CN110734925B - 一种粒细胞或单核细胞标记系统及其标记方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种粒细胞和单核细胞标记系统，所述标记系统包括Ms4a3基因、IRES‑Cre重组酶和LoxP‑Stop‑LoxP‑reporter报告系统。所述Ms4a3基因为粒细胞和单核细胞前体所特异性表达的基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提出了所述标记系统的构建方法以及检测方法。本发明还提出所述系统在造血系统发育、免疫细胞发育和功能、肿瘤学研究等方面的广泛应用。

Description

一种粒细胞或单核细胞标记系统及其标记方法和应用

技术领域

本发明涉及与粒细胞或单核细胞相关的造血系统发育、组织巨噬细胞更新和肿瘤研 究领域，具体涉及一种粒细胞或单核细胞标记系统、标记方法以及应用。

背景技术

髓系细胞(Myeloid cells)包括粒细胞(Granulocytes)、单核细胞(Monocytes)、巨 噬细胞(Macrophages)、树突状细胞(Dendritic cells)，髓系细胞在抗感染免疫、炎症、组织修复和重建、肿瘤中发挥重要作用。对其来源和发育的研究将有助于完善人们对髓 系细胞在生理和病理状态下功能的理解。对于髓系细胞的操控有助于人们对抗感染、缓 解炎症和治疗癌症。

包括粒细胞、单核细胞和树突状细胞的髓系细胞由骨髓中的造血干细胞产生。造血 干细胞在骨髓中通过垂直的层级分化产生上述细胞类群。然而，骨髓中的造血干细胞主要由血液学家定义，而终末分化的免疫细胞则由免疫学家定义，在造血干细胞和终末分 化的免疫细胞之间存在一个灰色区域，在该灰色区域中很多发育分化过程依然不够清晰。 广泛接受的观点认为，在骨髓中髓系祖细胞(Common Myeloid Progenitor，CMP)发育 产生粒细胞-单核细胞前体(Granulocyte-Monocyte progenitor，GMP)，GMP进一步产生 粒细胞前体和单核树突状细胞前体(Monocytes and DC Progenitor，MDP)，粒细胞前体 进而产生粒细胞，MDP则产生单核细胞和树突状细胞。但是，随着单细胞测序技术的发 展和新的动物模型的建立，该细胞发育图谱已经被质疑。高效并且特异的单核细胞示踪 模型有助于骨髓髓系细胞发育的研究。

组织巨噬细胞是髓系细胞的重要成员，关于组织巨噬细胞的来源和更新，长期以来， 组织巨噬细胞被认为是由血液中的循环单核细胞进入组织后发育而来。但是，随着技术 发展和新的动物模型的建立，这一长期以来所秉持的观念遭受到了质疑。许多新的研究显示在成年个体中的大多数组织如大脑、表皮、肝脏和肺中，巨噬细胞并不由血液中的 单核细胞发育而来，相反，这些巨噬细胞是由胚胎造血系统产生，在胚胎发育过程中定 植到组织中，并且在组织中自我更新和维持。而循环单核细胞对组织巨噬细胞群体的贡 献似乎只限于一些特定的组织，如肠道和真皮。但是，骨髓来源的单核细胞对不同组织 巨噬细胞的贡献程度和动态变化依然存在争议。此外，虽然在正常状态下组织巨噬细胞 的来源和更新被广泛研究，但是在炎症等复杂环境下单核细胞对组织巨噬细胞的贡献的 研究依然缺乏。因此，粒细胞或单核细胞示踪模型将有力助推巨噬细胞领域研究。

对细胞的标记是研究细胞发育和功能的基础，长期以来多种不同的标记系统被开发出 来，其中，Cre/LoxP系统被广泛用于细胞示踪和基因敲除研究，是该领域的基本技术。该技术包含Cre重组酶和LoxP报告系统两部分。Cre重组酶是发现于P1噬菌体中的DNA 重组酶，Cre重组酶能够识别特异的DNA序列，即LoxP序列，并且介导两个同向loxP 序列间DNA片段的删除。LoxP报告系统的组成包括LoxP序列，Stop序列和报告基因。 Stop序列由多个small t intron和SV40poly(A)Signal元件组成，可以抑制下游报告基 因的表达。在Stop序列的两端存在两个LoxP位点。在没有Cre酶存在的情况下，Stop 序列抑制下游基因的表达，细胞不能被标记。在Cre酶存在的情况下，Cre重组酶识别Stop 序列两端的LoxP位点，将两者之间的Stop序列剪切，下游报告基因的抑制被解除，细 胞被报告基因标记，通过检测报告基因表达的产物(通常是荧光蛋白或者酶)实现对细 胞的示踪。Rosa-tdTomato报告品系小鼠的Rosa26基因位点插入了 LoxP-Stop-LoxP-tdTomato序列，Stop序列的存在阻止基因的表达。在正常情况下由于Stop 的存在荧光蛋白tdTomato不能够表达。当细胞内存在Cre重组酶时，Cre重组酶识别Stop 两端同向的LoxP序列并将其删除。重组后Stop对tdTomato表达的阻止被解除，tdTomato 开始表达，细胞被标记上红色荧光tdTomato。这种标记是非可逆的，因此该细胞的所有 子代都会稳定表达红色荧光蛋白tdTomato，从而实现对特定来源细胞的示踪。使用 Cre/LoxP系统对细胞进行示踪的关键是对Cre表达的调控，为了能够在特定的细胞中完 成对Stop的删除，需要使Cre重组酶在特定的细胞和特定的时间表达。为使Cre重组酶 在特定的细胞中表达，需要鉴定出该细胞的特异性表达基因，然后将Cre重组酶编码序 列插入到该标志基因后，使Cre在该细胞中特异性表达。

在现有技术中，存在的主要问题是难以实现对Cre重组酶在粒细胞或单核细胞中的特 异性表达的控制。现有的标记方法主要的缺点是特异性较差，如Cx3cr1示踪系统，该系 统在标记单核细胞的同时还会标记树突状细胞和部分淋巴细胞。

发明内容

为克服现在技术中存在的上述问题，本发明提出了一种粒细胞或单核细胞标记系统， 即一种高效特异的粒细胞或单核细胞标记系统。本发明提出的粒细胞或单核细胞标记系 统在粒细胞或单核细胞前体中对其进行标记，而非在成熟的粒细胞或单核细胞中进行标 记。本发明将粒细胞或单核细胞前体中表达的特异性的启动子(在粒细胞或单核细胞前体中特异性表达的基因)与Cre/LoxP系统结合起来，从而建立高效特异的单核细胞和粒 细胞示踪模型。本发明首次将单核-粒细胞前体中表达的特异性Ms4a3基因与Cre/LoxP 系统结合，成功解决了现有技术无法实现Cre重组酶在单核细胞和粒细胞特异性表达的 问题，从而实现了对这两个谱系细胞的特异性标记。

