tctgtgcctt ccttcaaagg ttctccaaat gctaattgag gatgatgaaa actcccagtg aggcatggct tgtgctatta gtatcttact aagataagtg gcttacctgt aactcgtgta cgtttccgtt acctaattgg agaaaagttg attattggag aacatggtga ttctagtgtg gttgctctga agactctgga ccctaaatta aatatccata aacaagttat tcaaagtgcc tcttgggcta ttggactgtc tgtgatggat agagtgcacc cagtttccac catggttaag ctcagtatcc cttgtgtctt ggggcggaat aattctgagg aggaggccct tttcaagaag gatctaatat tttaaattaa agccttctaa aggctgtgta ttttaaattt tgaaagtatt ggagacctg

120

ISO

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

879 tctgtgcctt ccttcaaagg ttctccaaat gctaattgag gatgatgaaa actcccagtg aggcatggct tgtgctatta gtatcttact atagttattg tcacagcagg tgcaaggcag caacgtaatg tggctataat gaaatcaatc tgtaaaattc ttgttgtttc aaatccagtg agtggcttac ctgtaactcg tgtaattgga cgttacctaa ttggagaaaa gttgggtgtc ggagaacatg gtgattctag tgggattata cccttgtgtc ttggggcgga atggtgtctc ggaggaggcc cttttcaaga agagtgcaga atrttaaatt aaagccttct aatgttccac

120

ISO

240

300

360

420

480

540

600

660

720

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt tgtttggaga acagaagata gcaggctgtg tattttaaat tttgaaagta ttttcattga tcttaaaaaa taaaaacaaa ttggagacct g

<210»	5
<211>	1047
<212»	ONA
<213»	Homo sapiens
<400»	5

ccttcaaagg	ttctccaaat	60
gatgatgaaa	actcccagtg	120
tgtgctatta	gtatcttact	130
ttggacaaac	tgaagggaga	240
tcaaagatta	cttctggaaa	300
acagcaggtg	caaggcagca	360
gctataatga	aatcaatcat	420
gttgtttcaa	atccagtgga	480
gtaactcgtg	taattggaag	S40
ggagaaaagt	tgggtgtcca	600
gattctagtg	tgcccttatg	660
gaccctaaat	taggaacgga	720
attcaaaggg	attatatgga	780
ggcggaatgg	tgtctcagat	840
tcaagaagag	tgcagaaaca	900
ccttctaatg	ttccactgtt	960
aaagtatttt	cattgatctt	1020 1047

ctgtcgttgg tgtatttttc tggtgtcact tctgtgcctt gtcaactgtc aaggagcagc taattgagaa gctaattgag taaaattact attgttggaa ctggtgccgt aggcatggct gaaggatttg gctgatgaac ttgcccttgt tgatgttgca aatgatggat ettcagcatg gcagtctttt ctttagtact agattacagt gtatctgeaa actccagaat agttattgtc ggagggagaa actcgccttg ccctggtcca acgtaatgtg tcctgccata gtccattata gtcctgattg taaaattctt tattttgaca tatatagtct ggaagataag tggcttacct tggttgtaat etagactctg cccgtttccg ttacctaatt ccccacaagc tgccatggtt ggattattgg agaacatggt gagtggggtg aatgttgctg gtgttgctct gaagactctg ttcagataag gaacactgga aaaatatcca taaacaagtt ataaaagaag aactctttct cagtatccct tgtgtcttgg gttgtgaaaa ttaacttgaa ttctgaggag gaggcccttt ctttggaatattcaaaagga tctaatattt taaattaaag tggagaacag aagatagcag gctgtgtatt ttaaattttg aaaaaataaa aacaaattgg agacctg <210» 6 <211» 332 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 6

Met ser Thr Val Lys Olu Gin Leu Ile Glu Lys 1 5 10

Leu Ile Glu Asp Asp 15

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Glu Asn

ser

Gin 20

Cys

Lys Ile

Thr

ile 25

val

Gly

Thr Gly Ala Val 30

Gly

Met

Ala

cys

Al a

ile

Ser

ile

Leu

Leu

Lys

Asp

Leu

Ala

Asp

Glu

Leu

35

40

45

Ala

Leu

va1

ASP

Val

Ala

Leu

Asp

Lys

Leu

Lys

Gly

Glu

Met

Met

ASp

so

55

60

teu

Gin

His

Gly

Ser

Leu

Phe

Phe

Ser

Thr

ser

Lys

Ile

Thr

ser

Gly

65

70

75

80

Lys

Asp Tyr

ser

Val

Ser

Ala

Asn

Ser

Arg

ile

val

Ile

val

Thr

Ala

85

90

95

Gly Ala

Arg

Gin

Gin

Glu Gly

Glu

Thr

Arg

Leu

Ala

Leu

Val

Gin

Arg

100

105

210

Asn

val

Ala

ile

Met

Lys

ser

ile

ile

pro

Ala

ile

Val

His

Tyr

Ser

115

120

125

pro

Asp

Cys

Lys

Ile

Leu

Val

val

Ser

Asn

Pro

val

Asp

Ile

Leu

Thr

130

135

140

Tyr

ile

val

Trp

Lys

ile

Ser

Gly

Leu

Pro

val

Thr

Arg

Val

Ile

Gly

145

150

155

160

Ser

Gly

cys

Asn

Leu

ASp

ser

Ala

Arg

Phe

Arg

Tyr

Leu

ile

Gly

Glu

165

170

175

Lys

Leu

Gly

Val

His

pro

Thr

Ser

Cys

His

Gly

Trp

Ile

ile

Gly

Glu

130

185

190

His

Gly

Asp

Ser

ser

Val

Pro

Leu

Trp

Ser

Gly

val

Asn

Val

Ala

Gly

195

200

205

val

Ala

LfiU

Lys

Thr

Leu

Asp

Pro

Lys

Leu

Gly

Thr

ASp

Ser

ASP

Lys

210

215

220

Glu

His

Trp

Lys

Asn

ile

His

Lys

Gin

val

Ile

Gin

ser

Ala

Tyr

Glu

225

230

235

240

ile

Ile

Lys

Leu

Lys

Gly Tyr

Thr

Ser

Trp

Ala

Ile

Gly

Leu

ser

Va1

245

250

255

Met

Asp

Leu

Val

Gly

Ser

Ile

Leu

Lys

Asn

Leu

Arg Arg

Val

His

Pro

260

265

270

val

Ser

Thr

Met

val

Lys

Gly

Leu

Tyr Gly

Ile

Lys

GlU

Glu

Leu

Phe

275

280

285

PL 215 160 B1

342-

3PCT

,ST2

5.ΪΧ

t

Leu ser

Ile

pro

Cys

Val

Leu

Gly

Arg

Asn

Gly

va1

Ser

Asp

Val

Vsl

290

295

300

Lys Ile

Asn

Leu

Asn

ser

Glu

Glu

Glu

Ala

Leu

Phe

Lys

Lys

Ser

Ala

305

310

315

320

Glu Thr

Leu

Trp

Asn

ile

Gin

Lys

Asp

Leu

Ile

Phe

325

330

<2l0>

7

<211>

51

<212>

PRT

<213>

Homo

sapi

iens

<400>

7

Met Ser

Thr

Val

Lys

Glu

Gin

Leu

Ile

Glu

Lys

Leu

Ile

Glu

Asp

Asp

1

5

10

15

GlU Α5Π

Ser

Gin

Cys

Lys

ile

Thr

Ile

val

Gly

Thr

Gly

Ala

Val

Gly

20

25

30

Met Al a

CV5

Ala

Ile

Ser

ile

Leu

Leu

Lys

ile

Thr

val

Tyr

Leu

Gin

35

40

45

Thr Pro

Glu

50

<21O>

S

<2U>

215

<212>

PRT

<213>

Homo

sap-

i ens

<400>

3

Met Lys

Ser

lle

Ile

Pro

Ala

ile

val

His

Tyr

ser

Pro

ASp

cys

Lys

1

5

10

15

ile Leu

val

Val

Ser

Asn

Pro

val

Asp

Ile

Leu

Thr

Tyr

ile

val

Trp

20

25

30

Lys Ile

ser

Gly

Leu

Pro

val

Thr

Arg

Val

Ile

Gly

Ser

Gly

cys

Asn

35

40

45

Leu ASP

Ser

Ala

Arg

Phe

Arg

Tyr

Leu

Ile

Gly

Glu

Lys

Leu

Gly

Val

50

53

60

PL 215 160 B1

	342-3PCT.ST25.txt
His 65	pro Thr ser cys His Gly Trp ile ile Gly Glu His Gly Asp ser 70 75 80
Ser	val Pro Leu Trp ser Gly val Asn Val Ala Gly Val Ala Leu Lys 85 90 95
Thr	Leu Asp Pro Lys Leu Gly Thr Asp Ser Asp Lys Glu His Trp Lys 100 105 110
Asn	ile His Lys Gin val Ile Gin Ser Ala Tyr Glu ile Ile Lys Leu 115 120 125
Lys	Gly Tyr Thr Ser Trp Ala ile Gly Leu Ser val Met Asp Leu val 130 ' 13S 140
Gly 145	ser Ile Leu Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro val ser Thr Met 150 155 160
val	lys Gly Leu Tyr Gly ile Lys Glu Glu Leu Phe Leu ser Ile Pro lSS 170 175
cys	val Leu Gly Arg Asn Gly Val ser Asp val Va1 Lys Ile Asn Leu 180 185 190
Asn ser Glu Glu Glu Ala Leu Phe Lys Lys ser Ala Glu Thr Leu Trp 195 200 205 Asn Tle Gin Lys Asp Leu ile Phe 210 215 <21Q> 9 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Met 1	ser Thr val Lys Glu Gin Leu Ile Glu Lys Leu Ile Glu Asp Asp 5 10 15
Glu Asn ser Gin cys Lys tle Thr ile Val Gly Thr Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala cys Ala ile ser ile Leu Leu Lys Trp ile phe 35 40 45 <210> 10

PL 215 160 B1

<211> <212> <213>

76 PRT

342~3PCT.ST25.txt

Homo

sapi ens

<400>

10

Met Asp

Leu

val

Gly

Ser

ile

Leu Lys Asn

Leu

Arg

Arg

Val

His

Pro

1

5

10

15

val ser

Thr

Met

Va1

Lys

Gly Leu Tyr Gly

Ile

Lys

Glu

Glu

Leu

Phe

20

25

30

Leu Ser

il e

pro

cys

val

Leu

Gly Arg

Asn

Gly

Val

Ser

Asp

Val

val

35

40

45

Lys Ile

Asn

Leu

Asn

Ser

Glu

Glu

Glu

Ala

Leu

Phe

cys

Lys

ser

Ala

50

55

60

Glu Thr

Leu

Trp

Asn

Ile Gin

Lys

ASp

Leu

ile

Phe

65

70

75

<210>

11

<211>

109

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

11

Met Lys

Ser

ile

ile

Pro

Ala

ile

Va1

His

Tyr

Ser

Pro

ASP

cys

Lys

X

5

10

15

Ile Leu

val

Val

ser

Asn

Pro

val

Asp

Ile

Leu

Thr

Tyr

Ile

val

Trp

20

25

30

Lys ile

Ser 35

Gly

Leu

pro

Val

Thr 40

Arg

val

Il e

Gly

Ser 45

Gly cys

Asn

Leu Asp 50

Ser

Ala

Arg

Phe

Arg 55

Tyr

Leu

ile

Gly

Glu 60

Lys

Leu Gly

val

His Pro

Thr

Ser

Cys

His

Gly

Trp

ile

Ile

Gly

Glu

His

Gly Asp

Ser

65

70

75

80

Ser Gly

ile

Ile

Trp

Asn

Lys

Arg

Arg

Thr

Leu

Ser

Gin

Tyr

Pro

Leu

85

90

95

Cys Leu

sly

Ala

Glu

Trp

Cys

Leu

Arg

cys

Cys

Glu

Asn

100

105

PL 215 160 B1

<210>	12
<211>	66
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	12

wet

val

Gly

Leu

Leu

Glu

Asn

Met

Val

ile

Leu

val

Gly

Leu Tyr

1

5

10

15

Ile

Lys

Glu

Glu

Leu

Phe

Leu

Ser

ile

pro

cys

val

Leu

Gly Arg

20

25

30

Gly

Val

Ser

Asp

val

val

Lys

ile

Asn

Leu

Asn

Ser

Glu

Glu Glu

35

40

45

Leu

Phe

Lys

tys

ser

AU

Glu

Thr

Leu

Trp

Asn

ile

Gin

Lys Asp

50

55

50

ile Phe 65
<210>	13
<211>	241
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	13

Met 1

ser Thr val

Lys Glu Gin teu ile Glu

Lys

Leu

ile

Glu

Asp 15

Asp

5

10

GlU

Αδη

Ser

Gin

cys

Lys

ile

Thr

Ha Val

dy

Thr

Gly

Ala

Val

Gly

20

25

30

Met

Ala

cys

Ala

ile

ser

ile

Leu

Leu

Lys

Asp

Leu

Ala

Asp

Gili

Leu

35

40

45

Ala

Leu

Val

A£p

val

Ala

Leu

Asp

tys

teu

tys

Gly

Glu

Met

Met

Asp

50

55

60

Gin

His

Gly

ser

teu

Phe

Phe

ser

Thr

ser

Lys

ile

Thr

Ser

Gly

65

70

75

80

Lys

ASp

Tyr

Ser

Val

Ser

Ala

Asn

ser

Arg

ile

val

Π e Val

Thr

Ala

90 95

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Gly Ala

Arg

Gin 100

Gin

Glu

Gly

Glu

Thr 105

Arg

ted

Ala

Leu

Val 110

Gin

Arg

Asn Val

Ala 115

ile

Met

Lys

Ser

Ile 120

ile

Pro

Ala

Ile val 125

His

Tyr

ser

Pro Asp 130

Cys

Lys

Ile

Leu

val 135

Val

Ser

Asn

Pro val 140

Asp

Ile

teu

Thr

Tyr xle 145

val

Trp

Lys

Ile 150

Ser

Gly

Leu

Pro

val 155

Thr

Arg

val

ile

Gly 160

ser Gly

cys

Asn

Leu 165

ASp

Ser

Ala

Arg

Phe 170

Arg Tyr

Leu

ile

Gly 175

Glu

Lys Leu

Gly Val 180

His

Pro

Thr

ser

cys 185

His

Gly Trp

ile

ile 190

Gly Glu

His Gly

ASp 195

ser

Ser

val

Pro

Leu 200

Trp

Ser

Gly val

Asn 205

val

Ala

Gly

val Ala 210

Leu

Lys

Thr

Leu

ASp 215

pro

Lys

Leu

Gly Thr Asp 220

ser

Asp

Lys

Glu His 225

Trp

Lys

aso

Ile 230

His

Lys

Gin

val

Ile 235

Gin Arg

Asp Tyr

Met 240

Glu

S21O> 14

<211> 23

<212> PRT

<213> Ho®o

sapiens

<400> 14

Gly Ala Val

Gly Met

Ala

cys

Ala

ile

ser

Ile

Leu

Leu

Lys

Ile

Thr

1	5	20	15
val	Tyr ueu Gin Thr Pro Glu 20

<210> 15 <211> 17 <212> PRT

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt <213> Homo sapiens <400> 15

Gly Ala val Gly Met Ala cys Ala ile ser ile Leu Leu Lys Trp ile 15 10 15

Phe <210> 16 <2U> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Gly Trp ile ile Gly Glu His Gly Asp ser ser Gly ile ile Trp Asn 15 10 15

Lys Arg Arg Thr Leu Ser Gin Tyr pro Leu cys Leu Gly Ala Glu Trp 20 25 30 cys Lau Arg cys cys Glu Asn 35 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Met val Gly Leu Leu Glu Asn Met val ile Leu Val Gly Leu Tyr Gly 15 10 15 ile tys Glu Glu Leu Phe Leu 20 <210> 1S <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt <40G> 18

Glu His Trp Lys Asn Ile His Lys sin Val ile Gin Arg Asp Tyr Met 15 10 15

Glu <21G> 19 <Z11> 2168 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gaatccgcgg ggagggcaca acagctgcta cctgaacagt ttctgaccca acagttaccc 60 agcgccggac tcgctgcgcc ccggcggctc tagggacccc cggcgcctac acttagctcc 120 gcgcccgaga gaatgttgga ccgacgacac aagacctcag acttgtgtta ttctagcagc 180 tgaacaeaec ccaggctctt ctgaccggca gtggctctgg aagcagtctg gtgtatagag 240 ttatggattc actaccagat tctactgtat gctcttgaea actatgacca caatggtcca 300 cccacaaatg aattatcagg agtgaaccca gaggcacgta tgaatgaaag tcctgatceg 360 actgacctgg cgggagtcat cattgagctc ggccccaatg acagtccaca gacaagtgaa 420 tttaaaggag caaccgagga ggcacctgcg aaagaaagcc cacacacaag tgaatttaaa 480 ggagcagccc gggtgtcacc tatcagtgaa agtgtgttag cacgactttc caagtttgaa 540 gttgaagatg ctgaaaatgt tgcttcatat gacagcaaga ttaagaaaat tgtgcattca 600 attgtatcat cctttgcatt tggactattt ggagttttcc tggtcttact ggatgtcaćt 660 ctcatccttg ccgacctaat tttcactgac agcaaacttt atattccttt ggagtatcgt 720 tctatttctc tagctattgc cttatttttt ctcatggatg ttcttcttcg agtatttgta 780 gaaaggagac agcagtattt ttctgactta tttaacattt tagatactgc cattattgtg 840 attcttctgc tggttgatgt cgtttacatt ttttttgaca ttaagttgct taggaatatt 900 cccagatgga cacatttact tcgacrtcta cgacttatta ttctgttaag aatttttcat 960 ctgtttcatc aaaaaagaca acttgaaaag ctgataagaa ggcgggtttc agaaaacaaa 1020 aggcgataca caagggatgg atttgaccta gacctcactt acgttacaga acgtattatt 1080 gctatgtcat ttccatcttc tggaaggcag tctttctata gaaatccaat caaggaagtt 1140 gtgcggtttc tagataagaa acaccgaaac cactatcgag tctacaatct atgcagtgaa 1200 agagcttacg atcctaagca cttccataat agggtcgtta gaatcatgat tgatgatcat 1260 aatgtcccca ctctacatca gatggtggtt ttcaccaagg aagtaaatga gtggatggct 1320 caagatcttg aaaacatcgt agcgattcac tgtaaaggag gcacagatag aacaggaact 1380 atggtttgtg ccttccttat tgcctctgaa atatgttcaa ctgcaaagga aagcctgtat 1440

PL 215 160 B1

342-3PCT.5T25.tXX tattrtggag aaaggegaac agataaaacc cacagcgaaa aatttcaggg agtagaaact 1500 ccttctcaga agagatatgt tgcatatttt gcacaagtga aacatctcta caactggaat 1560 ctccctccaa gacggatact ctttataaaa cacttcatta tttattcgat tcctcgttat 1620 gtacgtgatc taaaaatcca aatagaaatg gagaaaaagg ttgtcttttc cactatttca 1680 ttaggaaaat gttcggtact tgataacatt acaacagaca aaatattaat tgatgtąttc 1740 gacggtccac ctctgtatga tgatgtgaaa gtgcagtttt tctattcgaa tcttcctaca 1800 tactatgaca attgctcatt ttacttctgg ttgcacacat cttttattga aaataacagg 1860 ctttatctac caaaaaatga attggataat ctacataaac aaaaagcacg gagaatttat 1920 ccatcagatt ttgccgtgga gatacttttt ggcgagaaaa tgacttccag tgatgttgta 1980 gctggatccg artaagtata gctccccctt ccccttctgg gaaagaatta tgttctttcc 2040 aaccctgcca catgttcata tatcctaaat ctatcctaaa tgttcccttg aagtatttat 2100 ttatgtttat atatgtttat acatgttctt caataaatct attacatata tataaaaaaa 2160 aaaaaaaa 2158

