KR101261887B1 - 종양에서 특이적으로 발현되는 유전자 산물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양과 관련하여 발현되는 유전자 산물 및 이를 코딩하는 핵산의 동정에 관한 것이다. 본 발명은 상기 종양과 관련하여 발현하는 유전자 산물이 이상 발현하는 질병의 치료 및 진단에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양과 관련하여 발현되는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드, 및 이들을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

Description

종양에서 특이적으로 발현되는 유전자 산물 및 이의 용도{GENETIC PRODUCTS DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN TUMORS AND USE THEREOF}
본 발명은 종양과 관련하여 발현되는 유전자 산물 및 이를 코딩하는 핵산의 동정, 상기 종양과 관련하여 발현하는 유전자 산물이 이상 발현하는 질병의 치료 및 진단, 및 종양과 관련하여 발현되는 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드, 및 이들을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
통상적인 치료 방법의 완벽한 이용 및 학제적(interdisciplinary) 접근에도불구하고, 암은 여전히 주요한 사인 중 하나이다. 보다 최근 치료 개념은 재조합 종양 백신 및 항체 요법과 같은 다른 특수한 방법을 사용하여 환자의 면역계를 전체적인 치료 개념에 통합시키는 것을 목적으로 한다. 이러한 방법의 성공을 위한 필수 조건은 그 작용 인자(effector)의 기능이 간섭적으로 증진되는 환자의 면역계에 의하여 종양 특이적 또는 종양 관련 항원 또는 에피토프를 인식하는 것이다. 종양 세포는 이들의 기원인 비악성 세포와 생물학적으로 실질적으로 다르다. 이러한 차이점은 종양 발생 동안의 유전적 변형에 기인하며, 특히, 암 세포 내에서의 질적 또는 양적으로 변형된 분자 구조체의 형성을 또한 야기한다. 종양 잠복(harboring) 숙주의 특정 면역계에 의하여 인식되는 이러한 종류의 종양 관련 구조체를 종양 관 련 항원(tumor-associated antigen)이라 칭한다. 종양 관련 항원의 특이적 인식은 두 개의 기능적으로 상호 연결된 단위인 세포성 및 체액성 메카니즘을 수반한다: CD4+ 및 CD8+ T 림프구가 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 II 및 I 각각의 분자 상에 노출된 프로세싱된 항원을 인식하는 한편, B 림프구는 프로세싱되지 않은 항원에 직접 결합하는 순환 항체를 생산한다. 잠재적인 종양 관련 항원의 임상 치료적 중요성은 면역계에 의한 종양(neoplastic) 세포 상의 항원 인식이 세포 독성(cytotoxic) 작용 인자 메카니즘을 개시시키고, T 헬퍼 세포의 존재 하에서, 암 세포를 제거할 수 있다는 데 있다 (Pardoll, Nat. Med. 4:525-31, 1998). 따라서, 종양 면역학의 주요한 목적은 이들 구조체를 분자적으로 정의하는 것이다. 이들 항원의 분자적 특성은 오랜 기간동안 알려지지 않았었다. 적절한 클로닝 기술이 개발된 후에야, 세포독성 T 림프구 (CTL) (van der Bruggen 등, Science 254:1643-7, 1991)의 표적 구조체를 분석하거나 프로브로서 순환 자기 항체 (Sahin 등, Curr. Opin. Immunol. 9:709-16, 1997)를 사용함에 의하여 종양 관련 항원에 대하여 계통적으로 종양 cDNA 발현 라이브러리를 스크리닝하는 것이 가능해졌다. 이 때문에, cDNA 발현 라이브러리를 신선한 종양 조직으로부터 제작하고 적절한 시스템에서 단백질로서 재조합적으로 발현시켰다. 환자로부터 분리한 면역 작용 인자(immunoeffectors), 즉 종양 특이적 세포 용해(lysis) 패턴을 갖는 CTL 클론, 또는 순환 자기 항체를 사용하여 각각의 항체를 클로닝하였다.
최근, 이러한 접근에 의하여 다수의 항원이 다양한 종양(neoplasias) 내에서 정의되었다. 여기에서, 암/정소 항원(cancer/testis antigens, CTA) 종류가 매우 중요하다. CTA 및 이를 코딩하는 유전자 (cancer/testis genes 또는 CTG)가 이들의 특징적인 발현 패턴에 의하여 정의되어 있다 [Tureci et al, Mol Med Today. 3:342-9, 1997]. 이들은 정소와 생식 세포를 제외하고는 정상 조직에서 발견되지 않지만, 많은 인간 악성 종양(malignoma)에서 종양형 특이적이지 않지만 매우 상이한 기원의 종양 실체에서 상이한 빈도로 발현된다 (Chen & Old, Cancer J. Sci. Am. 5:16-7, 1999). CTA에 대한 혈청 반응성 또한 건강한 대조군에서는 발견되지 않으며 종양 환자에서만 발견된다. 이러한 종류의 항원은, 특히 그 조직 분포 때문에, 면역 치료 계획에 특히 유용하며 통상적인 임상적 환자 연구에서 시험된다 (Marchand 등, Int. J. Cancer 80:219-30, 1999; Knuth 등, Cancer Chemother. Pharmacol. 46:p46-51, 2000).
그러나, 전술한 통상적인 방법으로 항원을 동정하는데 사용되는 프로브는 일반적으로 이미 암이 진행된 환자로부터 얻은 면역 작용 인자 (순환 자기항체 또는 CTL 클론)이다. 많은 데이터가 종양이, 예컨대, T 세포의 무감작화(anergization) 및 내성화(tolerization)를 야기할 수 있고, 질병의 진행 중에, 특히 효과적인 면역 인식을 일으킬 수 있는 이러한 특이성을 면역 작용 인자 레퍼토리로부터 상실시킨다는 것을 보여준다. 통상적인 환자 연구는 아직까지 상기 이미 발견되고 사용되는 종양 관련 항원의 실제 작용에 대한 어떠한 믿을 수 있는 증거도 얻지 못했다. 따라서, 자발적 면역 반응을 일으키는 단백질은 부적절한 표적 구조체라는 사실을 배제할 수 없다.
발명의 요약
본 발명은 암의 진단 및 치료를 위한 표적 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 있어서, 이러한 목적은 청구의 범위의 주된 내용에 의하여 달성된다.
본 발명에 있어서, 종양과 관련하여 발현되는 항원 및 이를 코딩하는 핵산을 동정하고 제공하기 위한 계획을 추구한다. 이러한 계획은 일반적으로 성인 조직에서는 발현하지 않는(silent) 실질적으로 정소 특이적이고, 따라서 생식 세포 특이적인, 유전자가 종양 세포에서 이소적(ectopic)이고 금지된 방법으로 재활성화된다는 사실에 기초한다. 우선, 데이터 마이닝(data mining)에 의하여 모든 알려진 정소 특이적 유전자의 가능한 한 완벽한 목록을 얻은 후, 특이적 RT-PCR에 의한 발현 분석에 의하여 종양에서의 상기 유전자의 이상 활성화를 평가한다. 데이터 마이닝은 공지된 종양 관련 유전자 동정법 중 하나이다. 그러나, 통상적인 치료 계획에 있어서, 잔존 유전자가 종양 특이적이라는 전제하에서, 일반적으로 종양 조직 라이브러리로부터 정상 조직 라이브러리의 전사체(transcriptom)를 공제한다 (Schmitt 등, Nucleic Acids Res. 27:4251-60, 1999; Vasmatzis 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:300-4, 1998. Scheurle 등, Cancer Res. 60:4037-43, 2000).
그러나, 보다 성공적인 것으로 판명된 본 발명의 개념은 모든 정소 특이적 유전자를 전자적으로 추출하고, 종양에서의 상기 유전자의 이소적 발현을 평가하기 위하여 데이터 마이닝을 이용하는 것에 기초한다.
따라서, 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 종양에서 특이적으로 발현하는 유전자를 동정하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 공지의 서열 라이브러리("in silico")의 데이터 마이닝과 이어지는 실험실 시험("wet bench") 연구의 평가를 결합한 것이다.
본 발명에 있어서, 두 가지의 상이한 바이오인포매틱 스크립트에 기초하는 결합된 방법은 암/정소 (CT) 유전자 종류의 새로운 구성원을 동정 가능하게 하였다. 이들은 단순히 정소 특이적, 생식 세포 특이적 또는 정자 특이적으로 이미 분류되어 있다. 이러한 유전자가 종양 세포에서 이상 활성화된다는 발견에 의하여 이들에 기능적 관련을 갖는 실질적으로 신규한 특질이 부여될 수 있다. 본 발명에 있어서, 이들 종양 관련 유전자와 이에 의하여 코딩되는 유전자 산물을 면역원성 작용과 독립적으로 동정하고 제공하였다.
본 발명에 따라서 동정된 상기 종양 관련 항원은 (a) SEQ ID NOs: 1-5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39, 40, 54-57, 62, 63, 70, 74 및 85-88로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열 또는 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산, (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산, (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 축퇴(degenerate)된 핵산 및 (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원은 SEQ ID NOs: 1-5, 19-21, 29, 31-33, 37, 39, 40, 54-57, 62, 63, 70, 74 및 85-88로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 아미노산을 갖는다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원은 SEQ ID NOs: 6-13, 14-18, 22-24, 30, 34-36, 38, 41, 58-61, 64, 65, 71, 75, 80-84 및 89-100으로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 그 일부 또는 그 유도체를 포함한다.
본 발명은 개괄적으로 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부, 이를 코딩하는 핵산 또는 상기 코딩 핵산에 대하여 유도된 핵산 또는 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부에 대하여 유도된 항체의 치료 및 진단에 있어서의 용도에 관한 것이다. 이러한 이용은 이들 항원, 기능적 단편, 핵산, 항체 등의 단독 뿐 아니라 이들 중 두 가지 이상의 조합과 관련있으며, 한 구체예는 또한 진단, 치료 및 처치 대조군용의 다른 종양 관련 유전자와의 결합과 관련있다.
치료 및/또는 진단을 위한 적합한 질병은 본 발명에 따라서 동정된 상기 종양 관련 항원 중 하나 이상이 선택적으로 발현되거나 비정상적으로 발현되는 질병이다.
본 발명은 또한 종양 세포와 관련하여 발현되고 공지된 유전자의 변형된 스플라이싱 (스플라이스 변이체)에 의하여 생산되거나 대체적인(alternative) 오픈 리딩 프레임을 사용하는 변형된 번역(translation)에 의하여 생산되는 유전자 산물 및 핵산과 관련된 것이다. 상기 핵산은 서열 목록의 SEQ ID NO: 2-5, 20, 21, 31-33, 54-57 및 85-88에 따른 서열을 포함한다. 게다가, 상기 유전자 산물은 서열 목록의 SEQ ID NO: 7-13, 23, 24, 34-36, 58-61 및 89-100에 따른 서열을 포함한다. 본 발명의 스플라이스 변이체는 종양(neoplastic) 질병의 진단 및 치료를 위한 표적으로서 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
예컨대,
- 다양한 전사 개시 부위의 사용,
- 추가적인 엑손의 사용,
- 단독 또는 두 개 이상의 엑손의 완전 또는 불완전한 스플라이싱,
- 돌연변이(새로운 공여체/수용체 서열의 생성 및 결실)에 의하여 변형된 스플라이스 조절 서열,
- 인트론 서열의 불완전한 제거와 같은 매우 다양한 메카니즘에 의하여 스플라이스 변이체가 생산된다.
유전자의 변형된 스플라이싱에 의하여 변형된 전사체 서열(스플라이스 변이체)이 생긴다. 스플라이스 변이체의 변형된 서열 부위에서의 번역에 의하여 구조와 기능에 있어서 원래 단백질과 뚜렷하게 구별되는 변형된 단백질이 생성된다. 종양 관련 스플라이스 변이체는 종양 관련 전사체 및 종양 관련 단백질/항원을 생산할 수 있다. 이들은 종양 세포의 검출 및 종양의 치료 표적 모두를 위한 분자 표지로서 이용할 수 있다. 예컨대, 혈액, 혈청, 골수, 타액, 기관지 세척, 신체 분비 및 조직 생체 검사와 같은 종양 세포 검출을, 예컨대, 스플라이스 특이적 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 증폭에 의한 핵산 추출 후에, 본 발명에 따라서 수행할 수 있다. 본 발명에 있어서, 모든 서열 의존적 검출 시스템이 검출에 적합하다. 이들은, PCR과 별도로, 예컨대, 유전자 칩/마이크로어레이 시스템, 노던 블라트, RNAse 보호 분석법 (RNAse protection assays, RDA) 등이다. 모든 검출 시스템은 공통적으로 하나 이상의 스플라이스 변이체 특이적 핵산 서열과의 특이적 혼성화에 기초하여 검출한다는 특성을 갖는다. 그러나, 종양 세포는 또한 상기 스플라이스 변이체에 의하여 코딩되는 특정 에피토프를 인식하는 항체에 의하여 본 발명에 따라서 검출될 수 있다. 상기 항체는 상기 스플라이스 변이체에 특이적인 면역화 펩타이드를 사용하여 제조할 수 있다. 건강한 세포에서 우선적으로 생산되는 유전적 산물의 변이체와 뚜렷하게 구별되는 에피토프를 갖는 아미노산이 면역화에 특히 적합하다. 항체를 사용하는 종양 세포의 검출을 환자로부터 분리된 샘플 상에서 또는 정맥내 투여된 항체에 의한 화상 진단(imaging)으로서 수행할 수 있다. 진단 유용성 외에도, 새로운 또는 변형된 에피토프를 갖는 스플라이스 변이체는 면역 치료에 있어서 흥미있는 표적이다. 본 발명의 에피토프를 치료적 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 T 림프구의 표적화를 위하여 사용할 수 있다. 수동 면역치료에 있어서, 스플라이스 변이체 특이적 에피토프를 인식하는 항체 또는 T 림프구를 여기에 선택적으로 전달시킬 수 있다. 다른 항원의 경우에서와 같이, 이들 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드와 함께 표준 기술 (동물의 면역화, 재조합 항체의 분리를 위한 엄격한 방법)을 사용하여 항체를 또한 생성할 수 있다. 또는, 면역화를 위하여 상기 에피토프를 포함하는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 사용하는 것이 가능하다. 에피토프 특이적 T 림프구의 생체외(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 생성을 위한 다양한 기술이 공지되어 있고, 예컨대, Kessler JH, 등, 2001, Sahin 등, 1997에 상세하게 기재되어 있으며, 또한 스플라이스 변이체 특이적 에피토프를 포함하는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 상기 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 사용하는 것에 기초한다. 스플라이스 변이체 특이적 에피토프를 포함하는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 또한 능동 면역 치료 (백신화, 백신 요법)에 있어서 약학적 활성 물질로서 사용될 수 있다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원을 인식하고 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 발현되거나 또는 비정상적으로 발현되는 세포에 대하여 우선적으로 선택적인 작용제(agent)를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 구체예에 있어서, 상기 작용제는 세포 사멸의 유도, 세포 성장의 감소, 사이토카인의 분비 또는 세포막의 손상을 야기하며, 바람직하게는 종양 억제 활성을 갖는다. 다른 구체예에 있어서, 상기 작용제는 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 선택적으로 혼성화하는 안티센스 핵산이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 작용제는 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체, 특히, 상기 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 보체 활성화된(complement-activated) 항체이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 작용제는 두 가지 이상의 작용제를 포함하며, 각각의 작용제는 상이한 종양 관련 항원을 인식하고, 상기 항원 중 적어도 하나는 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원이다. 인식이 반드시 상기 항원의 발현 또는 활성의 억제를 직접적으로 수반할 필요는 없다. 본 발명의 이러한 측면에 있어서, 선택적으로 종양에 한정된 상기 항원은 이러한 특정 위치에 대한 보충 작용 인자 메카니즘의 표지로서의 역할을 한다. 바람직한 예에 있어서, 상기 작용제는 HLA 분자 상의 항원을 인식하고 이러한 방법으로 표지된 세포를 용해시키는 세포독성 T 림프구이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 작용제는 종양 관련 항원에 선택적으로 결 합하여 상기 세포에 천연 또는 인공 작용 인자 메카니즘을 보충시키는 항체이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 작용제는 상기 항원을 특이적으로 인식하는 다른 세포의 작용 인자 기능을 증진시키는 T 헬퍼 림프구이다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 활성 또는 발현을 억제하는 작용제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 바람직한 예에 있어서, 상기 작용제는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 선택적으로 혼성화하는 안티센스 핵산이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 작용제는 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 작용제는 두 가지 이상의 작용제를 포함하며, 상기 각각의 작용제는 상이한 종양 관련 항원의 활성 또는 발현을 선택적으로 억제하는 것이고, 상기 항원 중 적어도 하나 이상은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원이다.
또한, 본 발명은 투여시 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 유래의 펩타이드 에피토프와 HLA 분자 간의 복합체의 양을 선택적으로 증가시키는 작용제를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 작용제는 (i) 종양 관련 항원 또는 그 일부, (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산, (iii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 숙주 세포, 및 (iv) 상기 종양 관련 항원 유래의 펩타이드 에피토프와 MHC 분자 간의 분리된 복합체로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분을 함유한다. 한 구체예에 있어서, 상기 작용제는 두 가지 이상의 작용제를 포함하며, 상기 각각의 작용제는 MHC 분자와 상이한 종양 관련 항원의 펩타이드 에피토프 간의 복합체의 양을 선택적으로 증 가시키는 것이고, 상기 항원 중 적어도 하나는 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원이다.
또한, 본 발명은 (i) 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원 및 그 일부, (ii) 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산, (iii) 본 발명에 따라 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체, (iv) 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산, (v) 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현시키는 숙주 세포, 및 (vi) 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부와 HLA 분자 간의 분리된 복합체로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산이 발현 백터 내에 프로모터와 기능적으로 연결되어 상기 약학 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 존재하는 숙주 세포는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 분비하고 이를 표면 상에 발현시키거나, 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부에 결합하는 HLA 분자를 추가적으로 발현시킬 수 있다. 한 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 HLA 분자를 내생적으로 발현시킨다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 숙수 세포는 HLA 분자 및/또는 종양 관련 항원 또는 그 일부를 재조합적 방법으로 발현시킨다. 상기 숙수 세포는 비증식적인 것이 바람직하다. 바람직한 예에 있어서, 상기 숙주 세포는 항원 제시(antigen-presenting) 세포, 특히 수지상 세포 (dendritic cell), 단핵 세포 또는 대식 세포(macrophage)이다.
본 발명의 약학 조성물에 존재하는 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체, 천연 항체 또는 합성 항체의 단편이며, 이들 모두는 조합적 기술에 의하여 생산할 수 있다. 상기 항체는 치료 또는 진단에 유용한 작용제와 결합될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 존재하는 안티센스 핵산은, 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산에 인접한 뉴클레오타이드 6 내지 50 개의 서열, 특히, 10 내지 30 개, 15 내지 30 개 및 20 내지 30 개의 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 약학 조성물에 의하여 직접 또는 핵산 발현현을 통하여 제공되는 종양 관련 항원, 또는 그 일부가 세포 표면의 MHC 분자와 결합하고, 상기 결합은 세포 독성 반응을 유발시키거나 및/또는 사이토카인 방출을 유도하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 양립 가능한 담체 및/또는 아쥬반트를 함유할 수 있다. 상기 아쥬반트는 사포닌, GM-CSF, CpG 뉴클레오타이드, RNA, 사이토카인 또는 케모카인 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 종양 관련 항원의 선택적 발현 또는 비정상적 발현 특징을 갖는 질병의 치료에 사용되는 것이 바람직하다. 바람직한 예에 있어서, 상기 질병은 암이다.
또한, 본 발명은 한 가지 이상의 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특징을 갖는 질병의 진단 방법 또는 치료 방법과 관련된 것이다. 한 구체예에 있어 서, 상기 치료는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에 있어서, 상기 발명은 본 발명에 의하여 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특징을 갖는 질병의 진단 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자로부터 분리된 생물학적 시료 내에서 (i) 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부의 검출 및/또는 (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부의 검출 및/또는 (iii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 대한 항체의 검출 및/또는 (iv) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 특이적인 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구의 검출을 포함한다. 구체예에 있어서, 검출은 (i) 상기 생물학적 시료를 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부, 상기 항체 또는 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 특이적인 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구에 특이적으로 결합하는 작용제와 접촉시키고 (ii) 상기 작용제와 상기 핵산 또는 그 일부, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부, 상기 항체 또는 상기 세포독성 또는 T 헬퍼 림프구 간의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함한다. 구체예에 있어서, 상기 질병은 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특성을 가지며, 그 검출은 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 두 가지 이상의 핵산의 검출, 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부의 검출, 상기 두 가지 이상의 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 두 가지 이상의 항체의 검출 또는 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원에 특이적인 두 가지 이상의 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구의 검출을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 환자로부터 분리한 생 물학적 시료를 유사한 정상 생물학적 시료와 비교한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특성을 갖는 질병의 퇴축(regression), 경과 또는 발병의 결정 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산의 양, (ii) 종양 관련 항원 또는 그 일부의 양, (iii) 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체의 양, 및 (iv) 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 세포 용해 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 양으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 파라미터에 대하여, 상기 질병을 앓고 있거나 상기 질병에 걸릴 가능성이 높은 환자로부터 얻은 시료를 모니터링하는 것을 포함한다. 상기 방법은 상기 파라미터를 첫 번째 시점의 첫 번째 시료에서 측정하고, 두 번째 시점의 또 다른 시료에서 측정하는 것을 포함하며, 상기 두 시료를 비교함으로써 병의 경과를 결정한다. 구체예에 있어서, 상기 질병은 두 가지 이상의 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 특성을 갖는 것이며, 모니터링은 (i) 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원을 코딩하는 두 가지 이상의 핵산 또는 그 일부의 양, 및/또는 (ii) 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부의 양, 및/또는 (iii) 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 두 가지 이상의 항체의 양, 및/또는 (iv) 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 두 가지 이상의 세포 용해성 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 양을 모니터링하는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 핵산 또는 그 일부의 검출 또는 핵산 또는 그 일부의 모니터링은 상기 핵산 또는 그 일부와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 수행하거나, 상기 핵산 또는 상기 그 일부를 선택적으로 증폭시킴으로써 수행할 수 있다. 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로브는 상기 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 개의 서열, 특히 10 내지 30 개, 15 내지 30 개 및 20 내지 30 개의 서열을 포함한다.
구체예에 있어서, 검출하고자 하는 종양 관련 항원 또는 그 일부는 세포내 또는 세포 표면에 존재한다. 본 발명에 있어서, 종양 관련 항원 또는 그 일부의 검출 또는 종양 관련 항원 또는 그 일부의 양의 모니터링은 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 검출하고자 하는 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부는 MHC 분자, 특히 HLA 분자와의 복합체 형태로 존재한다.