Ms4a3基因能在粒细胞或单核细胞中特异性表达，基于此，本发明提出了Ms4a3基因在作为粒细胞或单核细胞标志物中的应用。

本发明提出了Ms4a3基因在标记/检测粒细胞或单核细胞过程中作为标志物中的应用。

本发明提出了Ms4a3基因的试剂在制备标记/检测粒细胞或单核细胞的体外诊断试剂 中的应用。

本发明提出了一种粒细胞或单核细胞标记系统，所述标记系统包括5’同源臂 -IRES-Cre重组酶-3’同源臂、LoxP-Stop-LoxP-报告基因；其中，所述5’同源臂的序列如 SEQID NO.2所示，所述3’同源臂的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提出了一种粒细胞或单核细胞前体标记系统，所述标记系统包括Ms4a3-IRES-Cre和LoxP-Stop-LoxP-报告基因。其中，所述Ms4a3-IRES-Cre重组酶由 Ms4a3基因序列和IRES-Cre重组酶序列融合构成。

优选地，本发明所述粒细胞或单核细胞标记系统包括Ms4a3基因-IRES-Cre重组酶、 LoxP-Stop-LoxP-tdTomato报告基因。

在表达Ms4a3的细胞中，Ms4a3基因驱动Cre重组酶的表达，Cre重组酶切割报告基因tdTomato前(上游)的终止信号Stop，从而解除终止信号Stop对tdTomato表达的阻 止，进而表达tdTomato，产生红色荧光蛋白，即可完成对细胞的标记。

优选地，所述标记系统可以包括载体，所述载体包括Cre重组酶编码基因，和LoxP-Stop-LoxP-tdTomato；或所述载体包括Cre-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato。或，优选地，所述标记系统包括第一载体和第二载体；其中，第一载体包括Cre重组酶编码基因；第 二载体包括LoxP-Stop-LoxP-tdTomato。

其中，所述Ms4a3基因特异性表达在骨髓粒细胞和单核细胞前体中，所述Ms4a3基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述Cre重组酶是指来源于P1噬菌体的Cre重组酶，其序列如SEQ ID NO.4所示。Cre重组酶的表达受Ms4a3基因的调控，并与Ms4a3的表达同步，所述Cre重组 酶特异性表达在粒细胞或单核细胞前体GMP中，所述Cre重组酶可以和雌激素受体融 合形成CreERT2诱导型重组系统。

其中，所述IRES为核糖体内部进入位点，序列如SEQ ID NO.5所示。

其中，所述LoxP-Stop-LoxP-报告基因包括LoxP、Stop和报告基因元件。其中，LoxP序列是可以被Cre重组酶识别的DNA序列，Cre重组酶可以剪切掉两个同向LoxP之间 的DNA序列。Stop是一段DNA序列，Stop可以阻止其后面基因的表达。在正常情况下 由于Stop序列的存在，报告基因的表达受到抑制。当存在Cre重组酶时，两个LoxP之间 的Stop序列被剪切掉。Stop对报告基因的抑制解除，报告基因开始表达。其中，报告基 因可以是tdTomato或其他荧光蛋白的编码基因，如GFP、YFP等；优选地，所述 LoxP-Stop-LoxP-报告基因中，报告基因为tdTomato元件。

其中，所述LoxP的序列如SEQ ID NO.6所示。

其中，所述Stop的序列如SEQ ID NO.7所示。

其中，所述tdTomato的序列如SEQ ID NO.8所示.

其中，所述Rosa基因(Gt(ROSA)26Sor)的序列如SEQ ID NO.9所示。

优选地，本发明提出了选择在粒细胞和单核细胞前体中对其进行标记的技术方案， 通过对前体细胞的标记，可以有效标记近乎所有粒细胞、单核细胞和单核细胞来源的其 他细胞，其中所述单核细胞来源的其他细胞包括树突状细胞和巨噬细胞。

本发明还提出了一种标记组合物，所述标记组合物包括如上所述的粒细胞或单核细 胞标记系统。

本发明还提出了一种体外诊断试剂，所述体外诊断试剂包括如上所述的粒细胞或单 核细胞标记系统、或如上所述的标记组合物。

本发明还提出了如上所述的粒细胞或单核细胞前体标记系统、或如上所述的标记组 合物在对粒细胞或单核细胞标记中的应用。

本发明还提出了一种粒细胞或单核细胞前体的标记方法，所述标记方法包括以下步 骤：

步骤1：向粒细胞或单核细胞前体中导入如权利要求4所述的粒细胞或单核细胞标记 系统；

步骤2：Ms4a3基因驱动Cre重组酶在细胞中特异性表达；

步骤3：Cre重组酶识别并切割报告基因上游的终止信号Stop序列，从而解除终止信 号Stop对报告基因表达的抑制；

步骤4：报告基因表达，完成对细胞的标记；

步骤5：通过流式细胞术、荧光成像或其他相应的检测手段进行检测。

本发明还提出了一种粒细胞和单核细胞前体标记系统的构建方法，所述构建方法包 括以下步骤为：

(1)确定以Ms4a3基因作为在粒细胞和单核细胞前体中特异性表达的基因；

(2)在Ms4a3基因后接入IRES-Cre序列，形成Ms4a3-IRES-Cre，实现Ms4a3驱动

下的Cre重组酶的表达；

(3)将Ms4a3-IRES-Cre与LoxP报告系统(LoxP‐Stop‐LoxP‐tdTomato报告基因) 整合，即可构建得到所述粒细胞和单核细胞标记系统实现对细胞的示踪。

其中，所述步骤(2)中，可以将IRES-Cre序列构建在第一载体上，导入所述粒细 胞和单核细胞前体。

其中，所述步骤(3)中，可以将LoxP报告系统构建在第一载体上，导入所述粒细 胞和单核细胞前体。

或者，所述步骤(2)～(3)中，可以将IRES-Cre序列和LoxP报告系统构建在同一 载体上，导入所述粒细胞和单核细胞前体。

其中，所述载体可以是任何基因打靶所用的载体，如pUC19。

具体地，所述构建方法包括：

(1)确定以Ms4a3基因作为在粒细胞和单核细胞前体中特异性表达的基因；

通过对骨髓中造血细胞单细胞测序结果的分析，以及跨数据库的检索分析，本发明 提出了粒细胞和单核细胞前体所特异性表达的基因(Ms4a3)，即，确定Ms4a3基因作为粒细胞和单核细胞前体中特异性表达的基因。

(2)构建Ms4a3-Cre；Rosa-tdTomato小鼠示踪模型/标记系统

构建基于Cre/LoxP系统的粒细胞和单核细胞示踪模型/标记系统，包括步骤如下：将 一段IRES-Cre(IRES，核糖体内部进入位点；Cre，重组酶)插入到小鼠Ms4a3终止密 码子后。在该小鼠中，所有表达Ms4a3的细胞都将同时表达Cre重组酶。然后，将该小 鼠与Rosa-tdTomato报告小鼠杂交，得到Ms4a3-Cre；Rosa-tdTomato小鼠。在该Ms4a3-Cre； Rosa-tdTomato小鼠中，Cre重组酶识别Rosa26位点的两个LoxP序列，并剪切掉其中间 的终止信号序列(LoxP-Stop-LoxP)。当终止信号序列剪切后，该细胞和其子代细胞将持 续表达tdTomato，产生红色荧光，该荧光可以通过流式细胞术和荧光显微成像检测到， 实现对粒细胞和单核细胞的标记。