<210>	20
<211>	2114
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<400>	20

gaatccgcgg ggagggcaca acagctgcta cctgaacagt ttctgaccca acagttaccc 60 agcgccggac tcgctgcgcc ccggcggctc tagggacccc cggcgcctac acttagctcc 120 gcgcccgaga gaatgttgga ccgacgacac aagacctcag acttgtgtta ttctagcagc 180 tgaacacacc ccaggctctt ctgaccggca gtggctctgg aagcagtctg gtgtatagag 240 ttatggattc actaccagat tctactgtat gctcttgaca actatgacca caatggtcca 500 cccacaaatg aattatcagg agtgaaccca gaggcacgta tgaatgaaag tcctgatccg 360 actgacctgg cgggagtcat cattgagctc ggccccaatg acagtccaea gacaagtgaa 420 tttaaaggag caaccgagga ggcacctgcg aaagaaagtg tgttagcacg actttccaag 480 tttgaagttg aagatgctga aaatgttgct tcatatgaca gcaagattaa gaaaattgtg 540 cattcaattg tatcatcctt tgcatttgga ctatttggag ttttcctggt cttaetggat 600 gtcaetctca tccttgccga cctaattttc actgacagca aactttatat tcctttggag 660 tatcgttcta tttctctagc tattgcctta ttttttctca tggatgttct tcttcgagta 720 tttgtagaaa ggagacagca gtatttttęt gacttattta acattttaga tactgccatt 780 attgtgattc ttctgctggt tgatgtcgtt tacatttttt ttgacattaa gttgcttagg 840 aatattccca gatggacaca tttacttcga cttctacgac ttattattct gttaagaatt 900

PL 215 160 B1

342“3PCr,ST25.txt tttcatctgt ttcatcaaaa aagacaactt gaaaagctga taagaaggcg ggtttcagaa 960 aacaaaaggc gatacacaag ggatggattt gacctagacc tcacttacgt tacagaacgt 1020 attattgcta tgtcatttcc atcttctgga aggeagtctt tctatagaaa tccaatcaag 1080 gaagttgtgc ggtttctaga taagaaacac cgaaaccact atcgagtcta caatctatgc 1140 agtgaaagag cttacgatcc taagcacttc cataataggg tcgttagaat catgattgat 1200 gatcataatg tccccactct acatcagatg gtggttttca ccaaggaagt aaatgagtgg 1260 atggctcaag atcttgaaaa catcgtagcg attcactgta aaggaggcac agatagaaca 1320 ggaactatgg tttgtgcctt ccttattgcc tctgaaatat gttcaactgc aaaggaaagc 1380 ctgtattatt ttggagaaag gcgaacagat aaaacccaca gcgaaaaatt tcagggagta 1440 gaaaetcctt ctcagaagag atatgttgca tattttgcac aagtgaaaca tctctacaac 1500 tggaatctcc ctccaagacg gatactcttt ataaaacact tcattattta ttcgattcct 1560 cgttatgtac gtgatctaaa aatccaaata gaaatggaga aaaaggttgt cttttccact 1620 atttcattag gaaaatgttc ggtacttgat aacattacaa eagacaaaat attaattgat 1680 gtattcgacg gtccacctct gtatgatgat gtgaaagtge agtrtttcta ttcgaatctt 1740 cctacatact atgacaattg ctcatrttac ttctggttgc acacatcttt tattgaaaat 1300 aacaggcttt atctaccaaa aaatgaattg gataatctac ataaacaaaa agcacggaga 1860 atttatccat cagattttgc cgtggagata ctttttggcg agaaaatgac ttccagtgat 1920 gttgtagctg gatccgatta agtatagetc ccccttcccc ttctgggaaa gaattatgtt 1980 ctttccaacc ctgccacatg ttcatatatc ctaaatctat cctaaatgtt cccttgaagt 2040 atttatttat gtttatatat gtttatacat gttcttcaat aaatctarta catatatata 2100 aaaaaaaaaa aaaa 2114 <210> 21 <2łl> 2222 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gaatccgcgg ggagagcaca acagctgcta cctgaacagt agcgccggac tcgćtgcgcc ccggcggcfcc tagggacccc gcgcccgaga gaatgttgga ccgacgacac aagaccteag tgaacacacc ccaggctctt ctgaccggca gtggctctgg ttatggattc actaccagat tctactgtat gctcttgaca cccacaaatg aattateagg agtgaaccca gaggcacgta actgacctgg cgggagtcat cattgagctc ggecccaatg

ttctgaccca acagttaccc	60
cggcgcctac acttagctcc	120
acttgtgrta ttctagcagc	180
aageagtetg gtgtatagag	240
actatgacca caatggtcca	300
tgaatgaaag tcctgatccg	360
acagtccaca gacaagtgaa	420

PL 215 160 B1

342-3PCT,ST25.txt tttaaaggag caaccgagga gęcacctgcg aaagaaagcc cacacacaag tgaatttaaa 480 ggagcagccc gggtgtcacc tatcagtgaa agtgtgttag cacgactttc eaagtttgaa 540 gttgaagatg ctgaaaatgt tgettcatat gacagcaaga ttaagaaaat tgtgcattca 600 attgtatcat cctttgcatt tggactattt ggagttttcc tggtcttact ggatgtcact 660 ctcatccttg ccgacctaat tttcactgac agcaaacttt atattecttt ggagtatcgt 720 tctatttctc tagctattgc cttatttttt ctcatggatg ttcttcttcg agtatttgta 780 gaaaggagac agcagtattt ttctgactta tttaacattt tagatactgc cattattgtg 840 attcttctgc tggttgatgt cgtttacatt ttttttgaca ttaagttgct taggaatatt 900 cccagatgga cacatttact tcgacttcta cgacttatta ttctgttaag aatttttcat 960 ctgtttcatc aaaaaagaca acttgaaaag ctgataagaa ggcgggtttc agaaaacaaa 1020 aggcgataca caagggatgg atttgaccta gacctcactt acgttacaga acgtattatt 1080 getatgtcat ttccatcttc tggaaggcag tctttctata gaaatccaat caaggaagtt 1140 gtgcggtttc tagataagaa acaccgaaac cactatcgag tctacaatct atgcagtatg 1200 tacattactc tatattgtgc tactgtagat agaaaacaga ttactgcacg tgaaagagct 1260 tacgatccta agcacttcca taatagggtc gttagaatca tgattgatga tcataatgtc 1320 cccactctac atcagatggt ggttttcacc aaggaagtaa atgagtggat ggctcaagat 1380 cttgaaaaca tcgtagcgat tcactgtaaa ggaggcacag atagaacagg aactatggtt 1440 tgtgecttcc ttattgcctc tgaaatatgt tcaactgcaa aggaaagcct gtattatttt 1500 ggagaaaggc gaacagataa aacccacagc gaaaaatttc agggagtaga aactccttct 1560 cagaagagat atgttgcata ttttgcacaa gtgaaacatc tctacaactg gaatctccct 1620 ccaagacgga tactctttat aaaacacttc attatttatt cgattcctcg ttatgtacgt 1680 gatctaaaaa tccaaataga aatggagaaa aaggttgtct tttccactat ttcattagga 1740 aaatgttcgg tacttgataa cattacaaca gacaaaatat taattgatgt attcgacggt 1800 ccacctctgt atgatgatgt gaaagtgcag tttttctatt cgaatcttcc tacatactat 1860 gacaattgct cattttactt ctggttgcac acatctttta ttgaaaataa caggctttat 1920 ctaccaaaaa atgaattgga taatctacat aaacaaaaag cacggagaat ttatccatca 1980 gattttgccg tggagatact ttttggcgag aaaatgactt ccagtgatgt tgtagctgga 2040 tccgattaag tatagctccc ccttcccctt ctgggaaaga attatgttct ttccaaccct 2100 gccacatgtt catatatcct aaatctatcc taaatgttcc cttgaagtat ttatttatgt 2160 ttatatatgt ttatacatgt tcttcaataa atctattaca tatatataaa aaaaaaaaaa 2220 aa 2222 <210> 22 <2łl> 5S1

PL 215 160 B1

<212> PRT

342-3PCT.ST25.txt

<213> Homo

sapiens

<400> 22

Met

Asn

Glu

ser

Pro

Asp

Pro

Thr-

Asp

teu

Ala

Gly

val

ile ile Glu

1

5

10

15

Leu

Gly

Pro

Asn

ASp

ser

pro

Gin

Thr

Ser

Glu

Phe

Lys

Gly Ala Thr

20

25

30

Glu

Glu

Al a

Pro

Ala

Lys

Glu

ser

Pro

His

Thr

Ser

GlU

Phe

Lys

Gly

35

40

45

Ala

Ala

Arg

val

Ser

Pro

ile

ser

Glu

ser

Val

Leu

Ala

Arg

Leu

Ser

50

55

60

tys 65

Phe

Glu

Val

GlU

Asp 70

Ala

GlU

Asn

val

Ala 75

ser

Tyr Asp

ser

Lys 80

Ile

Lys

Lys

ile

val

His

Ser

Ile

Val

Ser

ser

Phe

Ala

phe

Gly

Leu

85

90

95

phe

Gly

val

phe

Leu

val

Leu

Leu

Asp

Val

Thr

Leu

Ile

Leu

Ala

Asp

100

105

110

Leu

ile

Phe

Thr

Asp

Ser

Lys

Leu

Tyr

ile

Pro

Leu

Glu

Tyr Arg

ser

115

120

125

ile

Ser

Leu

Ala

Ile

Ala

Leu

Phe

Phe

Leu

Met

Asp

val

Leu

Leu

Arg

130

135

140

val

Phe

Val

Glu

Arg

Arg

Gin

Gin

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Phe

Asn

ile

145

150

155

160

Leu

Asp

Thr Ala

ile

ile

val

Ile

Leu

Leu

Leu

Val

Asp

val

val

Tyr

165

170

175

ile

Phe

Phe

ASO 180

ile

Lys

Leu

Leu

Arg 135

Asn

Ile

pro

Arg

Trp 190

Thr

His

Leu

Leu

Arg

Leu

Leu

Arg

Leu

Ile

Ile

Leu

Leu

Arg

Ile

Phe

His

Leu

195

200

205

Phe

His

Gin

Lys

Arg

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu

ile

Arg

Arg

Arg

val

Ser

210

215

220

Glu

Asn

tys

Arg Arg

Tyr

Thr

Arg

Asp Gly

pbs

ASP

Leu

ASP

Leu

Thr

225

230

235

240

PL 215 160 B1

342-

3PCT

. s i 2

5.tx

t

Gly

Tyr

Val

Thr

GlU

Arg

Ile

Ile

Ala

Met

ser

Phe

Pro

Ser

ser

Arg

245

250

255

Gin

Ser

Phe

Tyr 260

Arg

Asn

Pro

Ile

Lys 265

Glu

Val

Val

Arg

Phe 270

Leu

Asp

Lys

Lys

His

Arg

Asn

His

Tyr

Arg

Val

iyr

Asn

teu

cys

Ser

Glu

Arg

275

280

285

Ala

Tyr

Asp

pro

Lys

His

Phe

His

Asn

Arg

Val

val

Arg

Ile

Met

Ile

290

295

300

ASD

ASp

His

Asn

val

Pro

Thr

Leu

His

Gin

Met

val

val

Phe

Thr

Lys

305

310

315

320

Glu

val

Asn

Glu

Trp

Met

Ala

Gin

ASp

Leu

GlU

Asn

Ile

Val

Ala

li e

325

330

335

His

Cys

Lys

Gly

Gly

Thr

ASP

Arg

Thr

Gly

Thr

Met

val

Cys

Ala

Phe

340

345

350

Leu

Ile

Ala

ser

Glu

He

cys

ser

Thr

Ala

Lys

Glu

Ser

Leu

Tyr

Tyr

355

360

365

Phe

Gly

GlU

Arg

Arg

Thr

Asp

Lys

Thr

His

ser

Glu

Lys

Phe

Gin

Gly

370

375

380

val

Glu

Thr

pro

ser

Gin

Lys

Arg

Tyr

val

Ala

Tyr

Phe

Ala

Gin

Val

385

390

395

400

Lys

His

Leu

Tyr

Asn 405

Trp

Asn

Leu

Pro

Pro 410

Arg

Arg

ile

Leu

Phe 415

Ile

Lys

His

Phe

Ile

ile

Tyr

ser

Ile

Pro

Arg

Tyr

Val

Arg

Asp

Leu

L'/s

420

425

430

Ile

Gin

Ile

Glu

Met

Glu

Lys

Lys

val

val

Phe

ser

Thr

Ile

Ser

Leu

435

440

445

Gly

Lys

cys

Ser

val

Leu

Asp

Asn

ile

Thr

Thr

Asp

Lys

Ile

Leu

ile

450

455

460

Asp

val

Phe

Asp

Gly

Pro

Pro

Leu

Tyr

Asp

Asp

Val

Lys

Val

Gin

Phe

465

470

475

480

phe

Ty 5“

Ser

Asn

Leu

pro

Thr

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Cys

Ser

Phs

Tyr

Phe

485

490

495

Trp

Leu

Hl 3

Thr

Ser

Phe

ile

Glu

Asn

Asn

Arg

Leu

Tyr

Leu

Pro

Lys

500

505

510

PL 215 160 B1

Asn Glu

342-

•3PCr.ST25.txt

Leu ASP 515

Asn

Leu

His

Lys 520

Gln

Lys

Ala

Arg

Arg 525

ile

Tyr

pro

Ser Asp

Phe Ala

val

Gl U

Ile

Leu

Phe

Gly

Glu

Lys

Met

Thr

Ser

Ser

530

535

540

Asp val

val

Ala

Gly

Ser

ASP

545

550

<210> :

23

<213> !

533

<212> 1

=RT

<215> Homo

sapi ans

<400> ;

23

Met Asn Glu

Ser

Pro

Asp

Pro

Thr

Asp

Leu

Ala Gly val

ile

Ile

Glu

1

5

10

15

Leu Gly Pro

Asn

Asp

Ser

Pro

Gin Thr

ser

Glu Phe

Lys

Gly Ala Thr

20

25

30

Glu Glu Ala

pro

Ala

Lys

Glu

ser

yal

Leu

Ala Arg

Leu

ser

Lys

Phe

35

40

45

Glu yal

Glu

Asp

Al a

Glu

Asn

val

Ala

Ser

Tyr Asp

Ser

Lys

Ile

Lys

50

55

60

Lys Ile

val

His

ser

ile

va1

Ser

ser

Phe Ala

Phe

Gly

Leu

Phe

Gly

65

70

75

80

Val Phe

Leu

Val

Leu

Leu

ASp

Val

Thr

teu

Ile

Leu

Ala

Asp

Leu

Ile

85

90

95

Phe Thr

ASP

Ser 100

Lys

Leu

Tyr

Ile

Pro 105

Leu

GlU

Tyr Arg

Ser 110

Ile

Ser

Leu Ala

Ile Ala

Leu

Phe

Phe

Leu

Met

Asp

val

Leu

Leu

Arg

Va1

Phe

115

120

125

Val Glu

Arg Arg

Gin

Gin

Tyr

phe

Ser

ASp

Leu

phe

Asn

ile

Leu

Asp

130

135

140

Thr Ala

Ile

He

val

ile

Leu

Leu

Leu

val

Asp

yal

val

Tyr

ile

phe

145

150

155

160

Phe Asp

ile

Lys

Leu

Leu

Arg

Asn

Ile

pro

Arg

Trp

Thr

His

Leu

Leu

165

170

175

PL 215 160 B1

Arg

Leu Lau

Arg 180

Leu

Ile

ile Lau

342-3PCr.ST25.txt

Phe

His

Leu Σ85

Arg ile

phe

His

Leu· 190

Gin

Lys

Arg

Gin

Leu

Glu

Lys

teu

Ile

Arg Arg Arg

val

ser

Glu

Asn

195

200

205

Lys

Arg 210

Arg Tyr

Thr

Arg

Asp 215

Gly Phe

Asp

Leu

Asp 220

Leu

Thr

Tyr

val

Thr Glu

Arg

ile

ile

Ala

Met

ser

phe

Pro

ser

Ser

Gly Arg

Gin

ser

225

230

235

240

Phe

Tyr Arg

Asn

Pro 245

Ile

Lys

Glu

val

Val 250

Arg

Phe

teu

Asp

Lys 255

Lys

His

Arg

Asn

His 260

Tyr Arg

Val

Tyr

Asn 265

Leu

Cys

Ser

Glu

Arg 270

Ala

Typ

Asp

Pro

Lys

His

Phe His

Asn

Arg

val

Val

Arg

ile

Met

Ile

Asp

Asp

275

280

285

His

Asn

Val

Pro

Thr

Leu

His

Gin

Met

val

va1

Phe Thr

Lys

Gl U

val

290

295

300

Asn

GlU

Trp

Met

Ala

Gin

ASP

Leu

Glu

Asn

ile va1

Ala Ile His

cys

305

3X0

315

320

Lys Gly Gly Thr

Asp 325

Arg

Thr

Gly

Thr

Met 330

Val

cys

Ala Phe

Leu 335

Ile

Ala

Ser

Glu Ile

cys

Ser

Thr Ala

Lys

Glu

Ser

Lau

Tyr Tyr

Phe

Gly

340

345

350

Glu

Arg

Arg 355

Thr

Asp

Lys

Thr His 360

ser

Glu

Lys

Phe

Gin 365

Gly val

Glu

Thr

Pro 370

Ser

Gin

Lys

Arg

Tyr 375

Val

Ala

iyr

Phe

Ala 380

Gin

Val

uys

His

Leu

Tyr

Asn

Trp

Asn

Leu

pro

pro

Ara Arg

ile

Leu

Phe

ile

Lys

His

385

390

395

400

Phe

ile

He

Tyr

Ser

ile

pro

Arg Tyr Val

Arg

Asp

Leu

Lys

Ile

Gin

405

410

415

ile

GlU

Met

GlU

Lys

Lys

val

Val

Phe

Ser

Thr

Ile

ser

Leu

Gly

Lys

420

425

430

cys

Ser

Val

Leu

Asp

Asn

Ile Thr

Thr

ASp

Lys

ile

Leu

ile

Asp

Va1

PL 215 160 B1

342Phe Asp Gly Pro Pro Leu Tyr asp Asp 450 455

PCT. ST25.txt

Val Lys val Gin Phe Phe Tyr 460 ser Asn Leu Pro Thr Tyr Tyr Asp Asn 465 470 cys ser Phe Tyr Phe Trp Leu 475 480

His Thr ser Phe Ile Glu Asn Asn Arg 485

Leu Tyr Leu Pro Lys Asn Glu 490 495

Leu Asp Asn Leu His Lys Gin Lys Ala 500 505

Arg Arg ile Tyr Pro Ser Asp 510

Phe Ala Val Glu Ile Leu Phe Gly Glu 515 520

Lys Met Thr ser ser Asp val 525 val Ala Gly Ser Asp 530 <210> 24 <2ll> 569 <212> prt <213> Homo sapi ens <400> 24

Met 1	Asn	Glu	Ser	Pro 5	Asp	pro	Thr	ASp
Leu	Gly	pro	Asn	ASp	ser	pro	Gin	Thr
			20				25
Glu	Glu	Ala	Pro	Ala	tys	Glu	ser	Pro
		35				40
Ala	Ala	Arg	val	Ser	pro	ile	ser	Glu
	50				55
Lys	Phe	Glu	val	Glu	Asp	Ala	Glu	Asn

Leu Ala Gly val ile ile Glu 10 15 ser Glu Phe Lys Gly Ala Thr 30

His Thr Ser Glu Phe Lys Gly 45

Ser Va1 Leu Ala Arg Leu ser 60 val Ala Ser Tyr Asp Ser Lys 75 80

70

Ile	Lys	Lys	Ile	val	His	Ser	Ile	val
		85
Phe	Gly	val	Phe	Leu	Val	Leu	Leu	Asp
		100					105
Leu	ile	Phe	Thr	Asp	ser	Lys	Leu	tyr
		115				120

ser ser phe Ala Phe Gly Leu 90 95

Val Thr Leu Ile Leu Ala Asp 110 ile Pro Leu Glu Tyr Arg ser 125

PL 215 160 B1 _ ,,, 342~3PCT.ST25.txt ' ile ser Leu Ala ile Ala Leu Phe Phe Leu Met Asp val Leu Leu Arg

130 135 140

Va1 Phe val Glu Arg Arg Gin Gin Tyr Phe Ser Asp Leu Phe Asn ile 145 150 155 160

L8U Asp Thr Ala ile Ile Val ile Leu Leu Leu Val Asp val val Tyr 165 170 175

Ile Phe Phe Asp Ile Lys Leu Leu Arg Asn Ile Pro Arg Trp Thr His 180 185 190

Leu Leu Arg Leu Leu Arg teu ile Ile Leu Lsu Arg Ile Phe His Leu 195 . 200 205

Phe His Gin Lys Arg Gin Leu Glu Lys Leu Ile Arg Arg Arg val ser 210 . 215 220

Glu 225

Asn

Lys

Arg

Arg

Tyr 230

Thr

Arg

Asp

Gly

Phe 235

Asp

Leu

ASP

Leu

Thr 240

Tyr

val

Thr

Glu

Arg 245

ile

Ile

Ala

Met

Ser 250

Phe

Pro

ser

ser

Gly 255

Arg

Gin

Ser

phe

Tyr

Arg

Asn

Pro

Ile

Lys

Glu

val

val

Arg

Phe

Leu

Asp

260

265

270

Lys

Lys

His

Arg

Asn

His

Tyr

Arg

val

Tyr

Asn

Leu

cys

Ser

Met

Tyr

275

280

285

ile

Thr

Leu

Tyr

cys

Ala

Thr

Val

Asp

Arg

Lys

Gl n

Ile

Thr

Ala

Arg

290

295

300

Glu

Arg

Ala

Tyr

ASP

Pro

Lys

His

Phe

His

Asn

Arg

Val

val

Arg

ile

305

310

315

320

Met

•Ile

Asp

ASp

His

Astr

Val

pro

Thr

Leu

His

Gin

Met

Val

val

Phe

325 330 335

Thr Lys Glu Val Asn Glu Trp Met Ala Gin Asp Leu Glu Asn ile val 340 345 350

Ala ile His cys Lys Gly Gly Thr Asp Arg Thr Gly Thr Mat Val Cys 355 ’ 360 365

Ala Phe Leu ile Ala Ser Glu ile Cys Sar Thr Ala Lys Glu ser Leu 370 375 380 .