본 발명에 있어서, 항체의 검출 또는 항체의 양의 모니터링은 상기 항체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 세포 용해성 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 검출 또는 세포 용해성 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 양의 모니터링은 상기 항원 또는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체를 제시하는 세포를 사용하여 수행할 수 있다.
검출 및 모니터링에 사용되는 상기 폴리뉴클레오타이드 프로브, 항체, 단백질 또는 펩타이드 또는 세포는 탐지 가능한 방법으로 표지되는 것이 바람직하다. 구체예에 있어서, 상기 탐지 가능한 표지로는 방사성 표지 또는 효소 표지가 있다. MHC와 종양 관련 항원 또는 그 일부와의 복합체를 사용하는 특이적 자극에 의하여 유발되는 T 림프구의 세포 독성 활성, 사이토카인 생산 및 증식을 탐지함으로써 의하여 T 림프구를 추가적으로 검출할 수 있다. T 림프구는 또한 재조합 MHC 분자 또는 한 가지 이상의 종양 관련 항원의 특정 면역원성 단편이 로딩되어 있고 특이적 T 세포 수용체를 접촉시킴으로써 특이적 T 림프구를 동정할 수 있는 두 가지 이상의 MHC 분자의 복합체를 통하여 검출할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현 특성을 갖는 질병의 치료, 진단 또는 모니터링 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체를 치료제 또는 진단제와 함께 투여하는 것을 포함한다. 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체 또는 천연 항체의 단편이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특성을 갖는 질병을 앓는 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 상기 환자로부터 면역 반응성 세포를 포함하는 시료를 추출하고, (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 대항하는 세포 용해성 T 세포의 생산에 유리한 조건 하에서, 상기 시료를 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현하는 숙주 세포와 접촉시키고 (iii) 세포 용해성 T 세포를 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현하는 세포를 용해시키기에 적절한 양으로 환자에 도입시키는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 종양 관련 항원에 대항하는 세포 용해성 T 세포의 T 세포 수용체를 클로닝하는 것과 관련된 것이다. 상기 수용체는 다른 T 세포로 전달될 수 있고, 이에 따라서 상기 T 세포는 원하는 특이성을 수여받게 되고, (iii) 단계에 의하여 환자내로 도입될 수 있다.
한 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 HLA 분자를 내생적으로 발현한다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 HLA 분자 및/또는 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 재조합적으로 발현한다. 상기 숙주 세포는 비증식적인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 숙수 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특성을 갖는 질병을 앓는 환자의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원을 코딩하고 상기 질병과 관련된 세포에 의하여 발현되는 핵산을 동정하고, (ii) 상기 핵산 또는 그 일부로 숙주 세포를 형질 감염(transfection)시키고, (iii) 상기 형질 감염된 숙주 세포를 배양하여 상기 핵산을 발현시키고 (형질 감염률이 높은 경우, 이 단계는 필수적이지 않다), (iv) 상기 숙주 세포 또는 이의 추출물을 상기 질병과 관련된 환자의 세포와의 면역 응답을 증가시키기에 적절한 양으로 상기 환자에게 도입시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 상기 동정된 MHC 분자를 발현하고 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 제시하는 숙주 세포를 사용하여 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 제시하는 MHC 분자를 동정하는 것을 포함한다. 상기 면역 응답은 B 세포 응답 또는 T 세포 응답을 포함할 수 있다. 또한, T 세포 응답은 종양 관련 항원 또는 그 일부를 제시하는 숙주 세포에 특이적이거나 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현하는 환자의 세포에 특이적인 세포 용해성 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 생산을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라서 동정되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특성을 갖는 질병의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 상기 종양 관련 항원을 비정상적 양으로 발현하는 환자로부터 얻은 세포를 동정하고, (ii) 상기 세포 시료를 분리하고, (iii) 상기 세포를 배양하고, (iv) 상기 세포를 상기 세포에 대한 면역 응답을 유발하기에 적절한 양으로 환자에게 도입시키는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 숙주 세포는 비증식적이거나 비증식적으로 되는 것이 바람직하다. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특성을 갖는 질병은 특히 암이다.
본 발명은 또한 (a) SEQ ID NOs: 2-5, 20-21, 31-33, 39, 54-57, 62, 63 및 85-88으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산, (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산, (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 축퇴된 핵산, (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 SEQ ID NOs: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65 및 89-100로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명이 핵산의 프로모터 서열에 관한 것이다. 이들 서열은 바람직하게는 발현 벡터 내에서 다른 유전자와 기능적으로 연결되어 있어서 적절한 세포 내에서 상기 유전자의 선택적인 발현을 보장할 수 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 재조합 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자에 관한 것으로, 상기 핵산 분자는 본 발명의 핵산을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
상기 숙주 세포는 또한 HLA 분자를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일례에 있어서, 숙주 세포는 HLA 분자를 내생적으로 발현한다. 또 다른 구체예에 있어서, 숙주 세포는 HLA 분자 및/또는 본 발명의 핵산 또는 그 일부를 재조합적으로 발현시킨다. 상기 숙주 세포는 비증식적인 것이 바람직하다. 바람직한 예에 있어서, 상기 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 핵산과 혼성화하고 유전자 프로브 또는 "안티센스" 분자로서 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따라서 동정된 핵산 또는 그 일부와 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 응답력 있는 (competent) 시료의 형태로 핵산 분자를 사용하여 본 발명에 따라서 동정된 상기 핵산과 상동인 핵산을 찾을 수 있다. PCR 증폭, 서던 및 노던 혼성화를 이용하여 상동인 핵산을 찾을 수 있다. 혼성 화는 낮은 수준의 엄격한 조건하에서 수행될 수 있으며, 중간 수준의 엄격한 수준에서 수행되는 것이 보다 바람직하고, 매우 엄격한 조건에서 수행되는 것이 가장 바람직하다. 본 발명에서 "엄격한 조건 (stringent conditions)"이라 함은 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미하는 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 (a) SEQ ID NOs: 2-5, 20-21, 31-33, 39, 54-57, 62, 63 및 85-88로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 핵산, (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산, (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 축퇴된 핵산, (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)과 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 폴리펩타이드 또는 단백질에 관한 것이다. 바람직한 예에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NOs: 7-13, 14-18, 23-24, 34-36, 58-61, 64, 65 및 89-100로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 그 일부 또는 그 유도체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질에 관한 것이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 면역원성 단편에 관한 것이다. 상기 단편은 인간 HLA 수용체 또는 인간 항체에 결합하는 것이 바람직하다. 본 발명의 단편은 6 개 이상, 특히 8 개 이상, 10 개 이상, 12 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 30 개 이상 또는 50 개 이상의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 작용제에 관한 것이다. 바람직한 예에 있어서, 상기 작용 제는 항체이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 조합적 기술에 의하여 생산된 항체이거나 항체의 단편이다. 또한, 본 발명은 (i) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부와 (ii) 상기 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부가 결합하는 MHC 분자의 복합체에 선택적으로 결합하는 항체에 관한 것이며, 상기 항체는 단독으로 존재하는 (i) 또는 (ii)에는 결합하지 않는다. 본 발명의 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체 또는 천연 항체의 단편이다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 본 발명의 작용제와 치료제 또는 진단제와의 콘쥬게이트에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료제 또는 진단제는 독소이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현을 탐지하기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 (i) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산, (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부, (iii) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 항체, 및/또는 (iv) 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부와 MHC 분자와의 복합체에 특이적인 T 세포의 검출을 위한 작용제를 포함한다. 일례에 있어서, 상기 핵산 또는 그 일부의 검출을 위한 작용제는 상기 핵산을 선택적으로 증폭시키기 위한 핵산 분자이며, 상기 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 개, 특히, 10 내지 30 개, 15 내지 30 개 및 20 내지 30 개의 서열을 포함하는 것이다.
본 발명은 종양 세포에서 선택적으로 발현되거나 이상 발현되고, 종양 관련 항원인 유전자를 기재한다.
본 발명에 있어서, 이들 유전자 또는 그 유도체는 치료적 접근을 위한 우선적 표적 구조체이다. 개념적으로, 상기 치료적 접근은 선택적으로 발현된 종양 관련 유전자 산물의 활성을 억제하는 것을 목적으로 한다. 이는, 상기 각각의 선택적 이상 발현이 종양 병원성에 기능적으로 중요하고 그 연결이 해당 세포의 선택적 손상에 의하여 이루어지는 경우에 있어서, 유용하다. 다른 치료 개념은 종양 세포에 대하여 선택적으로 세포 손상 잠재성을 갖는 작용 인자 메카니즘을 보충하는 표지로서의 종양 관련 항원을 계획한다. 이 때, 상기 표적 분자 자체의 기능 및 종양 발달에 있어서의 그의 역할은 전적으로 관계가 없다.
본 발명에 있어서, 핵산의 "유도체 (derivative)"는 상기 핵산 내에 단일 또는 다수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 부가가 존재하는 것을 의미한다. 또한, 상기 유도체라 함은 또한 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상에서의 핵산의 화학적 유도체화를 포함한다. 상기 유도체라 함은 또한 자연 발생적이지 않은 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다.
본 발명에 있어서, 핵산은 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)인 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자들을 포함한다. 본 발명에 있어서, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유적으로 형성된 환상의 닫힌 분자의 형태로서 존 재할 수 있다.
본 발명에 기재된 상기 핵산은 분리된 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 상기 "분리된 핵산(isolated nucleic acid)"이라 함은 핵산이 (i) 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의하여, 생체외(in vitro) 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의하여 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예컨대, 절단 및 겔-전기영동 분획에 의하여, 정제되거나, (iv) 예컨대 화학 합성에 의하여 합성된 것임을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의한 조작에 사용 가능한 것이다.
두 핵산 서열이 서로 혼성화 가능하고 다른 하나와 안정된 이중 나선 구조를 형성할 수 있는 경우, 하나의 핵산이 다른 하나의 핵산에 대하여 상보적이라고 하며, 이 때, 상기 혼성화는 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 (엄격한 조건) 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 엄격한 조건은, 예컨대, Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook 등, Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel 등, Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 기재되어 있으며, 예컨대, 65 ℃의 혼성화 완충액 (3.5 x SSC, 0.02 % Ficoll, 0.02 % 폴리비닐피롤리돈, 0.02 % 소 혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5 % SDS, 2 mM EDTA)에서의 혼성화를 기재하고 있다. SSC는 pH 7의 0.15 M 염화나트륨/0.15 M 시트르산나트륨이다. 혼성화 후, DNA가 전달되어 있는 멤브레인을, 예컨대, 실온에서 2 x SSC로 세척하고 나서, 68 ℃까지의 온도에서 0.1 내지 0.5 x SSC/0.1 x SDS로 세척한다.
본 발명에 있어서, 상보적 핵산은 적어도 40 %, 특히 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 % 및 바람직하게는 적어도 95 %, 적어도 98 % 또는 적어도 99% 이상의 뉴클레오타이드 상동성을 갖는다.
본 발명에 있어서, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산은 단독 또는 다른 핵산, 특히 이형(heterologous) 핵산과 함께 존재할 수 있다. 바람직한 예에 있어서, 핵산은 상기 핵산에 대하여 상동 또는 이형일 수 있는 발현 제어 서열 또는 조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 코딩 서열 및 조절 서열은, 이들이 상기 코딩 서열의 발현이 상기 조절 서열의 제어 또는 영향을 받도록 하는 방법으로 서로 공유적으로 연결되어 있는 경우, 서로 "기능적으로(functionally)" 연결되어 있다고 한다. 그리고 나서, 상기 코딩 서열에 기능적으로 연결된 조절 서열과 함께, 상기 코딩 서열이 기능적 단백질로 번역되는 경우, 상기 조절 서열은, 코딩 서열 내에서의 프래임 쉬프트(frame shift) 또는 상기 코딩 서열이 원하는 단백질 또는 펩타이드로 번역되지 못하게 되는 일 없이, 상기 코딩 서열의 전사를 일으킨다.
본 발명에 있어서, "발현 제어 서열(expression control sequence)" 또는 "조절 서열(regulatory sequence)"이라 함은 프로모터, 인핸서 및 유전자의 발현을 조절하는 다른 조절 인자를 포함한다. 본 발명의 구체예에 있어서, 발현 제어 서열은 조절 가능하다. 조절 서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 유형에 따라서 다양할 것이나, 일반적으로, TATA 박스, 캡형성(capping) 서열, CAAT 서열 등과 같이, 각각 전사 및 번역의 개시에 수반되는 5' 미전사(untranscribed) 서열 및 5' 미번역 (untranslated) 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 5' 미전사 조절 서열은 기능적으로 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 부위를 포함한다. 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성화 인자 서열을 포함한다.
따라서, 한편으로는, 본 명세서에 설명된 상기 종양 관련 항원은 모든 발현 제어 서열 및 프로모터와 결합될 수 있다. 그러나, 또 다른 한편으로는, 본 발명에 있어서, 본 명세서에 설명된 종양 관련 유전자 산물의 프로모터는 모든 다른 유전자와 결합될 수 있다. 이는 이들 프로모터의 선택적 활성을 이용할 수 있도록 한다.
본 발명에 있어서, 핵산은 또한 숙주 세포로부터의 상기 핵산에 의하여 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 분비를 제어하는 폴리펩타이드를 코딩하는 다른 핵산과 함께 존재할 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산은 또한 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드를 숙주 세포의 세포막 상에 고정시키거나(anchored), 상기 세포의 특정 세포 기관 내로 구획화시키는 폴리펩타이드를 코딩하는 다른 핵산과 함께 존재할 수 있다.
바람직한 예에 있어서, 본 발명에 있어서, 재조합 DNA 분자는 벡터이며, 적합하게는, 예컨대, 본 발명의 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 같은, 핵산의 발혀을 조절하는 프로모터를 갖는다. "벡터(vector)"라 함은 본 명세서에서 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, 상기 핵산을, 예컨대, 원핵 세포 또는 진핵 세포 내로 도입시키거나, 적절한 경우, 게놈 내로 통합시킬 수 있는 핵산을 위한 모든 중 간 운반체(intermediary vehicle)를 포함한다. 이러한 종유의 벡터는 세포 내에서 복제 및/또는 발현되는 것이 바람직하다. 중간 운반체를, 예컨대, 전기영동, 미세 발사물(microprojectiles)에 의한 충격, 리포좀 투여, 아그로박테리아에 의한 전달 또는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스를 통한 삽입에 사용하기 위하여 적응시킬 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지미드 또는 바이러스 게놈을 포함한다.
본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 사용하여 숙주 세포를 형질 감염시킬 수 있다. 본 명세서에서 핵산은 재조합 DNA와 RNA를 모두 의미한다. 재조합 RNA는 DNA 주형의 생체외 전사에 의하여 제조할 수 있다. 또한, 이를 적용 전에 서열 안정화, 캡형성 및 폴리아데닐화에 의하여 변형시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, "숙주 세포(host cell)"라 함은 외래 핵산으로 형질 감염되거나 형질 전환될 수 있는 모든 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서, 숙주세포라 함은 원핵 세포 (예컨대, E. coli) 또는 진핵 세포 (예컨대, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 영장류로부터 유래하는 세포와 같은 포유류 세포가 특히 바람직하다. 상기 세포는 다수의 조직형으로부터 유래하고 1차 세포 및 세포계를 포함할 수 있다. 구체예에 있어서, 케라틴 세포(keratinocytes), 말초혈 백혈구, 골수의 줄기 세포 및 배아 줄기 세포가 포함된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 숙수 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다. 핵산은 숙수 세포내에 단일 복제물 또는 둘 이상의 복제물의 형태로 존재할 수 있으며, 일례에 있어서, 숙주 세포에서 발현된다.
본 발명에 있어서, "발현(expression)"이라 함은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이는 또한 핵산의 부분적 발현도 포함한다. 또한, 발현은 일시적 또는 지속적으로 수행될 수 있다. 포유류 세포에서의 바람직한 발현 시스템으로서 pcDNA3.1 및 pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA) 등이 있으며, 이들은 사이토메갈로바이러스(CMV)의 인핸서-프로모터 서열 및 G418에 대하여 저항성을 부여하는 유전자 (이로 인하여 안정적으로 형질 감염된 세포주를 선별할 수 있음)와 같은 선별 표지를 포함한다.
본 발명에서 HLA 분자가 종양 관련 항원 또는 그 일부를 제시하는 이들 경우에 있어서, 발현 벡터는 또한 상기 HLA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. HLA 분자를 코딩하는 핵산 서열이 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산과 동일한 발현 벡터상에 존재하거나, 두 핵산이 서로 다른 발현 벡터 상에 존재할 수 있다. 후자의 경우, 두 발현 벡터를 세포내로 동시 형질 감염시킬 수 있다. 숙주 세포가 종양 관련 항원 또는 그 일부 및 HLA 분자 모두를 발현하지 않는 경우, 이들을 코딩하는 두 핵산을 동일 발현 벡터 또는 서로 다른 발현 벡터 상에서 세포 내로 형질 감염시킨다. 세포가 이미 HLA 분자를 발현하는 경우, 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산 서열만을 세포 내로 형질 감염시킬 수 있다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 증폭시키기 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는, 예컨대, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 혼성화하는 한 쌍의 증폭 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머는 상기 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 개, 특히, 10 내지 30 개, 15 내지 30 개 및 20 내지 30 개의 서열 을 포함하고, 프라이머 다이머의 형성을 피하기 위하여, 중복되지 않는 것이 바람직하다. 프라이머 중 하나는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 한 가닥과 혼성화하고, 다른 프라이머는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 증폭을 가능하게 하는 배열로 상보적 가닥과 혼성화 할 것이다.
"안티센스" 분자 또는 "안티센스" 핵산을 사용하여 핵산 발현을 조절, 특히, 감소시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, "안티센스 분자" 또는 "안티센스 핵산"이라 함은 생리적 조건 하에서 특정 유전자를 포함하는 DNA 또는 상기 유전자의 mRNA와 혼성화하여 상기 유전자의 전사 및/또는 상기 mRNA의 번역을 억제하는, 올리고리보뉴클레오타이드 또는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 올리고리보뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고디옥시리보뉴클레오타이드 등의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 "안티센스 분자"는 또한 핵산 또는 그 일부를 그의 천연 프로모터에 대하여 역방향으로 포함하는 구조체를 포함한다. 핵산 또는 그 일부의 안티센스 전사체는 효소를 특정화하는 자연 발생적 mRNA와 이중 나선을 형성하여 mRNA의 축적 또는 mRNA의 활성 효소로의 번역을 방지할 수 있다. 핵산을 불활성화시키기 위하여 리보자임을 사용하는 것 또한 가능하다. 본 발명에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 개, 특히, 10 내지 30 개, 15 내지 30 개 및 20 내지 30 개의 서열을 갖고 표적 핵산 또는 그 일부와 완전히 상보적인 것이 바람직하다.
바람직한 예에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 번역 개시 부위, 전사 개시 부위 또는 프로모터 부위와 같은 5' 상류 부위 및 N-말단과 혼성화한다. 다른 구체예에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 3' 미번역 부위 또는 mRNA 스플라이싱 부위와 혼성화한다.
일례에 있어서, 본 발명이 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 이들의 조합으로 이루어지며, 이들의 5' 말단의 하나의 뉴클레오타이드와 3' 말단의 다른 하나의 뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 결합에 의하여 서로 연결되어 있다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 통상적인 방법으로 합성되거나 재조합적으로 생산될 수 있다.
바람직한 예에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 "변형된(modified)" 올리고뉴클레오타이드이다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대, 안정성 또는 치료 효율 등을 증가시키기 위하여, 그의 표적에 결합하는 능력을 손상시키지 않고, 매우 다양한 방법으로 변형시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, "변형된 올리고뉴클레오타이드"라 함은 (i) 이들의 뉴클레오타이드 중 2 개 이상이 합성 뉴클레오사이드 간 결합 (즉, 포스포디에스테르 결합이 아닌 뉴클레오사이드 간 결합)에 의하여 서로 결합되어 있고, 및/또는 (ii) 핵산에서는 일반적으로 발견되지 않는 화학기가 상기 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 결합되어 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 합성 뉴클레오사이드 결합은 포스포로티오에이트, 알킬 포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 인산에스테르, 알킬 포스포노티오에이트, 포스포아미데이트(phosphoramidates), 카바메이트, 카보네이트, 인산트리에스테르, 아세타미데이트(acetamidates), 카복시메틸에스테르 및 펩타이드인 것이 바람직하다.
"변형된 올리고뉴클레오타이드"라 함은 또한 공유적으로 변형된 염기 및/또는 당을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. "변형된 올리고뉴클레오타이드"는, 예컨대, 3' 위치의 수산화기 및 5' 위치의 인산기를 제외한 저분자량 유기 작용기와 공유적으로 결합하는 당 잔기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대, 2'-O-알킬화 리보오스 잔기 또는 리보오스 대신에 아라비노오스와 같은 다른 당을 포함할 수 있다.
본 발명에 개시된 단백질 및 폴리펩타이드는 분리된 것이 바람직하다. "분리된(isolated) 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"라 함은 단백질 또는 폴리펩타이드가 그의 본래 환경으로부터 분리된 것을 의미한다. 분리된 단백질 또는 폴리 펩타이드는 본질적으로 정제된 상태일 수 있다. "본질적으로 정제된(essentially purified)"이라 함은 단백질 또는 폴리펩타이드가 자연 상태 또는 생체내에서 이들과 결합된 다른 물질을 본질적으로 갖지 않는 것을 의미한다.
이러한 단백질 및 폴리펩타이드는, 예컨대, 항체의 생산 및 면역학적 또는 진단 분석법에 사용되거나 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 개시된 단백질 및 폴리펩타이드는 조직 또는 세포 균질 파쇄액(homogenate)과 같은 생물학적 시료로부터 분리될 수 있으며, 또한, 다수의 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 재조합적으로 발현될 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열의 "유도체(derivatives)"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다.
아미노산 삽입 변이체는 아미노 말단 및/또는 카복시 말단 융합 및 특정 아미노산 서열 내 하나 또는 두 개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 자리에 삽입되며, 결과 생성물의 적절한 스크리닝이 가능한 무작위 삽입 또한 가능하다. 아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산이 제거된 특성을 갖는다. 아미노산 치환 변이체는 서열 내 하나 이상의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 특성을 갖는다. 상동 단백질 또는 펩타이드 간의 비보존적인 아미노산 서열 내 위치에 존재하는 변형이 바람직하다. 아미노산을 소수성, 친수성, 전기 음성도, 측쇄의 부피 등과 같은 유사한 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다 (보존적 치환). 보존적 치환은, 예컨대, 아미노산을 아래에 열거된 아미노산 군 중에서 상기 치환될 아미노산과 동일한 군의 아미노산으로 교체할 수 있다:
1. 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. 음성 하전된 잔기 및 그의 아마이드: Asn, Asp, Glu, Gln
3. 양성 하전된 잔기: His, Arg, Lys
4. 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5. 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.