(3)验证Ms4a3-Cre；Rosa-tdTomato粒细胞和单核细胞示踪系统

为验证该示踪系统的性能，本发明检测了小鼠血液和脾脏中各细胞谱系的标记情况， 发现本发明提出的所述Ms4a3-Cre；Rosa-tdTomato粒细胞和单核细胞示踪系统可以高效 且特异地标记单核细胞(97％)和粒细胞(99％)，对T细胞，B细胞和NK细胞等淋巴 细胞和树突状细胞(包括传统树突状细胞和浆细胞样树突状细胞)则不标记或很少标记。

综上，该粒细胞和单核细胞示踪系统可以高效特异的标记/检测粒细胞和单核细胞。

本发明还提出了所述粒细胞和单核细胞标记系统在髓系细胞发育，巨噬细胞来源和 更新，肿瘤治疗，肿瘤药效评价等领域的应用。如

当Ms4a3-Cre品系与LoxP报告品系小鼠杂交时，用于研究粒细胞-单核细胞前体对外周免疫细胞的贡献，以及对肿瘤浸润细胞的贡献(可以是系统性的flox或特异性的flox模型)；

当Ms4a3-Cre品系与flox小鼠模型(细胞谱系特异性flox DTA或细胞特异性floxDTR) 联合使用以消除GMP，单核细胞，单核细胞衍生细胞(树突细胞或巨噬细胞)；

将Ms4a3-Cre小鼠模型与靶向特定基因的flox小鼠模型结合使用以测试该相应基因在 GMP、单核细胞、单核细胞来源的细胞(树突细胞或巨噬细胞)和粒细胞中的功能(包括在稳态和炎症环境下)，以及相应基因在肿瘤浸润髓系细胞中的作用。

本发明的有益效果在于，本发明的粒细胞或单核细胞标记系统可以特异性地标记单核 细胞或粒细胞，从而有益于单核细胞或粒细胞相关的研究或应用。

附图说明

图1单细胞转录组分析表明Ms4a3在cMoP中特异性高表达。a，对BM cMoP，BM CDP，BM MDP，BM preDC，BM monocytes和blood Monocytes进行tSNE降维分析。b， 对上述a中的细胞群体利用Seurat进行热图和Violin图分析。

图2Ms4a3-Cre粒细胞-单核细胞标记系统的构建方法示意图。将一段IRES-Cre(IRES， 核糖体内部进入位点；Cre，重组酶)插入到小鼠Ms4a3终止密码子后。在该小鼠中，所 有表达Ms4a3的细胞都将同时表达Cre重组酶(图2a)。然后，将该小鼠与Rosa-tdTomato报告小鼠杂交，得到Ms4a3-Cre；Rosa-tdTomato小鼠(图2b)。在该Ms4a3-Cre； Rosa-tdTomato小鼠中，Cre重组酶识别Rosa26位点的两个LoxP序列，并剪切掉其中间 的终止信号序列(LoxP-Stop-LoxP)。当终止信号序列剪切后，该细胞和其子代细胞将持 续表达tdTomato，产生红色荧光，该荧光可以通过流式细胞术和荧光显微成像检测到， 实现对粒细胞和单核细胞的标记(图2c)。

图3Ms4a3-Cre示踪模型小鼠血液各细胞谱系和脾脏树突状细胞的标记情况分析示 意图。a，b，在外周血，只有髓系的粒细胞和单核细胞被标记。c，各谱系细胞标记情况 统计。

图4Ms4a3-Cre示踪模型小鼠用于研究单核细胞对组织巨噬细胞的贡献。a，表明单核细胞对大脑小胶质细胞(Microglia)，表皮朗格汉斯细胞(Langerhans cells)，和肝脏枯否细胞(Kupffer cells)的贡献很低。b，单核细胞对肺泡巨噬细胞/脾脏巨噬细胞/肾脏巨噬细胞和腹腔巨噬细胞有一定的贡献。c，单核细胞对肠道巨噬细胞和真皮巨噬细胞有显著且迅速的贡献。

图5通过荧光成像显示单核细胞对巨噬细胞的贡献。F4/80阳性表示所有的组织巨噬 细胞。F4/80阳性，而tdTomato阴性表示胚胎来源的巨噬细胞。F4/80和tdTomato双阳性表示来源于骨髓单核细胞的巨噬细胞。在肝脏中，绝大多数F4/80阳性的细胞为tdTomato阴性，说明这些巨噬细胞是来源于胚胎时期。在肠道和皮肤中，F4/80阳性的细胞为tdTomato阳性，说明这些细胞来源于骨髓单核细胞。

图6表示本发明示踪模型用于研究肿瘤浸润髓系细胞的示意图。a显示不同细胞亚群在tSNE图上的位置；b不同细胞类群tdTomato的标记情况，灰色表示表达量高，黑色 表示表达量低；c为CD11b、CD172a、MHCII、Ly6C、F4/80和CD64在肿瘤浸润细胞中 的表达，灰色表示表达量高，黑色表示表达量低。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识， 本发明没有特别限制内容。

实施例1确定以Ms4a3基因作为在粒细胞和单核细胞前体中特异性表达的基因

为了确定在粒细胞和单核细胞前体中特异性表达的基因，本发明分选了血液单核细 胞/骨髓单核细胞/骨髓单核细胞前体/骨髓单核-树突前体/骨髓树突状细胞前体，并利用C1 Fluidigm单细胞平台制备单细胞文库，进行单细胞测序。

实验结果如图1所示，a，单细胞转录组数据通过tSNE降维分析后，细胞被聚类到不同的簇(Cluster)。Ms4a3特异性表达在cMoP簇中。b，热度图显示Ms4a3在cMoP 中表达。c，Violin图为不同基因在各细胞群体中的表达的比较，其中Ms4a3呈现最特异 的表达。

实施例2本发明Ms4a3-Cre粒细胞-单核细胞标记系统的构建

构建方法，如图2所示，包括以下步骤：

步骤a，利用Crispr-Cas9基因编辑的方法将IRES-Cre序列插入到Ms4a3终止密码子 后。

步骤b，Ms4a3-Cre小鼠与Rosa26-tdTomato报告品系小鼠杂交得到Ms4a3-Cre；Rosa-tdTomato示踪小鼠。

本发明中，示踪系统工作原理为：在表达Ms4a3的粒细胞单核细胞前体中，Cre重组酶与Ms4a3同时表达，Cre重组酶识别Rosa26位点的Stop序列并将其去除，使得 tdTomato开始表达，因此该细胞及其子代细胞都会被tdTomato标记，带上红色荧光，可 以通过流式细胞术和荧光显微成像对其进行检测。

实施例3 Ms4a3-Cre；Rosa-tdTomato粒细胞-单核细胞标记系统的验证

具体步骤如下

步骤a，取小鼠外周血，裂解红细胞后通过流式细胞技术检测各细胞亚群的标记情况。

步骤b，取小鼠脾脏，研磨成单细胞悬液，裂解红细胞后通过流式细胞技术检测树突 状细胞的标记情况。

实验结果如图3所示，Ms4a3示踪模型小鼠血液各细胞谱系和脾脏树突状细胞的标记情况分析。其中，图3中的a，b表示流式细胞术检测模型小鼠外周血中个谱系的标记 情况，粒细胞和单核细胞被高效标记，T细胞、B细胞和NK细胞等淋巴细胞未见标记； 脾脏中的树突状细胞只有非常低的标记。图3中的c表示各谱系细胞标记情况统计，统 计结果显示粒细胞的标记比例超过99％和单核细胞标记比例超过95％，T细胞、B细胞 和NK细胞等淋巴细胞的标记比例小于1％；脾脏中的树突状细胞的标记小于10％。