Tyr Tyr phe Gly Glu Arg Arg Thr Asp Lys Thr His Ser Glu Lys Phe 385 390 395 400

PL 215 160 B1

Gin Gly Val

Glu

342-3PCT.ST25.txt

Thr Pro Ser 405

Gin

Lys

Arg 410

Tyr

val

Ala

Tyr

Phs 415

Ala

Gin

Val

Lys

His 420

Leu

Tyr

Asn

Trp

Asn 425

Leu

Pro

pro Arg Arg 430

ile

Leu

Phe

ile

Lys

His

Phe

ile

ile

jyt

ser

ile

pro

Arg Tyr

Val

Arg

Asp

435

440

445

Leu

tys 450

Ile

Gin

Ile

Glu

Met

Glu

tys

Lys

Va1

val

Phe

ser

Thr

ile

455

460

ser

Leu

Gly

Lys

cys

ser

val

Leu

Asp

Asn

ile

Thr

Thr

ASp

tys

ile

465

470

475

480

Leu

ile

Asp

Val

phe Asp Gly

pro

Pro

Leu

Tyr

ASp

Asp

val

Lys

val

485

490

495

Gin

phe

Phe

Tyr

Ser

Asn

Leu

Pro

Thr

Tyr Tyr

Asp

Asn

cys

ser

Phe

500

505

510

Tyr

phe

Trp

teu

His

Thr

Ser

Phe

Ile siu

Asn

Asn

Arg

Leu

Tyr

LSU

515

520

525

pro

Lys 530

Asn

Glu

Leu

Asp

Asn 535

Leu

His

Lys

Gin

Lys 540

Ala

Arg

Arg

Ile

Tyr

pro

Ser

Asp

Phe Ala

Va1

Glu

Ile

Leu

Phe

Gly

Glu

Lys

wet

Thr

545

550

555

560

Ser Ser Asp Val Val Ala Gly ser Asp 565

<210>	25
<211>	21
<212>	ONA
<213>	Sztuczna sekwencja
<4Q0>	25

tgccgtaggc atggcttgtg c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja

PL 215 160 B1

<400» 26 caacatctga gacaccattc c
<210»	27
<211»	21
<212»	ONA
<213»	Sztuczna sekwencja
<400» 27 tggatgtcac tctcatcctt g
<210»	28
<211»	21
<212»	DNA
<213»	Sztuczna sekwencja

342-3PCT.5T25.txt <400> 28 ccatagttcc tgttctatct g ' 21

<210»	29
<211»	2192
<212»	ONA
<213»	Homo sapiens
<400»	29

agctcagctg ggagcgcaga ggctcacgcc tgtaatccca tcarttgctt aggtctgatc 60 aatctgctcc acacaatttc tcagtgatcc tctgcatctc tgcctacaag ggcctccctg 120 acacccaagt tcatattgct cagaaacagt gaacttgagt ttttcgtttt accttgatct 180 ctctctgaga aagaaatcca gatgatgcaa cacctgatga agacaataca tggaaaatga 240 cagtcttgga aataactttg gctgtcatcc tgaetctact gggacttgcc atcctggcta 300 ttttgttaac aagatgggca cgacgtaagc aaagtgaaat gtatatctcc agatacagtt 360 eagaaca&ag tgctagactt ctggactatg aggatggtag aggatcccga catgcatatc 420 aacacaaagt gacacttcat atgataaccg agagagatcc aaaaagagat tacacaccat 480 caaccaacte tctagcactg tctcgatcaa gtattgcttt acctcaagga tccatgagta 540 gtataaaatg tttacaaaca actgaagaac ctccttecag aactgcagga gccatgatgc 600 aattcacagc cctattcccg gagctacagg acctatcaag ctctctcaaa aaaccattgt 660 gcaaactcca ggacctattg tacaatatct ggatccaatg tcagatcgca tctcacacaa 720 tcactggtca ccttcagcac ccgcggtcac ccatggcacc cataataatt tcacagagaa 780

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt ccgcaagtca gctggcagca cctataagaa tacctcaagt tcacactatg gacagttctg 840 gaaaaatcac actgactcct gtggttatat taacaggtta catggacgaa gaacttcgaa 900 aaaaatcttg ttccaaaatc cagattctaa aatgtggagg cactgcaagg tctcagatag 960 ccgagaagaa aacaaggaag caactaaaga atgacatcat atttacgaat tctgtagaat 1020 ccttgaaatc agcacacata aaggagccag aaagagaagg aaaaggcact gatttagaga 1080 aagacaaaat aggaatggag gtcaaggtag acagtgacgc tggaatacca aaaagacagg 1140 aaacccaact aaaaatcagt gaagatgagt ataccacaag gacagggagc ccaaataaag 1200 aaaagtgtgt cagatgtacc aagaggacag gagtccaagt aaagaagagt gagtcaggtg 1260 tcccaaaagg acaagaagcc caagtaacga agagtgggtt ggttgtactg aaaggacagg 1320 aagcccaggt agagaagagt gagatgggtg tgccaagaag acaggaatcc caagtaaaga 1380 agagtcagtc tggtgtctca aagggacagg aagcccaggt aaagaagagg gagtcagttg 1440 tactgaaagg acaggaagcc caggtagaga agagtgagtt gaaggtacca aaaggacaag 1500 aaggccaagt agagaagact gaggcagatg tgccaaagga acaagaggtc caagaaaaga 1560 agagtgaggc aggtgtactg aaaggaccag aatcccaagt aaagaacact gaggtgagtg 1620 taccagaaac actggaatcc caagtaaaga agagtgagtc aggtgtacta aaaggacagg 1680 aagcccaaga aaagaaggag agttttgagg ataaaggaaa taatgataaa gaaaaggaga 1740 gagatgeaga gaaagatcca aataaaaaag aaaaaggtga caaaaacaca aaaggtgaca 1800 aaggaaagga caaagttaaa ggaaagagag aatcagaaat caatggtgaa aaatcaaaag 1860 gctcgaaaag gcgaaggcaa atacaggaag gaagtacaac aaaaaagtgg aagagtaagg 1920 ataaattttt taaaggccca taagacaagt gattattatg attcccatac tccagataca 1980 aaccatatec cagccattgc ctaaacagat tacaattata aaatcccttt catcttcata 2040 tcacagtttc tgctcttcag aagtttcacc ctttttaatc tctcagccac aaacctcagt 2100 tccaatatrg ttataagtta agacgtatat gattccgtca agaaagactg gatactttct 2160 gaagtaaaac attttaatta aagaaaaaaa aa 2192 <2l0> 30 <211» 568 <212> PRT <213> Horno sap1ans <400» 30

Met Thr Val Leu cłu ile Thr Leu Ala val ile Leu Thr teu Leu Gly 15 10 15

Leu Ala Ile Leu Ala ile teu Leu Thr Arg Trp Ala Arg Arg Lys Gin 20 25 30

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Ser Leu

Glu Met Tyr 35

Ile ser Arg Tyr Ser Ser Glu Gin 40

Ser Ala 45 Tyr Gin

Arg His

Leu Lys

ASP 50

Tyr

Glu

ASp

Gly Arg 55

Gly

Ser Arg

His

Ala 60

val

Thr

Leu

His

Met

ile Thr

Glu

Arg Asp

Pro

Lys

Arg

ASP

Tyr

Thr

65

70

75

80

pro

ser

Thr

Asn

ser

Leu

Ala

Leu

Ser Arg

Ser

ser

ile

Ala

teu

pro

85

90

95

Gin

Gly

Ser

Met

Ser

ser

ile

Lys

Cys

Leu Gin Thr

Thr

Glu

Glu

pro

100

105

110

pro

ser

Arg

Thr

Ala Gly

Ala

Met

Met

Gin

Phe Thr

Ala

Leu

Phe

pro

115

120

125

Glu

Leu ISO

Gin

Asp

teu

Ser

ser 135

ser

Leu

tys

Lys

Pro 140

Leu

cys

tys

Leu

Gin

ASp

teu

Leu

Tyr

Asn

ile

Trp

Ile

Gin

cys

Gin

ile Ala

Ser

His

145

150

15 S

160

Thr

ile Thr

Gly

His

Leu

Gin

His

Pro

Arg

Ser

Pro

Met

Ala

Pro

Ile

165

170

175

Ile

Ile

Ser

Gin

Arg

Thr

Ala

ser

Gin

Leu

Ala

Ala

Pro

Ile

Arg

Ile

180

185

190

Pro

Gin

val

His

Thr

Met

Asp

Ser

Ser

Gly Lys

Ile

Thr

Leu

Thr

Pro

195

200

205

Va1

val 210

ll e

Lau

Thr

Gly Tyr 215

Met

Asp

Glu Glu

Leu 220

Arg

tys

Lys

Ser

cys

Ser

Lys

ile

Gin

Ile

Leu

tys

cys

Gly Gly

Thr Ala

Arg

Ser

Gin

225

230

235

240

ile

Ala

Glu

Lys

Lys

Thr

Arg

tys

Gin

Leu

Lys

Asn

Asp

Ile

Ile

Phe

245

250

255

Thr

Asn

ser

val

Glu

ser

teu

tys

Ser

Ala His

Ile

Lys

Glu

Pro

Glu

260

255

270

Arg

Glu

Gly 275

tys

Gly Thr

Asp

Leu 280

Glu

Lys

Asp

Lys

He 285

ciy

Met

Glu

val

tys

val

Asp

Ser Asp Ala Gly

Ile

Pro

Lys

Arg

Gin

Glu

Thr

Gin

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Leu Lys Ile Ser Glu Asp

Glu Tyr

Thr

Thr Arg 315

Thr

Gly

ser

Pro

Asn 320

305

310

Lys

Glu

Lys

cys

val 325

Arg

cys

Thr

Lys

Arg 330

Thr

Gly val

Gin

val 335

Lys

lys

Ser

Glu

ser

Gly val

pro

Lys

Gly

Gin

Glu

Ala Gin val

Thr

tys

340

345

350

ser

Gly

Leu

val

val

Leu

Lys

Gly

sin

Glu

Ala

Gin

Val

Glu

Lys

ser

355

360

365

Glu

Met 370

Gly

val

pro

Arg

Arg 375

Gin

GlU

Ser

Gin

Val 380

Lys

Lys

Ser

Gin

Ser

Gly

val

Ser

Lys

Gly

Gin

Glu

Ala

Gin

val

Lys

Lys

Arg

Glu

Ser

385

390

395

400

va!

val

Leu

tys

Gly

Gin

GlU

Ala

Gin

val

Glu

Lys

Ser

Glu

Leu

tys

405

410

415

val

Pro

Lys

Gly

Gin

Gl'J

Gly

Gin

Val

Glu

Lys

Thr

Glu

Ala

ASP

Val

420

425

430

Pro

Lys

Glu

Gin

Glu

Val

Gin

Glu

tys

Lys

ser

Glu

Ala

Gly

Va1

Leu

435

440

445

Lys

Gly

Pro

Glu

Ser

Gin

val

tys

Aśn

Thr

cłu

val

Ser

Val

Pro

Glu

450

4S5

460

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

val

Lys

Lys

Ser

Glu

ser

Gly

val

Leu

Lys

Gly

465

470

475

480

Gin

Glu

Ale

Gin

Glu 485

Lys

Lys

Glu

Ser

phe 490

GlU

Asp

Lys

Gly

Asn 495

Asn

ASp

Lys

Glu

Lys 500

Glu

Arg

Asp

Ala

Glu 505

Lys

Asp

Pro

Asn

Lys 510

Lys

Glu

Lys

Gly

Asp 515

Lys

Asn

Thr

Lys

Gly Asp 520

tys

Gly

Lys

Asp 525

Lys

Val

Lys

Gly

Lys

Arg

Glu

Ser

Glu

Ile

Asn Gly

Glu

Lys

Ser

tys

Gly

Ser

Lys

530

535

540

Arg

Arg

Arg

Gin

ile

Gin

Glu

Gly ser

Thr Thr

Lys

Lys Trp

Lys

Ser

54 5

550

555

560

Lys Asp

Lys

Phe

Phe

Lys

Gly

pro

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

<210»	31
<211»	1686
<212»	DNA
<213»	Homo sapiens
<400»	31

atgacagtct tggaaataac tttggctgtc atcctgactc tactgggact tgccatcctg 60 gctattttgt taacaagatg ggcacgatgt aagcaaagtg aaatgtatat ctccagatac 120 agttcagaac aaagtgctag acttctggac tatgaggatg gtagaggatc ccgacatgca ISO tattcaacac aaagtgacac ttcatatgat aaccgagaga gatccaaaag agattacaca 240 ccatcaacca actctctagc actgtctcga tcaagtattg ctttacctca aggatccatg 300 agtagtataa aatgtttaca aacaactgaa gaacctcctt ccagaactgc aggagccatg 360 atgcaattca cagcccctat tcecggagct acaggaccta tcaagctctc tcaaaaaacc 420 attgtgcaaa ctccaggacc tattgtacaa tatcctggat ccaatgctgg tccaccttca 480 gcaccccgcg gtccacccat ggcacccata ataatttcac agagaaccgc aagtcagetg 540 gcagcaccta taataatttc gcagagaact gcaagaatac ctcaagttca caetatggac 500 agttctggaa aaatcacact gactcctgtg gttatattaa caggttacat ggatgaagaa 660 cttgcaaaaa aatcttgttc csaaatccag attctaaaat gtggaggcac tgcaaggtct 720 cagaatagcc gagaagaaaa caaggaagca ctaaagaatg acatcatatt tacgaattct 780 gtagaatcct tgaaatcagc acacataaag gagccagaaa gagaaggaaa aggcactgat 840 ttagagaaag acaaaatagg aatggaggtc aaggtagaca gtgacgctgg aataccaaaa 000 agacaggaaa cccaactaaa aatcagtgag atgagtatac cacaaggaca gggagcccaa 960 ataaagaaaa gtgtgtcaga tgtaccaaga ggacaggagt cceaagtaaa gaagagtgag 2020 tcaggtgtcc caaaaggaca agaagcccaa gtaacgaaga gtgggttggt tgtactgaaa 1080 ggacaggaag cccaggtaga gaagagtgag atgggtgtgc caagaagaca ggaatcccaa 1140 gtaaagaaga gtcagtctgg tgtctcaaag ggacaggaag cccaggtaaa gaagagggag 1200 tcagttgtac tgaaaggaca ggaagcccag gtagagaaga gtgagttgaa ggtaccaaaa 1260 ggacaagaag gccaagtaga gaagactgag gcagatgtgc caaaggaaca agaggtccaa 1320 gaaaagaaga gtgaggcagg tgtactgaaa ggaccagaat cceaagtaaa gaacactgag 1380 gtgagtgtac cagaaacact ggaatcccaa gtaaagaaga gtgagtcagg tgtactaaaa 1440 ggacaggaag cccaagaaaa gaaggagagt tttgaggata aaggaaataa fgataaagaa 1500 ^Hggagagag atgcagagaa agatecaaat aaaaaagaaa aaggtgacaa aaacacaaaa 1560 ggtgacaaag gaaaggacaa agttaaagga aagagagaat cagaaatcaa tggtgaaaaa 1620 tcaaaaggct cgaaaagggc gaaggcaaat ataggaagga agtacaacaa aaaagtggaa 1680

PL 215 160 B1

1686

342-3PCT.ST25.txt

gagtaa
<21O>	32
<211>	1710
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens

<400> 32
atgacagtct	tggaaataac	tttggetgtc atcctgactc tactgggact	tgccatcctg	60
gctattttgt	taacaagatg	ggcacgacgt aagcaaagtg	aaatgcatat	ctccagatac	120
agttcagaac	aaagtgctag	acttctggae tatgaggatg	gtagaggatc	ccgacatgca	180
tattcaacac	aaagtgacac	ttcatgtgat	aaccgagaga	gatccaaaag	agattacaca	240
cmcaacca	actctctagc	actgtctcga	tcaagtattg	ctttacctca	aggatccatg	300
agtagtataa	aatgtttaca	aacaactgaa	gaacttcctt	ccagaactgc	aggagccatg	360
atgcaattca	cagcccctat	teccggagct	acaggaccta	tcaagctctc	tcaaaaaacc	420
attgtgcaaa	ctccaggacc	tattgtacaa	tatcctggac	ccaatgtcag	atcgcatcct	480
cacacaatca	ctggtccacc	ttcagcaccc	cgcggtccac	ccatggcacc	cataataatt	540
tcacagagaa	ccgcaagtca	gctggeagca	cctataataa	tttcgcagag	aactgcaaga	600
atacctcaag	ttcacactat	ggacagttct	ggaaaaacea	cactgactcc	tgtggttata	660
ttaacaggtt	acatggatga	agaacttgca	aaaaaatctt	gttccaaaat	ccagattcta	720
aaatgtggag	gcactgcaag	gtctcagaat	agccgagaag	aaaacaagga	agcactaaag	780
aatgacatea	tatttacgaa	ttctgtagaa	tcettgaaat	cagcacacat	aaaggagcca	840
gaaagagaag	gaaaaggcąc	tgatttagag	aaagacaaaa	taggaatgga	ggtcaaggta	900
gacagtgacg	ctggaatacc	aaaaagacag	gaaacccaac	taaaaatcag	tgagatgagt	960
ataccacaag	gacagggagc	ccaaataaag	aaaagtgtgt	cagatgtacc	aagaggacag	1020
gagtcceaag	taaagaagag	tgagtcaggt	gtcccaaaag	gacaagaagc	ccaagtaacg	1080
aagagtgggt	tggttgtact	gaaaggacag	gaagcccagg	tagagaagag	tgagatgggt	1140
gtgccaagaa	gacaggaatc	ccaagtaaag	aagagtcagt	ctggtgtctc	aaagggacag	1200
gaagcccagg	taaagaagag	ggagtcagtt	gtactgaaag	gacaggaagc	ccaggtagag	1260
aagagtgagt	tgaaggtacc	aaaaggaeaa	gaaggccaag	tagagaagac	tgaggcagat	1320
gtgecaaagg	aacaagaggt	ccaagaaaag	aagagtgagg	caggtgtact	gaaaggacca	1380
gaatcccaag	taaagaacac	tgaggtgagt	gtaccagaaa	cactggaatc	ccaagtaaag	1440
aagagtgagt	caggtgtact	aaaaggacag	gaagcccaag	a ta a sł na a rwa cLaaoyAnyycl	gagttttgag	1500
gataaaggaa	ataatgataa	agaaaaggag	agagatgcag	agaaagatcc	aaataaaaaa	1560
gaaaaaggtg	acaaaaacac	aaaaggtgac	aaaggaaagg		aggaaagaga	1620