세 개의 잔기는, 단백질 구조에 있어서의 이들의 특수한 역할 때문에, 괄호 안에 나타내었다. Gly는 측쇄가 없는 유일한 잔기이기 때문에 사슬에 유연성을 부여한다. Pro는 사슬을 매우 제한하는 특수한 기하학적 구조를 갖는다. Cys는 디설 파이드 가교를 형성할 수 있다.
상기 아미노산 변이체는, 예컨대, 고상 합성(solid phase synthesis, Merrifield, 1964) 및 유사한 방법과 같은 공지된 펩타이드 합성 기술에 의하여, 또는 재조합 DNA 조작에 의하여 용이하게 제작할 수 있다. 치환 돌연변이를 그 서열이 알려지거나 부분적으로 알려진 DNA 내의 미리 정해진 위치에 삽입하기 위한 기술은 공지되어 있으며, 예컨대, M13 변이 유발(M13 mutagenesis)을 포함한다. 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 단백질 제조를 위한 DNA 서열의 조작은, 예컨대, Sambrook 등, (1989)에 상세하기 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 단백질 또는 폴리펩타이드의 "유도체"는 또한, 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 폴리펩타이드와 같이, 효소와 관련된 모든 분자의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 부가를 포함한다. 또한, "유도체"라 함은 상기 단백질 또는 폴리펩타이드의 모든 기능적 화학 등가물로 확장될 수 있다.
본 발명에 있어서, 종양 관련 항원의 일부 또는 단편 이들이 유도된 폴리펩타이드의 기능적 특성을 갖는다. 이러한 기능적 특성에는 항체와의 상호 작용, 다른 펩타이드 또는 단백질과의 상호 작용, 핵산의 선택적 결합 및 효소 활성 등이 있다. 특수한 성질은 HLA와 복합체를 형성하고, 적절한 경우, 면역 응답을 생성시키는 능력이다. 이러하 면역 응답은 세포 독성 또는 T 헬퍼 세포를 자극하는 것에 기초할 수 있다. 본 발명의 종양 관련 항원의 일부 또는 단편은 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산이 6 개 이상, 특히 8 개 이상, 10 개 이상, 12 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 30 개 이상 또는 50 개 이상인 서열을 포함하는 것이 바람직하 다.
본 발명에 있어서, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 일부 또는 단편은 적어도 종양 관련 항원 및/또는, 상기 정의된 바와 같은, 상기 종양 관련 항원의 일부 또는 단편을 코딩하는 핵산의 일부와 관련된 것이다.
종양 관련 항원을 코딩하는 유전자의 분리 및 동정은 또한 한 가지 이상의 종양 관련 항원의 발현 특성을 갖는 질병의 진단을 가능하게 한다. 이러한 방법은 종양 관련 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 결정하거나 및/또는 코딩된 종양 관련 항원 및/또는 이로부터 유도된 펩타이드를 결정하는 것을 포함한다. 핵산은 표지된 프로브를 사용하는 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응을 포함하는 통상적인 방법으로 결정할 수 있다. 종양 관련 항원 또는 이로부터 유도된 펩타이드는 상기 항원 및/또는 펩타이드를 인식하는 것에 대하여 환자의 항혈청을 스크리닝함으로써 결정할 수 있다. 이들은 또한 상응하는 종양 관련 항원에 대한 특이성에 대하여 환자의 T 세포를 스크리닝함으로써 결정할 수도 있다.
본 발명은 또한, 상기 종양 관련 항원의 세포 결합 파트너 및 항체를 포함하여, 본 명세서에 개시된 종양 관련 항원에 결합하는 단백질을 분리 가능하도록 한다.드
본 발명에 있어서, 특정 구체예는 종양 관련 항원으로부터 유도된 "우성 음성(dominant negative)" 폴리펩타이드를 제공하는 것을 반드시 수반한다. 우성 음성 폴리펩타이드는, 세포 기관과 상호 작용함으로써, 활성 단백질이 세포 기관과 상호 작용하는 것을 방해하거나, 활성 단백질과 경쟁하여, 상기 활성 단백질의 효 율을 감소시키는, 불활성 단백질이다. 예컨대, 리간드와 결합하지만 상기 리간드와 의 결합에 대한 응답으로서 어떠한 신호도 발생시키지 않는 우성 음성 수용체는 상기 리간드의 생물학적 효율을 감소시킬 수 있다. 유사하게, 일반적으로 표적 단백질과 상호 작용하지만 상기 표적 단백질을 인산화시키지 않는 우성 음성 촉매적 불활성 키나아제는 세포 신호에 대한 응답으로서의 상기 표적 단백질의 인산화를 감소시킬 수 있다. 유사하게, 유전자 조절 부위 내의 프로모터에 결합하지만 상기 유저자의 전사를 증가시키지 않는 우성 음성 전사 인자는 전사를 증가시키지 않고 프로모터 결합 부위를 차지함으로써 정상 전사 인자의 효율을 감소시킬 수 있다.
우성 음성 폴리펩타이드의 세포내 발현 결과, 활성 단백질의 기능이 감소된다. 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는, 예켠대, 통상적인 변이 유발 방법 및 폴리펩타이드 변이체의 우성 음성 효율을 평가함으로써, 단백질의 우성 음성 변이체를 제조할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원에 결합하는 폴리펩타이드와 같은 물질을 포함한다. 이러한 결합 물질은, 예컨대, 종양 관련 항원 및 종양 관련 항원과 이들의 결합 파트너와의 복합체를 검출하는 스크리닝 분석법 및 상기 종양 관련 항원 및 상기 종양 관련 항원과 이들의 결합 파트너와의 복합체의 정제에 사용될 수 있다. 이러한 물질은 또한 종양 관련 항원의 활성을, 예컨대, 이러한 항원에 결합함으로써, 억제하기 위하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 예컨대, 종양 관련 항원에 선택적으로 결합할 수 있는, 항체 또는 항체 단편과 같은 결합 물질을 포함한다. 항체에는 통상적인 방법으로 생산되는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 등이 있다.
항체의 작은 부분인 파라토프 만이 항체가 자신의 에피토프에 결합하는 데 수반된다는 것이 알려져 있다 (cf. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). 예컨대, pFc' 및 Fc 부위는 보체 캐스케이드(cascade)의 작용 인자이지만 항원 결합에는 수반되지 않는다. pFc' 부위가 효소적으로 제거되어 있거나 pFc' 부위 없이 생산된, F(ab')2 단편이라고 불리는 항체는 완전한 항체의 두 항원 결합 부위를 모두 운반한다. 유사하게, Fc 부위가 효소적으로 제거되어 있거나 상기 Fc 부위 없이 생산된, Fab 단편이라고 불리는 항체는 본래 항체 분자의 한 항원 결합 부위를 운반한다. 또한, Fab 단편은 공유적으로 결합된 항체 경쇄 및, Fd라고 불리는, 상기 항체의 중쇄 부분으로 구성된다. Fd 단편은 항체 특이성의 주요한 결정 인자이며 (단일 Fd 단편은, 항체의 특이성을 변화시키지 않고, 10 개까지의 서로 다른 경쇄와 결합할 수 있음), Fd 단편은, 분리시, 에피토프에 결합하는 활성을 보유한다.
항원 에피토프와 직접적으로 상호 작용하는 상보적 결정 부위(complementary-determining regions, CDRs)와 파라토프의 3차 구조를 유지하는 프레임워크 부위(framework regions, FRs)가 항체의 항원 결합 부분 내에 위치한다. IgG 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄의 Fd 단편은 모두 4 개의 프레임워크 부위(FR1 내지 FR4)를 포함하며, 이들은 각각 3 개의 상보적 결정 부위(CDR1 내지 CDR3)에 의하여 분리된다. CDRs, 구체적으로, CDR3 부위, 보다 구체적으로 중쇄의 CDR3이 항체 특이성에 큰 비중으로 관여한다.
포유류 항체의 CDR 이외의 부위는, 원 항체의 에피토프에 대한 특이성을 보유하면서, 동일하거나 상이한 특이성을 갖는 항체의 유사 부위로 대체될 수 있다는 것이 알려져 있다. 이는 인간 이외의 CDRs가 인간 FR 및 Fc/pFc' 부위에 결합하여 기능적 항체를 생산하는 "인간화된(humanized)" 항체의 개발을 가능하게 한다.
예컨대, 국제공개공보 제92/04381호는 적어도 쥐 FR 부위의 일부가 인간 기원의 FR 부위로 대체되어 있는 인간화된 쥐의 RSV 항체의 생산 및 용도를 개시하고 있다. 항원 결합 능력을 갖는 본래 항체의 단편을 포함하는, 이러한 종류의 항체를 보통 "키메라(chimeric)" 항체라고 부른다.
본 발명은 또한 항체의 F(ab')2, Fab, Fv 및 Fd 단편, Fc 및/또는 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3 부위가 인간 또는 인간 이외의 상동 서열로 대체되어 있는 키메라 항체, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3 부위가 인간 또는 인간 이외의 상동 서열로 대체되어 있는 키메라 F(ab')2-단편 항체, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3 부위가 인간 또는 인간 이외의 상동 서열로 대체되어 있는 키메라 Fab-단편 항체, 및 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 부위가 인간 또는 인간 이외의 상동 서열로 대체되어 있는 키메라 Fd-단편 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 "단쇄(single-chain)" 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 종류의 폴리펩타이드 결합 물질은, 예컨대, 파지 디스플레이 라이브러리로서 또는 고정화된 형태로 용액내에서 간단히 제작될 수 있는 축퇴 (degenerate) 펩타이드 라이브러리에 의하여 제공될 수 있다. 마찬가지로, 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드의 조합 라이브러리를 제작하는 것이 가능하다. 비펩타이드 합성 잔기(nonpeptidic synthetic residues) 및 펩타이드의 라이브러리 또한 제작할 수 있다.
파지 디스플레이는 본 발명의 결합 펩타이드를 동정하는데 특히 효과적이다. 이와 관련하여, 예컨대, 4 내지 약 80 개의 아미노산 잔기 길이의 삽입물을 제공하는 파지 라이브러리를 (예컨대, M13, fd 또는 람다 파지를 사용하여) 제작한다. 그리고 나서, 종양 관련 항원에 결합하는 삼입물을 운반할 파지를 선별한다. 이러한 공정은 2 회 이상의 종양 관련 항원에 결합하는 파지의 재선별을 통하여 반복할 수 있다. 반복 수행에 의하여 특정 서열을 운반하는 파지가 농축된다. 발현된 폴리펩타이드 서열을 동정하기 위해서 DNA 서열 분석을 수행할 수 있다. 종양 관련 항원에 결합하는 서열의 최소 선형 부분을 결정할 수 있다. 효모의 "2종 하이브리드 시스템(two-hybrid system)"을 또한 종양 관련 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 동정하는데 사용할 수 있다. 본 발명에 기재된 종양 관련 항원 또는 그의 단편은, 상기 종양 관련 항원의 펩타이드 결합 파트너를 동정하고 선별하기 위하여, 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 이러한 분자는, 예컨대, 스크리닝 분석법, 정제 프로토콜, 종양 관련 항원 기 능 방해 및 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다른 목적에 사용될 수 있다.
상기 항체 및 다른 결합 분자는, 예컨대, 종양 관련 항원을 발현하는 조직을 동정하는데 사용될 수 있다. 항체는 또한 종양 관련 항원을 발현하는 조직 및 세포를 보여주기 위한 특정 진단 물질과 결합될 수 있다. 이들은 또한 치료적 유용 물질과 결합될 수도 있다. 상기 진단 물질에는 황산바륨, 이오세탐산(iocetamic acid), 이오파노산(iopanoic acid), 칼슘 이포데이트(calcium ipodate), 소듐 디아트리조에이트(sodium diatrizoate), 메글루민 디아트리조에이트(meglumine diatrizoate), 메트리즈아미드(metrizamide), 소듐 티로파노에이트(sodium tyropanoate) 및 불소-18 및 탄소-11과 같은 양전자 방출체, 요오드-123, 테크네튬-99m, 요오드-131 및 인듐 111과 같은 감마 방출체, 불소 및 가돌리늄과 같은 핵 자기 공명용 핵종(nuclides)을 포함하는 방사성 진단제 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, "치료적 유용 물질(therapeutically useful substance)"이라 함은, 원하는 바에 따라, 하나 이상의 종양 관련 항원을 발현하는 세포에 선택적으로 도입되는 모든 치료적 분자를 의미하는 것으로, 항암제, 방사성 요오드 표지된 화합물, 독소, 세포 증식 억제제 또는 세포 용해제, 등을 포함하며, 상기 항암제에는, 예컨대, 아미노글루테티미드(aminoglutethimide), 아자티오프린(azathioprine), 벨로마이신 설페이드(bleomycin sulfate), 부설판(busulfan), 카무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시클로스포린(cyclosporine), 시타라비딘 (cytarabidine), 다카바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루빈(daunorubin), 독소루비신(doxorubicin), 택솔(taxol), 에토포시드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 인터페론-α, 로무스틴(lomustine), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토탄(mitotane), 프로카바진 HCl(procarbazine HCl), 티오구아닌(thioguanine), 빈블라스틴 설페이트(vinblastine sulfate) 및 빈크리스틴 설페이트(vincristine sulfate) 등이 있다. 다른 항암제가, 예컨대, Goodman과 Gilman의 "The Pharmacological Basis of Therapeutics" (8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc.), 특히 52장 [Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner]에 개시되어 있다. 독소는 포크위드 항바이러스 단백질(pokeweed antiviral protein), 콜레라 독소, 백일해 독소(pertussis toxin), 리신(ricin), 겔로닌(gelonin), 아브린(abrin), 디프테리아 외독소(diphtheria exotoxin) 또는 수도모나스(Pseudomonas) 외독소와 같은 단백질일 수 있다. 독소 잔기는 또한 코발트-60 등의 고에너지 방출 방사성 핵종(radionuclide)일 수 있다.
본 발명에 있어서, "환자(patient)"라 함은 인간, 인간 이외의 영장류 또는 다른 동물, 특히, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 마우스와 래트 같은 설치류 등의 포유류를 의미한다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 상기 환자는 인간이다.
본 발명에 있어서, "질병(disease)"이라 함은 종양 관련 항원이 발현되거나 비정상적으로 발현되는 모든 병적 상태를 의미하는 것이다. 본 발명에 있어서, "비 정상적 발현(Abnormal expression)"은 발현이 건강한 개체의 상태와 비교하여 변형된, 특히 증가된 것을 의미한다. 발현의 증가는 10 % 이상, 특히 20 % 이상, 50 % 이상 또는 100 % 이상 증가하는 것을 의미한다. 일례에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 질병을 앓는 개체의 조직에서만 발현하는 반면, 건강한 개체에서는 발현이 억제된다. 이러한 질병의 한 예가 암이며, 특히, 정상피종(seminomas), 흑색종(melanomas), 기형종(teratomas), 신경교종(gliomas), 결장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암이다.
본 발명에 있어서, 생물학적 시료는 조직 시료 및/또는 세포 시료일 수 있고, 본 명세서에 기재된 다양한 방법에 사용하기 위하여, 세절채취 생검(punch biopsy)을 포함하는 조직 생검 및 혈액, 기관지 흡인물, 소변, 대변, 또는 다른 체액을 채취하는 통상적인 방법으로 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, "면역 활성 세포(immunoreactive cell)"라 함은 적절한 자극에 의하여 면역 세포(B 세포, T 헬퍼 세포 또는 세포 용해 T 세포 등)로 성숙할 수 있는 세포를 의미한다. 면역 활성 세포는 CD34+ 조혈 모세포(hematopoietic stem cells), 미숙 및 성숙 T 세포 및 미숙 및 성숙 B 세포를 포함한다. 종양 관련 항원을 인식하는 세포 용해성 또는 T 헬퍼 세포의 생산이 소망되는 경우, 상기 면역 활성 세포를 세포 용해성 T 세포 및 T 헬퍼 세포의 생산, 분화 및/또는 선별에 유리한 조건하에서 종양 관련 항원을 발현하는 세포와 접촉시킨다. 항원에 노출시 T 세포 전구체의 세포 용해성 T 세포로의 분화는 면역계의 클론 선택(clonal selection)과 유사하다.
몇 가지 치료 방법, 하나 이상의 종양 관련 항원을 제시하는 암세포와 같은 항원 제시 세포의 세포 용해를 일으키는, 환자의 면역계 반응에 기초한다. 이와 관련하여, 예컨대, 종양 관련 항원과 MHC 분자의 복합체에 특이적인 자기 유래(autologous) 세포독성 T 림프구를 세포 이상을 갖는 환자에게 투여한다. 이러한 세포독성 T 림프구의 생체외(in vitro) 생산이 공지되어 있다. T 세포를 분화시키는 방법의 일례를 WO-A-9633265에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 혈액 세포와 같은 세포를 함유하는 시료를 환자로부터 채취하고, 상기 세포를 복합체를 제시하고 세포 독성 T 림프구(예컨대, 수지상 세포)의 증식을 유발시킬수 있는 세포와 접촉시킨다. 표적 세포는 COS 세포와 같이 형질 감염된 세포일 수 있다. 이러한 형질 감염된 세포는 자신의 표면에 원하는 복합체를 제시하고, 세포 독성 T 림프구와 접촉시, 후자의 증식을 촉진시킨다. 그리고 나서, 상기 클론 확장된 (clonally expanded) 자기 유래 세포 독성 T 림프구를 환자에 투여한다.
항원 특이적 세포독성 T 림프구를 선별하는 다른 방법에 있어서, MHC 클래스 I 분자/펩타이드 복합체의 형광(fluorogenic) 테트라머를 세포 독성 T 림프구의 특정 클론을 검출하는데 사용한다 (Altman 등, Science 274:94-96, 1996; Dunbar 등, Curr. Biol. 8:413-416, 1998). 용해성 MHC 클래스 I 분자는 β2 마이크로글로불린과 상기 클래스 I 분자에 결합하는 펩타이드 항원의 존재하의 생체외(in vitro)에서 접힌다. MHC/펩타이드 복합체를 정제한 후 바이오틴으로 표지하였다. 바이오틴 부착된 펩타이드-MHC 복합체을 표지된 아비딘(예컨대, 피코에리트린)와 4:1의 몰비로 혼합하여 테트라머를 형성한다. 그리고 나서, 테트라머를 말초혈 또는 림프절과 같은 세포독성 T 림프구와 접촉시킨다. 상기 테트라머는 펩타이드 항원/MHC 클래스 I 복합체를 인식하는 세포 독성 T 림프구에 결합한다. 상기 테트라머에 결합하는 세포를 형광 제어(fluorescence-controlled) 세포 분류에 의하여 분류하여 반응성 세포 독성 T 림프구를 분리할 수 있다. 그리고 나서, 상기 분리된 세포 독성 T 림프구를 생체외(in vitro) 증식시킬 수 있다.
입양 전이(adoptive transfer)(Greenberg, J. Immunol. 136(5):1917, 1986; Riddel 등, Science 257:238, 1992; Lynch 등, Eur. J. Immunol. 21:1403-1410, 1991; Kast 등, Cell 59:603-614, 1989)라 불리는 치료 방법에 있어서, 소망하는 복합체(예컨대, 수지상 세포)를 제시하는 세포를 치료하고자 하는 환자의 세포 독성 T 림프구와 결합시켜, 특정 세포 독성 T 림프구를 증식시킨다. 그리고 나서, 상기 증식된 세포 독성 T 림프구를 특정 복합체를 제시하는 특이한 비정상 세포 특성을 갖는 세포 이형(anomaly)을 갖는 환자에게 투여한다. 그리고 나면, 상기 세포 독성 T 림프구는 상기 비정상 세포를 용해시키고, 이에 의하여 소망하는 치료 효과가 달성된다.
종종, 환자의 T 세포 레퍼토리 중에서, 이러한 종류의 특정 복합체에 대하여 높은 친화성을 갖는 T 세포들은 내성 발달에 의하여 소멸되기 때문에, 낮은 친화성을 갖는 T 세포만이 증식될 수 있다. 이 때, 대안으로서 T 세포 수용체 자체를 전달시킬 수 있다. 이를 위해서, 또한, 소망하는 복합체 (예컨대, 수지상 세포)를 제 시하는 세포를 건강한 개체의 세포 독성 T 림프구와 결합시킨다. 그 결과, 공여체가 상기 특정 복합체와 미리 접촉하지 않았다면, 높은 친화성을 갖는 특이적 세포 독성 T 림프구를 증식시킬 수 있다. 이들 증식된 특이적 T 림프구의 높은 친화성의 T 세포 수용체를 클로닝하고, 예컨대 레트로바이러스 벡터를 사용하여, 유전자 전이를 통하여, 원하는 바와 같은 다른 환자의 T 세포내로 형질 도입시킬 수 있다. 그리고 나서, 이들 유전자 변형된 T 림프구를 사용하여 입양 전이를 수행한다 (Stanislawski 등, Nat Immunol. 2:962-70, 2001; Kessels 등, Nat Immunol. 2:957-61, 2001).
상기 치료 측면은 환자의 비정상 세포 중 적어도 일부가 종양 관련 항원과 HLA 분자와의 복합체를 제시한다는 사실로부터 출발한다. 이러한 세포는 공지의 방법 자체로 동정할 수 있다. 복합체를 제시하는 세포가 동정되자, 이들을 세포 독성 T 림프구를 포함하는 환자로부터 추출한 시료와 조합하여 사용할 수 있었다. 상기 세포 독성 T 림프구가 상기 복합체를 제시하는 세포를 용해한다면, 종양 관련 항원이 제시되었다고 추측할 수 있다.
입양 전이는 본 발명에 따라 적용될 수 있는 치료의 형태인 것만은 아니다. 세포 독성 T 림프구는 또한 공지된 방법 자체로 생체내(in vivo) 생성 가능하다. 한 가지 방법은 상기 복합체를 발현하는 비증식성 세포를 이용한다. 본 발명에서 사용되는 세포는 복합체의 제시에 필요한 하나 또는 양쪽 유전자로 형질 감염된 세포 또는 방사선 조사된 종양 세포와 같이, 복합체 (즉, 항원 펩타이드 및 제시 HLA 분자)를 일반적으로 발현하는 세포일 수 있다. 다양한 세포형을 사용할 수 있다. 또한, 원하는 하나 또는 양쪽 유전자를 운반하는 벡터를 사용하는 것이 가능하다. 바이러스 벡터 또는 박테리아 벡터가 특히 바람직하다. 예컨대, 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산을 특정 조직 또는 세포 유형에서의 상기 종양 관련 항원 또는 그의 단편의 발현을 제어하는 프로모터 및 인핸서 서열과 기능적으로 연결시킬 수 있다. 상기 핵산을 발현 벡터에 통합시킬 수 있다. 상기 발현 벡터는 외래 핵산을 삽입할 수 있는 비변형 염색체외 핵산, 플라스미드 또는 바이러스 게놈일 수 있다. 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 또한 레트로바이러스 게놈 내로 삽입하여, 핵산이 표적 조직 또는 표적 세포내로 통합시킬 수 있다. 이러한 시스템에 있어서, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 미생물이 원하는 유전자를 운반하고, 사실상 숙주 세포를 "감염(infect)"시킨다. 또 다른 바람직한 형태는, 예컨대, 리포좀 전달(liposomal transfer) 또는 전기 영동에 의하여 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 RNA 형태로 종양 관련 항원을 도입하는 것이다. 얻어진 세포는 원하는 복합체를 제시하고, 나중에 증식되는 자기 유래 세포 독성 T 림프구에 의하여 인식된다.