实施例4通过标记粒细胞单核细胞研究单核细胞对外周免疫细胞的贡献

具体步骤如下：

在不同的时间点检测组织巨噬细胞的标记情况，可以区分胚胎来源的巨噬细胞(tdTomato阴性)和单核细胞来源的巨噬细胞(tdTomato阳性)，得到单核细胞对组织巨 噬细胞的贡献。同时可以分析这两种不同来源的巨噬细胞在基因表达和功能上的差异。

实验结果如图4所示，a，表明单核细胞对大脑小胶质细胞(Microglia)，表皮朗格汉 斯细胞(Langerhans cells)，和肝脏枯否细胞(Kupffer cells)的贡献很低。b，单核细胞 对肺泡巨噬细胞/脾脏巨噬细胞/肾脏巨噬细胞和腹腔巨噬细胞有一定的贡献。c，单核细 胞对肠道巨噬细胞和真皮巨噬细胞有显著且迅速的贡献。

实施例5本发明应用于通过荧光成像对单核细胞进行示踪

具体步骤如下：

取小鼠各器官(肝脏、结肠、小肠、皮肤)，并在1％的多聚甲醛中固定过夜，用OCT包埋后进行冰冻切片。对切片进行染色，抗体为AF488标记的F4/80抗体。染色后通过 激光共聚焦显微镜进行成像。

实验结果如图5所示，组织巨噬细胞(包括胚胎来源的巨噬细胞和骨髓单核 细胞来源的巨噬细胞)为F4/80染色阳性(灰度值表示F4/80表达强度，灰度越 高表达越强)。其中，胚胎来源的组织巨噬细胞为tdToamto阴性，骨髓单核细胞 来源的巨噬细胞为tdTomato阳性(灰度值表示tdTomato表达强度，灰度越高表 达越强)。在肝脏中，绝大多数F4/80阳性的组织巨噬细胞为tdTomato阴性，说 明这些巨噬细胞是来源于胚胎时期。在肠道和皮肤中，绝大多数F4/80阳性的组 织巨噬细胞为tdTomato阳性，说明这些细胞来源于单核细胞。

实施例6本发明应用于肿瘤浸润髓系细胞来源和功能的研究

肿瘤中存在大量的髓系细胞，其数量远远超过淋巴细胞。但对肿瘤浸润髓系细胞的 研究进展缓慢。为了研究肿瘤浸润髓系细胞的来源和功能，本发明构建了小鼠B16皮下移植瘤模型，利用本发明的示踪系统，本发明对肿瘤浸润髓系细胞进行了系统的分析。

实验结果如图6所示，本发明的单核细胞示踪系统可以有效的在肿瘤中对肿瘤浸润 髓系细胞的来源和功能进行研究。a显示不同细胞亚群在tSNE图上的位置；b不同细胞类群tdTomato的标记情况，深色表示tdTomato阴性，浅色表示tdTomato阳性；c为CD11b、CD172a、MHCII、Ly6C、F4/80和CD64在肿瘤浸润细胞中的表达，浅色表示表达量高， 深色表示表达量低。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领 域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保 护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市免疫学研究所

<120> 一种粒细胞和单核细胞标记系统及其标记方法和应用

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtttagacc ctgggaactc tggttggttg atattgttgt tctttttttt tttttttttt 60

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ctcttgattc tagctgcata tgtatcaaaa gatggcctag tcagccatca ctggaaagag 2400