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST2S.ttt gaatcagaaa tcaatggtga aaaatcaaaa ggctcgaaaa gggcgaaggc aaatacagga 1680 aggaagtaca acaaaaaagt ggaągagtaa 1710 <21C> 33 <2ll> 1655 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atgacagtct tggaaataac tttggctgtc atcctgactc tsctgggact tgccatccrg 60 gctattttgt taacaagatg gtfcaegatgt aagcaaagtg aaatgtatat ctccagatac 120 agttcagaac aaagtgctag acttctggac tatgaggatg gtagaggatc ccgacatgca 180 tattcaacac aaagtgagag atccaaaaga gattacacac catcaaceaa ctctctagca 240 ctgtctcgat caagtattgc rttacctcaa ggatccatga gtagtataaa atgtttacaa 300 acaactgaag aacctccttc cagaactgca ggagccatga tgcaattcac agcccctatt 360 cccggagcta caggacctat caagctctct caaaaaacca ttgtgcaaac tccaggacet 420 attgtacaat atcctggatc caatgctggt ccaccttcag caccccgcgg tccaccęatg 480 gcacccataa taatttcaca gagaaccgca agtcagctgg cagcacctat aataatttcg 540 cagagaactg caagaatacc tcaagttcac actatggaca gttetggaaa aatcacactg 600 actectgtgg ttatattaac aggttacatg gatgaagaac ttgcaaaaaa atcttgttcc 660 aaaatccaga ttctaaaatg tggaggcact gcaaggtctc agaatagccg agaagaaaac 720 aaggaagcac taaagaatga eatcatattt acgaattctg tagaatcctt gaaatcagca 780 cacataaagg agccagaaag agaaggaaaa ggcactgatt tagagaaaga caaaatagga 840 atggaggtca aggtagacag tgacgctgga ataccaaaaa gacaggaaac ccaactaaaa 900 atcagtgaga tgagtatacc acaaggacaę ggagcccaaa taaagaaaag tgtgtcagat 960 gtaccaagag gacaggagtc ccaagtaaag aagagtgagt caggtgtccc aaaaggacaa 1020 gaagcccaag taacgaagag tgggttggtt gtaetgaaag gacaggaagc ccaggtagag 1080 aagagtgaga tgggtgtgcc aagaagacag gaatcccaag taaagaagag tcagtctggt 1140 gtctcaaagg gacaggaagc ccaggtaaag aagagggagt cagttgtact gaaaggacag 1200 gaagcccagg tagagaagag tgagttgaag gtaccaaaag gacaagaagg ccaagtagag 1260 aagactgagg cagatgtgcc aaaggaacaa gaggtccaag aaaagaagag tgaggcaggc 1320 gtaetgaaag gaccagaatc ccaagtaaag aacactgagg tgagtgtacc agaaacactg 1380 gaatcccaag taaagaagag tgagtcaggt gtactaaaag gacaggaagc ctaagaaaag 1440 aaggagagtt ttgaggataa aggaaataat gataaagaaa aggagagaga tgcagagaaa 1500 gatccaaata aaaaagaaaa aggtgacaaa aacacaaaag gtgacaaagg aaaggacaaa 1560

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt grtaaaggas agagagaatc agaaatcaat ggtgaaaaat caaaaggctc gaaaagggcg aaggcaaata caggaaggaa gtacaacaaa aaagtggaag aotaa

1620

1665

<21G>	34
<211»	561
<212>	PRT
<213»	Hooo sapiens

<400» '34

Met

Thr

va1

Leu

Glu

ile

Thr

teu

Ala

Va1

He

Leu

Thr

Leu

Leu

Gly

1

5

20

15

Leu

Ala

ile

Leu

Ala

ile

Leu

Leu

Thr

Arg

Trp

Ala

Arg

cys

tys

Gin

20

25

30

ser

Siu

Met

Tyr

ile

Ser

Arg

Tyr

ser

ser

Glu

Gin

ser

Ala

Arg

Leu

35

40

45

Leu

ASp 50

Tyr

Glu

Asp

siy

Arg 55

Gly

ser

Arg

His

Ala 60

Tyr

Ser

Thr

Gin

Sar 65

ASp

Thr

Ser

Tyr

ASp 70

Asn

Arg

Glu

Arg

Ser 75

tys

Arg

Asp

Tyr

Thr 80

pro

ser

Thr

ASn

Ser

Leu

Ala

Leu

Ser

Arg

ser

Ser

ile

Ala

Leu

Pro

85

90

95

Gin

Gly

Ser

Met

Ser

Ser

Ile

tys

Cys

Leu

Gir*

Thr

Thr

Glu

Glu

Pro

100

105

110

Pro Ser Arg Thr Ala Gly Ala Met Met Gin Phe Thr Ala pro Ile Pro 115 120 125

Gly Ala Thr Gly Pro ile Lys Leu ser Gin Lys Thr ile val Gin Thr 130 135 140

Pro Gly Pro lle.va1 Gin Tyr Pro Gly ser Asn Ala Gly Pro Pro Ser 145 150 155 160

Ala Pro Arg Gly Pro Pro Met Ala Pro ile Ile ile ser Gin Arg Thr 165 170 175

Ala ser Gin teu Ala Ala Pro ile Ile ile ser Gin Arg Thr Ala Arg 180 185 190 ile Pro Gin va1 His Thr Met Asp ser ser Gly Lys ile Thr Leu Thr 195 200 205

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Pro

Va1 Val Ile Leu Thr Glv

Tyr Met Asp Glu

Glu Leu Ala 220

Lys

Lys

210

21S

Ser

cys

Ser

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Lys

cys

Gly Gly

Thr

Ala

Arg

Ser

225

230

235

240

Gin

Asn

ser

Arg

Glu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Asn

ASP

II s

Ile

245

250

255

Phe

Thr

Asn

Ser

val

GlU

Ser

Leu

Lys

Ser

Ala

His

ile

Lys

Glu

Pro

260

265

270

GlU

Arg

Glu

Gly

Lys

Gly

Thr

Asp

Leu

Glu

Lys

Asp

Lys

Ile

Gly

Met

275

280

285

Glu

val 290

Lys

Val

Asp

ser

Asp 295

Ala

Gly

ile

pro

Lys Arg 300

Gin

Glu

Thr

Gin

Leu

Lys

ile

ser

GlU

Met

Ser

ile

Pro

Gin

Gly

Gin

Gly

Ala

Gin

305

310

315

320

ile

Lys

tys

ser

val 325

Ser

ASp

Val

Pro

Arg 330

Gly

Gin

Glu

Ser

Gin 335

Val

Lys

Lys

ser

Glu

ser

Gly

val

Pro

Lys

Gly

Gin

Glu

Ala

Gin

val

Thr

340

345

350

Lys

ser

Gly

Leu

Val

Val

Leu

Lys

sly

Gin

Glu

Ala

Gin

val

Glu

Lys

355

360

365

Ser

Glu

Met

Gly

Val

Pro

Arg

Arg

Gin

Glu

Ser

Gin

val

Lys

Lys

ser

370

375

380

Gin

Ser

Gly val

ser

Lys

Gly

Gin

Glu Ala

Gin

Val

tys

Lys

Arg

Glu

385

390

395

400

Ser

Val

Val

Leu

Lys

Gly

Gin

Glu

Ala

Gin

val

Glu

Lys

ser

Glu

Leu

405

410

415

Lys

Val

Pro

Lys

Gly

Gin

Glu

Gly

Gin

Val

GlU

Lys

Thr

Glu

Ala

Asp

420

425

430

val

Pro

Lys

Siu

Gin

Glu

Val

Gin

Glu

Lys

Lys

ser

Glu

Ala

Gly val

435

440

445

Leu

Lys

Gly

Pro

Glu

Ser

Gin

Val

Lys

Asn

Thr

Glu

Val

ser

val

pro

450

455

460

Glu

Thr

Leu

Glu

ser

Gin

val

Lys

Lys

Ser

Glu

Ser

Gly

Va1

Leu

Lys

465

470

475

480

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Gly

Gin

Glu

Ala

Gin

Glu

Lys

Lys

Glu

ser

Phe

Glu

Asp

Lys

Gly

Asn

4S5

490

495

Asm

Asp

tys

Glu 500

Lys

Glu

Arg

Asp

Ala 505

GlU

Lys

ASp

pro

Asn 510

Lys

Lys

Glu

Lys

Gly 515

Asp

Lys

Asn

Thr

Lys 520

Gly

Asp

tys

Gly

Lys 525

ASP

Lys

val

Lys

Gly

Lys

Arg

Glu

Ser

Glu

Ile

Asn

Gly

Glu

Lys

Ser

Lys

Gly

Ser

530

535

540

Lys

Arg

Ala

Lys

Ala

Asn

Thr

Gly

Arg

Lys

Tyr

Asn

Lys

Lys

val

Glu

545

550

555

560

Glu <210> 35

<211>

569

<212> l

PRT

<213> 1

Homo

sapiens

<4oo> :

35

Met

Thr

val

Leu

Glu

ile

Thr

Leu

Ala

val

Ile

Leu

Thr

Leu

Leu

Gly

1

5

10

15

Leu

Ala

Sie

Leu

Ala

ile

Leu

Leu

Thr

Arg

Trp

Ala

Arg

Arg

tys

Gin

20

25

30

Ser

Glu

Met

His

ile

Ser

Arg

Tyr

ser

Ser

Glu

Gin

Ser

Ala

Arg

Leu

35

40

45

Leu

Asp 50

Tyr

Glu

ASp

Gly

Arg 55

Gly

Ser

Arg

His

Ala 60

Yyp

Ser

Thr

Gin

Ser

Asp

Thr

Ser

Cys

Asp

Asn

Arg

Glu

Arg

ser

Lys

Arg

Asp

Tyr

Thr

65

70

75

SO

Pro

ser

Thr

Asn

Ser

Leu

Ala

Leu

Ser

Arg

Ser

Ssr

ile

Ala

Leu

Pro

85

90

95

Gin

Gly

Ser

Met

ser

ser

Ile

L'/S

cys

teu

Gin

Thr

Thr

Glu

Glu

Leu

100

105

HO

Pro

Ser

Arg

Thr

Al a

eiy

Ala

Met

Met

Gin

Phe

Thr

Ala

Pro

Ile

Pro

115

120

125

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25,tXt,

Gl y

Ala

Thr

Gly

Pro

Ile

Lys

Leu

Ser

Gin

Lys

Thr

ile

val

Gin

Thr

130

135

140

Pro

Gly

Pro

.Ile

Val

Gin

Tyr

Pro

Gly

pro

Asn

Val

Arg

ser

His

Pro

145

150

155

160

His

Thr

ile

Thr

Gly

Pro

Pro

ser

Ala

Pro

Arg

Gly

Pro

Pro

Met

Ala

165

170

175

Pro

ile

Ile

Ile

Gin

Arg

Thr

Ala

Ser

Gin

Leu

Ala

Ala

Pro

Ile

180

185

190

ile

ile

ser

Gin

Arg

Thr

Ala

Arg

He

pro

Gin

val

His

Thr

Met

ASP

195

200

205

ser

Ser

Gly

Lys

Thr

Thr

Leu

Thr

Pro

val

val

Ile

Leu

Thr

Gly

Tyr

210

215

220

Met

ASP

Glu

Glu

Leu

Ala

Lys

Lys

Ser

Cys

Ser

tys

Ile

Gin

ile

Leu

22Ξ

230

235

240

Lys

cys

Gly

Gly

Thr

Ala

Arg

Ser

Gin

Asn

ser

Arg

Glu

Glu

Asn

Lys

245

250

255

GlU

Ala

Leu

Lys

ASF1

ASP

ile

Ile

Phe

Thr

Asn

Ser

val

Glu

ser

Leu

260 265 270

Lys ser Ala His ile Lys Glu Pro Glu Arg Glu Gly Lys Gly Thr Asp 275 280 285

Leu

Glu Lys 290

Asp

Lys ile

Gly Met 295

Glu

Val

Lys val 300

ASp

Ser

ASp

Ala

Gly

Ile

Pro

tys

Arg

Gin

GlU

Thr

Gin

Leu

Lys

ile

Ser

clu

Met

Ser

305

310

315

320

Ile

pro

Gin

Gly Gin

Gly Ala Gin

ile

Lys

Lys

ser

val

Ser

Asp

Val

3 zS

330

335

Pro

Arg

Gly

Gin

Glu

Sar

Gin

val

Lys

tys

ser

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

340

345

350

Lys

Gly

Gin

Glu

Ala

Gin

val

Lys

ser

Gly

Leu

Val

val

Leu

Lys

355

360

365

Gly Gin 370

Glu

Ala

Gin

val

Glu 375

Lys

Sar

Glu

Met

Gly 380

val

Pro

Arg

Arg

Gin Glu

Ser

Gin

val

Lys

Lys

Ser

Sin

ser

Gly

val

Ser

Lys

Gly

Gin

385

390

395

400

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Glu

Ala

Gin Val Lys Lys 405

Arg Glu

ser

Val Val Leu Lys Gly Gin Glu

410

415

Ala

Gin

Val

Glu

Lys

Ser

Siu

Leu

Lys

val

pro

Lys

Gly

Gin

Glu

Gly

420

425

430

Gin

val

Glu

Lys

Thr

Glu

Ala

Asp

val

Pro

Lys

Glu

Gin

GlU

Val

Gin

435

440

445

Glu

Lys

Lys

ser

Glu

Ala

Gly

val

Leu

Lys

Gly

Pro

Glu

ser

Gin

val

450

455

460

Lys

Asn

Thr

Glu Va1

Ser

val

Pro

Glu

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

val

Lys

465

470

475

480

Lys

ser

Glu

Ser

Gly

Va1

Leu

Lys

Gly

Gin

Glu

Ala Gin

Glu

Lys

Lys

485

490

495

Glu

Ser

Phe

Glu

Asp

Lys

Gly

Asn

Asn

Asp

tys

Glu

Lys

Gil

Arg

Asp

500

505

510

Ala

Glu

Lys

Asp

Pro

Asn

Lys

Lys

Glu

Lys

Gly

Asp

Lys

Asn

Thr

tys

515

520

525

Gly

Asp

Lys

Gly

Lys Asp

Lvs

val

Lys

Gly

lys

Arg

Glu

Ser

Glu

ile

530

535

540

Asn

Gly

Glu

Lys

Ser

tys

Gly

Ser

Lys

Arg

Ala

Lys

Ala

Asn

Thr

Gly

545

550

555

560

Arg

Lys

Tyr

Asn

Lys

Lys

Val

Glu

Glu

565

<210> 36 <2łl> 554 <212> PRT

<213> Homo sapiens
<400> 36
Met Thr va1 1	Leu Glu 5	ile	Thr	Leu	Ala	Val ile 10	Leu	Thr	Leu	Leu 15	Gly
Leu Ala Ile	Leu Ala 20	Ile	Leu	Leu	Thr 25	Arg Trp	Ala	Arg	cys 30	Lys	Gin
ser Glu Met 35	Tyr Ile	Ser	Arg	Tyr 40	ser	Ser Glu	Gin	ser AS	Ala	Arg	Leu

PL 215 160 B1

342~3PCT.5T2S.tXt

Leu

Asp Tyr 50

Glu

Asp

Gly

Arg Gly ser Arg His 55

Ala 60

Tyr ser Thr Gin

Ser

GlU

Arg

Ser

Lys

Arg

Asp Tyr.

Thr

Pro

Ser

Thr

Asn

ser

Leu.

Ala

65

70

75

80

leu

Ser

Arg

ser

ser

Ile

Ala

Leu

Pro

Gin

Gly

ser

Met

Ser

Ser

ile

85

90

95

Lys

cys

Leo

Gin

Thr

Thr

Glu

Glu

pro

pro

ser

Arg

Thr

Ala Gly Ala

100

105

110

Met

Met

Gin

phe

Thr

Ala

pro

Ile

pro

Gly

Ala

Thr

Gly

pro

Ile

Lys

115

120

125

Leu

Ser

Gin

tys

Thr

ile Val

Gin Thr

Pro

dy

pro

ile

val

Glfi

Tyr

130

135

140

Pro

Gly

Ser

Asn

Ala

Gly

pro

Pro

Ser

Ala

Pro

Arg

Gly

Pro

pro

Met

145

150

155

160

Ala

Pro

ile

Ile

ile

ser

sin

Arg

Thr

Ala

Ser

Gin

Leu

Ala

Ala

Pro

155

170

175

Ile

Ile

Ile

ser 180

Gin

Arg

Thr

Ala

Arg 185

Ile

Pro

Gin

val

His 190

Thr

Met

Asp

Ser

Ser

Gly

Lys

ile

Thr

Leu

Thr

Pro

va1

val

ile

Leu

Thr Gly

195

200

205

Tyr. Met

Asp

Glu

Glu

Leu

Ala

Lys

Lys

Ser

cys

ser

Lys

ile

Gin

ile

210

215

220

Leu

Lys

Cys

Gly Gly

Thr

Ala

Arg

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

Glu

Gl.U

Asn

225

230

235

240

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Α5Π

ASp

Ile

ile

Phe

Thr

Asn

ser

Val

Glu

ser

245

250

255

teu

Lys

Ser

Al a 260

HlS

Ile

tys

GlU

pro 265

Glu

Arg

Glu

Gly

Lys Gly 270

Thr

ASp

Leu

Glu

Lys

ASp

Lys

Ile Gly

Met

Glu

val

Lys

va1

ASp

ser

Asp

275

280

285

Ala

Gly

Ile

Pro

tys

Arg

Gin

Glu

Thr

Gin

Leu

Lys

Ile

ser

Glu

Met

295

300

Ser

ile

Pro

Gin

Gly

Gin

Gly

Ala

Gin

Ile

Lys

Lys

ser

val

Ser

ASP

305

310

315

320

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

val

Pro

Arg

Gly

Gin 325

Glu

ser

Gin

val

tys 330

Lys

Ser

Glu

Ser

Gly 335

Val

ΡΓΟ

Lys

Gly

Gin 340

Glu

Ala

Gin

val

Thr 345

tys

Ser

Gly

Leu

Val 350

Val

ueu

Lys

Gly

Gin

Glu

Ala

Gin

val

Glu

Lys

ser

Glu

Met

Gly

Val

Pro

Arg

355

360

365

Arg

Gin

Glu

ser

Gin

Val

Lys

tys

ser

Gin

Ser

Gly

val

Ser

Lys

Gly

370

375

380

Gin

Glu

Ala

Gin

Val

Lys

Lys

Arg

Glu

Ser

Va1

Val

Leu

Lys

Gly

Gin

385

390

395

400

GlU

Ala

Gin

Val

Glu

Lys

Ser

GlU

Leu

Lys

Val

Pro

Lys

Gly

Gin

Glu

405

410

415

Gly

Gin

Val

Glu

Lys

Thr

Glu

Ala

Asp

val

Pro

Lys

Glu

Gin

Glu

val

420

425

430

Gin

Glu

Lys 435

Lys

ser

Glu

Ala

Gly 440

Val

Leu

Lys

Gly

Pro 445

GlU

Ser

Gin

Val

Lys

Asn

Thr

Glu

val

ser

va1

Pro

Glu

Thr

Leu

Glu

Ser

Gin

Val

450

455

460

Lys

Lys

ser

Glu

ser

Gly

val

Leu

Lys

Gly

Gin

Glu

Ala

Gin

Glu

Lys

465

470

475

480

Lys

Glu

ser

phe

Glu

Asp

Lys

Gly

Asn

Asn

Asp

Lys

Glu

Lys

Glu

Arg

485

490

495

Asp

Ala

Glu

Lys 500

ASp

Pro

Asn

Lys

Lys 505

Glu

Lys

Gly

Asp

Lys 510

Asn

Thr

Lys

Gly

Asp 515

Lys

dy

tys

Asp

Lys 520

val

Lys

Gly

tys

Arg 525

Gl U

Ser

Glu

Ile

Asn

Gly

Glu

Lys

Ser

Lys

Gly

Ser

Lys

Arg

Ala

Lys

Ala

Asn

Thr

530

535

540

Gly

Arg

Lys

yyp

Asn

tys

Lys

val

GlU

Glu

545 550 <21Q> 37 <211> 1182 <212> DNA

PL 215 160 B1 <213» Homo sapiens

342-3PCT.ST25.txt <400> 37 acacaggttg atgtcatcca ccaggcagcc caagctcagg agcagtcaac atgaacttta cacattggtt tttgcctcta tctggctctc ctgggaatga gatatgtgca atttcagcca cattttgcca tatgaaagca tcagctaatg aactacttgc ttaaaaactg tcactgtctc tgaaaaatga cttaataaaa <210» 38 <211» 267 <212» PRT <213» Homo sapiens gagcagagaa agccaacaag ttatggctcc gtgctcagcg cgggtcaagg aagaagaagc ttggaattgt ctgctgttat tctctgtgtc acattgttag tcaatggggt cgctgatgat accaagcaaa accctgtgac cccctaaata aaaaacttet tgtttgagat ttcctacatt ttctgcaact tgtcattaga agaggaaaca ccatgctgaa tggatttcaa tgctcagccc aaatatacaa aaaggcacta rttgtgttta tggtggatac agcatccaag ttctatcttg agctggccaa cttctccctc caccacaacc accagcgtct gtaaaagaaa taagaagatg ttgtttttag accactacta ctcttaaagt aacaaaaaaa tagaggtgcc gtaaatgaaa cagcctctgg tacggcatca atgataaatc ggggtgatcc atatccttct ccattctggg gagctttccc gccttcattg gactactggg ttggagttct aatatgtctg tcttcagctc aaggggtatc tcttttattg gttggtcgct catgctggca tagaaatgtt aaaaaaaaaa aaaggaacaa ccatacccaa gttcaatcaa catctccggg caagtgtggg agatcatggt cttttagaga gtggcctttc gttgtctggt gagtgattct ccgtgctttc tcgtagcttg tcctggttat ctcccagatg agtctaatrt tctacaatga aatgatggct aaggtgaagg tctgttcata aa

agacataatg	60
cccttaccca	120
cttagaaaac	180
aatctttgct	240
aacagcagta	300
tggattgatg	360
agtattaggt	420
ttttattatc	480
gaaaggcagc	540
gctgctggtg	600
tggaaaaggc	660
tgccacagcc	720
tccaaatatg	780
caacaactac	840
catggagaaa	900
tttctagtct	960
gtatctccct	1020
atcagaggac	1080
ttactttttc	1140
	1182