항원 제시 세포내로의 생체내 통합을 가능하게 하기 위하여 종양 관련 항원 또는 그 단편을 아쥬반트와 조합함으로써 유사한 효과를 얻을 수 있다. 상기 종양 관련 항원 또는 그 단편은 단백질, DNA (예컨대, 벡터 내에 포함되어), 또는 RNA로서 표현될 수 있다. 상기 종양 관련 항원은 HLA 분자에 대한 펩타이드 파트너를 생산하도록 가공되는 한편, 그의 단편은 추가적인 가공이 필요없이 제시될 수 있다. 후자는 특히, 이들이 HLA 분자에 결합할 수 있는 경우이다. 완전한 항원이 수지상 세포에 의하여 생체내에서 가공되는 투여 형태가, 효과적인 면역 응답에 요구되는 T 헬퍼 세포 응답을 생성할 수 있기 때문에, 바람직하다 (Ossendorp 등, Immunol Lett. 74:75-9, 2000; Ossendorp 등, J. Exp. Med. 187:693-702, 1998). 일반적으로, 종양 관련 항원의 유효량을, 예컨대, 피내(intradermal) 주입을 통하여, 환자에게 투여하는 것이 가능하다. 그러나, 림프절 내로 주입하는 것도 가능하다 (Maloy 등, Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303, 2001). 또한, 수지상 세포내로의 흡수를 촉진시키는 시약과 조합하여 주입하는 것도 가능하다. 종양 관련 항원은 많은 암환자의 T 세포 또는 동종이계 암 항혈청(allogenic cancer antisera)과 반응하는 것이 생체내 바람직하다. 그러나, 이에 대한 자발적인 면역 응답이 미리 존재하지 않는 것들이 특히 중요하다. 명백히, 종양을 용해할 수 있는 이들 면역 응답에 대하여 유도하는 것이 가능하다 (Keogh 등, J. Immunol. 167:787-96, 2001; Appella 등, Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1:177-84, 1995; Wentworth 등, Mol Immunol. 32:603-12, 1995).
본 발명에 개시된 약학 조성물은 또한 면역화를 위한 백신으로서 사용 가능하다. 본 발명에 있어서, "면역화(immunization)" 또는 "백신화(vaccination)"라 함은 항원에 대한 면역 응답을 증가시키거나 활성화시키는 것을 의미한다. 종양 관련 항원 또는 이를 코딩하는 핵산의 사용에 의한 암에 대한 면역화 효과를 테스트하기 위하여 동물 모델을 사용하는 것이 가능하다. 예컨대, 인간 암세포를 마우스에 도입시켜, 암을 유발하고, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 하나 이상 투여할 수 있다. 암세포에 대한 효과 (예컨대, 종양 크기의 감소)를 핵산에 의한 면역화의 유효성을 측정함으로서 측정할 수 있다.
면역화를 위한 조성물의 일부로서, 한 가지 이상의 종양 관련 항원 또는 그의 자극 단편을 면역 응답을 유도하거나 면역 응답을 증가시키기 위한 한 가지 이상의 아쥬반트와 함께 투여한다. 아쥬반트는 항원에 통합되거나 또는 후자와 함께 투여되어 면역 응답을 강화시키는 물질이다. 아쥬반트는 항원 보유체(reservoir) (세포외적으로 또는 대식세포 내)를 제공하고, 대식세포를 활성화시키고, 특정 림프구를 자극함으로써 면역 응답을 강화시킨다. 아쥬반트는 알려져 있고, 모노포스포릴 리피드 A (MPL, SmithKline Beecham), QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 및 QS-L1 (So 등, Mol. Cells 7:178-186, 1997)과 같은 사포닌, 불완전 프로인드 아쥬반트(incomplete Freund's adjuvant), 완전 프로인드 아쥬반트(complete Freund's adjuvant), 비타민 E, 몬타나이드(montanide), 알룸(alum), CpG 올리고뉴클레오타이드 (cf. Kreig 등, Nature 374:546-9, 1995) 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생분해성 오일로부터 제조되는 다양한 유중수 (water-in-oil) 에멀젼을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 펩타이드를 DQS21/MPL와 혼합하여 투여하는 것이 바람직하다. MPL에 대한 DQS21의 비율은 통상적으로 약 1:10 내지 10:1이고, 약 1:5 내지 5:1이 바람직하고, 약 1:1이 특히 바람직하다. 인간에 투여하기 위하여, 백신 제제는 통상적으로 DQS21 및 MPL를 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍ 범위로 함유한다.
환자의 면역 응답을 자극하는 다른 물질을 또한 투여할 수 있다. 예컨대, 사이토카인을, 그의 림프구에 대한 조절 특성으로 인하여, 백신화에 사용하는 것이 가능하다. 이러한 사이토카인에는, 예컨대, 백신에 대한 보호 작용을 증가시키는 것으로 나타난 인터루킨-12 (IL-12) (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF 및 IL-18 등이 있다.
면역 응답을 강화시켜 백신화에 사용될 수 있는 화합물이 많이 있다. 상기 화합물은 단백질 또는 핵산의 형태로 제공되는 공동 자극 분자를 포함한다. 이러한 공동 자극 분자의 예로서 수지상 세포 (DC) 상에서 발현되며 T 세포 상에 발현되는 CD28 분자와 상호 작용하는 B7-1 및 B7-2 (각각, CD80 및 CD86) 등이 있다. 이러한 상호 작용은 항원/MHC/TCR 자극된 (신호 1) T 세포에 대한 공동 자극 (신호 2)을 제공하여 상기 T 세포의 증식 및 작용 인자 기능을 증진시킨다. B7도 또한 T 세포 상에서 CTLA4 (CD152)와 반응하며, CTLA4와 B7 리간드를 수반하는 연구에 의하여 B7-CTLA4 상호 작용이 항암 면역성과 CTL 증식을 증진시키는 것으로 나타났다(Zheng, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11): 6284-6289 (1998)).
B7은 통상적으로 종양 세포에서 발현되지 않으며, 이들은 T 세포에 대하여 유효한 항원 제시 세포 (APCs)가 아니다. B7 발현의 유도에 의하여 종양 세포가 세포 독성 T 림프구의 증식 및 작용 인자의 기능을 보다 효과적으로 자극할 수 있게 된다. B7/IL-6/IL-12의 조합에 의한 공동 자극이 T 세포 집단 내의 IFN-감마 및 Th1-사이토카인 양상의 유도를 나타내며, T 세포 활성을 보다 증진기키는 결과를 가져온다 (Gajewski 등, J. Immunol. 154: 5637-5648 (1995)).
세포 독성 T 림프구의 완전한 활성화 및 완전한 작용 인자 기능은 T 헬퍼 세포 상의 CD40 리간드와 수지상 세포에 의하여 발현되는 CD40 분자 간의 상호 작용 을 통한 T 헬퍼 세포의 수반을 필요로 한다 (Ridge 등, Nature 393:474 (1998), Bennett 등, Nature 393:478 (1998), Schoberger 등, Nature 393:480 (1998)). 이러한 공동 자극 신호의 메카니즘은 아마도 B7 생산 및 상기 수지상 세포 (항원 제시 세포)에 의한 관련된 IL-6/IL-12 생산의 증가와 관련있다. 따라서, CD40-CD40L 상호 작용은 신호 1 (항원/MHC-TCR)과 신호 2 (B7-CD28)와의 상호 작용을 보완한다.
수지상 세포를 자극시키기 위하여 항CD40 항체를 사용함으로써, 일반적으로 염증 반응 범위 밖이거나 비전문적 항원 제시 세포 (종양 세포)에 의하여 제시되는 종양 항원에 대한 반응이 직접적으로 증진될 것으로 기대된다. 이러한 상황에서, T 헬퍼 및 B7 공동 자극 신호는 제공되지 않는다. 이러한 메카니즘은 항원 펄스된(antigen-pulsed) 수지상 세포에 기초하는 치료법과 관련하여 또는 T 헬퍼 에피토프가 공지된 TRA 전구체에 정의되어 있지 않은 경우 사용할 수 있었다.
본 발명은 또한 핵산, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 투여하는 것을 제공한다. 폴리펩타이드와 펩타이드는 공지된 방법 자체로 투여할 수 있다. 일례에 있어서, 생체외적(ex vivo) 방법, 즉, 세포를 환자로부터 추출하고 종양 관련 항원을 통합시키기 위하여 상기 세포를 유전자 변형시키고 상기 변형된 세포를 환자 내로 다시 도입시킴으로써, 핵산을 투여한다. 이는 일반적으로 유전자의 기능적 복제를 환자의 세포 내로 생체외적으로(in vitro) 도입시키고, 상기 유전자 변형된 세포를 다시 환자 내로 도입시키는 것을 포함한다. 상기 유전자의 기능적 복제는 상기 유전자가 유전자 변형된 세포에서 발현될 수 있도록 하는 조절 인자의 기능적 조절하 에 있다. 형질 감염법 및 형질 도입법은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 본 발명은 또한 표적 제어 리포좀 및 바이러스와 같은 벡터를 사용하여 생체내적으로 핵산을 투여하는 것을 제공한다.
바람직한 예에 있어서, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 투여하기 위한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 약독화 폭스 바이러스 등의 폭스 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스 (Semliki Forest virus), 레트로바이러스, 신드비스 바이러스(Sindbis virus) 및 Ty 바이러스 유사 입자로 이루어진 군 중에서 선택된다. 아데노바이러스 및 레트로바이러스가 특히 바람직하다. 레트로바이러스는 통상적으로 복제 결함이 있다 (즉, 이들은 감염성 입자를 생성할 수 없다).
본 발명에 있어서 핵산을 생체외 또는 생체내적으로 세포 내로 도입시키기 위하여 다양한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 종류의 방법은 핵산 CaPO4 침전물의 형질 감염, DEAE와 관련된 핵산의 형질 감염, 원하는 핵산을 운반하는 상기 바이러스를 사용하는 형질 감염 또는 감염, 리포좀 매개 형질 감염 등을 포함한다. 구체예에 있어서, 핵산을 특정 세포로 도입시키는 것이 바람직하다. 이러한 예에 있어서, 핵산을 세포에 투여하기 위하여 사용되는 담체 (예컨대, 레트로바이러스 또는 리포좀)는 결합된 표적 제어 분자를 가질 수 있다. 예컨대, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자를 상기 핵산 담체 내로 통합시키거나 여기에 부착시킬 수 있다. 바람직한 항체 는 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체를 포함한다. 핵산이 리포좀을 통하여 투여되는 것이 소망되는 경우, 표적 제어 및/또는 흡수를 가능하게 하기 위하여, 엔도사이토시스(endocytosis)와 관련된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 리포좀 제제에 포함시킬 수 있다. 이러한 단백질로는 특정 세포 유형에 특이적인 캡시드 단백질 또는 그 단편, 흡수되는(internalized) 단백질에 대한 항체, 세포내 자리를 어드레싱(addressing)하는 단백질 등이 있다.
본 발명의 치료 조성물은 약학적으로 양립 가능한 제제 형태로 투여될 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 약학적으로 양립 가능한 농도의 염, 완충 물질, 보존제, 담체, 아쥬반트, CpG 및 사이토카인과 같은 면역 강화 물질, 및, 적절한 경우, 다른 치료 활성 화합물을 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 치료 활성 화합물은 주사 또는 주입(infusion)과 같은 통상적인 경로를 통하여 투여할 수 있다. 상기 투여는, 예컨대, 경구 투여, 정맥내 투여, 복막내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 경피적 투여일 수 있다. 항체는 폐 에어로졸에 의하여 치료적으로 투여하는 것이 바람직하다. 안티센스 핵산은 느린 정맥내 투여에 의하여 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량(effective amount)"이라 함은 단독 또는 추가적인 용량과 함께 소망하는 반응 또는 소망하는 효과를 달성하는 양을 의미한다. 하나 이상의 종양 관련 항원 발현 특성을 갖는 특정 질병 또는 특정 증상의 치료의 경우, 상기 소망하는 반응은 상기 질병의 경과를 억제하는 것과 관계된 것이다. 이는 질병의 진행 속도를 늦추고, 특히, 질병의 진행을 중단시 키는 것을 포함한다. 이러한 질병 또는 증상의 치료에 있어서의 소망하는 반응은 또한 상기 질병 또는 상기 증상의 발병을 예방하거나 발병을 지연시키는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물의 유효량은 치료하고자 하는 증상, 질병의 증세, 연령, 생리적 조건, 크기 및 체중 등의 환자의 개인적 파라미터, 치료 기간, 동반되는 치료법이 있는 경우 그 유형, 투여의 특정 경로 및 유사 인자에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 살균 처리되고 치료적 활성 물질을 유효량으로 함유하여 소망하는 반응 또는 소망하는 효과를 발생시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 투여되는 분량은 투여 유형, 환자의 상태, 소망하는 투여 기간 등과 같은 다양한 파라미터에 따라서 달라질 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 분량으로 불충분한 경우, 보다 많은 분량 (또는 다른 보다 국부화된 투여 경로에 의하여 달성되는 효과적으로 증가된 분량)을 사용할 수 있다.
일반적으로, 1 ng 내지 1 mg, 바람직하게는 10 ng 내지 100 ㎍ 분량의 종양 관련 항원을 제제화하고, 치료 또는 면역 응답을 발생시키거나 증가시키기 위하여 투여한다. 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 (DNA 및 RNA)의 투여가 소망되는 경우, 1 ng 내지 0.1 mg 분량을 제제화하고 투여한다.
본 발명의 약학 조성물을 일반적으로 약학적으로 양립 가능한 양 및 약학적으로 양립 가능한 조성으로 투여한다. "약학적으로 양립 가능한(pharmaceutically compatible)"이라 함은 약학 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 이러한 종류의 제제는 일반적으로 염, 완충 물질, 보존제, 담체 및, 적절한 경우, 다른 치료적 활성 화합물을 함유할 수 있다. 의약품에 사용되는 경우, 상기 염은 약학적으로 양립 가능하여야 한다. 그러나, 약학적으로 양립 가능하지 않은 염은 약락적으로 양립 가능한 염을 제조하는데 사용할 수 있으며, 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 약리적 또는 약학적으로 양립 가능한 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등의 산으로부터 제조된 것을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 약학적으로 양립 가능한 염은 또한 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로서 제조될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 양립 가능한 담체를 함유한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 양립 가능한 담체(pharmaceutically compatible carrier)"라 함은 인간에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 양립 가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 인캡슐레이팅 물질을 의미하는 것이다. "담체(carrier)"라 함은 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분으로서, 적용을 용이하게 하기 위하여 활성 성분이 결합되어 있는 것을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물의 성분은 일반적으로 소망하는 약학적 효과를 실질적으로 손상시키는 상호 작용이 일어나지 않는 것들이다.
본 발명의 약학 조성물은 아세트산 염(acetic acid in a salt), 시트르산염(citric acid in a salt), 붕산염(boric acid in a salt) 및 인산염(phosphoric acid in a salt)과 같은 적절한 완충 물질을 함유할 수 있다.
상기 약학 조성물은 또한, 적절한 경우, 염화벤즈알코늄(benzalkonium chloride), 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살(thimerosal)과 같은 적절한 보존제를 함유할 수 있다.
상기 약학 조성물은 일반적으로 일정한 복용 형태로 제공되며, 알려진 방법 자체로 제조될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은, 예컨대, 캡슐, 타블렛, 로젠지(lozenges), 현탁액, 시럽, 엘릭서(elixir) 또는 에멀젼 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로, 수용자의 혈액과 등장인 것이 바람직한, 활성 화합물의 살균 수성 또는 비수성 제제를 포함한다. 양립 가능한 담체 및 용매의 예로서, 링거액 또는 염화나트륨 등장액이 있다. 또한, 일반적으로 살균된 고정유(fixed oil)를 용액 또는 현탁액 매질로서 사용할 수 있다.
이하, 본 발명은 후술하는 도면 및 실시예에 의하여 보다 상세히 설명할 것이나, 이들 도면 및 실시예는 단지 예시적인 목적으로 사용될 뿐이며 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 발명의 상세한 설명 및 실시예에 의하여, 본 발명에 포함되는 유사한 다른 구체예들도 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
도 1: eCT의 클로닝을 개략적으로 나타낸 것. 상기 방법은 데이타베이스에서 후보자 유전자 (GOI="Genes of interest")를 동정하고, RT-PCR에 의하여 상기 유전자를 테스트하는 것을 포함한다.
도 2: LDH C의 스플라이싱. 대체적인(alternative) 스플라이싱에 의하여, 엑손 3 (SEQ ID NO:2), 두 개의 엑손 3 및 4 (SEQ ID NO:3), 엑손 3, 6 및 7 (SEQ ID NO:4) 및 엑손 7 (SEQ ID NO:5)이 결실된다. ORF = 개방 해독틀(open reading frame), aa = 아미노산.
도 3: 가능한 LDH-C 단백질의 정렬. SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:10은 원형 단백질 (SEQ ID NO:6)의 절단된 부분이다. 단백질 서열 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:13는 추가적으로 변형되고 종양 특이적 에피토프만을 함유한다 (굵은체로 표시). 촉매 중심을 네모틀 안에 표시하였다.
도 4: 실시간 PCT에 의한 다양한 조직에서의 LDH C의 정량 분석. 전사체가 정소를 제외한 정상 조직에서는 탐지되지 않았지만, 종양에서는 상당한 수준의 발현이 탐지되었다.
도 5: TPTE 변이체의 엑손 조성. 본 발명에 있어서, 정소 조직 및 종양에서 발현하고 프레임 쉬프트가 일어나 서열 부위가 변형된 스플라이스 변이체 (SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57)를 동정하였다.
도 6: 가능한 TPTE 단백질의 정렬. 대체적인 스플라이싱은 해독틀은 원칙적으로 보존하면서 코딩되는 단백질의 변경을 초래한다. 추정되는 막통과 도메인을 굵은체로 표시하고, 촉매 도매인을 네모칸으로 표시하였다.
도 7: 핵산 수준에서의 TSBP 변이체의 정렬. 공지된 서열 (NM 006781, SEQ ID NO: 29)에 대한 본 발명에 있어서 발견되는 TSBP 변이체의 핵산 서열(SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33)의 차이점을 굵은체로 표시하였다.
도 8: 단백질 수준에서의 TSBP 변이체의 정렬. 본 발명에서 발견되는 TSBP 변이체에 의하여 코딩되는 단백질 (SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36)에 있어서, 프레임 쉬프트가 이전에 개시된 단백질 (SEQ ID NO:30, NM 006781)과의 실질적인 차이를 야기시키며 이를 굵은체로 나타내었다.
도 9: MS4A12에 대한 RT-PCR. 테스트된 조직 중에서 정소, 결장 및 결장 암종 (colon ca's)에서만 발현이 검출되었다. 나타낸 6 개의 간 조직 시료 중 하나에서, 상기 샘플이 결장 암종 전이의 침투를 받았기 때문에, MS4A12에 대하여 양성 검출(positive detection)을 수행하였다. 이후의 연구 역시 결장 암종 전이에서의 구별되는 발현을 보여주었다.
도 10: BRCO1에 대한 RT-PCR. BRCO1은 포유류의 정상 유선 조직에서의 발현과 비교하여 유방 종양에서 뚜렷하게 과발현한다.
도 11: MORC, TPX1, LDHC, SGY-1에 대한 RT-PCR. 다양한 정상 조직의 연구에 의하여 정소에서만 발현함이 밝혀졌다(1 피부, 2 소장, 3 결장, 4 간, 5 폐, 6 위, 7 유방, 8 신장, 9 난소, 10 전립선, 11 갑상선, 12 백혈구, 13 흉선, 14 음성 대조군, 15 정소). 종양 시험 (1-17 폐 종양, 18-29 흑색종, 30 음성 대조군, 31 정소)에 의하여 각각의 eCT에 대하여 상이한 빈도로 상기 종양에서 이소적으로 발현함을 밝혔다.
도 12: MCF-7 유방암 세포계에서의 LDHC의 미토콘드리아 위치화. MCF-7 세포를 LDHC 발현 플라스미드로 일시적으로 형질 감염시켰다. LDHC 특이적 항체를 사용하여 항원을 검출하였고, 미토콘드리아 호흡쇄 효소(mitochondrial respiratory chain enzyme) 사이토크롬 C-산화 효소와의 독특한 공동 위치화(colocalization)를 나타내었다.
도 13: TPTE의 예상 위상 기하학 및 MCF-7 세포의 세포 표면 상의 세포 하부(subcellular) 위치화. 왼편의 다이어그램은 4 개의 추정 TPTE 막통과 도메인 (화살표)을 나타낸 것이다. MCF-7 세포를 TPTE 발현 플라스미드를 사용하여 일시적으로 형질 감염시켰다. TPTE 특이적 항체를 사용하여 항원을 검출하였고, 세포 표면 상에 위치하는 MHC I 분자와의 독특한 공동 위치화를 나타내었다.
도 14: 세포막 상의 MS4A12 위치화. 종양 세포를 GFP-표지된 MS4A12 구조체를 사용하여 일시적으로 형질 감염시키고, 공초점 면역형광 현미경으로 플라즈마 멤브레인 표지와의 완벽한 공동 위치화를 나타내었다.
재료 및 방법
"인 실리코 클로닝(in silico cloning)", "전자적 클로닝(electronic cloning)" 및 "가상 클로닝(virtual cloning)"이라 함은, 단독적으로, 모의 실험실 시험 과정에서도 또한 사용되는, 데이터베이스에 기초한 방법의 사용을 의미한다.
다른 의미로 명시적으로 정의되지 않는 한, 모든 다른 단어 또는 표현은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 이해되는 바와 같이 사용된다. 기재된 기술 및 방법은 알려진 방법 자체에 의하여 수행되며, 예컨대, Molecular Cloning [Sambrook 등, Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]등에 기재되어 있다. 키트 및 시약의 사용을 포함하는 모든 방법은 제조자의 사용 설명서에 따라서 수행 할 수 있다.
eCT (전자적으로 클로닝된 암/정소 유전자)의 결정을 위한 데이터 마이닝 기초 방법
두 가지의 in silico 방법, 즉, GenBank 키워드 검색 및 cDNAx프로파일러(cDNAxProfiler)을 조합하였다 (도 1). NCBI ENTREZ 검색과 복구 시스템(Retrieval System) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)을 사용하여, 정소 조직에서 특이적으로 발현하는 것으로 주석이 달린 후보 유전자에 대한 GenBank 검색을 수행하였다 (Wheeler 등, Nucleic Acids Research 28:10-14, 2000).