aggcccattg gacttgcaaa ctttatatgc cccagtacag gggaacgcca gggccaaaaa 2460

gtgggagtgg gtaggtaggg gtgtgtgtgg gggggagggt atgggggact tttaggatag 2520

cattggaaat gtaaatgagg aaaataccta ataaaaatat taaaaaaaga aataaagtcc 2580

tcatagagac catatatgag aacaagtcat ttccaccata caaaactatc tgacttctag 2640

ccttgaaggg cttcagacac agggtcccaa cctaagctga agcctcagat gatccccgaa 2700

agccactggg gtacagtggg ccaaggtaag acactggagg actgtcattc atttttgtac 2760

tcccagaaca tggggcatgg gctgctttta tcactgttaa cattagagtg aggtctagtc 2820

agaatcgttc ctaatagagg atgaaatttg cctttgtttg tttgtttgtt tgtttttaaa 2880

ttgctatgac aaaaaaaaaa cccagactaa atgaacgtag gaaagcttta tgcctatttc 2940

caatttgaag ggaggggtgg tgacaagggc tgctctggcc ctgccagcag agtatgtgat 3000

gggctggtca cactctctgc agtcaggaag cagacagatg agtgctcact cagctcacgg 3060

ttcctttttc atccagtcca aagccatggg attttgaatt ccatattcag gattcatctt 3120

ctaagttaaa tgcttatggg aactctctca cagaggtaac cagagtcata attcatatcc 3180

caggcaaccc taaatgtcta attatgagtg tctgccctct gctttctctc aagtgttctc 3240

cctcactccc tctattctat ggtgtgacat gaaagccctc agaagtgcta gtgttctggc 3300

acaggacttt tcagattcta tggccacgag aaaaataaac tcttcttctt tataacccac 3360

cctgtcagtg gcattctctt atactatcag acaacagacc aatacatctg gataaatatg 3420

agagaatctg attatctcct ctatgtcagt tttgtctttc attacattga ttcagtagtg 3480

gtatttaggt catgggttat cccaaggatg gaagaaatgg atgcaccctg aagcaaattg 3540

aacagcaagt gacagttgat gtaaacgcaa tatatttaaa ttaccattgt cttaatttat 3600

gacaaatgaa ctaaccttgc ttggcctgag aggattaaac attataattt ctataaaaac 3660

agttttagca acatcactga tacgttatgt aaactcagtc ccttaatggc cacaatatgt 3720

tgttcccctt cccaacacta ttcattctgc ctggcttcac ttttttttta catagctaga 3780

cttattctcc cccatcccac tctaccttcc cactgactta gccccttgtt ctgcttttat 3840

ttcttgctcc aataatgtgt gaagcaacat cttagagcca gatgctgatg gctccatata 3900

ccagcttcct tcttaatggt atacttgggg aagtgggtgg gccattagtg ccctcaaata 3960

ggagtgttat tagcacacct ttcaggcagc cagcaaaacc acttccactg gacttgctga 4020

ggaattgcac aaagaagaga ttcgttaagc ctgaggagga agagactgct ggttttgggg 4080

gacagactct ggtggtcatt actgtctcct cttctgtaat gagttggact tgcaggggaa 4140

ggacttgtca aatcctgaat tcttcaaggt aaaccctacc agacctttct ccattggaat 4200

catctcttca tttttctgtc tgctaagggt ggctttcttg ggataaaagt cttctgtttc 4260

atttctcagt agaggtttgg aatttttagc tgtgtggaca aatgtctttg gaatgcagat 4320

attacctggc gcctggtaac ccggtgccat gatttttggc ataatatatt tggaaaatgt 4380

agacatggat agaccaatgt taggcaggca gtcaggcacg cacgcgcaca cacacacata 4440

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacatt ttgacatatt 4500

aagaggctgc ctctgagttt ggtggccagg tctagctatg agaggtggcc tgaatgataa 4560

gttttgtgag ggagatcctg cctgagtgca taagagtgtg gtgataatta gaggcagatt 4620

tgacccttaa cttctcagat ccctgccagg tggacttggg aatgttattt aatgctctat 4680

ttcttagatt cctcatctgt aaaatggaaa gtgtcataat gacaatacac attccaatag 4740

atgttttgca aactgaattg gttgacatga gtaaaacacc cagaagtgtt ctacacagat 4800

agagctgggg agatgaactc cttagtggga cactaggaag cctacaattt ctagatttct 4860

tttaaaagcc aaattgacta tattttgtag aacatggctt gctttacctg aaggctggag 4920

cttaccttca attcttttct aaaaagctca acaatgtgtc agacctccaa agccattgtg 4980

tggtgttttc agcatgaaga cccagtgcct gctaatggat tttctattat tattcttaaa 5040

catggctatt tataaagttt gtattagata tatatgaact gtgaggcagt gaggcagatg 5100

agcacacaga gagatgcaag cacctttaaa attgaagctc agcctgaggt gtgtggaact 5160

tgtgctgaag ggattcccag aacatgaaga aagggttcac cattcagact aggccaggac 5220

taaaagggtt ttttgaaagc ttgattttgg cagtatccag gccaagttgt agtggggaga 5280

gaggatttgc tttgtgaaga gaatagtttt agggtataaa ggcaaggcgc agggtgtgac 5340

ttctggaact cagaccctcc tcagaagagc aatcctgatg cgtggacaag atgaactctt 5400

ctgtgacact aaaaaatact gttagaaagt ggtccaagga ggcaccaagc ctgtgagttc 5460

ttccccatga tagccccaaa cagccccaaa tggcctccca ggaatctcat aatacaggac 5520

tggggatctc ggcaggtggt acctcatcag gcagacacat gaagccagag gagactggtg 5580

gttctgttta tcagcccttg gatgagtcac gccatgttca acgaggtgta ctgcaagccc 5640

tcggggtaag tcagcctttg ctataaagtt ggcttatgag agaaggagca aaagattata 5700

tggacattct gtaaatttct tcctgtaaat ttctgagtta tttatcaagt cactgaggac 5760

aagatagggt catggagatc tgaggagtag aaatggagaa tcagtcagtc tctcataggg 5820

agaatatcca ccccagcgta cctcagagaa tttgttctaa ggctctttat tgtttcttgg 5880

tgctttctga ccacttatat caggaggttg agttctgtga agttcccctc tcttcccctc 5940

tccttccccc actccccttc ccttccctcc cccttgcctt ctttcccctt ctctcccctc 6000

cctttccctc ccctcaccct tgcctttttt ccccttctct cccctcttcc ttctttcttc 6060

ccttcttccc tctctctttc atcccccctc ccttaccact cctccccttc tctgccctcc 6120

ctttccctcc tctcctctct tctgtctttc ctgtggtgct ggggatgaga accaggtcct 6180

cctggatgcc aggaaaatgc tattattcag ttaaaactcc aaccctttgt acagttttta 6240

tatggagtct tactaaatca cacaggttgg ccttgaactc attctgtagc tcatatagat 6300

gtttctacct catcaccata atctatattt taaataaaaa tattttaaaa taaaaatttg 6360

acagctacct ggctttgtcg tatttctcag aacaagattt tgttcagtta atttaggctt 6420

agcatttaaa ccatttaaag gcacaataag tccttttgga ggaaaataaa aataacatta 6480

tacctttttt ttttcttcgt cttccttaca ggccatccag atcctgaatg gaatactgat 6540

tctagctctc ggaatttttc tggtttgttt acaacacgtg tcccaccact tcaggcattt 6600

cttcttcttc accttctaca caggctaccc actgtggggt gctgtgtttg tgagtattca 6660

tttccttggc catagaccat ctcctaccca gcactgctag tgtgctagta tgaaagtgtt 6720

ctttgaagat taccagctgt ggttttgatt tataatttcc aacaaaagta ggcaaaagtc 6780

tctttctttc tgtgcaactt atgattttac tttttgttat ggccaaataa aatcctgttg 6840

tgtatacgta ctacatttta tttatccatt catttgttga tgggcatgat ggacatgacc 6900

agttccatct cctgggtatt atgaatggtg cagcaataaa catgggttta taagtatctt 6960

agtggtgaaa cataaaagtc cttggataca cacacacaca cacacacaca cacatacaga 7020

gagagagaga gagagagaga ggcacatgca cacaaatgga gaatcctata gcttcaaagc 7080

tttctagact cagaaaaata aaaattgtat gatttttctc ccttgcaact cctagatttt 7140

aattttatat attcacctat aagtatgtgt gggtgtgggc ataagttgtg agactagaat 7200

agagacgaga agaggagaaa agagatctgc agggaaggaa gagggacaga agacagcagc 7260

agcagcagaa gcgtcacgtg agagaagatg gagggtcagc attggttctc agtctgagaa 7320

aagactgtat gtgttttcag ttcatgctcg ttcacaatgg cactttgaat ttgacattcc 7380

tgaaattctg agaaagttaa gataaagttt tgatggaata gttaagctct gaagtattcc 7440

tgaattgttc tgcataataa atcttgacag cccaagtgaa gaatttctgc actgcatttt 7500

agaaaagaca gaagtgaaga atttcaggtg ttgcataagt attgggtttt attttctcag 7560

aaagtgaaat tagtttattt aaaaaatgga aggggagcca gaaagatggc tcaatagagc 7620

actggctgtt ctcccagaga actcagcttc gatttacagc acccacaagg aggctcacaa 7680

ctgtctctac ctccagttct agatccaata ctctcttgtg acgtagagac acatgcaggt 7740

cacacacata aatttaaaag ggggaaggaa ttagggacca ggatttgctt aagcacacca 7800

aaagatttga gcactgatta caattctcaa agttgctcta tggccccaat acacggtcag 7860

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tgaactgctg tgtactcact atagggtcct tcctattgct tcatctttta taatcctatc 7980