<400» 38

Met

Met

ser

Ser

Lys

Pro

Thr

ser

His

Ala

Glu

Vai

Asn

Glu

Thr

ile

1

5

10

15

Pro

Asn

Pro

3r

Pro

Pro

Gly

ser

Phe 25

Met

Ala

Pro

Gly

Phe 30

Gin

Gin

Pro

Leu

Gly

Ser

Ile

Asn

Leu

Glu

Asn

Gin

Ala

Gin

Gly

Ala

Gin

Arg

35

40

45

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Ala Gin Pro 50

Tyr Gly

Ile

Thr ser pro 55

Gly

Π e

phe 60

Ala

Ser

ser

Gin

Pro

Gly Gin

Gly

Asn

Ile

Gin

Met

ile

Asn

Pro

Ser

Va1

Gly Thr

Ala

65

70

75

80

Val

wet

Asn

Phe

Lys

Glu

Glu

Ala

Lys

Ala

Leu

Gly

val

ile

Gin

ile

85

90

95

Met

Val

Gly

Leu

Met

His

Ile

Gly Phe Gly

Ile

Val

Leu

cys

Leu

Ile

100

105

no

ser

Phe

Ser

Phe

Arg

Glu

val

Leu

Gly

phe

Ala

Ser. Thr

Ala Val

ile

115

120

125

Gly

Gly Tyr

pro

Phe

Trp

Gly Gly

Leu

Ser

Phe

Ile

ile

ser Gly

ser

130

135

140

Leu

Ser

val

ser

Ala

ser

Lys

Glu

Leu

Sar

Arg

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

145

150

155

160

Ser

Leu

Gly

Met

Asn

ile

val

ser

ser

ile

Leu

Ala

Phe

ile Gly

Val

165

170

175

Ile

Leu

Leu

Leu

val

Asp

Met

cys

Ile

Asn

Gly

Vał

Ala

Gly

Gin

Asp

ISO

185

190

Tyr

Trp

Ala

val

Leu

Ser

Gly

tys

Gly

Ile

Ser

Ala

Thr

Leu

Met

Ile

195

200

205

Phe

ser

Leu

Leu

Glu

Phe

Phe

val

Ala

Cys

Ala

Thr

Ala

His

Phe

Ala

210

215

220

Asn

Gin

Ala

Asn

Thr

Thr

Thr

Asn

Met

Ser

val

Leu

val

Ile

pro

Asn

225

230

235

240

Met

Tyr

Glu

Ser

Asn

pro

val

Thr

pro

Ala

Ser

ser

Ser

Ala

Pro

Pro

245

250

255

Arg

cys

Asn

Asn ncn

Tyr

ser

Ala

Asn

Ala SIC

Pro

Lys

260 265

<210	39
<211>	1948
<212>	DMA
<213>	Homo

saoiens

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt <400> 39 gcacgaggtt ttgaggacca gcaacacagc aatacttcca gatctccata taacctctgt 60 tcatttggga ggggctttgt attttcaaca ggagagttca aagttcattt ttttttcagc 120 aactacagtt ctaagtgaaa tctattttta ttgatacatg gtattttaca tgtttatggg 180 atacatatga gtcataatct attttaaata ataccttagt gttgtaaaat caacagtget 240 ttttaaaaga aatatacctt gttaattatc ccacatgtgt ctccagaagt acagcttgaa 300 caaatccacc ttctgtggac caagcaccac cctgggcatt tctagcatga gcaaaatcca 360 aggtcctggc tggactccag agatgctatt tacctcagaa gcatgacaat aggaggcaga 420 aggagcaggc aaatccaagt cctttcttgt agtttccttg tttggggagg aaaagttgag 480 ttttactatt atggaaaaga aacaggaaat agagacagac aaagagatat gacaatacąg 540 tcctgccacc cagatactca tttecaccta ccattccatg catttgtttt gaatatataa 600 gtatgtacat aaaggtaggt actctcaagt ccatcagggc ttggctgtcc actgtttttg 660 aagttccaga atgtttttgc taagttgagg aaataccaaa tcaggactat gaaaattatg 720 gtatatattg atgtgtcaca gaacacagat gtgacataat aaagatgtgt aagattatat 780 atataacttg tgtgtacacc tacctcatct ggggataaca cctcaagttt aattttgagg 840 cttgggtcaa tcgtgcttcc cttccctttc ataggtcctc tatgagatat tgtcatagat 900 tccatgttat gcaatagcca tagaatatga catctctcts tgataattct atattaettt 960 aattgctgca cagaagttca ttgtatgtaa gtgccacagt atattataga tcrtcttgtg 1020 ggacatctat ttctagttta tgtgatagta tagcactttc atgaatgttc ttgtacttga 1080 tetttacaca rtttcttttt tccrtaggat gaattctgag agatgtaatt gatggggcaa 1140 aatgtactca ctgtttgagg tttgaaattt ttccatcaaa agctggtact cttggttttt 1200 taagacaaag agcaaatcct cccctgccag gattgacttt tggctctttt ttttcaaacc 1260 tcactgcttt rtggtttagt tgtcataaaa tgccaagcac catgaacagg gctccatgaa 1320 ggggctcaga ggtaggaggg ctgtgattag gagaaggctt ggactgatgg gcaatttgag 1380 tgctcagaat tagagtgagg gggtgggggt gctgcaggga cagatgctgg ggaaagacac 1440 cctgaagggc aaagggagca acaatggctg cagtacatgt ggcctttcag ctagcgcaga 1500 ggatggaaac cagagtgggc tgatgattgg atgccaggcc tgagccagca actgtgatcc 15 SO tgagctgtgc acacttccgg ttgggattat ttctggtttc tacttcctgt ttgaagatgt 1620 ggcatggaga gtgctctgct ttgacctgaa gtattttatc tatcetcagt ctcaggacac 1680 tgttgatgga attaaggcca agcacatctg caaaaaagac attgrtggag gaggtgcaaa 1740 gagetggaaa ccaagtctcc agtcctggga aaagcagtgg tatggaaaag caatggaaag 1800 agcattttga aaatgccatt ccactgtttt ctggccttta tgatttctgc tgagaaatcc 1860 actgttagtc tgatggggtc tcctteatag caccaatgac ctgaagagcc ttgttgaagg 1920 aagaetecat ctgatgactc agagcaag 1948

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST23.txt <210» 40 <212> 1406 <212> DNA <213> Homo sapians <400» 40 cggtgagagg ggcgcgcagc agcagctcct caacgccgca acgcgccggc ccaactgcag 60 gaaggtctgt gctctggagc cagggtaaat ggttataaaa ttatacacca tggcectcct 120 asagacactc taggaaaacc atgtcatcct gatcttaaaa cacctgcaag aaagagcaca 180 gtacttcacc attaataaag tagatatttc ateetgetea gaaaaccaac atttccagca 240 atggctttac taccggtgtt gtttctggtt actgtgctgc ttccatcttt acctgcagaa 300 ggaaaggatc ccgcttttac tgctttgtta accacccagt tgcaagtgca aagggagatt 360 gtaaataaac acaatgaact aaggaaagca gtctctccac ctgccagtaa catgttaaag 420 atggaatgga gcagagaggt aacaacgaat gcccaaaggt gggcaaacaa gtgcacttta 480 caacatagtg atccagagga ccgcaaaacc agtacaagat gtggtgagaa tctctatatg 540 tcaagtgacc ctacttcctg gtcttctgca atccaaagct ggtatgacga gatcctagat 600 tttgtctatg gtgtaggacc aaagagtccc aatgcagttg ttggacatta tactcagctt 660 gtttggtact cgacttacca ggtaggctgt ggaattgcct actgtcccaa t^^+agt 720 ctaaaatact actatgtttg ccaatattgt cctgctggta ataatatgaa tagaaagaat 780 aceecgtacc aacaaggaać actttgtgcc ggttgecetg atgactgtga caaaggacta 840 tgcaccaata gttgecagta tcaagatctc ctaagtaact gtgattcttt gaagaataca 900 gctggctgtg aacatgagtt actcaaggaa aagtgcaagg ctacttgcct atgtgagaac 960 aaaatttact gatttaccta gtgageattg tgcaagactg catggataag ggctgcatca 1020 tttaattgcg acataccagt ggaaattgta tgtatgttag tgacaaattt gatttcaaag 1080 agcaatgcat cttctccccc agatcatcac agaaatcact ttcaggcaat gatttacaaa 1140 agtagcatag tagatgatga caactgtgaa ctctgacata aatttagtgc tttataacga 1200 actgaatcag gttgaggatt ttgaaaactg tataaccata ggatttaggt cactaggaet 1260 ttggatcaaa atggtgcart acgtatttcc tgaaacatgc taaagaagaa gactgtaaca 1320 tcattgccat tcctactacc tgagttttta cttgcataaa caataaattc aaagctttac 1380 atctgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1406 <210» 41 <211» 243 <212» PRT <213» Homo sapiens

PL 215 160 B1

342-

3 PCT

»ST2

5.tx

t

<40C

l> 41

Met

Ala

Leu

Leu

Pro

val

Leu

Phe

Leu

val

Thr

val

Leu

Leu

Pro

ser

1

5

10

15

Leu

Pro

Ala

Glu

Gly

Lys

Asp

pro

Ala

Phe

Thr

Ala

Leu

Leu

Thr

Thr

20

25

30

Gin

Leu

Gin

val

Gin

Arg

Glu

Ile

val

Asn

Lys

His

Asn

Glu

Leu

Arg

35

40

45

Lys

Ala

val

Ser

pro

Pro

Ala

5er

Asn

Mat

Leu

tys

Met

GlU

Trp

Ser

50

55

60

Arg

Glu

val

Thr

Thr

Asn

Ala

Gin

Arg

Trp

Ala

Asn

Lys

cys

Thr

Leu

65y

70

75

80

Gin

His

Ser

Asp

Pro

GlU

Asp

Arg

Lys

Thr

Ser

Thr

Arg

cys

Gly

Glu

85

90

95

Asn

Leu

Tyr

Met

ser

ser

ASP

Pro

Thr

ser

Trp

Ser

Ser

Ala

Ile

Gin

100

105

110

ser

Trp

Tyr 115

Asp

Glu

ile

Leu

ASp 120

Phe

Va1

Tyr

Gly

val 125

Gly

Pro

tys

ser

pro

Asn

Ala

Va1

val

Gly

His

Tyr

Thr

Gin

Leu

val

Trp

Tyr

ser

130

135

140

Thr

Tyr

Gin

val

Gly

cys

Gly

ile

Ala

Tyr

cys

Pro

Asn

Gin

ASP

Ser

145

150

155

160

Leu

Lys

Tyr

Tyr

Tyr

val

cys

Gin

Tyr

cys

Pro

Ala

Gly

Asn

Asn

Met

165

170

175

ASO

Arg

Lys

Asn

Thr

Pro

Tyr

Gin

Gin

Gly

Thr

Pro

cys

Ala

Gly

cys

180

185

ISO

pro

ASp

ASP

cys

ASp

Lys

Gly

Leu

Cys

Thr

Asn

Ser

cys

Gin

Tyr

Gin

195

200

205

Asp

Leu 210

Leu

ser

Asn

cys

Asp 215

Ser

Leu

Lys

Asn

Thr 220

Ala

Gly

cys

Glu

His

Glu

Leu

Leu

Lys

Glu

Lys

cys

Lys

Ala

Thr

cys

Leu

cys

Glu

Asn

225

230

235

240

Lys ile Tyr

PL 215 160 B1

<210>	42
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<400> 42 tctagcactg tctcgatcaa g
<210>	43
<2H>	21
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<400> 43 tgtcctcttg gtacatefia c
<210>	44
<21ł>	21
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<400> 44 ctgtgtcagc atccaaggag e
<210>	.45
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<400> 45 ttcacctttg ccagcatgta g

342-3PCT.ST25.txt <210> 46 <213> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <400> 46 cttgctctga gtcatcagat g

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

<210» 47
<211»	21
<212»	DNA
<213»	Sztuczna sekwencja
<400» 47 cacagaatat gagccataca g
<210>	48
<211»	22
<212»	DNA
<213»	Sztuczna sekwencja
<400» 48 ggtgtcactt ctgtgccttc ct
<210»	49
<211»	21
<212»	DNA
<213»	Sztuczna sekwencja
<400» 49 cggcaccagt tccaacaata g
<210>	50
<211»	18
<212»	DNA
<213»	Sztuczna sekwencje
<400» 50 caaaggttct ccaaatgt
<210»	51
<211»	21
<212»	DNA
<213»	Sztuczna sekwencje

PL 215 160 B1 <400» 51 tagcgcctca actgtcgttg g <210» 52 <211> 23 <212» DNA <213» huczna sekwencja

342-3PCT.ST25.txt <400» 52 cgtgagcgct tcgagatgtt ccg

<210»	53
<211»	23
<212»	DNA
<213»	Sztuczne sekwencja
<400»	53

cccaaccagc tgcccaactg tag

<210»	54
<211»	1550
<212»	DNA
<213»	Homo sapiens
<400»	54

atgaatgaaa gacagtccac ccacacacaa gcacgacttt attaagaaaa ctggtcttac tatattcctt gttettcttc ttagatactg attaagttgc attctgttaa aggcgggttt tacgttacag gtcctgatcc agacaagtga gtgaatttaa ccaagtttga ttgtgcattc tggatgtcac tggagtatcg gagtatttgt ccattattgt ttaggaatat gaatttttca cagaaaacaa aacgtattat gactgacctg atttaaagga aggagcagcc agttgaagat aattgtatca tctcatcctt ttctatttct agaaaggaga gattcttctg tcccagatgg tctgtttcat aaggcgatac tgctatgtca gcgggagtca gcaaccgagg cgggtgtcac gctgaaaatg tcctttgcat gccgacctaa ctagctattg eagcagtatt ctggttgatg acacatttac caaaaaagac acaagggatg tttccatctt tcattgagct aggcacctgc ctatcagtga ttgcttcata ttggactatt ttttcactga ccttattttt tttctgactt tcgtttacat ttegacttct aacttgaaaa gatttgacct ctggaaggca cggccccaat gaaagaaagc aagtgtgtta tgacagcaag tggagttttc cagcaaactt tctcatggat atttaacatt tttttttgac acgacttatt gctgataaga agacctcact gtctttctat

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

PL 215 160 B1

342-3PC7.ST25.txt agaaatccaa tcaaggaagt tgtgcggttt ctagataaga aacaccgaaa ccactatcga 840 gtctacaatc tatgcagtga aagagcttac gatcctaagc acttccataa tagggtcgtt 900 agaatcatga ttgatgatca taatgtcccc actctacatc agatggtggt tttcaccaag 960 gaagtaaatg agtggatggc tcaagatctt gaaaacatcg tagcgattca ctgtaaagga 1020 ggcacagata gaacaggaac tatggtttgt gccttcctta ttgcctctga aatatgttca 1080 actgcaaagg aaagcctgta ttattttgga gaaaggcgaa cagataaaac ccacagcgaa 1140 aaatrtcagg gagtagaaac tccttctcag gttatgtacg tgatętaaaa atccaaatag 1200 aaatggagaa aaaggttgtc ttttccacta tttcattagg aaaatgttcg gtacttgata 1260 acattacaac agacaaaata tt .tattgatg tattcgacgg tccacctctg tatgatgatg 1320 tgaaagtgca grttttctat tcgaatcttc ctaeatacta tgacaattgc tcattttact 1330 tctggttgca cacatcttrt attgaaaata acaggcttta tctaccaaaa aatgaattgg 1440 ataatctaca taaacaaaaa gcacggagaa tttatccatc agattttgcc gtggagatac 1500 tttttggcga gaaaatgact tccagtgatg ttgtagctgg atccgattaa 1550 <210» 55 <213» 1407 <212» ONA <213» Hoao sapi ens <400» 55 „ atgaatgaaa gtcccgatcc gactgacctg gcgggagtca tcattgagct ęggccccaat 60 gacagtccac agacaagtga atttaaagga gcaaccgagg aggcacętgc gaaagaaagc 120 ccacacacaa gtgaatttaa aggagcagcc cgggtgtcac ctatcagtga aagtgtgtta 180 gcacgacttt ccaagtttga agttgaagat gctgaaaatg ttgcttcata tgacagcaag 240 attaagaaaa ttgtgcattc aattgtatca tcctttgcat ttggactatt tggagttttc 300 ctggtcttae tggatgtcac tctcatcctt gccgacćtaa rtttcactga cagcaaactt 360 tatattcctt tggagtatcg ttctatttct ctagctattg ccttattttt tctcatggat 420 gttcttcttc gagtatttgt agaaaggaga cagcagtatt tttctgactt atttaacatt 480 ttagatactg ccattattgt gattcttctg ctggttgatg tcgrttacat tttttttgac 540 attaagttgc ttaggaatat tcccagatgg acacatttac ttcgacttct acgacttatt 600 attctgttaa gaatttttca tctgtttcat caaaaaagac aacttgaaaa gctgataaga 660 a-OScgggttt cagaaaacaa aaggcgatac acaagggatg gatttgacct agacctcact 720 tacgttacag aacgtattat tgctatgtca tttccatctt ctggaaggca gtctttctat 780 agaaatccaa tcaaggaagt tgtgcggttt ctagataaga aacaccgaaa ccactatcga 840 gtctacaatc tatgcagtga aagagcttac gatcctaagc acttccataa tagggtcgtt 900

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt agaatcatga ttgatgatca taatgtcccc actctacatc agatggtggt tttcaccaag 960 gaagtaaatg agtggatggc tcaagatctt gaaaacatcg tagcgattca ctgtsaagga 1020 ggcacaggtt atgtacgtga tctaaaaatc caaatagaaa tggagaaaaa ggttgtcttt 1080 tccactattt cattaggaaa atgttcggta cttgataaca ttacaacaga caaaatatta 1140 attgatgtat tcgacggtcc acctctgtat gatgatgtga aagtgcagtt tttctattcg 1200 aatcttccta catactatga caattgctca ttttacttct ggttgcacac atcttttatt 1260 gaaaataaca ggctttatct accaaaaaat gaattggata atctacataa acaaaaagca 1320 cggagaattt atccatcaga ttttgccgtg gagatacttt ttggcgagaa aatgactccc 1380 agtgatgttg tagctggatc cgattaa 1407 <210> 56 <211> 1413 <212> DNA <213> Homo sapi ens <4OO> 56 atgaatgaaa gtcctgatcc gactgacctg gcgggagtca tcattgagct cggccccaat 60 gacagt.ccac agacaagtga atttaaagga gcaaccgagg aggcacctgc gaaagaaagt. 120 gtgttagcac gactttccaa gtttgaagtt gaagatgctg aaaatgttgc ttcatatgac 180 agcaagatta agaaaattgt gcattcaatt gtatcatcct ttgcatttgg actatttgga 240 gttttcctgg tcttactgga tgtcactctc atccttgccg acctaatttt cactgacagc 300 aaactttata ttcctrtgga gtatcgttct atttctctag ctattgcctt atcttttctc 360 atggatgttc ttcttcgagt atttgtagaa aggagacagc agtatttttc tgacttattt 420 aacattttag atactgccat tattgtgatt cttctgctgg ttgatgtcgt ttacattttt 480 tttgacatta agttgcttag gaatattccc agatggacac atttacttcg acttctscga 540 cttattattc tgttaagaat ttttcatctg ttteatcaaa aaagacaact tgaaaagctg 600 ataagaaggc gggtttcaga aaacaaaagg cgatacacaa gggatggatt tgacctagac 660 ctcacttacg ttacagaacg tattattgct atgtcatttc catcttctgg aaggcagtct 720 ttctatagaa atccaatcaa ggaagttgtg cggtttctag ataagaaaca ccgaaaccac 780 tatcgagtct acaatctatg cagtgaaaga gcttacgatc ctaagcactt ccataatagg 840 gtcgttagaa tcatgattga tgatcataat gtccccactc tacatcagat ggtggttttc 900 accaaggaag taaatgagtg gatggctcaa gatcttgaaa acatcgtagc gattcactgt 960 ąaaggaggca cagatagaac aggaactatg gtttgtgcct tccttattgę ctctgaaata 1020 tgttcaactg caaaggaaag cctgtattat tttggagaaa ggcgaacaga taaaacccac 1080 agcgaaaaat ttcagggagt agaaactcct tctgtacttg ataacattac aacagacaaa 1140