키워드로 "정소 특이적 유전자(testis-specific gene)", "정자 특이적 유전자(sperm-specific gene)" "정원세포 특이적 유전자(spermatogonia-specific gene"를 사용하는 질문을 수행하여, 후보자 유전자 (GOI, genes of interest)를 데이터베이스로부터 추출하였다. 상기 검색은, 생물체에 관해서는 "호모 사피언스(homo sapience)", 분자 유형에 관해서는 "mRNA"라는 한정을 사용하여, 이들 데이터베이스의 총정보 중 일부로 한정하여 수행하였다.
발견된 GOI 목록을 동일한 서열에 대해서 상이한 이름을 결정하고 이러한 잉여성(redundancy)을 소거하여 큐레이팅하였다(curated).
키워드 검색으로 얻은 모든 후보자 유전자를 "전자 노던(electronic Northern, eNorthen)" 방법에 의하여 그들의 조직 분포에 대하여 차례로 연구를 수행하였다. 상기 eNorthern은 EST (발현된 서열 택, expressed sequence tag) 데이터베이스 (Adams 등, Science 252:1651, 1991) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)에 의한 GOI 서열의 정렬에 기초한다. 상기 GOI와 상동인 것으로 나타난 각각의 EST의 조직 기원을 결정할 수 있고, 이러한 방법으로 모든 EST의 합계에 의하여 GOI의 조직 분포를 예비적으로 평가한다. 태반 및 태아 조직을 제외하고 정소 이외의 정상 세포로부터 유래하는 EST에 대하아ㅕ 상동성을 갖지 않는 GOI 만을 사용하여 추가적인 연구를 수행하였다. 이러한 평가는 또한 공지된 도메인이 잘못 주석이 달린 cDNA 라이브러리를 포함하고 있다는 것을 고려한 것이다 (Scheurle 등, Cancer Res. 60:4037-4043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm).
사용된 두 번째 데이터마이닝법은 NCBI Cancer Genome Anatomy Project (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler)의 cDNAxProfiler이다 (Hillier 등, Genome Research 6:807-828, 1996; Pennisi, Science 276:1023-1024, 1997). 이는 데이터베이스에 축적된 전사체(transcriptomes) 풀(pool)이 논리 연산자에 의하여 서로 연관되도록 할 수 있다. 혼합 라이브러리를 제외하고, 정소로부터 제조된 모든 발현 라이브러리가 할당된 풀 A를 정의하였다. 정소, 난소 또는 태아 조직을 제외한 정상 조직으로부터 제조된 모든 cDNA 라이브러리를 풀 B에 할당하였다. 일반적으로, 모든 cDNA 라이브러리를 기본적인 제작 방법에 관계없이 사용하였으며, 단, 1000보다 큰 사이즈를 갖는 것들만 허용하였다. BUT NOT 연산자에 의하여 풀 B를 풀 A로부터 디지탈 방식으로 공제하였다. 이러한 방식으로 발견된 GOI 세트에 대하여 또한 eNorthern 연구를 수행하였으며, 문헌적 검색에 의하여 확인하였다.
이러한 조합된 데이터마이닝은 공지된 도메인 내의 모든 약 13,000 전장 유 전자를 포함하고, 이들 유전자들 중에서 잠재적 정소 특이적 발현을 갖는 총 140 유전자를 예측한다. 후자 중에서 25 유전자는 CT 유전자 클래스 중에서 이미 알려진 유전자이며, 이는 본 방법의 효율을 강조하는 것이다.
모든 다른 유전자를 특이적 RT-PCR에 의하여 정상 조직에서 일차적으로 평가하였다. 정소 이외의 정상 조직에서 발현하는 것으로 증명된 모든 GOI는 오류-포지티브(false-positive)로서 간주되어야 하였으며, 추가적 연구로부터 제외시켰다. 잔존하는 것들을 광범위하게 다양한 종양 조직의 커다란 패널에서 연구하였다. 여기서 하기에 설명되는 항원이 종양 세포에서 이소적으로 활성화된다는 것을 증명하였다.
RNA 추출, 폴리-d(T) 프라이밍된(primed) cDNA의 제작 및 RT-PCR 분석
카오트로픽제(chaotropic agent)로서 구아니듐 이소티오시아네이트를 사용하여 천연 조직 물질로부터 전체 RNA를 추출하였다 (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-9, 1987). 산성 페놀로 추출하고 이소프로판올로 침전시킨 후, 상기 RNA를 DEPC 처리된 물에 용해시켰다.
제조자의 사용 설명서를 따라서, Superscript II (Invitrogen)을 사용하여, 20 ml의 반응 혼합물에서, 전체 RNA 2 내지 4 ㎍으로부터 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 수행하였다. 프라이머로서 dT(18) 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. cDNA의 보존 및 특질을 PCR 30 회에 의한 p53의 증폭에 의하여 조사하였다 (센스 CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, 안티센스 CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, 혼성화 온도 67℃).
첫 번째 가닥 cDNA의 집적소(archive)를 많은 정상 조직 및 종양 본체 (entities)로부터 제작하였다. 발현 연구를 위하여, 이들 cDNA 0.5 ml를, GOI 특이적 프라이머(아래 참조) 및 HotStarTaq DNA 중합효소 (Qiagen) 1 U를 사용하여, 30 ml의 반응 혼합물에서 증폭시켰다. 각각의 반응 혼합물은 dNTPs 0.3 mM, 각각의 프라이머 0.3 mM 및 10 x 반응 완충물 3 ml을 함유하였다.
상기 프라이머는 서로 다른 두 개의 엑손에 위치하도록 선택하였으며, 오류-포지티브 결과에 대한 원인인 게놈 DNA의 오염에 의한 간섭의 배제를 주형인 비가역적(nonreverse) 전사된 DNA를 테스트하여 확인하였다. 95 ℃에서 15 분 후, HotStarTaq DNA 중합효소를 활성화시키기 위하여, PCR 35 회를 수행하였다 (94 ℃에서 1 분, 특정 혼성 온도에서 1 분, 72 ℃에서 2 분 및 72 ℃에서 6 분동안 최종적으로 신장시킴).
이러한 반응물 20 ㎕을 분류하고 브롬화에티듐 염색된 아가로오스 겔 상에서 분석하였다.
아래의 프라이머를 사용하여 표시된 혼성화 온도에서의 해당 항원의 발현을 분석하였다.
LDH-C (67 ℃)
센스 TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC, 안티센스 CAACATCTGAGACACCATTCC
TPTE (64 ℃)
센스 TGGATGTCACTCTCATCCTTG, 안티센스 CCATAGTTCCTGTTCTATCTG
TSBP (63 ℃)
센스 TCTAGCACTGTCTCGATCAAG, 안티센스 TGTCCTCTTGGTACATCTGAC
MS4A12 (66 ℃)
센스 CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, 안티센스 TTCACCTTTGCCAGCATGTAG
BRCO1 (60 ℃)
센스 CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, 안티센스 CACAGAATATGAGCCATACAG
TPX1 (65 ℃)
센스 TTTTGTCTATGGTGTAGGACC, 안티센스 GGAATGGCAATGATGTTACAG
무작위 헥사머 프라이밍된(hexamer-primed) cDNA의 제작 및 정량적 실시간(quantitative real time) PCR
LDHC 발현을 실시간 PCR에 의하여 정량 분석하였다.
ABI PRISM Sequence Detection System (PE Biosystems, USA)을 사용하는 정량적 실시간 PCR의 원리는 형광 리포터 염료의 방출을 통하여 PCR 산물을 직접적이고 특이적으로 검출하기 위하여 Taq DNA 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 이용한다. 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머 외에도, 상기 PCR은 PCR 산물의 서열과 혼성화하는 이중 형광 표지된 프로브(TaqMan probe)를 사용한다. 상기 프로브는 리포터 염료 (예컨대, FAM)가 결합된 표지된 5'와 소광(quencher) 염료 (예컨대, TAMRA)와 결합된 3'이다. 상기 프로브가 본래 상태라면, 소광제에 대한 리포터의 공간적 접근성이 리포터 형광의 방출을 억제한다. 상기 프로브가 PCR 동안에 PCR 산물과 혼성화한다면, 상기 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의하여 절단되고 리포터 형광의 억제가 제거된다. 표적 증폭의 결과로서의 리포터 형광의 증가는 각각의 PCR 순환 후에 측정하며 정량 화에 사용한다. 표적 유전자의 발현은 연구하고자 하는 조직에서 지속적으로 발현하는 대조군 유전자의 발현에 대하여 상대적으로 또는 절대적으로 정량화한다. LDHC 발현을, 상기 시료를 "하우스키핑(housekeeping)" 유전자인 18s RNA에 대하여 표준화시킨 후, ΔΔ-Ct법 (PE Biosystems, USA)을 사용하여 계산하였다. 상기 반응은 이중 혼합물에서 수행하였고 두 번 측정하였다. High Capacity cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 제조자의 사용 설명서에 따라서 헥사머 프라이머를 합성하였다. 각각의 경우에 있어서, 희석된 cDNA 5 ㎕를 총부피 25 ㎕로 PCR에 사용하였다: 센스 프라이머 (GGTGTCACTTCTGTGCCTTCCT) 300 nM; 안티센스 프라이머 (CGGCACCAGTTCCAACAATAG) 300 nM; TaqMan 프로브 (CAAAGGTTCTCCAAATGT) 250 nM; 센스 프라이머 18s RNA 50 nM; 안티센스 프라이머 18s RNA 50 nM; 18s RNA 시료 250 nM; 12.5 ㎕ TaqMan Universal PCR Master Mix; 최초 변성 95 ℃ (10 분); 95 ℃ (15 초); 60 ℃ (1 분); 40 회. 엑손 1과 엑손 2의 경계를 넘는 128 bp 산물의 증폭에 의하여, 본 명세서에 개시된 모든 LDHC 스플라이스 변이체를 상기 정량화에 포함시켰다.
클로닝 및 서열 분석
통상적인 방법에 의하여 전장 유전자와 유전자 단편을 클로닝하였다. pfu 프루프리딩 중합효소(Stratagene)을 사용하여 대응 항원을 증폭시켜서 상기 서열을 결정하였다. PCR 완료 후, 제조자의 사용 설명서에 따라서 상기 단편을 TOPO-TA 벡터내로 클로닝하기 위하여, 상기 증폭체(amplicon) 끝을 HotStarTaq DNA 중합효소 를 사용하여 연결하였다. 상업적 시설에서 서열 분석을 수행하였다. 상기 서열은 통상적인 예측 프로그램 및 알고리즘에 의하여 분석하였다.
실시예 1: 신규한 종양 항원인 LDH C의 동정
LDH C (SEQ ID NO:1) 및 그의 번역 산물 (SEQ ID NO:6)은 락테이트 탈수소 효소 계통의 정소 특이적 동질 효소(isoenzyme)로서 설명되어 있다. 상기 서열은 GenBank에 공지되어 있다 (accession number: NM_017448). 상기 효소는 140 kDa 분자량을 갖는 호모테트라머를 형성한다 (Goldberg, E. 등, Contraception 64(2):93-8, 2001; Cooker 등, Biol. Reprod. 48(6):1309-19, 1993; Gupta, G.S., Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 34(6):361-85, 1999).
어디에서나 보편적으로 발현되는 관련 동질 효소 LDH A 및 LDH B를 교차 증폭시키지 않으며, 정소 특이적인 것으로 전술된 LDH C 원형 서열 NM_017448에 기초한 프라이머 쌍 (5'-TGCCGTAGGCATGGCTTGTGC-3' 5'-CAACATCTGAGACACCATTCC-3')을 이용하는 발현 분석을 위한 RT-PCR 연구는, 본 발명에 있어서, 테스트된 모든 정상 조직에서 발현이 일어나지 않음을 확인하였으며, 체세포에서의 상기 항원의 엄격산 전사 억제가 종양에의 경우에는 제거되었음을 보여주었다 (표 1 참조). CT 유전자에 전형적으로 전술된 바와 같이, LDH C는 많은 종양 본체(entities)로 발현되었다.
종양에서의 LDHC의 발현
조직 테스트된 총 수 양성 %
흑색종 (Melanoma) 16 7 44
유방 암종 (Mammary carcinomas) 20 7 35
대장 종양 (Colorectal tumors) 20 3 15
전립선 암종 (Prostate carcinomas) 8 3 38
기관지 암종 (Bronchial carcinomas) 17 8 47
신장 세포 암종 (Kidney cell carcinomas) 7 4 57
난소 안종 (Ovarian carcinomas) 7 3 43
갑상선 암종 (Thyroid carcinomas) 4 1 25
자궁 경부 암종 (Cervical carcinomas) 6 5 83
흑색종 세포계 (Melanoma cell lines) 8 5 63
기관지 암종 세포계
(Bronchial carcinoma cell lines)		 6 2 33
상기의 PCR 프라이머를 사용하여 얻어진 증폭 산물의 예상 크기는 824 bp이다. 그러나, 본 발명에 있어서, 다수의 추가적인 밴드의 증폭이 종양에서 관찰되었으며, 정소에서는 관찰되지 않았다. 이는 대체적(alternative) 스플라이스 변이체의 존재를 나타내는 것이기 때문에, 완전한 개방 해독틀(complete open reading frame)을 LDH-C 특이적 프라이머 (5'-TAGCGCCTCAACTGTCGTTGG-3', 5'-CAACATCTGAGACACCATTCC-3')를 사용하여 증폭시키고, 독립적인 전장 클론을 서열 분석하였다. SEQ ID NO:1에 기재된 LDH C 서열의 원형 ORF 및 염색체 11 상의 게놈 서열과의 정렬에 의하여 추가적 스플라이스 변이체 (SEQ ID NO:2 내지 5)를 확인하였다. 상기 대체적 스플라이스는 엑손 3 (SEQ ID NO:2), 두 개의 엑손 3 및 4 (SEQ ID NO:3), 엑손 3, 6 및 7 (SEQ ID NO:4) 또는 엑손 7 (SEQ ID NO:5)의 결여를 초래한다 (도 2 참조).
이들 신규한 스플라이스 변이체는 오직 종양에서만 생성되었고, 정소에서는 생성되지 않았다. 대체적 스플라이싱은 해독틀의 변화를 가져오고, SEQ ID NO:7 내 지 13 (SEQ ID NO:7에 대한 ORF: SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 위치 59-214 및, 각각, SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:8에 대한 ORF: SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 위치 289-939; SEQ ID NO:9에 대한 ORF: SEQ ID NO:3의 뉴클레오타이드 위치 59-196; SEQ ID NO:10에 대한 ORF: SEQ ID NO:3의 뉴클레오타이드 위치 535-765; SEQ ID NO:11에 대한 ORF: SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 위치 289-618; SEQ ID NO:12의 ORF: SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 위치 497-697; SEQ ID NO:13에 대한 ORF: SEQ ID NO:5의 뉴클레오타이드 위치 59-784)에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 새로운 가능한 ORFs를 발생시킨다 (도 2 및 3 참조). 미숙한 종결은 별도로 하고, 코딩되는 단백질을 N-말단 및 C-말단 모두에서 절단되도록 하기 위하여 대체적 개시 코돈을 이용하는 것 또한 가능하다.
SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:10은 원형 단백질의 절단된 부분을 나타내며, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:13의 단백질 서열은 추가적으로 변형되고 종양 특이적 에피토프(도 3에 굵은체로 표시)만을 포함한다. 종양 특이적 에피토프를 유발시킬 수 있는 펩타이드 부위는 다음과 같다 (프레임 쉬프트에 의하여 생성된 정확히 종양 특이적인 부위를 밑줄 그어 표시하였다):
SEQ ID NO:14: GAVGMACAISILLK ITVYLQTPE (SEQ ID NO:7 중 일부)
SEQ ID NO:15: GAVGMACAISILLK WIF (SEQ ID NO:9 중 일부)
SEQ ID NO:16: GWIIGEHGDSS GIIWNKRRTLSQYPLCLGAEWCLRCCEN (SEQ ID NO:11 중 일부)
SEQ ID NO:17: MVGLLENMVILV GLYGIKEELFL (SEQ ID NO:12 중 일부)
SEQ ID NO:18: EHWKNIHKQVIQ RDYME (SEQ ID NO:13 중 일부)
이들 부위는 MHC I 또는 MHC II 분자 상에서 T 림프구에 의하여 인식되며 정확한 종양 특이적 응답을 유발할 수 있는 에피토프를 잠재적으로 포함할 수 있다.
예측된 단백질이 모두, 혐기성 해당(glycolysis)의 마지막 단계를 의미하는, 피루베이트의 락테이트로의 NADH 의존적 대사를 위한 촉매적 락테이트 탈수소 효소 도메인을 갖는 것은 아니다. 이러한 도메인은 락테이트 탈수소 효소로서의 효소적 기능에 요구되는 것이다 (도 3에 네모틀로 표시). 예컨대, TMpred 및 pSORT (Nakai & Kanehisa, 1992)를 이용하는, 다른 분석에 의하여, 추정 단백질의 서로 다른 세포 하부 위치화를 예측한다.
본 발명에 있어서, 발현 정도를 특이적 프라이머-시료 세트를 사용하는 실시간 PCR에 의하여 정량화하였다. 증폭체(amplicon)가 엑손 1과 엑손 2 간의 접합점에 존재하여 모든 변이체 (SEQ ID NO:1 내지 5)를 검출한다. 또한, 이러한 연구에 의하여 정소를 제외한 모든 정상 조직에서 어떠한 전사체도 검출되지 않는다. 이들에 의하여, 종양에서 상당한 수준의 발현이 있음을 확인한다 (도 4 참조).
LDHC 특이적 폴리클로날 항체를 가장 N-말단 부위 MSTVKEQLIEKLIEDDENSQ (SEQ ID NO:80)로부터 펩타이드를 선택하여 본 발명에 따라서 생산하였다. LDHC 특이적 항체를 상기 펨타이드를 이용하여 래빗에서 생산하였다. 이어지는 단백질 발현에 대한 연구에 의하여, 정소 및 다양한 종양에서의 선택적 LDHC 발현을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 면역 조직학적 연구에 의하여, 미토콘드리아에서의 LDHC의 사이토크롬 C와의 독특한 공동 위치화를 밝혔다. 이는 LDHC가 종양의 호흡쇄에 있어서 중요한 역학을 한다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 2: 신규한 종양 항원인 TPTE의 동정
TPTE 전사체 (SEQ ID NO:19) 및 이의 번역 산물 (SEQ ID NO:22)의 서열은 GenBank에 공지되어 있다 (accession number NM_013315) [Walker, S.M. 등, Biochem. J. 360(Pt 2):277-83, 2001; Guipponi M. 등, Hum. Genet. 107(2):127-31, 2000; Chen H. 등, Hum. Genet. 105(5):399-409, 1999]. TPTE는 가능한 막통과 티로신포스파타아제를 코딩하는 유전자로 기재되어 있으며, 21번, 13번, 15번, 22번 및 Y 염색체의 동원체 주변 부의에 위치하는 정소 특이적 발현 특성을 갖는다 (Chen, H. 등, Hum. Genet. 105:399-409, 1999). 본 발명에 따른 정렬 연구에 의하여, 3번 및 7번 염색체 상의 상동 게놈 서열을 추가적으로 밝혔다.
본 발명에 있어서, PCR 프라이머 (5'-TGGATGTCACTCTCATCCTTG-3' 및 5'-CCATAGTTCCTGTTCTATCTG-3')를 TPTE (SEQ ID NO:19) 서열에 기초하여 생성하고, 많은 인간 조직에서 RT-PCR 분석에 사용하였다 (95 ℃ 15 분; 94 ℃ 1 분; 63 ℃ 1 분; 72 ℃ 1 분; 35 회). 정상 조직에서의 발현은 정소에 국한된 것으로 나타났다. 다른 eCT에 대하여 설명한 바와 같이, TPTE 변이체는 본 발명에 있어서 많은 조직에서 이소적으로 활성화되는 것으로 나타났다 (표 2 참조). 본 발명에 있어서, 정소 조직 및 종양 조직에서 발현하고 프레임 쉬프트가 일어나 서열 부위가 변경된, 추가적인 TPTE 스플라이스 변이체를 동정하였다 (SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 및 SEQ ID NO:57) (도 5).
종양에서의 TPTE의 발현
조직 테트트된 총 수 양성 %
흑색종 18 9 50
유방 암종 20 4 20
대장 종양 20 0 0
전립선 암종 8 3 38
기관지 암종 23 9 39
신장 세포 암종 7 0 0
난소 암종 7 2 29
갑상선 암종 4 0 0
자궁 경부 암종 6 1 17
흑색종 세포계 8 4 50
기관지 암종 세포계 6 2 33
포유류 암종 세포계 5 4 80
상기 TPTE 게놈 서열은 24 엑손 (accession number NT_029430)을 포함한다. SEQ ID NO:19의 전사체는 이들 엑손 모두를 포함한다. SEQ ID NO:20의 스플라이스 변이체는 엑손 7을 편집(splicing out)하여 제작된다. SEQ ID NO:21의 스플라이스 변이체는 엑손 15 하류 쪽 인트론의 부분적 결합을 나타낸다. SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 및 SEQ ID NO:57의 변이체들이 나타내는 바와 같이, 엑손 18, 19, 20 및 21을 편집(splicing out)하는 것 또한 대체적(alternative)으로 가능하다.
이러한 대체적 스플라이싱은, 원칙적으로 해독틀을 유지하면서, 코딩되는 단백질의 변형을 유발한다 (도 6). 예컨대, SEQ ID NO:20 (SEQ ID NO:23)의 서열에 의하여 코딩되는 번역 산물은 SEQ ID NO:22의 서열과 비교하여 13 아미노산 결실을 갖는다. SEQ ID NO:21 (SEQ ID NO:24)의 서열에 의하여 코딩되는 번역 산물은 분자의 중앙 부위에 추가적인 삽입을 운반하여 다른 변이체와 14 아미노산이 상이하다.
변이체 SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 및 SEQ ID NO:57의 번역 산물, 즉, 단백질 SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60 및 SEQ ID NO:61을 유사하게 변형시킨다.
기능적 도메인을 예측하기 위한 분석에 의하여, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:58 및 SED ID NO:60에 대한 티로신포스파타아제 도메인이 존재함을 밝혔지만, SEQ ID NO:59 및 SEQ ID NO:61에 대한 것은 존재하지 않는 것으로 나타났다. 모든 변이체에 대하여, 3 내지 4 막통과 도메인을 예측하였다 (도 6).