aaggatgtgg tttaaaggat tagacgtgaa cgtttgccct cagtttcctt attaggatgt 8040

cagaaatagc aaaacgatct tcttttgagg tctctgaaat gaaatgagag acgtatatta 8100

tcattaattt ggatggtttc tttctcctgc actttttaca tagtctcccc attttaatag 8160

cacacaactg ttagttgatg atgttaacat ggggatatgc tgttggatgg ggaaagaagc 8220

tgaggtgaaa aaaggcttag taacctacct agaatcccat gctggatcct atgagctgga 8280

gctactattg aaaacagtcg ctcattcaca aagtgtaggg ttgggaagac ctgtgaaaaa 8340

tctctggtat ctgagacaga actcaaaacc tcttcctaca ttttcatcta gaattcagta 8400

gttaagtttt gcttagcaag cctttattct tcaagattta gtaacttggt taaagtgttg 8460

taaaatctta ccaactgaaa attttggaaa atcataaata caaagaaaat ctaatttgtc 8520

agaatcagag tcatgggaag gtagtgcatg aatataatga tttgaaaact ggagaacata 8580

tttagattta taaattctct tttgaagcat ctagaccaat aaattacaga tttgaaatat 8640

gggcaacaat gtgagaattt aaaaatgtat catttataga aatataaata taggcacaac 8700

tatagtattt cattatttgg ctgaatacat taaacccatt aaaaggtaga cataaacaaa 8760

ctgaaattat gatgaattta cttataatag actatttaaa tttagacata taaagaaagt 8820

aatacataat gcaaagtata cttttgtgtg aactgaacaa aaccaatttg tgtaacttct 8880

actgatagct gctgccgggg ggataccatg gagaaagtgg tcaagactaa atgtcccttt 8940

atccgtccta cttcctattt taaacagttt atcagctcag gatccttgac tgttgccgca 9000

gggagaaacc ccacacgaat gctggtaagt gctgactctt cctctttttc tctatgttca 9060

gatgaacaga aatgaattac ccaccaacag tagaaaacag agggtgggtc tagctgagga 9120

accaagtctc gtttaatgca caggattttt gtgtgctgtt aggtttaaca aattattttt 9180

agtgaaaggt ctttcaccac tgtctttgaa tttgaaagca aaaatttctc tccttttgat 9240

tgttcattac aaaataggta actctctgtc ttatgttctc tgcgttatct agctatttag 9300

tcccattctg ttcaattcct tccctgcccc cagtgcattt tcatcacagc attccatttt 9360

caaataccta tcttttttct ttcattccca ctccctgatg ggtttgctct ctgttctgag 9420

aaactgcagc catggagaga ctttcaggca cacacactaa cacactgtgt gctctagacc 9480

tgctccagtg tatcttttcc tcagctttta ccagggagga actcaccgac tttctttaaa 9540

actaattctc ctacttgggt gttctagccc atgccttttt ccattatata aattcatcat 9600

tttaatacgt ttctactagg tactttaaat ttatatcagt atataagaac attgctgact 9660

gtctgtctgt ctgtctgtct gtctgtctgt atctatataa tcttggcatt atttttccct 9720

gatagctagg tatagttcat ttttctgctt gtgacaaaac tccattttaa aggagtaatg 9780

tatagtctat ctacaattct tatctattca gttatagtta aaccttccta ccttcctcat 9840

tcttttgttt cttcctggcc tctgtaactt ctctctttaa gaatattgaa ggtatccagg 9900

ttgctaaaac acttctcagt tcatggccca ctcctgactt cacttataaa cagtgtttta 9960

gctcaactcc tctcctgatt atttttctct tgggctccag aacaccttga gtggcttatg 10020

ttcctcttgt cctttgaagt caccttaata gtctcctgtt gaggtttact ctgttgctat 10080

ttattataat gctaaatact ggcccccaag atctggttcc ctcagggaag aggtagtcct 10140

ctcatacacc aagtgatgct atgtaacctt gatcctttac ttaaaactat tggttaaata 10200

aagatgccta cagcctatag ctgggcagaa gagaggtagg tggggcttgg ggtctgagaa 10260

gagaaccagt agggagagag aaggtagaga gaggaaaaga tgtcatgggg taagagatag 10320

tgagaactgg ctgtgagggc tggccagtca gagtaagagt ggttcaggca gaacatggca 10380

agtcatatct tggggttatt gacagggaag tagacaggat agcgctggag tcgatatctg 10440

cccagctcta gtgctttaaa ggcttattat aaatataaaa gctttgtgtc ttttgtctgg 10500

gaactgcatg atcaaaggcg ggatagaaac ccctgattca gattaaatat ttactacaac 10560

agtctcaact tctttttttc aggctgttca gggctaggtt cccagtgttt ctgttgttgg 10620

catctacact gcacagtcta tatttacttt gatgatttca gccattttca ttgcttcaga 10680

tgacaccgct cctgacaaaa atattgtttt ttgatcacac tccaaacaaa atttttttat 10740

ttttaaaaaa atttttataa ttgtttattg atcacactcc tgacaaaaat attgttctgg 10800

caagattttt ctcctgagca tctggttgtc ccatcatttt tgcttctact tacacatctg 10860

aaaggtctaa actcagcttc tattatccct caaacttgtt ccatgaagtg cctgtcagct 10920

gatggaaact tcctcctttt agattcttag accaatacca tgagctagcc ctatcccaat 10980

ctcttctttc acattactga agccagtatc agcaaattcc atgggctcca ccttacaaat 11040

tacctgcgtg tgtagctttt tctcatcttt cctctgatag cattccatgt agtctcccaa 11100

ttgggctctt cgcttctatt tgtgaatctc attttttgat cttaataaag acaaagtgac 11160

tcagcttgaa ttattgctct gtcatttctt tgctcaaaat cctccatcca ttttgtattt 11220

ttctcaggat tagaaataga ctttgcatga attacatggc tttacataat agatatcgct 11280

gttaattctg actcagtgtc ctaatcttta tctaccctgg ctctcttgat tcctgggaac 11340

atatggcctc agggactttg ggctgttttc ttcacccaga ccttctttgg atcatctagg 11400

gaaattctca gttatttatt cctatcccca tatgttatta ctgtgcaacg tcacaaactt 11460

ctactacttt ctctggtttt ccactttgtt agactattct actagcctca atacttagtt 11520

gcttaaaaat atagcataat ttatacacta gtatgtttat agttttcctt ttttttaaaa 11580

ttgagatgtg gtcttatgta ttataggcta gctttgagtg gtaatctctg tcatcaccca 11640

cagagtgctg gaattacagc atcaatggca cccagtttat gcagtactga tgactgatac 11700

tggggcttag tgcatgctag gcaagtgttc taattgtgta tcctaacccc ttctctgttt 11760

tactgctaga ctgtacactc ttggtgcaat gggagaatct cagttcatgg gaaattgctc 11820

tgtgtctaaa atactgtggg gtgcttaaat atatacttct gttgccaagg ggttaaagga 11880

tgttctacct atattaatgg acattttgtt tttgttttag atgcaaaaca gttttgggat 11940

aaacattgcc agtactacaa ttgcatttgt tgggactgtt ttcctttctg tgcatttggc 12000

attcaatacc caggctttca agggttgcca atcttcaccg tcacctgatg tctgcatttc 12060

cctgggttcc tcatcagatg tatgtttaaa aactgttaat agcggcagtg ggtggcgtgg 12120

ggagcagggc atggggaggg tataggagac tttcggagag gaaaatagga aggggaataa 12180

catttgaaat gtaagtgaag aaaatatcta ataaaaaaac tgttgataac atatttcaaa 12240

ccattcaaaa gatacaggaa aacagtaggt tgtatactat gttaacttga atattggctt 12300

tgttatttat tagttttgta atgaaggaca aattagacaa tctgtctata ttctaatttt 12360

cttatctttg aaataaatat aataatgagt agcacctacc taatggattg ctataaaatt 12420

cagtacgtta atacttgata agtaatgaaa acagtgttta gccatcacgt tgtattatta 12480

ttactgctat ttattatact ctccagaaat aatacattaa tttattttac atacatttga 12540

tgtaacaaac ttcagagaca taccacttaa tctgcaacat ggaacgtttg tgcatgctag 12600

gtatacacta tcaacttagc tatactcata catatatttg gtctaaattc tgtgtgacca 12660

tgtgagtgtg ttgcctatat ccccagcatt atgtatatat gtatgtatgt atgtatgtat 12720

gtatgcatgt atgtgcacta tgtgttttct tggtgctgga ggaagttgga agagataact 12780

tgatctcctg gacctgaagt tacagatggt tgtggcaaac cacattggtg cttggaattg 12840

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atcctttatt aaatttttaa tcacctaaat ttgtatttat ctatgtctat ttttatggat 12960