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt atattaattg atgtattcga cggtccacct ctgtatgatg atgtgaaagt gcagtttttc 1200 tattcgaatc ttcctacata ctatgacaat tgctcatttt acttctggtt gcacacatct 1260 tttattgaaa ataacaggct ttatctacca aaaaatgaat tggataatct acataaacaa 1320 aaagcacgga gaatttatcc atcagatttt gccgtggaga tactttttgg cgagaaaatg 1380 acftccagtg atgttgtagc tggatccgat taa 1413 <210> 57 <211> 1353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 atgaatgaaa gtcctgatcc gactgacctg gcgggagtca tcattgagct cggccccaat 50 gacagtccac agacaagtga atttaaagga gcaaccgagg aggcacctgc gaaagaaagt 120 gtgttagcac gactttccaa gtttgaagtt gaagatgctg aaaatgttgc ttcatatgac 180 agcaagatta agaaaattgt gcattcaatt gtatcatcct ttgcatttgg actatttgga 240 gttttcctgg tcttactgga tgtcactctc atccttgccg aectaatttt cactgacagc 300 aaactttata ttcctttgga gtatcgttct atttctctag ctattgcctt attttttctc 360 atggatgttc ttcttcgagt atttgtagaa aggagacagc agtatttttc tgacttattt 420 aacattttag atactgccat tattgtgatt cttctgctgg ttgatgtcgt ttacattftt 430 tttgacatta agttgcttag gaatattccc agatggacac atttacttcg acttctacga S40 cttattattc tgttaagaat ttttcatctg tttcatcaaa aaagacaact tgaaaagctg 600 ataagaaggc gggtttcaga aaacaaaagg egatscacaa gggatggatt tgaectagac 660 ctcacttacg ttacagaacg tattattgct atgtcatttc catcttctgg aaggcagtct 720 ttctatagaa atccaatcaa ggaagttgtg cggtttctag ataagaaaca ccgaaaccac 780 tatcgagtct acaatctatg cagtgaaaga gcttacgatc ctaagcactt ccataatagg 340 gtcgttagaa tcatgattga tgatcataat gtccccactc tacatcagat ggtggttttc 900 accaaggaag taaatgagtg gatggctcaa gatcttgaaa acatcgtagc gattcactgt 960 aaaggaggca caggttatgt acgtgatcta aaaatccaaa tagaaatgga gaaaaaggtt 1020 gtcttttcca ctatttcatt aggaaaatgt tcggtacttg ataacattac aacagacaaa 1080 atattaattg atgtattcga cggtccacct ctgtatgatg atgtgaaagt gcagtttttc 1140 tattcgaatc ttcctacata ctatgacaat tgctcatttt acttctggtt gcacacatct 1200 tttattgaaa ataacaggct ttatctacca aaaaatgaat tggataatct acataaacaa 1260 aaagcacgga gaatttatcc atcagatttt gccgtggaga tactttttgg cgagaaaatg 1320 scttccagtg atgttgtagc tggatccgat taa 1353

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

<210>	58
<211>	395
<212>	PRT
<213>	Romo
<400>	58

Met

Asn

Glu

Ser

pro

Asp

Pro

Thr

Asp

Leu

Ala Gly

val

ile

ile

Glu

1

5

10

15

Leu

Gly

Pro

Asn

ASp

Ser

Pro

Gin

Thr

ser

Glu Phe

tys

Gly

Ala

Thr

20

25

30

Glu

Glu

Ala

pro

Ala

Lys

Glu

ser

pro

Hi 5

Thr Ser

Glu

Phe

Lys

Gly

35

40

45

Ala

Ala

Arg

val

Sar

Pro

Ile

Ser

Glu

Ser

Va1 Leu

Ala

Aro

Leu

Ser

50

55

60

Lys

Phe

Glu

val

Glu

Asp

Ala

Glu

Asn

val

Ala ser

Tyr

Asp

Ser

Lys

65

70

75

80

Ile

Lys

Lys

Ile

val

His

Ser

Ile

val

ser

Ser Phe

Ala

Phe

Gly

Λ Leu

85

90

95

Phe

Gly

val

Phe

teu

val

Leu

Leu

ASP

val

Thr Leu

Ile

Leu

Ala

Asp

100

105

110

Lau

ile

Phe

Thr

Asp

Ser

Lys

Leu

Tyr

ile

Pro Leu

Glu

Tyr

Arg

Ser

115

120

125

Ile

Ser

Leu

Ala

Ile

Ala

teu

Phe

Phe

Lau

Met Asp

Val

Leu

Leu

Arg

130

135

140

val

Phe

val

Glu

Arg

Arg

Gin

Gin

Tyr

Phe

Ser Asp

Leu

Phe

Asn

Ile

145

150

155

160

teu

Asp

Thr

Ala

ile

ile

val

ile

Lau

Leu

teu Val

ASP

val

val

Tyr

165

170

175

ile

Phe

phe

ASp

Ile

Lys

Leu

Leu

Arg

Asn

ile Pro

Arg

Trp

Thr

His

180

185

190

Leu

Leu

Arg

Leu

Leu

Arg

Leu

Ile

Ile

Leu

Leu Arg

Ile

Phe

His

Leu

195

200

205

Phe

His

Gin

Lys

Arg

Gin

Leu

Glu

tys

Leu

Ile Arg

Arg

Arg

val

Ser

210 215 220

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt

Glu

Asn

Lys

Arg Arg

Tyr

Thr

Arg

Asp

Gly

Phe

Asp

Leu

Asp Lau

Thr

225

230

235

240

Tyr

va1

Thr

Glu

Arg

ile

Ha

Ala

Met

ser

Phe

Pro

Ser

Ser Gly

Arg

245

250

255

Gin

ser

Phe

Tyr 260

Arg

Asn

Pro

ile

Lys 265

Glu

val

Val

Arg

Phe Leu 270

Asp

tys

Lys

His

Arg

Asn

His

Tyr

Arg

val

Tyr

ASO

Leu

cys

Ser Glu

Arg

275

280

2s5

Ala

Tyr

Asp

Pro

Lys

His

Phe

His

Asn

Arg

val

val

Arg

ile Met

Ile

290

295

300

ASO 305

Asp

His

Asn

va1

pro 310

Thr

Leu

His

Gin

Met 315

val

val

phe Thr

tys 320

Glu

Val

Asn

Glu

Trp

Met

Ala

Gin

ASp

Leu

Glu

Asn

ll e

val Ala

ile

325

330

335

His

Cys

Lys

Gly Gly Thr Asn 340

Arg

Thr 345

Gly Thr

Met

val

cys Ala 350

Phe

teu

Ile

Ala

Ser

Glu

Ile

cys

Ser

Thr

Ala

tys

Glu

Ser

Leu Tyr

Tyr

355

360

365

Phe

Gly 370

Glu

Arg

Arg

Thr

Asp 375

Lys

Thr

His

ser

Glu 330

tys

Phe Gin

Gly

Val

GlU

Thr

Pro

Ser

Gin

val

Met

Tyr

val

ile

385

390

395

<210>

59

<211>

468

<212> i

PRT

<2i:

3> 1

Homo

sapiens

<4Q0>

59

Met

Asn

Glu

Ser

Pro

Asp

Pro

Thr

Asp

Leu

Ala

Gly

val

ile Ile

Glu

1

5

10

15

teu

Gly

Pro

Asn

ASP

Ser

Pro

Gin

Thr

Ser

Glu

phe

tys

Gly Ala Thr

20

25

30

Glu

Glu

Ala

Pro

Ala

Lys

Glu

Ser

Pro

His

Thr

Sar

Glu

Phe Lys Gly

35

40

45

PL 215 160 B1 □42-3PCT.ST25.txt

Ala

Ala

Arg

Val

Ser

Pro

ile

Ser

Glu

ser

Val

Leu

Ala

Arg

Leu

ser

50

55

60

Lys

Phe

Glu

val

GlU

Asp

Ala

GlU

Asn

Val

Ala

Ser

iyr

Asp

Se r

Lys

65

70

75

80

ile

Lys

Lys

ile

Va1

His

ser

Ile

val

ser

ser

Phe

Ala

Phe

Gly

Leu

85

90

95

Phe

Gly

val

Phe

Leu

yal

Lau

Leu

Asp

Val

Thr

Leu

ile

L6U

Ala

ASp

100 105 110

Leu

Ile

Phe 115

Thr

ASp

Ser

Lys

teu 120

Tyr

Ile

Pro

Leu- Glu 125

Tyr

Arg

Ser

ile

ser

Leu

Ala

ile

Ala

Leu

Phe

Phe

Leu

Met

Asp Val

Leu

Leu

Arg

130

135

140

Val

Phe

Val

Glu

Arg

Arg

Gin

Gin

Tyr

Phe

Ser

Asp L6U

Phe

Asn

ile

145

150

155

160

teu

Asp

Thr Ala

ile

ile

val

lla

Leu

Leu

Leu

Val Asp

val

Val

Tyr

165

170

175

Ile

Phe

Phe

Asp

Ile

tys

Leu

Leu

Arg

Asn

Ile

pro Arg

Trp

Thr

His

180

185

190

Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu ile ile Leu teu Arg ile Phe His Leu

195

200

205

Phe His Gin Lys Arg Gin Leu Glu Lys Leu Ile Arg Arg Arg val Ser

210

215

220

Glu Asn Lys Arg Arg Tyr Thr Arg Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr

225

230

235

240

Tyr val Thr Glu Arg Ile He Ala Met Ser Phe Pro ser ser Gly Arg

245

250

255

Gin ser Phe Tyr Arg Asn pro ile Lys Glu val val Arg Phe Leu Asp

260

265

270

Lys Lys His Arg Asn His Tyr Arg Val Tyr Asn Leu Cys Ser Glu Arg

275

180

285

Ala Tyr Aso Pro Lys His Phe His Asn Arg Val Val Arg Ile Met Ile

290

295

300

Aso Asp His Asn val Pro Thr Leu His Gin Met Val Val Phe Thr Lys

305

310

315

320

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.rxt

Glu Val

Asn

Glu Trp 325

Met Ala Gir.

Asp

Leu 330

Glu

Asn

ile

val

Ala 335

ile

His cys

Lys

Gly Gly Thr Gly Tyr 340

Val 345

Arg Asp

teu

tys

ile 350

Gin

Ile

Glu Met

Glu 355

Lys Lys

Val val

Phe 360

Ser

Thr

Ile

Ser

Leu 365

Gly

Lys

cys

Sar Val 370

Leu

Asp Asn

ile Thr 375

Thr

ASP

Lys

ile

Leu 380

Ile

ASp

Val

phe

ASp Gly 385

pro

Pro Leu

Tyr Asp 390

Asp

Val

Lys

Val 395

Gin

Phe

Phe

Tyr

ser 400

Asn Leu

Pro

Thr Tvr 405

Tyr Asp

Asn

cys

śer 410

Phe

Tyr

phe

Trp

Leu 415

His

Thr ser

Phe

ile Glu 420

Asn Asn

Arg

Leu 425

Tyr

Leu

Pro

Lys

Asn 430

Glu

Leu

ASP Asn

Leu 435

His Lys

Gin tys

Ala 440

Arg

Arg

Ile

Tyr

pro 445

ser

Asp

Phe

Ala Val -450

Glu

ile teu

phe Gly 455

Glu

Lys

Met

Thr

Ser 460

Ser

Asp

Val

Val

Ala Gly 465

Ser

ASp

<210>

60

<211>

470

<212>

PRT

<213>

Hofto

sapi ens

<4O0>

60

Met Asn 1

i Glu

ser Pro 5

Asp pro

Thr

ASp

teu 10

Ala

Gly

Val

Ile

Ile 15

Glu

Leu Gly pro Asn Asp ser Pro Gin Thr Ser Glu Phe Lys Gly Ala Thr 20 25 30

Glu Glu Ala Pro Ala Lys Glu Ser val Leu Ala Arg Leu Ser Lys Phe 35 40 45

Glu Val Glu Asp Ala Glu Asn Val Ala ser Tyr Asp ser Lys ile tys 50 55 60

PL 215 160 B1

Lys ile val His Ser Ile Val
65	70
Val	Phe	Leu	val	Leu 85	teu	ASp
Phe	Thr	ASp	ser 100	Lys	Leu	Tyr
Lsu	Ala	Ile 115	Ala	Leu	phe	Phe
val	Glu 130	Arg	Arg	Gin	Gin	Tyr 135
Thr 145	Ala	ile	ile	val	ile 150	Leu
Phe	Asp	Ile	tys	Leu 165	Leu	Arg
Arg	Leu	Leu	Arg 180	Leu	ile	Ile
Gltl	tys	Arg 19S	Gin	Leu	Glu	Lys
Lys	Arg 210	Arg	Tyr	Thr	Arg	ASp 215
Thr 225	Glu	Arg	ile	Ile Ala 230	Met
phe	Tyr	Arg	Asn	pro ile 245	Lys
His	Arg	ASO	His 260	Tyr	Arg	val
Asp	pro	Lys 275	His	Phe	His	Asn
His	Asn 290	val	Pro	Thr	Lau	His 295
Asn 305	Glu	Trp	Met	Ala	Gin 310	Asp
Lys	Gly Gly	Thr	Asp Arg 375	Thr

342~3PCT.ST2S.txt
Ser	ser	Phe	Ala 75	Phe	Gly	Leu	Phe	Gly 80
val	Thr	Leu 90	ile	Leu	Ala	Asp	Lau 95	ile
ile	pro 105	Leu	Glu	Tyr	Arg	OJ* iio	ile	Ser
Leu 120	Met	Asp	val	Leu	Leu 125	Arg	val	phe
Phe	Ser	ASP	Leu	Phe 140	Asn	ile	Leu	Asp
Leu	Leu	val	Asp 155	Val	val	Tyr	Ile	Phe 160
Asn	Ile	Pro 170	Arg Trp	Thr	His	Leu 175	Leu
Leu	Leu 185	Arg	ile	Phe	His	Leu 190	Phe	His
teu 200	ile	Arg Arg	Arg	Val 205	Ser	Gly	Asn
dy	Phe	Asp	Leu	ASp 220	Leu	Thr	Tyr	val
Ser	Phe	Pro	Ser 235	Ser	Gly	Arg	Gin	ser 240
Glu	val	val 250	Arg	Phe	Leu	Asp	Lys 255	Lys
Tyr	Asn 265	Leu	cys	ser	Glu	Arg 270	Ala	Tyr
Arg 280	val	val	Arg	Ile	Met 285	Ile	Asp	Asp
Gin	Met	val	val	Phe 300	Thr	Lys	Glu	Val
Leu	Glu	Asn	ile 315	Val	Ala	ile	His	cys 320
Gly Thr	Met	val	Cys	Ala	Phe	Leu	ile

330 335

PL 215 160 B1

342-3PCT,ST25.txt

Ala

ser

Glu

ile 340

cys

Ser

Thr

Ala

Lys 345

GlU

Ser

Lau

Tyr

Tyr 350

Phe

Gly

Gl U

Arg

Arg 355

Thr

Asp

Lys

Thr

His 360

Ser

Glu

Lys

Phe

Gin 365

Gly

Val

Glu

Thr

Pro

ser

val

Leu

Asp

Asn

ile

Thr

Thr

Asp

Lys

Ile

Leu

Ile

ASp

370

375

380

val

Phe

AŚp

ciy

Pro

Pro

Lsu

Tyr

Asp

Asp

val

Lys

Val

Gin

Phe

Phe

335

390

391

400

pyły*

Ser

Asn

Leu

Pro 405

Thr

Tyr

Tyr

Asp

Asn 410

cys

ser

Phe

Tyr

phe 415

Trp

Leu

His

Thr

Ser

Phe

Ile

GlU

Asn

Asn

Arg

Leu

Tyr

Leu

Pro

Lys

Asn

420

425

430

Glu

Leu

Asp

Asn

Leu

His

tys

Gin

Lys

Ala

Arg

Arg

ile

Tyr

pro

Ser

435

440

445

Asp

Phe

Ala

Val

Glu

Ile

Leu

Phe

Gly

Glu

Lys

Met

Thr

Ser

ser

Asp

450

455

460

Val

val

Ala

Gly

Ser

ASp

465 470 <210> 61 <211> 450 <212> PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

61

Met

Asn

GlU

Ser

Pro

Asp

Pro Thr

Asp

Leu

Ala Gly

val

ile

Ile Glu

1

5

10

15

Leu

cly

Fro

Asn 20

ASP

Ser

Pro

Gin

Thr 25

ser

Glu Phe

Lys

Gly Ala 30

Thr

Glu

Glu

Ala

pro

Ala

tys

Glu

ser

val

Leu

Ala Arg

Leu

Ser

Lys

Phe

35

40

45

Glu

val

Glu

ASp

Ala

Glu

Asn

val

Ala

ser

Tyr Asp

Ser

tys

Ile

tys

50

55

60

Lys

Ile val

His

Ser

ile Val

ser

Ser

Phe Ala Phe

Gly

Leu

Phe

Gly

65

70

75

80

PL 215 160 B1

342-3PCr.ST2S.tx-e

yal Phe teu Val Leu Leu

Asp val Thr

Leu Ile Leu Ala 90

ASp

Leu 95

Ile

85

Phe

Thr

asp ser

Lys

Leu

Tyr

ile

pro

Leu

Glu

Tyr Arg

Ser

ile

ser

100

105

Π.ΧΟ

Leu

Ala

ile Ala

Leu

Phe

Phe

Leu

Met

Asp

Val

leu

Leu

Arg

val

phe

115

120

125

val

Glu

Arg

Arg

Gin

Gin

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Phe

Asn

Ile

Leu

A5P

130

135

140

Thr

Al a

ile

Ile val

Ile

Leu

Leu

Leu

vai

Asp

val

val

Tyr

ile

Phe

145

150

155

160

Phe

ASp

Ile

Lys

Leu

teu

Arg

Asn

Ile

Pro

Arg

Trp

Thr

His

Leu

Leu

165

170

175

Arg

Leu

Lau

Arg

Leu

ile

Ile

Leu

Leu

Arg

Ile

Phe

His

Leu

°he

HI s

180

185

190

Gin

Lys

Arg '195

Gin

Leu

Glu

Lys

Leu 200

Ile

Arg Arg

Arg

Val 205

Ser

Glu

Asn

Lys

Arg

Arg Tyr

Thr

Arg

Asp

Gly

Phe

Asp

Leu

ASp

Leu

Thr

Tyr

val

210

215

220

Thr

Glu

Arg

ile

Ile Ala

Met

Ser

Phe

Pro

Ser

Ser

Gly Arg

Gin

ser

225

230

235

240

Phe

Tyr

Arg

Asn

Pro

ile

Lys

Glu

val

val

Arg

Phe

Leu

Asp

Lys

Lys

245

250

255

His

Arg

Asn

His 260

Tyr

Arg

Val

Tyr

Asn 265

Leu

cys

ser

Glu

Arg 270

Ala

Tyr

ASp

Pro

Lys

His

Phe

His

Asn

Arg

Val

val

Arg

ile

Met

Ile

ASp

Asp

275

280

285

His

Asn

Val

Pro

Thr

Leu

His

Gin

Met

Val

val

Phe

Thr

Lys

Glu

Val

290

295

300

Asn 305

Glu

Trp

Met

Ala

Gin 310

Asp

Leu

Glu

Asn

ile 315

Val

Ala

Ile

His

3^0

Lys

Gly

Gly

Thr

Gly

Typ

Val

Arg

Asp

Leu

tys

Ile

Gin

Ile

Glu

Met

325

330

335

GlU

Lys

Lys

val

val

Phe

ser

Thr

Ile

Sar

Leu

Gly

Lys

cys

Ser

val

340

345

350

PL 215 160 B1

342-

3PCT

.st2

5,tx

t

Leu

ASp

Asn

Ile

Thr

Thr

Asp

Lys

Ile

Leu

ile

ASP

val

Phe

Asp

ely

355

360

365

Pro

Pro

Leu

Tyr

Asp

Asp

Val

Lys

val

Gin

phe

Phe

Tyr

Ser

Asn

Leu

370

375

380

Pro

Thr

Tyr

Tyr

Asp

Asn

Cys

Ser

Phe

Tyr

Phe

Trp

Lau

His

Thr

Ser

385

390

395

400

Phe

ile

Glu

Asn

Asn

Arg

Lau

Tyr

Leu

pro

Lys

Asn

Glu

Leu

as»

Asn

405

410

415

Leu

His

Lys

Gin

Lys

Ala

Arg

Arg

Ile

Tyr

pro

ser

Asp

Phe

Ala

val

420

425

430

Olu

tle

Leu

Phe

Gly

Glu

tys

Het

Thr

Ser

Ser

Asp

val

Val

Ala

Gly

435

440

445

ser Asp 4S0 <210> 62 <2X2> 1299 <212> DNA <213> Homo sapiens ...