특이적 항체를 사용하는 TPTE 항원 발현 분석에 의하여, 정소 및 다수의 상이한 종양에서의 선택적 발현을 확인하였다. 공동 위치화 연구는 또한 본 발명에 있어서 TPTE가 종양 세포의 세포 표면에 클래스 I 면역 글로불린과 함께 위치하고 있음을 밝혔다. 이미, TPTE은 골지(Golgi) 관련 단백질로서 설명되어 있다. TPTE이 종양 세포의 세포 표면에서 발현하기 때문에, 이러한 종양 항원은 본 발명에 있어서 진단적 또는 치료적 모노클로날 항체의 개발을 위한 우수한 표적으로서 적합하다. 예측되는 TPTE의 막 위상(topology)에 의하여, 세포외 노출되는 부위가 본 발명의 목적에 특히 적합하다. 본 발명에 있어서, 이는 펩타이드 FTDSKLYIPLEYRS (SEQ ID NO:81)와 FDIKLLRNIPRWT (SEQ ID NO: 82)를 포함한다. 또한, TPTE는 종양 세포의 이동(migration)을 촉진시키는 것으로 나타났다. 이를 위하여, 진핵 세포의 프로모터의 조절 및 조절 세포 하에서 TPTE로 형질 감염된 종양 세포를 "보이덴 챔버(Boyden chamber)" 이동 실험에서, 이들이 유도된 이동성을 보이는지 여부에 대하여 시험하였다. 본 발명에 있어서, TPTE 형질 감염된 세포는, 4 개의 독립적인 시험에서, 현저하게 (3 배) 증가된 이동성을 보여주었다. 이러한 기능적 데이터는 TPTE가 종양의 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따라서, 예컨대, 발현 벡터 또는 레트로바이러스에 의한 서로 다른 RNA 간섭 (RNAi) 방법, 안티센스 RNA를 사용하거나 소분자를 사용하여, 종양 세포 내에서 내생 TPTE 활성을 억제하는 처리에 의하여, 전이를 감소시켜 매우 중요한 치료적 효과를 거둘 수 있었다. 종양에서의 포스파타아제의 활성, 증가된 이동성 및 증가된 전이 형성 간의 인과 관계가 최근 PTEN 티로신포스파타아제에 대하여 확립되었다 (Iijima and Devreotes Cell 109:599-610, 2002).
실시예 3: 새로운 종양 항원인 TSBP의 동정
본 발명에서 사용된 전자 클로닝 방법에 의하여 TSBP (SEQ ID NO:29)와 이로부터 유도된 단백질 (SEQ ID NO:30)을 생산하였다. 상기 유전자는 이미 정소 특이적으로 조절되는 것으로 설명되어 있다 (accession number NM_006781). 상기 유전자는 염기성 단백질을 코딩하고 MHC 복합체 (C6orf10)을 코딩하는 서열과 인접하여 6번 염색체 상에 위치할 것으로 예상된다 (Stammers M. 등, Immunogenetics 51(4-5):373-82, 2000). 본 발명에 있어서, 이미 설명된 서열은 맞지 않는 것으로 나타났다. 본 발명의 서열은 공지된 서열과 실질적으로 다르다. 본 발명에 있어서, 3 개의 상이한 스플라이싱 변이체를 클로닝하였다. 본 발명에서 발견된 TSBP 변이체의 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO:31, SEQ ID NO: 32 및 SEQ ID NO:33)에 있어서의 차이점을 도 7에 나타내었다 (다른 부분을 굵은체로 표시). 이들은 프레임 쉬프트를 유발하여 본 발명에서 발견되는 TSBP 변이체에 의하여 코딩되는 단백질 (SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 및 SEQ ID NO:36)이 이전에 기술된 단백질 (SEQ ID NO:30)과 실질적으로 달라지게 된다 (SEQ ID NO:30) (도 8).
본 발명에 있어서, 이 항원이 정상 조직에서 엄격하게 전사 억제된다는 것을 확인하였다 (PCR 프라이머 5'-TCTAGCACTGTCTCGATCAAG-3' 및 5'-TGTCCTCTTGGTACATCTGAC-3'). 그러나, 연구된 25 정상 조직에 있어서, TSBP는, 정소는 별론으로 하고, 정상 림프절 조직에서 발현하였다. 본 발명에 있어서, 종양에서의 TSBP의 이소적 활성화 또한 탐지되었으며, 따라서, 이는 종양 표지 또는 종양 관련 항원으로 자격이 있다 (표 3).
TSBP 발현은 초기 종양 조직에서 발견되지만, 해당 종양 본체의 영구적 세포계에서는 발견되지 않는다. 또한, 상기 유전자는 동맥에서 특이적으로 발현하고 혈관 형태 형성(morphogenesis)에 수반되는 Notch 4에 바로 인접하여 있다. 이들은 상기 유전자가 특이적 내피 세포에 대한 표지라는 표시이다. 따라서, TSBP는 종양 내피 및 신혈관(neovascular) 표적화에 대한 잠재적 표지로서의 역할을 할 수 있다.
결론적으로, TSBP 프로모터를 림프절에서의 선택적인 발현이 소망되는 다른 유전자 산물로 클로닝할 수 있다.
특이적 항원을 사용하여 SBP 항원 발현을 분석하여, 정소 및 림프절 뿐 아니라 흑색종 및 기관지 암종에서의 선택적인 위치화를 확인하였다. 또한, GFP 표지된 TSBP를 사용하는 면역 조직학적 연구에 의하여 독특한 핵주위 축적을 밝혔다.
종양에서의 TSBP의 발현
조직 테스트된 총 수 양성 %
흑색종 12 2 16
유방 암종 15 0 -
대장 종양 15 0 -
전립선 암종 8 0 -
기관지 암종 7 17 41
신장 세포 암종 7 0 -
난소 암종 7 0 -
갑상선 암종 4 0 -
자궁 경부 암종 6 0 -
흑색종 세포계 8 0 -
기관지 암종 세포계 6 0 -
실시예 4: 신규한 종양 항원인 MS4A12의 동정
MS4A12 (SEQ ID NO:37, accession number NM_017716)와 이의 번역 산물 (SEQ ID NO:38)이 B 세포 특이적 항원 CD20, 조혈 세포 특이적 단백질 HTm4 및 고친화성 IgE 수용체의 β 사슬과 관련된 다중 유전자족(multigene family)의 구성원으로서 기술되어 있다. 모든 유전자족 구성원은 적어도 4 개의 잠재적 막통과 도메인을 갖고 C-말단 및 N-말단이 모두 세포질 내에 있다는 특성을 갖는다 (Liang Y. 등, Immunogenetics 53(5):357-68, 2001; Liang Y. & Tedder, Genomics 72(2):119-27, 2001). 본 발명에 있어서, MS4A12에 대하여 RT-PCR 연구를 수행하였다. 공지된 MS4A12 서열 (NM_017716)에 기초하여 프라이머를 선택하였다 (센스: CTGTGTCAGCATCCAAGGAGC, 안티센스: TTCACCTTTGCCAGCATGTAG). 시험된 조직에 있어서, 정소, 결장 (6/8) 및 대장 암종 (colon-Ca's) (16/20) 및 결장 전이 (12/15)에서만 발현이 검출되었다 (도 9).
결장 전이에 있어서의 높은 발생률에 의하여 TSBP은 흥미있는 진단 및 치료 표적이 된다. 본 발명에 있어서, 단백질 서열 GVAGQDYWAVLSGKG (SEQ ID NO:83)를 포함하는 예측된 세포외 부위는 모노클로날 항체와 작은 화학적 억제제를 생산하는데 특히 적합하다. 본 발명에 있어서, 세포막에서의 MS4A12 단백질의 세포내 위치화 공초점 면역 형광에서의 플라즈마 멤브레인 표지를 사용하는 형광 중첩(superposition)에 의하여 확인하였다.
종양 조직에서의 MS4A12 발현 및 대장 암종 및 전이
회장 +
결장 +
간 -
폐 -
림프절 -
위 -
비장 -
부신 -
신장 -
식도 -
난소 -
직장 +
정소 +
흉선 -
피부 -
유방 -
췌장 -
PBMC -
PBMC act. -
전립선 -
갑상선 -
난관(Tube) -
자궁 -
대뇌 -
소뇌 -
대장 종양 16/20
대장 종양 전이 12/15
따라서, MS4A12는 정상 결장 내피에 대하여 세포막 위치 분화 항원이며, 또한 대장 종양 및 전이에서도 발현한다.
실시예 5: 신규한 항원인 BRCO1의 동정
BRCO1 및 이의 번역 산물은 이전에 기술되어 있지 않다. 본 발명의 데이터 마이닝법에 의하여 EST (expressed sequence tag) AI668620이 제작되었다. 발현 분석을 위하여 특정 프라이머 (센스: CTTGCTCTGAGTCATCAGATG, 안티센스: CACAGAATATGAGCCATACAG)를 사용하는 RT-PCR 연구를 수행하였다. 본 발명에 있어서, 정소 조직에서 뿐 아니라 정상 유선에서의 특이적으로 발현이 발견되었다 (Table 5). 다른 모든 조직에 있어서, 이 항원은 전사 억제된다. 이것은 유선 종양에서도 마찬가지로 검출된다 (20 중에서 20). BRCO1는 정상 유선 조직에서의 발현과 비교하여 유방 종양에서 뚜렷하게 과발현한다 (도 10).
EST 콘틱(contigs) (다음의 EST들이 포함됨: AW137203, BF327792, BF327797, BE069044 및 BF330665), 1500 bp 이상의 이 전사체를 본 발명에 따라서 전자적 전장 클로닝 (SEQ ID NO:39)에 의하여 클로닝하였다. 염색체 10p11-12에 대하여 서열을 지도화하였다. 동일한 부위에서, 바로 인접하여, 유방 분화 항원에 대한 유전자, NY-BR-1이 이미 기술되어 있다 (NM 052997; Jager, D. 등, Cancer Res. 61(5):2055-61, 2001).
정상 조직 및 유방 종양에서의 BRCO1의 발현
회장 -
결장 -
간 -
폐 -
림프절 -
위 -
비장 -
부신 -
신장 -
식도 -
난소 -
직장 -
정소 +
흉선 -
피부 -
유방 +
췌장 -
PBMC -
PBMC act. -
전립선 -
갑상선 -
난관 -
자궁 -
대뇌 -
소뇌 -
유방 암종 ++ (20/20)
맞춤 쌍 (matched pair, 유방 암종 및 인접 정상 조직) 연구에 의하여 정상 조직과 비교하여 유방 암종의 70%에서 BRCO1이 과발현함을 밝혔다.
따라서, BRCO1은 유방 종양에서 과발현하는 정상 유선 내피에 대한 새로운 분화 항원이다.
실시예 6: 신규한 종양 항원인 TPX1의 동정
TPX1 (Acc. No. NM 003296; SEQ ID NO: 40) 및 이의 번역 산물 (SEQ ID NO:41)의 서열이 알려져 있다. 상기 항원은 이미 정소 특이적인 것으로, 즉, 정자의 아크로솜(acrosome) 및 외부 섬유 요소로서 기재되어 있다. 이미, 정자가 세르 톨리 세포(Sertoli cell)에 부착시에 접착 분자로서 수반되는 것이 상기 항원 덕분이라고 알려져 있다 (O'Bryan, M.K. 등, Mol. Reprod. Dev. 58(1):116-25, 2001; Maeda, T. 등, Dev. Growth Differ. 41(6):715-22, 1999). 본 발명은 최초로 고형암에서의 TPX1의 이상 발현을 밝혔다 (표 6). TPX1와 호중구(neutrophile) 특이적 매트릭스 당단백질 SGP 28 (Kjeldsen 등, FEBS Lett 380:246-259, 1996) 간의 현저한 아미노산 상동성 때문에, 펩타이드 SREVTTNAQR (SEQ ID NO:84)를 포함하는 TPX1 특이적 단백질 서열이 본 발명에 있어서 진단 및 치료 분자를 제조하는데 적합하다.
종양에서의 TPX1의 발현
조직 테트트된 총 수 양성 %
흑색종 16 1 6
유방 암종 20 3 15
대장 종양 20 0 0
전립선 암종 8 3 37
기관지 암종 17 2 11
신장 세포 암종 7 1 14
난소 암종 7 1 14
갑상선 암종 4 0 0
자궁 경부 암종 6 1 16
흑색종 세포계 8 2 25
기관지 암종 세포계 6 1 16
실시예 7: 신규한 종양 유전자 산물인 BRCO2의 동정
BROC2 및 그의 번역 산물은 이전에 공지되어 있지 않다. 본 발명의 방법에 의하여 ESTs (expressed sequence tag) BE069341, BF330573 및 AA601511를 제작하였다. 특정 프라이머 (센스: AGACATGGCTCAGATGTGCAG, 안티센스: GGAAATTAGCAAGGCTCTCGC)를 사용하는 RT-PCR에 연구를 수행하여 발현 분석을 하였다. 본 발명에 있어서, 정소 조직 뿐 아니라 정상 유선에서도 특이적 발현이 관찰되었다 (표 7). 모든 다른 조직에 있어서, 이 유전자 산물은 전사 억제된다. 이는 유선 종양에서도 유사하게 검출된다. EST 콘틱 (다음의 ESTs이 포함됨: BF330573, AL044891 및 AA601511)을 사용하여, 전자적 전장 클로닝에 의하여 본 발명에 따라서 1300 bp의 상기 전사체를 클로닝하였다 (SEQ ID 62). 염색체 10p11-12에 대하여 서열을 지도화하였다. 동일한 부위에서, 바로 인접하여, 유방 분화 유전자 산물을 코딩하는 유전자, NY-BR-1이 이미 개시되어 있으며 (NM 052997; Jager, D. 등, Cancer Res. 61(5):2055-61, 2001), 여기에, 상기 실시예 6에 기재된 BRCO1이 위치한다. 본 발명에 있어서, 다른 유전자 분석에 의하여 SEQ ID NO:62 하에 열거된 서열이, 이전에 기재된 바 없는, NY-BR-1 유전자의 3' 미번역 부위를 나타낸다는 것을 확인하였다.
정상 조직과 유방 종양에서의 BRCO2의 발현
조직 발현
정소 +
유방 +
피부 -
간 -
전립선 -
흉선 -
뇌 -
폐 -
림프절 -
비장 -
부신 -
난소 -
백혈구 -
결장 -
식도 -
자궁 -
골격근 -
부고환 -
방광 -
신장 -
유방 암종 +
BRCO2은 정상 유선 내피에 대한 신규한 분화 유전자 산물이며, 또한 유방 종양에서도 발현된다.
실시예 8: 신규한 종양 유전자 산물인 PCSC의 동정
PCSC (SEQ ID NO:63) 및 이의 번역 산물은 이전에 기재되어 있는 바가 없다. 본 발명의 데이터마이닝법에 의하여 EST (expressed sequence tag) BF064073를 제조하였다. 특이적 프라이머 (센스: TCAGGTATTCCCTGCTCTTAC, 안티센스: TGGGCAATTCTCTCAGGCTTG)를 사용하여 RT-PCR 연구를 수행하여 발현을 분석하였다. 본 발명에 있어서, 정상 결장 뿐 아니라 결장 암종에서도 특이적 발현이 관찰되었다 (표 5). 다른 모든 조직에서, 이 유전자 산물은 전사 억제된다. PCSC는 두 개의 추정 ORFs (SEQ ID 64 및 SEQ ID 65)를 코딩한다. SEQ ID 64의 서열 분석 결과, CXC 사이토카인과 구조적 상동성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 4 개의 대체적 PCSC cDNA 단편을 클로닝하였다 (SEQ ID NO:85 내지 88). 본 발명에 있어서, 각각의 경우에서, 각 cDNA는 SEQ ID NO:89 내지 100의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 3 개의 추정 ORFs를 포함한다.
정상 조직 및 대장 암종에서의 PCSC의 발현
회장 +
결장 +
간 -
폐 -
림프절 -
위 -
비장 -
부신 -
신장 -
식도 -
난소 -
직장 +
정소 -
흉선 -
피부 -
유방 -
췌장 -
PBMC -
PBMC act. -
전립선 -
갑상선 -
난관 -
자궁 -
대뇌 -
소뇌 -
대장 종양 19/20
대장 종양 전이 15/15
따라서, PCSC는 정상 결정 내피에 대한 분화 항원이며, 또한, 대장 종양 및 모든 결장 전이 연구에서도 발현된담. 본 발명에 있어서, 모든 대장 전이에서 검출되는 PCSC 발현으로 인하여 상기 종양 항원은 전이 결장 종양의 예방 및 치료를 위한 매우 중요한 표적이 된다.
실시예 9: 신규한 종양 항원인 SGY-1의 동정
SGY-1 전사체의 서열 (SEQ ID NO:70) 및 이의 번역 산물의 서열 (SEQ ID NO:71)은 GenBank에 공지되어 있다 (accession number AF177398) (Krupnik 등, Gene 238, 301-313, 1999). Soggy-1은 Wnt 단백질족의 길항제 및 억제제로서 작용 하는 딕코프(Dickkopf) 단백질족의 구성원으로 이미 기재되어 있다. 상기 Wnt 단백질은 배 발생 중에 차례로 중요한 기능을 갖는다. 본 발명에 있어서, SGY-1의 서열 (SEQ ID NO:70)에 기초하여, PCR 프라이머 (5'-CTCCTATCCATGATGCTGACG-3' 및 5'-CCTGAGGATGTACAGTAAGTG-3')를 제작하고, 많은 인간 조직에서 RT-PCR 분석 (95 ℃ 15 분; 94 ℃ 1 분; 63 ℃ 1 분; 72 ℃ 1 분; 35 회)하는데 사용하였다. 정상 조직에서의 발현은 정소에 국한되지 않는것으로 나타났다. 다른 eCT에 대하여 기재된 바와 같이, 본 발명에 있어서, SGY-1는 많은 인간 조직에서 이소적으로 활성화되는 것으로 나타났다 (표 9).
종양에서의 SGY-1의 발현
조직 테스트된 총 수 양성 %
흑색종 16 4 25
유방 암종 20 4 20
대장 종양 20 0 0
전립선 암종 8 1 13
기관지 암종 32 3 18
신장 세포 암종 7 0 0
난소 암종 7 4 57
갑상선 암종 4 0 0
자궁 경부 암종 6 2 33
흑색종 세포계 8 2 25
기관지 암종 세포계 6 2 33
포유류 암종 세포계
실시예 10: 신규한 종양 항원인 MORC의 동정
MORC 전사체 서열 (SEQ ID NO:74) 및 이의 번역 산물 서열 (SEQ ID NO:75)은 GenBank에 공개되어 있다 (accession number XM 037008) (Inoue 등, Hum Mol Genet. Jul:8(7):1201-7, 1999).
MORC는 본래 정자 형성(spermatogenesis)에 수반되는 것으로 기재되어 있었 다. 마우스에서 이 단백질을 변이시킨 결과 생식선이 발달하지 않았다.
본 발명에 있어서, MORC 서열 (SEQ ID NO:74)에 기초하여, PCR 프라이머 (5'-CTGAGTATCAGCTACCATCAG-3' 및 5'-TCTGTAGTCCTTCACATATCG-3')를 제조하고, 다수의 인간 조직에서의 RT-PCR 분석 (95 ℃ 15 분; 94 ℃ 1 분; 63 ℃ 1 분; 72 ℃ 1 분; 35 회)에 사용하였다. 정상 조직에서의 발현은 정소에 국한되지 않는 것으로 나타났다. 다른 eCT에 대하여 기재된 바와 같이, 본 발명에 있어서, MORC는 다수의 종양 조직에서 이소적으로 활성화하는 것으로 나타났다 (표 10).