taagtggtat ttttcctcta tagaaatttg atcatgtatt tcttctagca atgatgtatt 13020

tcattctcag aaatgatgga aggataattt tctgcagtac tgtgctgagt ttctcccagc 13080

agtgtatttt gtcccatagg cctattataa atgcttacac ttcccctgaa agcctgtcag 13140

tgaaatcgta attttaatcc attttaataa actgtgtatt ttttctgtat gttgaataag 13200

cattcgtgat agtgtcagaa tctttcttct gtgatttctt ctccccttga ctagttcaca 13260

gaggtcaatc ttcagtctga tctgcgttcc actttaggac attgtgggtg ttcttcagcc 13320

tgctttcctg ctgacaagtt ttccctctgg atgttttcac tgatttgatc tgagacatcc 13380

ttttcctagg gcctggtgtc tttaatgctg attctcaccc tgctggagct gtccgtgacc 13440

atttctatct ctgccatgtg gtgcttggga aatgtttgtg gtttaagaga ggtgagttgg 13500

tgtcaatgtt gggcaagttc ggtcatctga aaactccaca atggttgaag ctatttccaa 13560

cttttagaaa aagaaacctt tgtatgatta tgatttgtgg ggttctaggg attatttctt 13620

agatcagtgt gtgagatgaa gtaaggttgg aaatgattca gatttgaaag tgcaaggtat 13680

atattagtat gcattttaat gtaattaaaa ttaatttgac ttattttctt ctgacttttt 13740

acttttgagg tgtatgtctc aggatgacca catattcttg ctagatattt agatcttgta 13800

atttagtttc ttaaaaattt ccacttgtaa ttcgtttttg gccaaagaat ctttacacgg 13860

ccctagtgga ctcctaagag tgggaatgag gtgtctctga ctccttcatc tactctttgg 13920

accccttcct cctagtctca ttgcatcttt ttaggccaga ttggttgata tccccaggaa 13980

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gaactgggag gactggagga aggggacatt gcagacggga tgtattgtat gagagaagga 14100

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ccacagaaat ggaaataaaa atgttctgat ggtctctggt ccacatgcat gttatcactt 14940

ttcagtgttt aacagagaaa tcatcagggc agaaatcttt gtggattcgt gatagtgatc 15000

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agctaaatac ctaataaaaa atggaaagaa aaaaaaaaaa gaaaagcctg tttgtgccag 19260

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<210> 2

<211> 5400

<212> DNA

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<400> 2

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tgagctctgg gagtactggt tagttcatat tgttgttcca cctatagggt tgcagatccc 2940

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gctaactgtg agcatccact tctgtgtttg ctaggccccg gcaaaacctc acaagagaca 3060

gctatatcag ggtcctttca gcaaaatctt gctagtgtat gcaatggtgc cagcatttgg 3120

aggctgatta tgggatggat ccccgggtat ggcagtctct agatggattt aaaagtaaat 3180

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aagattttgg ggttatgttt ttgttttgtt ttgttttgag aaggagcaca tgaagttggg 3300

tgggttggga actgaggaag ctctgtgagg acttgtggga gggaaaagaa tatgatgaac 3360

atatatttta tgaaaattga gaaaaattaa aaatataatg aaaaaatcta ggctataatt 3420

aactaagcaa agaaacttga tatcaaagag aaagccagag taaaatacac gtgaaaagcc 3480

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<210> 4

<211> 1056

<212> DNA

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<400> 4

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<210> 5

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60

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<210> 6

<211> 34

<212> DNA

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<400> 6

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<210> 7

<211> 2571

<212> DNA

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ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca 780

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tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 1680

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tgctaagttt tttgagtcat gctgtgttta gtaatagaac tcttgcttgc tttgctattt 2100

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gacatccccg attacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 1020

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acatgctcac ccgagtttta tactctcctg cttgagatcc ttactacagt atgaaattac 1620

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ttccctaatg agccactatg gatgtggcta aatccgtcta cctttctgat gagatttggg 3420

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cagaacataa cttcttaagg aaccttccca gattgccctc aacactgcac cacatttggt 5820