«400» '62 cgcccttaga catggctcag atgtgcagcc acagtgagtt tctgaacatt tcttctcaga 60 ctaagctctt acacacagtt gcagttgaaa gaaagaattg cttgacatgg ccacaggagc 120 aggcagcttc ctgcagacat gacagtcaac gcaaaetcat gtcactgtgg gcagacacat 180 gtttgcaaag agactcagag ccaaacaagc acactcaatg tgctttgccc aaatttaccc 240 attaggtaaa tcttccctcc tcccaagaag aaagtggaga gagcatgagt cctcacatgg 300 gaacttgaag tcagggaaat gaaggctcac caattatttg tgcatgggtt taagttttcc 360 ttgaaattaa gttcaggttt gtctttgtgt gtaccaatta atgacaagag gttagataga 420 agtatgctag atggcaaaga gaaatatgtt ttgtgtcttc aattttgcta aaaataaccc 480 agaacatgga taattcattt attaattgat tttggtaagc caagtcctat ttggagaaaa 540 ttaatagttt ttctaaaaaa gaattttctc aatatcacct ggcttgataa catttttctc 600 cttcgagttc cttcttctgg agtttaacaa acttgttctt tacaaataga ttatattgac 660 tacctctcac tgatgttatg atattagttt ctattgctta ctttgtattt ctaattttag 720 gattcacaat ttagctggag aactattttt taacetgttg cacctaaaca tgattgagct 780 agaagacagt tttaccatat gcatgcattt tctctgagtt atattttaaa atctatacat 840

PL 215 160 B1 twtcctaaa agcccatttc gagtttgtgt taaaattttt aaaacagaac gtgacttcat catcgtttaa cattttttct

342-3PCT.ST25.txt tatggaggaa atcactggca tcaaatgcca gtctcagacg gaagacctaa tggcctagag ctacttggct ttgtgaccta tggtgaggca taagtgctct tgcctctttt gtaaaatgag ggtttgactt aatcagtgat tttcatagct ttgaagaaca gaactttttt taaaaacagt tagatgcaac catattatat agatacaagt agagctaact tgctaaagaa aggatggagg ctctgaagct tatcccttaa tactgctatg tcctctgtag taccttagat ttctatggga aaactattgt ttatgcgaga gccttgctaa tttectaaaa ategtggata cccatgtata attttctcac cttctattt

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1299 <210>- 53 <21ł> 405 <212> ONA <213> Homo sapiens <400> 63 gcacaaggee tggggggcat ctgcgggcca gggccctgcg ggcccaggtc agatggcaag ctcttcctaa tgcwttact ćcaaaaagat ggacccaggt ggccatccrc caggtcactg cgggccaccc ccceccacca tggtccaggg ccctgcgggc ggccaccccc ccaccatggt ccagggccct acccaccccc tggtccacat cactgaggaa cctgagagaa ttgcccagct gacctggaat taaacagcct cctagaggcc acattctatt

ccgaaggggc	actgccactg	60
cctggccatg	gcccagggcc	120
caccccctgg	ccatggccca	180
gcgggcctcc	ccctggccat	240
gtagaagaaa	acaggacaca	300
gaggcctaaa	ccacaatctt	360
ctgta		405

Met 1

ASp

Pro

Gly

Pro 5

Lys

Gly

His

cys

His 10

cys

Gly

Gly

His

Gly 15

His

Pro

Pro

ol y

His

cys

Gly

Pro

Pro

Pro

Gly

His

Gly

pro

Gly

Pro

cys

20

25

30

Gly

pro

pro

Pro

Thr

Met

vai

Gin

Gly

Pro

Ala

Gly

His

Pro

Leu

Ala

35

40

45

PL 215 160 B1

Met Ala Gin 50

Gly

Pro

Ala Gly 55

His

342- Pro

3PCT.ST25.txt pro Thr Met Val 60

Gin

Gly

pro

Ala Gly Leu 65

Pro

Leu

Ala 70

Met

Ala

Gin Val

Thr 75

His

pro

teu

Val

His 80

Ile Thr Glu

Git!

va1 85

Glu

Glu

Asn

Arg

Thr 50

Gin Asp

Gly

Lys

pro 95

Glu

Arg Ile Ala

Gin 100

lau

Thr

Trp

Asn

Glu 105

Ala

<210> 65

<211> 71

<212> PRT

<2I3> Homo

sapians

<400> 65

Met Ala Ile 1

Leu

Gin 5

Va1

Thr

Ala

Gly

His 10

Pro

Leu

Ala

Met

Ala 15

Gin

Gly Pro Ala Gly 20

His

Pro

pro

Pro

Trp 2S

Ser

Arg

Ala

Leu

Arg 30

Ala

Thr

Pro Trp pro 35

Trp

pro

Arg

Ala

teu 40

Arg

Ala Thr

Pro

Pro 45

Pro

Trp

Ser

Arg Ala Leu

Arg

Ala

Ser

Pro

Trp

Pro

Trp pro

Arg

Ser

Pro

Thr

pro

SO 55 60'

Trp ser Thr Ser Leu Arg Lys

70 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <400> 66 agacatggct cagatgtoca g 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA

PL 215 160 B1

342-3PCT.sr25,txr <213> Sztuczna sekwencja <400> 67 ggaaattagc aaggctctcg c

<210»	68
<211»	21
<212>	DNA
<213»	Sztuczna sekwencja
<400»	68

tcaggtattc .cctgrtctta c

<210»	69
<211»	21
<212»	DNA
<213»	Sztuczna sekwencja

<400» 69 tgggcaattc tctcaggett g <210» 70 <213» 908 <212» DNA <213» Homo sapi ens <400» 70 aaaattćggc acgaggccgg grtgtggtct agcataaagg cggagcccag ggggtatggg agaagcctcc ccacctgccc ccgcaaggcg gcatrtgrtg tgctcctctc taccctggtg atcccctccg ctgcagctcc tatccatgat aagagagctc rttgggtrtc acaggcctcc agagcctart ccaaggcttc tcctgaaagg taacctgctt cggggcatag acagcttatt ctctgccccc ggggcctccc tgggaacrac cacaaagagg agaaccagga gcaccagctg ccctctccag ccacctccag atcgacaaga tgaccgacaa caagacagga tctccgagaa tgtggtggca tccattcaac cagcggaggg gagrttcgag aggtacccag gatggaggag aaggaggccc tggtacccat ccagaaggcc tccacacaga actccatccc cgggtggcct tctggatcat taagctgcca cccaccagga tgccctggag ggcggccact ggeteagega gaagegacac aagaaggggc gtcctgctgc gctoatgccc ageegaettt atggacttcc gggaacaaca gaggtgctga ggtgatttga acggacaget cggcggaggt cgcetgeagg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt ccatccggga tggactccgc aaggggaccc acaaggacgt cctagaagag gggaccgaga 720 gctcctccca ctccaggcrg tccccccgaa agacccactt actgtacatc ctcaggccct 780 ctcggcagct gtaggggtgg ggaccgggga geacctgcct gtagccccca tcagaccctg S40 ccccaagcac catatggaaa taaagttctt tcttacatct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaa g03 <210> 71 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens

<40Q> '

71

Met

Gly

GlU

Ala

Ser

Pro

pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Arg

His

L®U

teu

Va1

1

5

10

15

Leu

Leu

Leu

teu

Leu

ser

Thr

Leu

val

ile

Pro

Ser

Ala

Ala

Ala

pro

20

25

30

ile

His

Asp

Ala

Asp

Ala

Gin

Glu

ser

ser

teu

Gly

teu

Thr

Gly

Leu

35

40

45

Gin

Ser 50

Leu

Leu

Gin

Gly

phe 55

ser

Arg

Leu

Phe

Leu 60

Lys

Gly

Asn

Leu

Leu

Arg

Gly

ile

ASp

Ser

Leu

Phe

Ser

Ala

Pro

Met

Asp

phe

Arg

Gly

65

70

75

80

Leu

Pro

sly

Asn

Tyr

His

Lys

Glu

Glu

Asn

Gin

Glu

His

Gin

Leu

Gly

90 95

Asn Asn Thr Leu ser ser His teu Gin ile Asp Lys Met Thr Asp Asn 100 105 110

Lys Thr Gly Glu val Leu ile ser Glu aso va1 Val Ala Ser ile Gin 115 120 125 pro Ala Glu Gly Ser phe Glu Gly Asp Leu Lys Val pro Arg Met Glu 130 135 140

Glu Lys Glu Ala Leu val pro Ile Gin Lys Ala Thr Asp ser Phe His 145 150 155 160

Thr Glu Leu His Pro Arg val Ala Phe Tro ile ile Lys teu Pro Arg 165 170 175

PL 215 160 B1

Arg

Arg

His

Gin

Ala

342-

3pct,st2

,S.tJ

:t

Ser

ASp

Leu

Glu

Gly

Gly

His

Trp

Leu

Ser

Glu

180

135

130

uys

Arg

His

Arg

Leu

Gin

Ala

Ile

Arg

ASp

Gly

Leu

Arg

tys

Gly

Thr

195

200

205

His

Lys

Asp

Va1

Leu

Glu

Glu

Gly

Thr

Glu

ser

ser

Ser

His

ser

Arg

210

215

220

Leu

ser

Pro

Arg

tys

Tfir

His

Leu

Leu

Tyr

lla

Leu

Arg

Pro

Ser

Ara

225

230

235

240

Gin teu <210» 72 <211» 21 <212» DNA <213> Sztuczna sekwencja

<400» 72 Ctcctatcca tgatgctgac g
<210>	73
<211»	21
<212»	DNA
<213»	Sztuczna sekwencja
<400» 73 cctgaggatg tacagtaagt g
<210»	74
<211»	2387
<212»	DNA
<213»	Homo sapiens
<400»	74

tttcccagcg aggtggtcat tcagagccta cacatctgtt ctgtatttta acccatggat 60 gagaatattr. attcaagcca agagagttaa aactaaacat ctttgctatt gcctctacag 120 acccagaaag tatctttatg tcacatcttc ttttaaagga gcatttasag atgaagttaa ISO aaaggcagaa gaagcaętaa agattgctga atccatattg aaagaagcac aaatcaaagt 240 aaaccagtgt gaeagaacct ctttatcttc tgccaaggat gtattacaęa gagctttgga 300

PL 215 160 B1

342-3PCT.5T25.txt agatgtagaa gcaaagcaaa agaatcttaa agagaaacaa agagaattaa aaacagcaag 360 aacgctctcc ctgttctatg gagtgaacgt agaaaaccga agccaagctg gaatgttcat 420 ttacagtaat aaccgtttga tcaaaatgca tgaaaaagtg ggetcacagt tgaaactgaa 480 gtccttactt ggcgcaggcg tggttggaat tgttaatata cccttggagg tcatggaacc 540 atcccataat aaacaggaat ttctcaatgt ccaagagtat aatcatctac taaaagtcat 600 gggacagtac ttggtccagt actgtaagga caccggcatc aataatagaa atttaacatt 660 gttttgcaat gaatttggat accagaatga catcgatgtg gagaaacctt taaattcttt 720 tcaatatcaa agaagacaag ccatgggtat cccattcatc atacaatgtg atctttgtct 780 taaatggaga gtcttgcctt cctctactaa ttatcaggaa aaagaatttt ttgacatttg 84C gatttgtgct aataatccca accgcttgga aaacagttgt catcaggtag aargtctacc 900 ttccatccca ctgggcacca tgagcacaat atcaccatca aaaaatgaga aagagaagca 560 acttagagag tcggtcataa agtatcaaaa tagactggca gaacagcagc cacagcctca 1020 atttatacca gtggacgaaa tcactgtcac ttccacctgc ctaacttfcag cacataagga 1080 aaataccaaa acccagaaaa tcaggctttt gggcgatgac ttgaagcatg aatctctttc 1140 atcctttgag ctttcagcga gccgtagagg aeagaaaaga aacatagaag agacagactc 1200 tgatgragag tatatttcag aaacaaaaat tatgaaaaag tctatggagg agaaaatgaa 1260 ctctcaacag cagagaattc cagtagctct gccagaaaat gtcaaactag ctgagagatc 1320 ccagagaagt cagattgcta arattaccac tgtctggaga gctcaaccaa ctgaagggtg 1380 cctgaagaat gcccaggccg cttcttggga aatgaaaagg aagcagagtc tgaactttgt 1440 agaggaatgt aaggtattga ctgaagatga gaacacgagt gattcagata taatcctggt 1300 ttcagataaa agcaacactg atgtttcatt gaaacaagaa aaaaaggaaa ttcctctttt 1560 aaaccaagaa aaacaggagc tgtgcaatga tgttctagca atgaaaagaa gctcttcatt 1620 acctagctgg aaaagcttgc tcaatgtgcc gatggaagat gtgaatctaa gttctggaca 1680 catagccaga gtttctgtga g,tggeagttg taaagttgct tcttcgccag cgtcttcrca 1740 aagcacacct gtcaaggaaa cagtgagaaa actgaagtct aagttaaggg agattcttct 1300 gtattttttt cctgagcatc agctaccatc agaąttggaa gaacctgcat taagttgtga 1360 gctggagcag tgcccagagc agatgaacaa aaagctgaaa atgtgtrtca accagataca 1920 gaatacttac atggtccaat atgaaaaaaa aataaagagg aaattgcagt ccattatcta 1980 tgattcaaat acaagaggaa tacataatga aatctctctg gggcaatgtg aaaataaaag 2040 aaaaatctct gaggataagc tgaagaatct tcgtataaaa ctggcactat tgttgcagaa 2100 actccaactg ggtggtccag aaggtgacct ggagcagact gacaettatt tagaagcttt 2160 gcttaaagaa gataatcttc tcttccagaa caatrtaaat aaagtaacta tagatgcaag 2220 acatagactc cctttagaaa aaaatgaaaa gacttcggaa aattaagtca gagatggtat 2230 taccttttaa aaaatgctaa taagaaaatt ggaagattct tttaaaaatt tttctttttt 2340

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt gttgttgtta ctgtaaagtc tattctgttt aacaataaga aataagaaat aatttttttc 2400 aaataagaaa attgtgtact etagaaatgg agaccgattt acaatttatg tattccctaa 2460 tccaattatc taaatcttcc ttttctttca gaaatattaa taatatctag agttctctaa 2520 ttttcatgtg agetaetgąa aaaaatgaaa atgtcactca agcttaactt ttgttattcc 2580 ttaaaagatt gttattgtaa ttttgttatt ccttaaaaac atttaaaagc agattttttc 2640 aaaatcgata tgtgaaggac tacagaatca cctcctcttg aagatattga aaaagaaaga 2700 cattatgccc tttctccact atagccaaca ctcagtcsag cagaaaatac aaatccecce 2760 aaaactttga gacatagctt atataatttt attatttagt catagtaaaa gaataaatct 2820 ćctaagcata atatgtatac atattacaca tatgtaaaaa ttgttgtttt acatttacat 2880 atacgtaaag aagtatgttt ttacactttt cttgataagt gttttttttt tgtttagaaa 2940 tgtctgaaac tttagacaaa aacagtaaaa catttaatat tcatttg 2987 <210» 75 <211» 735 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 75

Met Arg ile Phe Ile Gin

Ala Lys

Arg

Val 10

Lys Thr

Lys

His

L2U 15

cys

1

5

Tyr cys

Leu

Tyr

Arg

Pro

Arg

Lys Tyr

Leu

Tyr

vai

Thr

Ser

Ser

Phe

20

25

30

Lys

Gly

Ala

Phe

Lys

ASp

Glu

val

tys

tys

Ala Glu

Glu

Ala Val

Lys

35

40

45

Ile

Ala

Glu

Ser

Ile

Leu

Lys

Glu Ala

Gin

Ile

Lys

val

Asn

Gin

cys

50

55

60

Asp

Arg

Thr

Ser

Leu

ser

Sar

Ala

Lys

ASp

val

Leu

Gin

Arg

Ala

teu

65

70

75

80

Glu

Asp

val

Glu

Ala

Lys

Gin

uys

Asn

Leu

Lys

Glu

Lys

Gin

Arg

Glu

85

90

95

Leu

Lys

Thr'

Ala

Arg

Thr

Leu

Ser

Leu

Phe

Tyr Gly

val

Asn

val

GlU

100

105

110

Asn

Arg

Ser

Gin

Ala

Gly

Met

Phe

Ile

Tyr

Ser

Asn

Asn

Arg

Lsu

He

115

120

125

PL 215 160 B1

Lys	Mat 130	His	Glu	Lys	val	Gly 13 S	Ser	342-3PCT.ST25.txt Gin Leu tys Leu Lys 140	ser	Leu	LfiU
Gly Ala 145	Gly val	Va1	Gly 150	Ile val	Asn ile Pro Leu Glu 155	val	Met	Glu 160
pro	ser	His	Asn	Lys 165	Gin	Glu	Phe	Leu Asn val Gin Glu 170	Tyr	Asn 175	His
Leu	Leu	Lys	Val 180	Met	Gly	Gin	Tyr	Leu val Gin Tyr cys 185	Lys 190	Asp	Thr
Gly	Ile	Asn 195	Asn	Arg	Asn	Leu	Thr 200	Leu Phe cys Asn Glu 205	phe	Gly Tyr
Gin Asn 210	ASP	ile	Asp	Val	Glu 215	Lys	pro Leu Asn ser Phe 220	Gin	Tyr	Gin
Arg 225	Arg	Gin	Ala	Met	Gly Ile 230	pro	Phe Ile Ile Gin cys Asp 235	teu	Cys 240
Leu	Lys	Trp	Arg	Val 245	Leu	Pro	Ser	ser Thr Asn Tyr Gin 250	Glu	Lyś 255	Glu
Phe	Phe	Asp	Ile 260	Trp	Ile	Cys	Ala	Asn Asn Pro ASn Arg 265	Leu 270	Glu	Asn
Sar	cys	His 275	Gin	Val	GlU	Cys	Leu 280	Pro Ser Ile Pro Leu 285	Gly Thr	Met
ser	Thr 290	Ile	ser	Pro	Ser	Lys 295	Asn	Glu Lys Glu Lys Gin 300	Leu	Arg	Glu
Ser 305	Val	ile	Lys	Tyr	Gin 310	A$n	Arg	Leu Ala Glu Gin Gin 315	pro	Gin	Pro 320
Gin	Phe	Ile	pro	val 325	Asp	Glu	ile Thr val Thr Ser Thr 330	cys	Leu 335	Thr
Ser	Ala	His	Lys 340	Glu	Asn	Thr	Lys	Thr Gin Lys Ile Arg 345	teu 350	Leu	Gly
Asp	Asp	Leu 355	Lys	His	Glu	Ser	Leu 360	Ser Ser Phe Glu Leu 365	ser	Ala	ser
Arg	Arg 370	Gly	Gin	Lys	Arg	Asn 375	ile	Glu Glu Thr Asp ser 380	Asp	Val	Glu
Tyr	ile	SG i*	Glu	Thr	Lys	xle	Met	Lys Lys Ser Met Glu	Glu	Lys	Met

385 390 395 400

100

PL 215 160 B1

342-

3pct

-ST2

S.tx

t

Asn

ser

Gin

Gin

Gin

Arg

ile

pro

Val

Ala

Leu

Pro

Glu

Asn

val

tys

405

410

415

Lsu

Ala

Glu

Arg

Sar

Gin

Arg

Ser

Gin

ile

Ala

Asn

Ile

Thr

Thr

Val

420

425

430

Trp

Arg

Ala

Gin

pro

Thr

Glu

Gly

cys

teu

Lys

Asn

Ala

Gin

Ala

Ala

435

440

445

Ser

Trp

Glu

Met

Lys

Arg

Lys

Gin

Ser

teu

Asn

Phe

val

GlU

Glu

cys

450

455

460

Lys

val

Leu

Thr

Glu

Asp

Glu

Asn

Thr

ser

ASP

Ser.