종양에서의 MORC의 발현
조직 테스트된 총 수 양성 %
흑색종 16 3 18
유방 암종 20 0 0
대장 종양 20 0 0
전립선 암종 8 0 0
기관지 암종 17 3 18
신장 세포 암종 7 0 0
난소 암종 7 1 14
갑상선 암종 4 0 0
자궁 경부 암종 6 0 0
흑색종 세포계 8 1 12
기관지 암종 세포계 6 1 17
<110> Sahin Dr., Ugur Tureci Dr., Ozlem Koslowski Dr., Michael <120> Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung <130> 342-3PCT <160> 100 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1171 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctgtcgttgg tgtatttttc tggtgtcact tctgtgcctt ccttcaaagg ttctccaaat 60 gtcaactgtc aaggagcagc taattgagaa gctaattgag gatgatgaaa actcccagtg 120 taaaattact attgttggaa ctggtgccgt aggcatggct tgtgctatta gtatcttact 180 gaaggatttg gctgatgaac ttgcccttgt tgatgttgca ttggacaaac tgaagggaga 240 aatgatggat cttcagcatg gcagtctttt ctttagtact tcaaagatta cttctggaaa 300 agattacagt gtatctgcaa actccagaat agttattgtc acagcaggtg caaggcagca 360 ggagggagaa actcgccttg ccctggtcca acgtaatgtg gctataatga aatcaatcat 420 tcctgccata gtccattata gtcctgattg taaaattctt gttgtttcaa atccagtgga 480 tattttgaca tatatagtct ggaagataag tggcttacct gtaactcgtg taattggaag 540 tggttgtaat ctagactctg cccgtttccg ttacctaatt ggagaaaagt tgggtgtcca 600 ccccacaagc tgccatggtt ggattattgg agaacatggt gattctagtg tgcccttatg 660 gagtggggtg aatgttgctg gtgttgctct gaagactctg gaccctaaat taggaacgga 720 ttcagataag gaacactgga aaaatatcca taaacaagtt attcaaagtg cctatgaaat 780 tatcaagctg aaggggtata cctcttgggc tattggactg tctgtgatgg atctggtagg 840 atccattttg aaaaatctta ggagagtgca cccagtttcc accatggtta agggattata 900 tggaataaaa gaagaactct ttctcagtat cccttgtgtc ttggggcgga atggtgtctc 960 agatgttgtg aaaattaact tgaattctga ggaggaggcc cttttcaaga agagtgcaga 1020 aacactttgg aatattcaaa aggatctaat attttaaatt aaagccttct aatgttccac 1080 tgtttggaga acagaagata gcaggctgtg tattttaaat tttgaaagta ttttcattga 1140 tcttaaaaaa taaaaacaaa ttggagacct g 1171 <210> 2 <211> 1053 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgtcgttgg tgtatttttc tggtgtcact tctgtgcctt ccttcaaagg ttctccaaat 60 gtcaactgtc aaggagcagc taattgagaa gctaattgag gatgatgaaa actcccagtg 120 taaaattact attgttggaa ctggtgccgt aggcatggct tgtgctatta gtatcttact 180 gaagattaca gtgtatctgc aaactccaga atagttattg tcacagcagg tgcaaggcag 240 caggagggag aaactcgcct tgccctggtc caacgtaatg tggctataat gaaatcaatc 300 attcctgcca tagtccatta tagtcctgat tgtaaaattc ttgttgtttc aaatccagtg 360 gatattttga catatatagt ctggaagata agtggcttac ctgtaactcg tgtaattgga 420 agtggttgta atctagactc tgcccgtttc cgttacctaa ttggagaaaa gttgggtgtc 480 caccccacaa gctgccatgg ttggattatt ggagaacatg gtgattctag tgtgccctta 540 tggagtgggg tgaatgttgc tggtgttgct ctgaagactc tggaccctaa attaggaacg 600 gattcagata aggaacactg gaaaaatatc cataaacaag ttattcaaag tgcctatgaa 660 attatcaagc tgaaggggta tacctcttgg gctattggac tgtctgtgat ggatctggta 720 ggatccattt tgaaaaatct taggagagtg cacccagttt ccaccatggt taagggatta 780 tatggaataa aagaagaact ctttctcagt atcccttgtg tcttggggcg gaatggtgtc 840 tcagatgttg tgaaaattaa cttgaattct gaggaggagg cccttttcaa gaagagtgca 900 gaaacacttt ggaatattca aaaggatcta atattttaaa ttaaagcctt ctaatgttcc 960 actgtttgga gaacagaaga tagcaggctg tgtattttaa attttgaaag tattttcatt 1020 gatcttaaaa aataaaaaca aattggagac ctg 1053 <210> 3 <211> 879 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgtcgttgg tgtatttttc tggtgtcact 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tgtgtcttgg ggcggaatgg tgtctcagat 840 gttgtgaaaa ttaacttgaa ttctgaggag gaggcccttt tcaagaagag tgcagaaaca 900 ctttggaata ttcaaaagga tctaatattt taaattaaag ccttctaatg ttccactgtt 960 tggagaacag aagatagcag gctgtgtatt ttaaattttg aaagtatttt cattgatctt 1020 aaaaaataaa aacaaattgg agacctg 1047 <210> 6 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Thr Val Lys Glu Gln Leu Ile Glu Lys Leu Ile Glu Asp Asp 1 5 10 15 Glu Asn Ser Gln Cys Lys Ile Thr Ile Val Gly Thr Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Leu Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ala Leu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Phe Ser Thr Ser Lys Ile Thr Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Ser Ala Asn Ser Arg Ile Val Ile Val Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Thr Arg Leu Ala Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Ala Ile Met Lys Ser Ile Ile Pro Ala Ile Val His Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Lys Ile Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Ile Val Trp Lys Ile Ser Gly Leu Pro Val Thr Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Ile Gly Glu 165 170 175 Lys Leu Gly Val His Pro Thr Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Leu Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ala Leu Lys Thr Leu Asp Pro Lys Leu Gly Thr Asp Ser Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Asn Ile His Lys Gln Val Ile Gln Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Ile Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Met Asp Leu Val Gly Ser Ile Leu Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Val Ser Thr Met Val Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Glu Leu Phe 275 280 285 Leu Ser Ile Pro Cys Val Leu Gly Arg Asn Gly Val Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Ile Asn Leu Asn Ser Glu Glu Glu Ala Leu Phe Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Glu Thr Leu Trp Asn Ile Gln Lys Asp Leu Ile Phe 325 330 <210> 7 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ser Thr Val Lys Glu Gln Leu Ile Glu Lys Leu Ile Glu Asp Asp 1 5 10 15 Glu Asn Ser Gln Cys Lys Ile Thr Ile Val Gly Thr Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Leu Lys Ile Thr Val Tyr Leu Gln 35 40 45 Thr Pro Glu 50 <210> 8 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Lys Ser Ile Ile Pro Ala Ile Val His Tyr Ser Pro Asp Cys Lys 1 5 10 15 Ile Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Ile Val Trp 20 25 30 Lys Ile Ser Gly Leu Pro Val Thr Arg Val Ile Gly Ser Gly Cys Asn 35 40 45 Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Ile Gly Glu Lys Leu Gly Val 50 55 60 His Pro Thr Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu His Gly Asp Ser 65 70 75 80 Ser Val Pro Leu Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly Val Ala Leu Lys 85 90 95 Thr Leu Asp Pro Lys Leu Gly Thr Asp Ser Asp Lys Glu His Trp Lys 100 105 110 Asn Ile His Lys Gln Val Ile Gln Ser Ala Tyr Glu Ile Ile Lys Leu 115 120 125 Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val Met Asp Leu Val 130 135 140 Gly Ser Ile Leu Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro Val Ser Thr Met 145 150 155 160 Val Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Glu Leu Phe Leu Ser Ile Pro 165 170 175 Cys Val Leu Gly Arg Asn Gly Val Ser Asp Val Val Lys Ile Asn Leu 180 185 190 Asn Ser Glu Glu Glu Ala Leu Phe Lys Lys Ser Ala Glu Thr Leu Trp 195 200 205 Asn Ile Gln Lys Asp Leu Ile Phe 210 215 <210> 9 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ser Thr Val Lys Glu Gln Leu Ile Glu Lys Leu Ile Glu Asp Asp 1 5 10 15 Glu Asn Ser Gln Cys Lys Ile Thr Ile Val Gly Thr Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Leu Lys Trp Ile Phe 35 40 45 <210> 10 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Asp Leu Val Gly Ser Ile Leu Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 1 5 10 15 Val Ser Thr Met Val Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Glu Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Ile Pro Cys Val Leu Gly Arg Asn Gly Val Ser Asp Val Val 35 40 45 Lys Ile Asn Leu Asn Ser Glu Glu Glu Ala Leu Phe Lys Lys Ser Ala 50 55 60 Glu Thr Leu Trp Asn Ile Gln Lys Asp Leu Ile Phe 65 70 75 <210> 11 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Lys Ser Ile Ile Pro Ala Ile Val His Tyr Ser Pro Asp Cys Lys 1 5 10 15 Ile Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr Tyr Ile Val Trp 20 25 30 Lys Ile Ser Gly Leu Pro Val Thr Arg Val Ile Gly Ser Gly Cys Asn 35 40 45 Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Ile Gly Glu Lys Leu Gly Val 50 55 60 His Pro Thr Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu His Gly Asp Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ile Ile Trp Asn Lys Arg Arg Thr Leu Ser Gln Tyr Pro Leu 85 90 95 Cys Leu Gly Ala Glu Trp Cys Leu Arg Cys Cys Glu Asn 100 105 <210> 12 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Val Gly Leu Leu Glu Asn Met Val Ile Leu Val Gly Leu Tyr Gly 1 5 10 15 Ile Lys Glu Glu Leu Phe Leu Ser Ile Pro Cys Val Leu Gly Arg Asn 20 25 30 Gly Val Ser Asp Val Val Lys Ile Asn Leu Asn Ser Glu Glu Glu Ala 35 40 45 Leu Phe Lys Lys Ser Ala Glu Thr Leu Trp Asn Ile Gln Lys Asp Leu 50 55 60 Ile Phe 65 <210> 13 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ser Thr Val Lys Glu Gln Leu Ile Glu Lys Leu Ile Glu Asp Asp 1 5 10 15 Glu Asn Ser Gln Cys Lys Ile Thr Ile Val Gly Thr Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Leu Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ala Leu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Phe Ser Thr Ser Lys Ile Thr Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Ser Ala Asn Ser Arg Ile Val Ile Val Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Thr Arg Leu Ala Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Ala Ile Met Lys Ser Ile Ile Pro Ala Ile Val His Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Lys Ile Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Ile Val Trp Lys Ile Ser Gly Leu Pro Val Thr Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Ile Gly Glu 165 170 175 Lys Leu Gly Val His Pro Thr Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Leu Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ala Leu Lys Thr Leu Asp Pro Lys Leu Gly Thr Asp Ser Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Asn Ile His Lys Gln Val Ile Gln Arg Asp Tyr Met 225 230 235 240 Glu <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Ala Val Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Leu Lys Ile Thr 1 5 10 15 Val Tyr Leu Gln Thr Pro Glu 20 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Ala Val Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Leu Lys Trp Ile 1 5 10 15 Phe <210> 16 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Trp Ile Ile Gly Glu His Gly Asp Ser Ser Gly Ile Ile Trp Asn 1 5 10 15 Lys Arg Arg Thr Leu Ser Gln Tyr Pro Leu Cys Leu Gly Ala Glu Trp 20 25 30 Cys Leu Arg Cys Cys Glu Asn 35 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Val Gly Leu Leu Glu Asn Met Val Ile Leu Val Gly Leu Tyr Gly 1 5 10 15 Ile Lys Glu Glu Leu Phe Leu 20 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu His Trp Lys Asn Ile His Lys Gln Val Ile Gln Arg Asp Tyr Met 1 5 10 15 Glu <210> 19 <211> 2168 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gaatccgcgg ggagggcaca acagctgcta cctgaacagt ttctgaccca acagttaccc 60 agcgccggac tcgctgcgcc ccggcggctc tagggacccc cggcgcctac acttagctcc 120 gcgcccgaga gaatgttgga ccgacgacac aagacctcag acttgtgtta ttctagcagc 180 tgaacacacc ccaggctctt ctgaccggca gtggctctgg aagcagtctg gtgtatagag 240 ttatggattc actaccagat tctactgtat gctcttgaca actatgacca caatggtcca 300 cccacaaatg aattatcagg agtgaaccca gaggcacgta tgaatgaaag tcctgatccg 360 actgacctgg cgggagtcat cattgagctc ggccccaatg acagtccaca gacaagtgaa 420 tttaaaggag caaccgagga ggcacctgcg aaagaaagcc cacacacaag tgaatttaaa 480 ggagcagccc gggtgtcacc tatcagtgaa agtgtgttag cacgactttc caagtttgaa 540 gttgaagatg ctgaaaatgt tgcttcatat gacagcaaga ttaagaaaat tgtgcattca 600 attgtatcat cctttgcatt tggactattt ggagttttcc tggtcttact ggatgtcact 660 ctcatccttg ccgacctaat tttcactgac agcaaacttt atattccttt ggagtatcgt 720 tctatttctc tagctattgc cttatttttt ctcatggatg ttcttcttcg agtatttgta 780 gaaaggagac agcagtattt ttctgactta tttaacattt tagatactgc cattattgtg 840 attcttctgc tggttgatgt cgtttacatt ttttttgaca ttaagttgct taggaatatt 900 cccagatgga cacatttact tcgacttcta cgacttatta ttctgttaag aatttttcat 960 ctgtttcatc aaaaaagaca acttgaaaag ctgataagaa ggcgggtttc agaaaacaaa 1020 aggcgataca caagggatgg atttgaccta gacctcactt acgttacaga acgtattatt 1080 gctatgtcat ttccatcttc tggaaggcag tctttctata gaaatccaat caaggaagtt 1140 gtgcggtttc tagataagaa acaccgaaac cactatcgag tctacaatct atgcagtgaa 1200 agagcttacg atcctaagca cttccataat agggtcgtta gaatcatgat tgatgatcat 1260 aatgtcccca ctctacatca gatggtggtt ttcaccaagg aagtaaatga gtggatggct 1320 caagatcttg aaaacatcgt agcgattcac tgtaaaggag gcacagatag aacaggaact 1380 atggtttgtg ccttccttat tgcctctgaa atatgttcaa ctgcaaagga aagcctgtat 1440 tattttggag aaaggcgaac agataaaacc cacagcgaaa aatttcaggg agtagaaact 1500 ccttctcaga agagatatgt tgcatatttt gcacaagtga aacatctcta caactggaat 1560 ctccctccaa gacggatact ctttataaaa cacttcatta tttattcgat tcctcgttat 1620 gtacgtgatc taaaaatcca aatagaaatg gagaaaaagg ttgtcttttc cactatttca 1680 ttaggaaaat gttcggtact tgataacatt acaacagaca aaatattaat tgatgtattc 1740 gacggtccac ctctgtatga tgatgtgaaa gtgcagtttt tctattcgaa tcttcctaca 1800 tactatgaca attgctcatt ttacttctgg ttgcacacat cttttattga aaataacagg 1860 ctttatctac caaaaaatga attggataat ctacataaac aaaaagcacg gagaatttat 1920 ccatcagatt ttgccgtgga gatacttttt ggcgagaaaa tgacttccag tgatgttgta 1980 gctggatccg attaagtata gctccccctt ccccttctgg gaaagaatta tgttctttcc 2040 aaccctgcca catgttcata tatcctaaat ctatcctaaa tgttcccttg aagtatttat 2100 ttatgtttat atatgtttat acatgttctt caataaatct attacatata tataaaaaaa 2160 aaaaaaaa 2168 <210> 20 <211> 2114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gaatccgcgg ggagggcaca acagctgcta cctgaacagt ttctgaccca acagttaccc 60 agcgccggac tcgctgcgcc ccggcggctc tagggacccc cggcgcctac acttagctcc 120 gcgcccgaga gaatgttgga ccgacgacac aagacctcag acttgtgtta ttctagcagc 180 tgaacacacc ccaggctctt ctgaccggca gtggctctgg aagcagtctg gtgtatagag 240 ttatggattc actaccagat tctactgtat gctcttgaca actatgacca caatggtcca 300 cccacaaatg aattatcagg agtgaaccca gaggcacgta tgaatgaaag tcctgatccg 360 actgacctgg 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acatcagatg gtggttttca ccaaggaagt aaatgagtgg 1260 atggctcaag atcttgaaaa catcgtagcg attcactgta aaggaggcac agatagaaca 1320 ggaactatgg tttgtgcctt ccttattgcc tctgaaatat gttcaactgc aaaggaaagc 1380 ctgtattatt ttggagaaag gcgaacagat aaaacccaca gcgaaaaatt tcagggagta 1440 gaaactcctt ctcagaagag atatgttgca tattttgcac aagtgaaaca tctctacaac 1500 tggaatctcc ctccaagacg gatactcttt ataaaacact tcattattta ttcgattcct 1560 cgttatgtac gtgatctaaa aatccaaata gaaatggaga aaaaggttgt cttttccact 1620 atttcattag gaaaatgttc ggtacttgat aacattacaa cagacaaaat attaattgat 1680 gtattcgacg gtccacctct gtatgatgat gtgaaagtgc agtttttcta ttcgaatctt 1740 cctacatact atgacaattg ctcattttac ttctggttgc acacatcttt tattgaaaat 1800 aacaggcttt atctaccaaa aaatgaattg gataatctac ataaacaaaa agcacggaga 1860 atttatccat cagattttgc cgtggagata ctttttggcg agaaaatgac ttccagtgat 1920 gttgtagctg gatccgatta agtatagctc ccccttcccc ttctgggaaa gaattatgtt 1980 ctttccaacc ctgccacatg ttcatatatc ctaaatctat cctaaatgtt cccttgaagt 2040 atttatttat gtttatatat gtttatacat gttcttcaat aaatctatta catatatata 2100 aaaaaaaaaa aaaa 2114 <210> 21 <211> 2222 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gaatccgcgg ggagggcaca acagctgcta cctgaacagt ttctgaccca acagttaccc 60 agcgccggac tcgctgcgcc ccggcggctc tagggacccc cggcgcctac acttagctcc 120 gcgcccgaga gaatgttgga ccgacgacac aagacctcag acttgtgtta ttctagcagc 180 tgaacacacc ccaggctctt ctgaccggca gtggctctgg aagcagtctg gtgtatagag 240 ttatggattc actaccagat tctactgtat gctcttgaca actatgacca caatggtcca 300 cccacaaatg aattatcagg agtgaaccca gaggcacgta tgaatgaaag tcctgatccg 360 actgacctgg cgggagtcat cattgagctc ggccccaatg acagtccaca gacaagtgaa 420 tttaaaggag caaccgagga ggcacctgcg aaagaaagcc cacacacaag tgaatttaaa 480 ggagcagccc gggtgtcacc tatcagtgaa agtgtgttag cacgactttc caagtttgaa 540 gttgaagatg ctgaaaatgt tgcttcatat gacagcaaga ttaagaaaat tgtgcattca 600 attgtatcat cctttgcatt tggactattt ggagttttcc tggtcttact ggatgtcact 660 ctcatccttg ccgacctaat tttcactgac agcaaacttt atattccttt ggagtatcgt 720 tctatttctc tagctattgc cttatttttt ctcatggatg ttcttcttcg agtatttgta 780 gaaaggagac agcagtattt ttctgactta tttaacattt tagatactgc cattattgtg 840 attcttctgc tggttgatgt cgtttacatt ttttttgaca ttaagttgct taggaatatt 900 cccagatgga cacatttact tcgacttcta cgacttatta ttctgttaag aatttttcat 960 ctgtttcatc aaaaaagaca acttgaaaag ctgataagaa ggcgggtttc agaaaacaaa 1020 aggcgataca caagggatgg atttgaccta gacctcactt acgttacaga acgtattatt 1080 gctatgtcat ttccatcttc tggaaggcag tctttctata gaaatccaat caaggaagtt 1140 gtgcggtttc tagataagaa acaccgaaac cactatcgag tctacaatct atgcagtatg 1200 tacattactc tatattgtgc tactgtagat agaaaacaga ttactgcacg tgaaagagct 1260 tacgatccta agcacttcca taatagggtc gttagaatca tgattgatga tcataatgtc 1320 cccactctac atcagatggt ggttttcacc aaggaagtaa atgagtggat ggctcaagat 1380 cttgaaaaca tcgtagcgat tcactgtaaa ggaggcacag atagaacagg aactatggtt 1440 tgtgccttcc ttattgcctc tgaaatatgt tcaactgcaa aggaaagcct gtattatttt 1500 ggagaaaggc gaacagataa aacccacagc gaaaaatttc agggagtaga aactccttct 1560 cagaagagat atgttgcata ttttgcacaa gtgaaacatc tctacaactg gaatctccct 1620 ccaagacgga tactctttat aaaacacttc attatttatt cgattcctcg ttatgtacgt 1680 gatctaaaaa tccaaataga aatggagaaa aaggttgtct tttccactat ttcattagga 1740 aaatgttcgg tacttgataa cattacaaca gacaaaatat taattgatgt attcgacggt 1800 ccacctctgt atgatgatgt gaaagtgcag tttttctatt cgaatcttcc tacatactat 1860 gacaattgct cattttactt ctggttgcac acatctttta ttgaaaataa caggctttat 1920 ctaccaaaaa atgaattgga taatctacat aaacaaaaag cacggagaat ttatccatca 1980 gattttgccg tggagatact ttttggcgag aaaatgactt ccagtgatgt tgtagctgga 2040 tccgattaag tatagctccc ccttcccctt ctgggaaaga attatgttct ttccaaccct 2100 gccacatgtt catatatcct aaatctatcc taaatgttcc cttgaagtat ttatttatgt 2160 ttatatatgt ttatacatgt tcttcaataa atctattaca tatatataaa aaaaaaaaaa 2220 aa 2222 <210> 22 <211> 551 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Asn Glu Ser Pro Asp Pro Thr Asp Leu Ala Gly Val Ile Ile Glu 1 5 10 15 Leu Gly Pro Asn Asp Ser Pro Gln Thr Ser Glu Phe Lys Gly Ala Thr 20 25 30 Glu Glu Ala Pro Ala Lys Glu Ser Pro His Thr Ser Glu Phe Lys Gly 35 40 45 Ala Ala Arg Val Ser Pro Ile Ser Glu Ser Val Leu Ala Arg Leu Ser 50 55 60 Lys Phe Glu Val Glu Asp Ala Glu Asn Val Ala Ser Tyr Asp Ser Lys 65 70 75 80 Ile Lys Lys Ile Val His Ser Ile Val Ser Ser Phe