cctgcttgaa cattgccatg gctcttaaag tcttaattaa gaatattaat tgtgtaatta 5880

ttgtttttcc tcctttagat cattccttga ggacaggaca gtgcttgttt aaggctatat 5940

ttctgctgtc tgagcagcaa caggtcttcg agatcaacat gatgttcata atcccaagat 6000

gttgccattt atgttctcag aagcaagcag aggcatgatg gtcagtgaca gtaatgtcac 6060

tgtgttaaat gttgctatgc agtttggatt tttctaatgt agtgtaggta gaacatatgt 6120

gttctgtatg aattaaactc ttaagttaca ccttgtataa tccatgcaat gtgttatgca 6180

attaccattt taagtattgt agctttcttt gtatgtgagg ataaaggtgt ttgtcataaa 6240

atgttttgaa catttcccca aagttccaaa ttataaaacc acaacgttag aacttattta 6300

tgaacaatgg ttgtagtttc atgcttttaa aatgcttaat tattcaatta acaccgtttg 6360

tgttataata tatataaaac tgacatgtag aagtgtttgt ccagaacatt tcttaaatgt 6420

atactgtctt tagagagttt aatatagcat gtcttttgca acatactaac ttttgtgttg 6480

gtgcgagcaa tattgtgtag tcattttgaa aggagtcatt tcaatgagtg tcagattgtt 6540

ttgaatgtta ttgaacattt taaatgcaga cttgttcgtg ttttagaaag caaaactgtc 6600

agaagctttg aactagaaat taaaaagctg aagtatttca gaagggaaat aagctacttg 6660

ctgtattagt tgaaggaaag tgtaatagct tagaaaattt aaaaccatat agttgtcatt 6720

gctgaatatc tggcagatga aaagaaatac tcagtggttc ttttgagcaa tataacagct 6780

tgttatatta aaaattttcc ccacagatat aaactctaat ctataactca taaatgttac 6840

aaatggatga agcttacaaa tgtggcttga cttgtcactg tgcttgtttt agttatgtga 6900

aagtttggca ataaacctat gtcctaaata gtcaaactgt ggaatgactt tttaatctat 6960

tggtttgtct agaacagtta tgttgccatt tgccctaatg gtgaaagaaa aagtggggag 7020

tgccttggca ctgttcattt gtggtgtgaa ccaaagaggg gggcatgcac ttacacttca 7080

aacatccttt tgaaagactg acaagtttgg gtcttcacag ttggaattgg gcatcccttt 7140

tgtcagggag ggagggaggg agggaggctg gcttgttatg ctgacaagtg tgattaaatt 7200

caaactttga ggtaagttgg aggaacttgt acattgttag gagtgtgaca atttggactc 7260

ttaatgattt ggtcatacaa aatgaaccta gaccaacttc tggaagatgt atataataac 7320

tccatgttac attgatttca cctgactaat acttatccct tatcaattaa atacagaaga 7380

tgccagccat ctgggccttt taacccagaa atttagtttc aaactcctag gttagtgttc 7440

tcactgagct acatcctgat ctagtcctga aaataggacc accatcaccc ccaaaaaaat 7500

ctcaaataag atttatgcta gtgtttcaaa attttaggaa taggtaagat tagaaagttt 7560

taaattttga gaaatggctt ctctagaaag atgtacatag tgaacactga atggctccta 7620

aagagcctag aaaactggta ctgagcacac aggactgaga ggtctttctt gaaaagcatg 7680

tattgcttta cgtgggtcac agaaggcagg caggaagaac ttgggctgaa actggtgtct 7740

taagtggcta acatcttcac aactgatgag caagaacttt atcctgatgc aaaaaccatc 7800

caaacaaact aagtgaaagg tggcaatgga tcccaggctg ctctagagga ggacttgact 7860

tctcatccca tcacccacac cagatagctc atagactgcc aattaacacc agcttctagc 7920

ctccacaggc acctgcactg gtacacataa tttcacacaa acacagtaag aagccttcca 7980

cctggcatgg tattgcttat ctttagttcc caacacttgg gaggcagagg ccagccaggg 8040

ctatgtgaca aaaaccttgt ctagaggaga aacttcatag cttatttcct attcacgtaa 8100

ccaggttagc aaaatttacc agccagagat gaagctaaca gtgtccacta tatttgtagt 8160

gttttaagtc aattttttaa atatacttaa tagaattaaa gctatggtga accaagtaca 8220

aacctggtgt attaacttga gaacttagca taaaaagtag ttcatttgtt cagtaaatat 8280

taaatgctta ctggcaaaga ttatgtcagg aacttggtaa atggtgatga aacaatcata 8340

gttgtacatc ttggttctgt gatcaccttg gtttgaggta aaagtggttc ctttgatcaa 8400

ggatggaatt ttaagtttat attcaatcaa taatgtatta ttttgtgatt gcaaaattgc 8460

ctatctaggg tataaaacct ttaaaaattt cataatacca gttcattctc cagttactaa 8520

ttccaaaaag ccactgacta tggtgccaat gtggattctg ttctcaaagg aaggattgtc 8580

tgtgcccttt attctaatag aaacatcaca ctgaaaatct aagctgaaag aagccagact 8640

ttcctaaata aataactttc cataaagctc aaacaaggat tacttttagg aggcactgtt 8700

aaggaactga taagtaatga ggttacttat ataatgatag tcccacaaga ctatctgagg 8760

aaaaatcagt acaactcgaa aacagaacaa ccagctaggc aggaataaca gggctcccaa 8820

gtcaggaggt ctatccaaca cccttttctg ttgagggccc cagacctaca tattgtatac 8880

aaacagggag gtgggtgatt ttaactctcc tgaggtacct tggtaaatct ttgtcctgag 8940

taagcagtac agtgtacagt ttacattttc atttaaagat acattagctc cctctacccc 9000

ctaagactga caggcacttt gggggtgggg agggctttgg aaaataacgc ttccatacac 9060

taaaagagaa atttctttaa ttaggcttgt tggttccata catctactgg tgtttctact 9120

acttagtaat attataatag tcacacaagc atctttgctc tgtttaggtt gtatatttat 9180

tttaaggcag atgataaaac tgtagatctt aagggatgct tctgcttctg agatgataca 9240

aagaatttag accataaaac agtaggttgc acaagcaata gaatatggcc taaagtgttc 9300

tgacacttag aagccaagca gtgtaggctt cttaagaaat accattacaa tcaccttgct 9360

agaaatcaag cattctggag tggtcaagca gtgtaacctg tactgtaagt tacttttctg 9420

ctatttttct cccaaagcaa gttctttatg ctgatatttc cagtgttagg aactacaaat 9480

attaataagt tgtcttcact cttttcttta ccaaggaggg tctcttcctt catcttgatc 9540

tgaaggatga acaaaggctt gagcagtgcg ctttagaaga taaactgcag catgaaggcc 9600

cccgatgttc acccagacta catggacctt tcgccacaca tgtcccattc cagataaggc 9660

ctggcacaca caaaaaacat aagtcattag gctaccagtc tgattctaaa acaacctaaa 9720

atcttcccac ttaaatgcta tgggtggtgg gttggaaagt tgactcagaa aatcacttgc 9780

tgtttttaga gaggatctgg gttcagtttc tgatacattg tggcttacaa ctataactcc 9840

agttctaggg ggtccatcca acatcctctt ctgttgaggg caccaaataa atgtattgtg 9900

tacaaa 9906

Claims (7)

1.一种粒细胞或单核细胞前体标记系统，其特征在于，所述标记系统包括Ms4a3基因-IRES-Cre重组酶，LoxP-Stop-LoxP-报告基因；所述Ms4a3基因是粒细胞或单核细胞前体GMP所特异性表达的基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；所述Cre重组酶是指来源于P1噬菌体的Cre重组酶，其序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求 1所述的粒细胞或单核细胞前体标记系统，其特征在于，所述Ms4a3基因驱动所述Cre重组酶的表达，所述Cre重组酶切割报告基因上游两个LoxP之间的终止信号Stop序列，从而解除终止信号Stop对报告基因表达的阻止，所述报告基因进行表达，完成对特定粒细胞或单核细胞前体的标记。

3.一种标记组合物，其特征在于，所述标记组合物包括如权利要求1所述的粒细胞或单核细胞前体标记系统。

4.一种体外诊断试剂，其特征在于，所述体外诊断试剂包括如权利要求1所述的粒细胞或单核细胞标记系统、或如权利要求3所述的标记组合物。

5.如权利要求1所述的粒细胞或单核细胞前体标记系统、或如权利要求3所述的标记组合物在非治疗与诊断目的的对粒细胞或单核细胞标记中的应用。

6.一种非治疗与诊断目的的粒细胞或单核细胞前体的标记方法，其特征在于，所述标记方法包括以下步骤：

步骤1：向粒细胞或单核细胞前体中导入如权利要求1所述的粒细胞或单核细胞标记系统；

步骤2：Ms4a3基因驱动Cre重组酶在细胞中特异性表达；

步骤3：Cre重组酶识别并切割报告基因上游的终止信号Stop序列，从而解除终止信号Stop对报告基因表达的抑制；

步骤4：报告基因表达，完成对细胞的标记；

步骤5：通过流式细胞检测或荧光显微镜检测。

7.一种粒细胞和单核细胞前体标记系统的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

在粒细胞和单核细胞前体的Ms4a3基因后接入IRES-Cre序列，形成Ms4a3-IRES-Cre，实现Ms4a3驱动下的Cre重组酶的表达；

（2）将Ms4a3-IRES-Cre与LoxP报告系统整合，即可构建得到所述粒细胞和单核细胞前体标记系统。

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