Asp

ile

ile

Leu

465

470

475

480

val

ser

Asp

Lys

Ser

Asn

Thr

Asp

val

Ser

lau

tys

Gin

Glu

Lys

485

490

495

Gl’U

Ile

Pro

Leu

Leu

Asn

Gin

Glu

Lys

Gin

Glu

Leu

cys

Asn

A5P

val

500

505

510

Leu

Ala

Met 515

Lys

Arg

ser

ser

Ser 520

teu

pro

Ser

Trp

Lys 525

ser

Leu

Leu

Asn

va1

•pro

Met

Glu

ASp

val

Asn

teu

Ser

ser

Gly

His

ile

Ala

Arg

530

535

540

Va1

ser

val

ser

Gly

ser

Cys

Lys

Val

Ala

ser

Ser

Pro

Ala

Ssr

Ser

545

550

555

560

Gin

Ser

Thr

pro

val

Lys

Glu

Thr

val

Arg

Lys

Leu

Lys

Ser

tys

Lau

565

570

575

Arg

Glu

Ile

Leu

Leu

Tyr

Phe

Phe

Pro

Glu

His

Gin

Leu

Pro

ser

Glu

580

585

590

Leu

Glu

GlU

pro

Ala

Leu

Ser

Cys

Glu

Leu

Glu

Gin

Cys

Pro

Glu

Gin

595

600

605

Met

Asn

Lys

tys

Leu

Lys

Met

cys

Phe

Asn

Gin

Ile

Gin

Asn

Thr

Tyr

610

615

620

Met

val

Gin

Tyr

Glu

tys

Lys

il e

Lys

Arg

Lys

Leu

Gin

ser

ile

ile

625

630

635

640

Tyr

Asp

Ser

Asn

Thr

Arg

Gly

Ile

His

Asn

Glu

ile

Ser

Leu

Gly

Gin

645

650

635

cys

Glu

Asn

Lys £Ct\

Arg

Lys

ll e

Sar

Glu £££

Asp

Lys

Leu

tys

Asn

Leu

Arg

660 665 670

PL 215 160 B1

101

342-3PCT.ST25.txt

Ile

Lys

Leu

Ala

LSU

Leu

Leu

Gin

Lys

Leu

Gin

Leu

Gly

Gly

Pro

Glu

675

680

565

ciy

ASp

Leu

Glu

Gin

Thr

Asp

Thr

Tyr

Leu

Glu

Ala

Leu

Leu

Lys

GlU

690

695

700

Asp

Asn

Leu

Leu

Phe

Gin

Asn

Asn

LfiU

Asn

Lys

Val

Thr

sle

Asp

Ala

705

710

715

720

Arg

His

Arg

Leu

Pro

Leu

Glu

Lys

Asn

GlU

Lys

Thr

Ser

Glu

Asn

725

730

735

<210> 76 <213> 21 .

<212> DNA <213> Sztuczna sekwenqo <400> 76 ctgagtatca gctaccatca g 21

<210>	77
<213>	21
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<4O0> 77 tctgtagtcc ttcacatatc g
<210>	78
<213>	21
,<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja
<400> 78 ttttgtctat ggtgtaggac c
<210>	79
<2łl>	21
<212>	DNA
<213>	Sztuczna sekwencja

102

PL 215 160 B1

PL 215 160 B1

103

<210» 84 , <211» 10 <212> PRT <213» Homo sapi ens <4OQ> 84

Ssr Arg Glu val Thr Thr Asn Ala Gin Arg i ś io³ <210» 85 <211» 216 <212> DNA <213» Homo sapiens <400» 35 tgctcttact ccaaaaagat ggacccaggg ccctgcgggc ctccccctgg ccatggccca 60 ggtcacccac cccctggtcc acatcactga ggaagtsgaa gaaaacagga cacsagatgg 120 caagcctgag agsattgccc agctgacctg gaaggaggcc taaaccgcaa tattctcttc 180 ctaataaaca gectcctaga ggccacattc tattct 216 <210» 86 <211» 227 <212» DNA <213» Hasso sapiens <400>

tgctcttact ccaaaaagat ggaęccaggt ccgaaggggc actgccactg tggggggcat 60 ggeęatcctc caggtcaccc aceccctggt ccacatcact gaggaagtag aagaaaacag 120 gacacaagat ggcaagcctg agagaattgc ccagctgacc tggaatgagg cctaaaccac 180 satcttctct tcctaataaa cagcctccta gaggccacat tctattc <210» <211»

261 <212» <213»

Homo sapiens

104

PL 215 160 B1

342~3PCT.5T25.Txt <40Ο> 87 tgctcttact ccaaaaagat ggacccaggt ccgaaggggc actgccactg tggggggcat 60 ggccatcctc caggtcactg cgggcctccc cctggccatg gcccaggtca cccaccccct 120 ggtccacatc actgaggaag tagaagaaaa caggacacaa gatggcaagc ctgagagaat 180 tgcccagctg acctggaatg aggcctaaac cacaatcttc tcttcctaat aaacagcctc 240 ctagaggcca cattctattc t 261 <210> 88 .

<211> 327 <212» . DNA >

<213». hobo sapiens <400> 88 .

tgctcttact ccaaaaagat ggacccaggt ccgaaggggc actgccactg tggggggcat 60 ggccatcctc caggtcactg cgggccaccc ccccaceatg gtccagggcc ctgcgggcca 120 cccccccacc atggtccagg gccctgcggg cctccccctg gccatggccc aggtcaccca 180 ccccctggtc ćacatcactg aggaagtaga agaaaacagg acacaagatg gcaagcctga 240 gagaartgcc cagctgacct ggaatgaggc ctaaaccaca atcttctctt cctaataaac 300 agcctcctag aggccacatt ctattct 327 <210» 89 <213> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 teu Leu Leu Gin Lys Asp Gly Pro Arg Ala Leu Arg Ala Ser Pro Trp 15 10 15

Pro Trp Pro Arg Ser Pro Thr Pro Trp Ser Thr Sar Leu Arg Lys 20 25 30 <210» 90 <213» 23 <212» PRT <213» Komo sapiens

PL 215 160 B1

105

342-3PCT.ST25.txt <400» 90

Met Asp pro Gly Pro Cys Gly Pro Pro Pro Gly His Gly Pro Gly His 15 10

Pro pro Pro Gly Pro His His 20 <210» 91 <211» 36 <212» PRT <213» Boa» sapiens <400> 91

Met

Ala

Gin

val

Thr

His

Pro

Leu

val

His

Ile

Thr

Glu

Glu

val

Glu

1

5

10

15

GlU

Aśn

Arg

Thr

Gin

Asp

Gly

Lys

Pro

Glu

Arg

Ile

Ala

Gin

Leu

Thr

20

25

30

Trp

Lys

Glu

Ala

35

<210» 92 <211» 34 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 92

Leu Leu Gin Lys Asp Gly Pro Arg ser Glu cly Ala Lsu Pro Leu Trp 15 10 15

Gly Ala Trp pro ser ser Arg Ser Pro Thr Pro Trp ser Thr Ser teu 20 25 · 30

Arg Lys <210» 93 <211» 27 <212» PRT <213» Homo sapiens .

106

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt <40δ> 93

Mst Asp Pro Gly Pro Lys Gly His cys His cys Gly Gly His Gly His

pro pro Gly His Pro pro Pro Gly Pro His His
	20	25
<210>	94
<211>	38
<212>	PRT
<213>	Homo sapisns

<4GS> 94 wet Ala ile Leu Gin val Thr His pro Leu val His ile Thr Glu Glu 15 10 15 val Glu Glu Asn Arg Thr Gin Asp Gly Lys Pro Glu Arg ile Ala Gin 20 25 30

Leu Thr Trp Asn Glu Ala 35

<210>	95
<211>	46
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	95

Leu

Leu

Leu

Gin

Lys

ASP

Gly

pro

Arg

ser

Glu

oiy

Ala

Leu

pro

Leu

1

5

10

15

Trp

Gly

Ala

Trp

ΡΓΟ

Ser

Ser

Arg

Ser

Leu

Arg

Ala

Ser

Pro

Trp

Pro

20

25

30

Trp

Pro

Arg

ser

pro

Thr

pro

Trp

Ser

Thr

ser

teu

Arg

Lys

35

40

45

<210> 96 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 215 160 B1

107

342-3PCT,ST25>txt <400» 96

Met Asp Pro Gly Pro lvs Gly His cys His Cys Gly Gly His Gly His 15' 10 15 pro Pro Gly His cys Gly Pro Pro Pro Gly His Gly Pro Gly His Pro 20 25 30

Pro Pro Gly pro His His 35

<210»	9?
<211»	49
<212»	PRT
<213»	Homo

<400» 97

Met Ala ile teu Gin Val Thr Ala Gly teu Pro teu Ala Met Ala Gin 15 10 15 val Thr His pro Leu val His Ile Thr Glu Glu val Glu Glu Asn Arg 20 25 30

Thr Gin Aso Gly Lys Pro Glu Arg ile Ala Gin Leu Thr Trp Asn Glu 35 40 45

Ala <210» 98 <211» 68 <212> PRT <213» Homo sapi ens <400» 98

teu teu 1

Leu

Gin

Lys 5

Asp

Gly

pro

Arg

Ser 10

Glu

Gly

Ala

teu

Pro 15

teu

Trp Gly

Ala

Trp 20

pro

Ser

Ser

Arg

Ser 25

Leu

Arg

Ala

Thr

Pro 30

Pro

pro

Trp ser

Arg 35

Ala

teu

Arg

Ala

Thr 40

pro

Pro

Pro

Trp

ser 45

Arg

Ala

Leu

Arg Ala 50

ser

pro

Trp

Pro

Trp 55

pro

Arg

ser

pro

Thr 60

pro

Trp

ser

Thr

108

PL 215 160 B1

342-3PCT.ST25.txt sar Leu Arg Lys 65 <210> 99 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99

Met 1	Asp	pro	Gly	Pro 5	Lys	Gly	His	cys
Pro	Pro	Gly	His 20	Cys	Gly	Pro	Pro	Pro 25
Gly	Pro	pro 35	pro	His	His	Gly	Pro 40	Gly
His	Gly	Pro	Gly	His	pro	Pro	Pro	Gly

His cys Gly Gly His Gly His 10 15

His	Gly	pro	Gly 30	pro	cys
Cys	Gly	pro 45	pro	pro	Gly
His	His 60

.50 55 <210> 100 <211> 71

<212> 1 <213> 1	’RT Homo sapiens
<4G0> 100
.Met Ala	Ile Leu Gin val Thr Ala Gly
1	5
Gly Pro	Ala Gly His Pro Pro Thr Met
	20 25
Pro Leu	Ala Met Ala Gin val Thr His
	35 40
Glu Val	Glu Glu Asn Arg Thr Gin Asp
50	55
Gin Leu	Thr Trp A$n Glu Ala
65	70

His Pro Pro Thr Met val Gin 10 15 val Gin Gly Pro Ala Gly Leu 30

Pro Leu val His Ile Thr Glu 45

Gly Lys Pro Glu Arg ile Ala 60

PL 215 160 B1

109

Claims (39)

1. Kompozycja zawierająca jeden albo więcej składników wybranych z grupy składającej się z:

(i) antygenu TPTE związanego z nowotworem albo jego części, która zawiera co najmniej 6 kolejnych aminokwasów, (ii) kwasu nukleinowego kodującego antygen TPTE związany z nowotworem albo jego części, która zawiera co najmniej 6 kolejnych aminokwasów, (iii) przeciwciała, które wiąże się z antygenem TPTE związanym z nowotworem, (iv) antysensownego kwasu nukleinowego, który swoiście hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym antygen TPTE związany z nowotworem, i (v) komórki gospodarza, która wykazuje ekspresję antygenu TPTE związanego z nowotworem albo jego części, która zawiera co najmniej 6 kolejnych aminokwasów, znamienna tym, że wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego zawierającego sekwencje kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a), do zastosowania jako środek farmaceutyczny.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że kwas nukleinowy z punktu (ii) występuje w wektorze ekspresyjnym.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że komórka gospodarza wydziela antygen TPTE związany z nowotworem albo jego część.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że komórka gospodarza dodatkowo wykazuje ekspresję cząsteczki HLA, która wiąże się z antygenem TPTE związanym z nowotworem albo jego częścią.

5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że komórka gospodarza wykazuje ekspresję cząsteczki HLA i/lub antygenu TPTE związanego z nowotworem albo jego części w sposób rekombinowany.

6. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że komórka gospodarza wykazuje endogenną ekspresję cząsteczki HLA.

7. Kompozycja według zastrz. 1, 4, albo 6, znamienna tym, że komórką gospodarza jest komórka prezentująca antygen.

8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne, chimeryczne albo humanizowane, albo fragment przeciwciała.

9. Kompozycja według zastrz. 1 albo 8, znamienna tym, że przeciwciało jest sprzężone ze środkiem terapeutycznym albo diagnostycznym.

10. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 1-9, znamienna tym, że jest do leczenia nowotworu.

11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że nowotworem jest nowotwór płuc, nowotwór piersi, nowotwór prostaty, czerniak, nowotwór okrężnicy, przerzuty nowotworu okrężnicy, rak komórek nerkowych albo rak szyjki macicy, rak okrężnicy albo rak gruczołu sutkowego.

12. Kompozycja według dowolnego z zastrz. 1-11, znamienna tym, że antygen TPTE związany z nowotworem obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną spośród grupy składającej się z SEQ ID NR: 22-24, 58-61, 81 i 82.

13. Zastosowanie (i) sondy polinukleotydowej, która swoiście hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym antygen TPTE związany z nowotworem i/lub (ii) przeciwciała swoiście wiążącego się z antygenem TPTE związanym z nowotworem, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do diagnozowania albo monitorowania choroby cechującej się ekspresją albo nieprawidłową ekspresją antygenu TPTE związanego z nowotworem w próbce biologicznej izolowanej od pacjenta, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

110

PL 215 160 B1

14. Zastosowanie przeciwciała wiążącego się z antygenem TPTE związanym z nowotworem i sprzężonego ze środkiem terapeutycznym albo diagnostycznym do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, diagnozowania albo monitorowania choroby cechującej się ekspresją albo nieprawidłową ekspresją antygenu TPTE związanego z nowotworem, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

15. Zastosowanie według zastrz. 13 albo 14, znamienne tym, że przeciwciało wiążące się z antygenem TPTE związanym z nowotworem jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym albo humanizowanym albo fragmentem przeciwciała.

16. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 13-15, znamienne tym, że antygen TPTE związany z nowotworem zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 22-24, 58-61, 81 i 82.

17. Przeciwciało, które wiąże się specyficznie z białkiem TPTE, przy czym wspomniane białko TPTE jest kodowane przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

18. Przeciwciało według zastrz. 17, znamienne tym, że białko TPTE zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 22-24, 58- 61, 81 i 82.

19. Przeciwciało według zastrz. 17 albo 18, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym albo humanizowanym albo fragmentem przeciwciała.

20. Koniugat, znamienny tym, że jest koniugatem pomiędzy przeciwciałem, które określono w dowolnym z zastrz. 17-19 i czynnikiem terapeutycznym albo diagnostycznym.

21. Koniugat według zastrz. 20, znamienny tym, że czynnik terapeutyczny albo diagnostyczny jest toksyną.

22. Przeciwciało jak określono w dowolnym z zastrz. 17-19 albo koniugat jak określono w zastrz. 20 albo 21 do zastosowania terapeutycznego albo diagnostycznego.

23. Zestaw do wykrywania ekspresji albo nieprawidłowej ekspresji antygenu TPTE związanego z nowotworem, znamienny tym, że obejmuje środki do wykrywania (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen TPTE związany z nowotworem, i/lub (ii) antygen TPTE związany z nowotworem, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

24. Zestaw według zastrz. 23, znamienny tym, że środkami do wykrywania kwasu nukleinowego, który koduje antygen TPTE związany z nowotworem, są cząsteczki kwasów nukleinowych do selektywnej amplifikacji wspomnianego kwasu nukleinowego.

25. Zastosowanie przeciwciała wiążącego się z TPTE i sprzężonego ze środkiem terapeutycznym albo diagnostycznym do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, diagnozowania albo monitorowania nowotworu dającego przerzuty cechującego się ekspresją albo nieprawidłową ekspresją TPTE, przy czym wspomniany TPTE ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy składający się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego według SEQ ID NR: 19, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym albo humanizowanym, albo fragmentem przeciwciała.

27. Sposób diagnozowania nowotworu in vitro, znamienny tym, że obejmuje:

PL 215 160 B1

111 (i) wykrywanie kwasu nukleinowego, który koduje antygen TPTE związany z nowotworem i/lub (ii) wykrywanie antygenu TPTE związanego z nowotworem, w próbce biologicznej izolowanej od pacjenta, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że wykrywanie obejmuje:

(i) kontaktowanie próbki biologicznej ze środkiem wiążącym się swoiście z kwasem nukleinowym kodującym antygen TPTE związany z nowotworem, albo z antygenem TPTE związanym z nowotworem, i (ii) wykrywanie tworzenia się kompleksu pomiędzy środkiem a kwasem nukleinowym, albo antygenem TPTE związanym z nowotworem.

29. Sposób według zastrz. 27 albo 28, znamienny tym, że wykrywanie jest porównywane z wykrywaniem w porównywalnej prawidłowej próbce biologicznej.

30. Sposób in vitro określania regresji, przebiegu albo początku nowotworu, znamienny tym, że obejmuje monitorowanie próbki od pacjenta, który ma nowotwór, albo który jest podejrzany o zapadnięcie na chorobę nowotworową, w odniesieniu do jednego albo większej ilości parametrów wybranych z grupy składającej się z:

(i) ilości kwasu nukleinowego, kodującego antygen TPTE związany z nowotworem, i (ii) ilości antygenu TPTE związanego z nowotworem, przy czym wspomniany antygen TPTE związany z nowotworem ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z:

(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR: 19-21 i 54-57, i (b) kwasu nukleinowego, wykazującego co najmniej 90% tożsamości sekwencji z kwasem nukleinowym z punktu (a).

31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że obejmuje oznaczanie parametru(ów) w pierwszej próbce w pierwszym punkcie w czasie i w następnej próbce w drugim punkcie w czasie a przebieg choroby jest oznaczany przez porównanie dwóch próbek.

32. Sposób według dowolnego z zastrz. 27-31, znamienny tym, że kwas nukleinowy jest wykrywany albo ilość kwasu nukleinowego jest monitorowana stosując sondę polinukleotydową, która hybrydyzuje swoiście ze wspomnianym kwasem nukleinowym.

33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że sonda polinukleotydowa zawiera sekwencję 6-50 kolejnych nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego antygen TPTE związany z nowotworem.

34. Sposób według dowolnego z zastrz. 27-31, znamienny tym, że kwas nukleinowy jest wykrywany albo ilość kwasu nukleinowego jest monitorowana przez selektywną amplifikację wspomnianego kwasu nukleinowego.

35. Sposób według dowolnego z zastrz. 27-31, znamienny tym, że antygen TPTE związany z nowotworem jest wykrywany albo ilość antygenu TPTE związanego z nowotworem jest monitorowana stosując przeciwciało wiążące się specyficznie ze wspomnianym antygenem TPTE związanym z nowotworem.

36. Sposób według dowolnego zastrz. 32, 33 i 35, znamienny tym, że sonda polinukleotydowa, albo przeciwciało jest znakowane w sposób dający się wykryć.

37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że wykrywalny znacznik jest markerem radioaktywnym albo markerem enzymatycznym.

38. Sposób według dowolnego zastrz. 27-37, znamienny tym, że próbka zawiera płyny ustrojowe i/lub tkanki organizmu.

39. Sposób według dowolnego zastrz. 27-38, znamienny tym, że antygen TPTE związany z nowotworem zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEQ ID NR.: 2224, 58-61, 81 i 82.