Ala Phe Gly Leu 85 90 95 Phe Gly Val Phe Leu Val Leu Leu Asp Val Thr Leu Ile Leu Ala Asp 100 105 110 Leu Ile Phe Thr Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Pro Leu Glu Tyr Arg Ser 115 120 125 Ile Ser Leu Ala Ile Ala Leu Phe Phe Leu Met Asp Val Leu Leu Arg 130 135 140 Val Phe Val Glu Arg Arg Gln Gln Tyr Phe Ser Asp Leu Phe Asn Ile 145 150 155 160 Leu Asp Thr Ala Ile Ile Val Ile Leu Leu Leu Val Asp Val Val Tyr 165 170 175 Ile Phe Phe Asp Ile Lys Leu Leu Arg Asn Ile Pro Arg Trp Thr His 180 185 190 Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Ile Ile Leu Leu Arg Ile Phe His Leu 195 200 205 Phe His Gln Lys Arg Gln Leu Glu Lys Leu Ile Arg Arg Arg Val Ser 210 215 220 Glu Asn Lys Arg Arg Tyr Thr Arg Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr 225 230 235 240 Tyr Val Thr Glu Arg Ile Ile Ala Met Ser Phe Pro Ser Ser Gly Arg 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<213> Kunstliche Sequenz <400> 27 tggatgtcac tctcatcctt g 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <400> 28 ccatagttcc tgttctatct g 21 <210> 29 <211> 2192 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 agctcagctg ggagcgcaga ggctcacgcc tgtaatccca tcatttgctt aggtctgatc 60 aatctgctcc acacaatttc tcagtgatcc tctgcatctc tgcctacaag ggcctccctg 120 acacccaagt tcatattgct cagaaacagt gaacttgagt ttttcgtttt accttgatct 180 ctctctgaca aagaaatcca gatgatgcaa cacctgatga agacaataca tggaaaatga 240 cagtcttgga aataactttg gctgtcatcc tgactctact gggacttgcc atcctggcta 300 ttttgttaac aagatgggca cgacgtaagc aaagtgaaat gtatatctcc agatacagtt 360 cagaacaaag tgctagactt ctggactatg aggatggtag aggatcccga catgcatatc 420 aacacaaagt gacacttcat atgataaccg agagagatcc aaaaagagat tacacaccat 480 caaccaactc tctagcactg tctcgatcaa gtattgcttt acctcaagga tccatgagta 540 gtataaaatg tttacaaaca actgaagaac ctccttccag aactgcagga gccatgatgc 600 aattcacagc cctattcccg gagctacagg acctatcaag ctctctcaaa aaaccattgt 660 gcaaactcca ggacctattg tacaatatct ggatccaatg tcagatcgca tctcacacaa 720 tcactggtca ccttcagcac ccgcggtcac ccatggcacc cataataatt tcacagagaa 780 ccgcaagtca gctggcagca cctataagaa tacctcaagt tcacactatg gacagttctg 840 gaaaaatcac actgactcct gtggttatat taacaggtta catggacgaa gaacttcgaa 900 aaaaatcttg ttccaaaatc cagattctaa aatgtggagg cactgcaagg tctcagatag 960 ccgagaagaa aacaaggaag caactaaaga atgacatcat atttacgaat tctgtagaat 1020 ccttgaaatc agcacacata aaggagccag aaagagaagg aaaaggcact gatttagaga 1080 aagacaaaat aggaatggag gtcaaggtag acagtgacgc tggaatacca aaaagacagg 1140 aaacccaact aaaaatcagt gaagatgagt ataccacaag gacagggagc ccaaataaag 1200 aaaagtgtgt cagatgtacc aagaggacag gagtccaagt aaagaagagt gagtcaggtg 1260 tcccaaaagg acaagaagcc caagtaacga agagtgggtt ggttgtactg aaaggacagg 1320 aagcccaggt agagaagagt gagatgggtg tgccaagaag acaggaatcc caagtaaaga 1380 agagtcagtc tggtgtctca aagggacagg aagcccaggt aaagaagagg gagtcagttg 1440 tactgaaagg acaggaagcc caggtagaga agagtgagtt gaaggtacca aaaggacaag 1500 aaggccaagt agagaagact gaggcagatg tgccaaagga acaagaggtc caagaaaaga 1560 agagtgaggc aggtgtactg aaaggaccag aatcccaagt aaagaacact gaggtgagtg 1620 taccagaaac actggaatcc caagtaaaga agagtgagtc aggtgtacta aaaggacagg 1680 aagcccaaga aaagaaggag agttttgagg ataaaggaaa taatgataaa gaaaaggaga 1740 gagatgcaga gaaagatcca aataaaaaag aaaaaggtga caaaaacaca aaaggtgaca 1800 aaggaaagga caaagttaaa ggaaagagag aatcagaaat caatggtgaa aaatcaaaag 1860 gctcgaaaag gcgaaggcaa atacaggaag gaagtacaac aaaaaagtgg aagagtaagg 1920 ataaattttt taaaggccca taagacaagt gattattatg attcccatac tccagataca 1980 aaccatatcc cagccattgc ctaaacagat tacaattata aaatcccttt catcttcata 2040 tcacagtttc tgctcttcag aagtttcacc ctttttaatc tctcagccac aaacctcagt 2100 tccaatattg ttataagtta agacgtatat gattccgtca agaaagactg gatactttct 2160 gaagtaaaac attttaatta aagaaaaaaa aa 2192 <210> 30 <211> 568 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Thr Val Leu Glu Ile Thr Leu Ala Val Ile Leu Thr Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ile Leu Ala Ile Leu Leu Thr Arg Trp Ala Arg Arg Lys Gln 20 25 30 Ser Glu 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gaacctcctt ccagaactgc aggagccatg 360 atgcaattca cagcccctat tcccggagct acaggaccta tcaagctctc tcaaaaaacc 420 attgtgcaaa ctccaggacc tattgtacaa tatcctggat ccaatgctgg tccaccttca 480 gcaccccgcg gtccacccat ggcacccata ataatttcac agagaaccgc aagtcagctg 540 gcagcaccta taataatttc gcagagaact gcaagaatac ctcaagttca cactatggac 600 agttctggaa aaatcacact gactcctgtg gttatattaa caggttacat ggatgaagaa 660 cttgcaaaaa aatcttgttc caaaatccag attctaaaat gtggaggcac tgcaaggtct 720 cagaatagcc gagaagaaaa caaggaagca ctaaagaatg acatcatatt tacgaattct 780 gtagaatcct tgaaatcagc acacataaag gagccagaaa gagaaggaaa aggcactgat 840 ttagagaaag acaaaatagg aatggaggtc aaggtagaca gtgacgctgg aataccaaaa 900 agacaggaaa cccaactaaa aatcagtgag atgagtatac cacaaggaca gggagcccaa 960 ataaagaaaa gtgtgtcaga tgtaccaaga ggacaggagt cccaagtaaa gaagagtgag 1020 tcaggtgtcc caaaaggaca agaagcccaa gtaacgaaga gtgggttggt tgtactgaaa 1080 ggacaggaag cccaggtaga gaagagtgag atgggtgtgc caagaagaca ggaatcccaa 1140 gtaaagaaga gtcagtctgg tgtctcaaag ggacaggaag 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gtgccaagaa gacaggaatc ccaagtaaag aagagtcagt ctggtgtctc aaagggacag 1200 gaagcccagg taaagaagag ggagtcagtt gtactgaaag gacaggaagc ccaggtagag 1260 aagagtgagt tgaaggtacc aaaaggacaa gaaggccaag tagagaagac tgaggcagat 1320 gtgccaaagg aacaagaggt ccaagaaaag aagagtgagg caggtgtact gaaaggacca 1380 gaatcccaag taaagaacac tgaggtgagt gtaccagaaa cactggaatc ccaagtaaag 1440 aagagtgagt caggtgtact aaaaggacag gaagcccaag aaaagaagga gagttttgag 1500 gataaaggaa ataatgataa agaaaaggag agagatgcag agaaagatcc aaataaaaaa 1560 gaaaaaggtg acaaaaacac aaaaggtgac aaaggaaagg acaaagttaa aggaaagaga 1620 gaatcagaaa tcaatggtga aaaatcaaaa ggctcgaaaa gggcgaaggc aaatacagga 1680 aggaagtaca acaaaaaagt ggaagagtaa 1710 <210> 33 <211> 1665 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atgacagtct tggaaataac tttggctgtc atcctgactc tactgggact tgccatcctg 60 gctattttgt taacaagatg ggcacgatgt aagcaaagtg aaatgtatat ctccagatac 120 agttcagaac aaagtgctag acttctggac tatgaggatg gtagaggatc ccgacatgca 180 tattcaacac aaagtgagag atccaaaaga gattacacac catcaaccaa 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aagagtgaga tgggtgtgcc aagaagacag gaatcccaag taaagaagag tcagtctggt 1140 gtctcaaagg gacaggaagc ccaggtaaag aagagggagt cagttgtact gaaaggacag 1200 gaagcccagg tagagaagag tgagttgaag gtaccaaaag gacaagaagg ccaagtagag 1260 aagactgagg cagatgtgcc aaaggaacaa gaggtccaag aaaagaagag tgaggcaggt 1320 gtactgaaag gaccagaatc ccaagtaaag aacactgagg tgagtgtacc agaaacactg 1380 gaatcccaag taaagaagag tgagtcaggt gtactaaaag gacaggaagc ccaagaaaag 1440 aaggagagtt ttgaggataa aggaaataat gataaagaaa aggagagaga tgcagagaaa 1500 gatccaaata aaaaagaaaa aggtgacaaa aacacaaaag gtgacaaagg aaaggacaaa 1560 gttaaaggaa agagagaatc agaaatcaat ggtgaaaaat caaaaggctc gaaaagggcg 1620 aaggcaaata caggaaggaa gtacaacaaa aaagtggaag agtaa 1665 <210> 34 <211> 561 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Thr Val Leu Glu Ile Thr Leu Ala Val Ile Leu Thr Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ile Leu Ala Ile Leu Leu Thr Arg Trp Ala Arg Cys Lys Gln 20 25 30 Ser Glu Met Tyr Ile Ser Arg Tyr Ser Ser Glu Gln Ser Ala Arg Leu 35 40 45 Leu Asp Tyr Glu Asp Gly Arg 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aaaggaacaa agacataatg 60 atgtcatcca agccaacaag ccatgctgaa gtaaatgaaa ccatacccaa cccttaccca 120 ccaggcagct ttatggctcc tggatttcaa cagcctctgg gttcaatcaa cttagaaaac 180 caagctcagg gtgctcagcg tgctcagccc tacggcatca catctccggg aatctttgct 240 agcagtcaac cgggtcaagg aaatatacaa atgataaatc caagtgtggg aacagcagta 300 atgaacttta aagaagaagc aaaggcacta ggggtgatcc agatcatggt tggattgatg 360 cacattggtt ttggaattgt tttgtgttta atatccttct cttttagaga agtattaggt 420 tttgcctcta ctgctgttat tggtggatac ccattctggg gtggcctttc ttttattatc 480 tctggctctc tctctgtgtc agcatccaag gagctttccc gttgtctggt gaaaggcagc 540 ctgggaatga acattgttag ttctatcttg gccttcattg gagtgattct gctgctggtg 600 gatatgtgca tcaatggggt agctggccaa gactactggg ccgtgctttc tggaaaaggc 660 atttcagcca cgctgatgat cttctccctc ttggagttct tcgtagcttg tgccacagcc 720 cattttgcca accaagcaaa caccacaacc aatatgtctg tcctggttat tccaaatatg 780 tatgaaagca accctgtgac accagcgtct tcttcagctc ctcccagatg caacaactac 840 tcagctaatg cccctaaata gtaaaagaaa aaggggtatc agtctaatct catggagaaa 900 aactacttgc aaaaacttct taagaagatg tcttttattg tctacaatga tttctagtct 960 ttaaaaactg tgtttgagat ttgtttttag gttggtcgct aatgatggct gtatctccct 1020 tcactgtctc ttcctacatt accactacta catgctggca aaggtgaagg atcagaggac 1080 tgaaaaatga ttctgcaact ctcttaaagt tagaaatgtt tctgttcata ttactttttc 1140 cttaataaaa tgtcattaga aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1182 <210> 38 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Met Ser Ser Lys Pro Thr Ser His Ala Glu Val Asn Glu Thr Ile 1 5 10 15 Pro Asn Pro Tyr Pro Pro Gly Ser Phe Met Ala Pro Gly Phe Gln Gln 20 25 30 Pro Leu Gly Ser Ile Asn Leu Glu Asn Gln Ala Gln Gly Ala Gln Arg 35 40 45 Ala Gln Pro Tyr Gly Ile Thr Ser Pro Gly Ile Phe Ala Ser Ser Gln 50 55 60 Pro Gly Gln Gly Asn Ile Gln Met Ile Asn Pro Ser Val Gly Thr Ala 65 70 75 80 Val Met Asn Phe Lys Glu Glu Ala Lys Ala Leu Gly Val Ile Gln Ile 85 90 95 Met Val Gly Leu Met His Ile Gly Phe Gly Ile Val Leu Cys Leu Ile 100 105 110 Ser Phe Ser Phe Arg Glu Val Leu Gly Phe Ala Ser Thr Ala Val Ile 115 120 125 Gly Gly 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accccgtacc aacaaggaac accttgtgcc ggttgccctg atgactgtga caaaggacta 840 tgcaccaata gttgccagta tcaagatctc ctaagtaact gtgattcctt gaagaataca 900 gctggctgtg aacatgagtt actcaaggaa aagtgcaagg ctacttgcct atgtgagaac 960 aaaatttact gatttaccta gtgagcattg tgcaagactg catggataag ggctgcatca 1020 tttaattgcg acataccagt ggaaattgta tgtatgttag tgacaaattt gatttcaaag 1080 agcaatgcat cttctccccc agatcatcac agaaatcact ttcaggcaat gatttacaaa 1140 agtagcatag tagatgatga caactgtgaa ctctgacata aatttagtgc tttataacga 1200 actgaatcag gttgaggatt ttgaaaactg tataaccata ggatttaggt cactaggact 1260 ttggatcaaa atggtgcatt acgtatttcc tgaaacatgc taaagaagaa gactgtaaca 1320 tcattgccat tcctactacc tgagttttta cttgcataaa caataaattc aaagctttac 1380 atctgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1406 <210> 41 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Ala Leu Leu Pro Val Leu Phe Leu Val Thr Val Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Ala Glu Gly Lys Asp Pro Ala Phe Thr Ala Leu Leu Thr Thr 20 25 30 Gln Leu Gln Val Gln Arg Glu Ile Val Asn Lys His Asn Glu 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Asp Ser Phe His 145 150 155 160 Thr Glu Leu His Pro Arg Val Ala Phe Trp Ile Ile Lys Leu Pro Arg 165 170 175 Arg Arg Ser His Gln Asp Ala Leu Glu Gly Gly His Trp Leu Ser Glu 180 185 190 Lys Arg His Arg Leu Gln Ala Ile Arg Asp Gly Leu Arg Lys Gly Thr 195 200 205 His Lys Asp Val Leu Glu Glu Gly Thr Glu Ser Ser Ser His Ser Arg 210 215 220 Leu Ser Pro Arg Lys Thr His Leu Leu Tyr Ile Leu Arg Pro Ser Arg 225 230 235 240 Gln Leu <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <400> 72 ctcctatcca tgatgctgac g 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <400> 73 cctgaggatg tacagtaagt g 21 <210> 74 <211> 2987 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 tttcccagcg aggtggtcat tcagagccta cacatctgtt ctgtatttta acccatggat 60 gagaatattc attcaagcca agagagttaa aactaaacat ctttgctatt gcctctacag 120 acccagaaag tatctttatg tcacatcttc ttttaaagga gcatttaaag atgaagttaa 180 aaaggcagaa gaagcagtaa agattgctga atccatattg aaagaagcac aaatcaaagt 240 aaaccagtgt gacagaacct ctttatcttc tgccaaggat gtattacaga gagctttgga 300 agatgtagaa gcaaagcaaa agaatcttaa agagaaacaa agagaattaa aaacagcaag 360 aacgctctcc ctgttctatg gagtgaacgt agaaaaccga agccaagctg gaatgttcat 420 ttacagtaat aaccgtttga tcaaaatgca tgaaaaagtg ggctcacagt tgaaactgaa 480 gtccttactt ggcgcaggcg tggttggaat tgttaatata cccttggagg tcatggaacc 540 atcccataat aaacaggaat ttctcaatgt ccaagagtat aatcatctac taaaagtcat 600 gggacagtac ttggtccagt actgtaagga caccggcatc aataatagaa atttaacatt 660 gttttgcaat gaatttggat accagaatga catcgatgtg gagaaacctt taaattcttt 720 tcaatatcaa agaagacaag ccatgggtat cccattcatc atacaatgtg atctttgtct 780 taaatggaga gtcttgcctt cctctactaa ttatcaggaa aaagaatttt ttgacatttg 840 gatttgtgct aataatccca accgcttgga aaacagttgt catcaggtag aatgtctacc 900 ttccatccca ctgggcacca tgagcacaat atcaccatca aaaaatgaga aagagaagca 960 acttagagag tcggtcataa agtatcaaaa tagactggca gaacagcagc cacagcctca 1020 atttatacca gtggacgaaa tcactgtcac ttccacctgc ctaacttcag cacataagga 1080 aaataccaaa acccagaaaa tcaggctttt gggcgatgac ttgaagcatg aatctctttc 1140 atcctttgag ctttcagcga gccgtagagg acagaaaaga aacatagaag agacagactc 1200 tgatgtagag tatatttcag aaacaaaaat tatgaaaaag tctatggagg agaaaatgaa 1260 ctctcaacag cagagaattc cagtagctct gccagaaaat gtcaaactag ctgagagatc 1320 ccagagaagt cagattgcta atattaccac tgtctggaga gctcaaccaa ctgaagggtg 1380 cctgaagaat gcccaggccg cttcttggga aatgaaaagg aagcagagtc tgaactttgt 1440 agaggaatgt aaggtattga ctgaagatga gaacacgagt gattcagata taatcctggt 1500 ttcagataaa agcaacactg atgtttcatt gaaacaagaa aaaaaggaaa ttcctctttt 1560 aaaccaagaa aaacaggagc tgtgcaatga tgttctagca atgaaaagaa gctcttcatt 1620 acctagctgg aaaagcttgc tcaatgtgcc gatggaagat gtgaatctaa gttctggaca 1680 catagccaga gtttctgtga gtggcagttg taaagttgct tcttcgccag cgtcttctca 1740 aagcacacct gtcaaggaaa cagtgagaaa actgaagtct aagttaaggg agattcttct 1800 gtattttttt cctgagcatc agctaccatc agaattggaa gaacctgcat taagttgtga 1860 gctggagcag tgcccagagc agatgaacaa aaagctgaaa atgtgtttca accagataca 1920 gaatacttac atggtccaat atgaaaaaaa aataaagagg aaattgcagt ccattatcta 1980 tgattcaaat acaagaggaa tacataatga aatctctctg gggcaatgtg aaaataaaag 2040 aaaaatctct gaggataagc tgaagaatct tcgtataaaa ctggcactat tgttgcagaa 2100 actccaactg ggtggtccag aaggtgacct ggagcagact gacacttatt tagaagcttt 2160 gcttaaagaa gataatcttc tcttccagaa caatttaaat aaagtaacta tagatgcaag 2220 acatagactc cctttagaaa aaaatgaaaa gacttcggaa aattaagtca gagatggtat 2280 taccttttaa aaaatgctaa taagaaaatt ggaagattct tttaaaaatt tttctttttt 2340 gttgttgtta ctgtaaagtc tattctgttt aacaataaga aataagaaat aatttttttc 2400 aaataagaaa attgtgtact ctagaaatgg agaccgattt acaatttatg tattccctaa 2460 tccaattatc taaatcttcc ttttctttca gaaatattaa taatatctag agttctctaa 2520 ttttcatgtg agctactgaa aaaaatgaaa atgtcactca agcttaactt ttgttattcc 2580 ttaaaagatt gttattgtaa ttttgttatt ccttaaaaac atttaaaagc agattttttc 2640 aaaatcgata tgtgaaggac tacagaatca cctcctcttg aagatattga aaaagaaaga 2700 cattatgccc tttctccact atagccaaca ctcagtcaag cagaaaatac aaatcccccc 2760 aaaactttga gacatagctt atataatttt attatttagt catagtaaaa gaataaatct 2820 cctaagcata atatgtatac atattacaca tatgtaaaaa ttgttgtttt acatttacat 2880 atacgtaaag aagtatgttt ttacactttt cttgataagt gttttttttt tgtttagaaa 2940 tgtctgaaac tttagacaaa aacagtaaaa catttaatat tcatttg 2987 <210> 75 <211> 735 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Met Arg Ile Phe Ile Gln Ala Lys Arg Val Lys Thr Lys His Leu Cys 1 5 10 15 Tyr Cys Leu Tyr Arg Pro Arg Lys Tyr Leu Tyr Val Thr Ser Ser Phe 20 25 30 Lys Gly Ala Phe Lys Asp Glu Val Lys Lys Ala Glu Glu Ala Val Lys 35 40 45 Ile Ala Glu Ser Ile Leu Lys Glu Ala Gln Ile Lys Val Asn Gln Cys 50 55 60 Asp Arg Thr Ser Leu Ser Ser Ala Lys Asp Val Leu Gln Arg Ala Leu 65 70 75 80 Glu Asp Val Glu Ala Lys Gln Lys Asn Leu Lys Glu Lys Gln Arg Glu 85 90 95 Leu Lys Thr Ala Arg Thr Leu Ser Leu Phe Tyr Gly Val Asn Val Glu 100 105 110 Asn Arg Ser Gln Ala Gly Met Phe Ile Tyr Ser Asn Asn Arg Leu Ile 115 120 125 Lys Met His Glu Lys Val Gly Ser Gln Leu Lys Leu Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gly Ala Gly Val Val Gly Ile Val Asn Ile Pro Leu Glu Val Met Glu 145 150 155 160 Pro Ser His Asn Lys Gln Glu Phe Leu Asn Val Gln Glu Tyr Asn His 165 170 175 Leu Leu Lys Val Met Gly Gln Tyr Leu Val Gln Tyr Cys Lys Asp Thr 180 185 190 Gly Ile Asn Asn Arg Asn Leu Thr Leu Phe Cys Asn Glu Phe Gly Tyr 195 200 205 Gln Asn Asp Ile Asp Val Glu Lys Pro Leu Asn Ser Phe Gln Tyr Gln 210 215 220 Arg Arg Gln Ala Met Gly Ile Pro Phe Ile Ile Gln Cys Asp Leu Cys 225 230 235 240 Leu Lys Trp Arg Val Leu Pro Ser Ser Thr Asn Tyr Gln Glu Lys Glu 245 250 255 Phe Phe Asp Ile Trp Ile Cys Ala Asn Asn Pro Asn Arg Leu Glu Asn 260 265 270 Ser Cys His Gln Val Glu Cys Leu Pro Ser Ile Pro Leu Gly Thr Met 275 280 285 Ser Thr Ile Ser Pro Ser Lys Asn Glu Lys Glu Lys Gln Leu Arg Glu 290 295 300 Ser Val Ile Lys Tyr Gln Asn Arg Leu Ala Glu Gln Gln Pro Gln Pro 305 310 315 320 Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu Ile Thr Val Thr Ser Thr Cys Leu Thr 325 330 335 Ser Ala His Lys Glu Asn Thr Lys Thr Gln Lys Ile Arg Leu Leu Gly 340 345 350 Asp Asp Leu Lys His Glu Ser Leu Ser Ser Phe Glu Leu Ser Ala Ser 355 360 365 Arg Arg Gly Gln Lys Arg Asn Ile Glu Glu Thr Asp Ser Asp Val Glu 370 375 380 Tyr Ile Ser Glu Thr Lys Ile Met Lys Lys Ser Met Glu Glu Lys Met 385 390 395 400 Asn Ser Gln Gln Gln Arg Ile Pro Val Ala Leu Pro Glu Asn Val Lys 405 410 415 Leu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Ser Gln Ile Ala Asn Ile Thr Thr Val 420 425 430 Trp Arg Ala Gln Pro Thr Glu Gly Cys Leu Lys Asn Ala Gln Ala Ala 435 440 445 Ser Trp Glu Met Lys Arg Lys Gln Ser Leu Asn Phe Val Glu Glu Cys 450 455 460 Lys Val Leu Thr Glu Asp Glu Asn Thr Ser Asp Ser Asp Ile Ile Leu 465 470 475 480 Val Ser Asp Lys Ser Asn Thr Asp Val Ser Leu Lys Gln Glu Lys Lys 485 490 495 Glu Ile Pro Leu Leu Asn Gln Glu Lys Gln Glu Leu Cys Asn Asp Val 500 505 510 Leu Ala Met Lys Arg Ser Ser Ser Leu Pro Ser Trp Lys Ser Leu Leu 515 520 525 Asn Val Pro Met Glu Asp Val Asn Leu Ser Ser Gly His Ile Ala Arg 530 535 540 Val Ser Val Ser Gly Ser Cys Lys Val Ala Ser Ser Pro Ala Ser Ser 545 550 555 560 Gln Ser Thr Pro Val Lys Glu Thr Val Arg Lys Leu Lys Ser Lys Leu 565 570 575 Arg Glu Ile Leu Leu Tyr Phe Phe Pro Glu His Gln Leu Pro Ser Glu 580 585 590 Leu Glu Glu Pro Ala Leu Ser Cys Glu Leu Glu Gln Cys Pro Glu Gln 595 600 605 Met Asn Lys Lys Leu Lys Met Cys Phe Asn Gln Ile Gln Asn Thr Tyr 610 615 620 Met Val Gln Tyr Glu Lys Lys Ile Lys Arg Lys Leu Gln Ser Ile Ile 625 630 635 640 Tyr Asp Ser Asn Thr Arg Gly Ile His Asn Glu Ile Ser Leu Gly Gln 645 650 655 Cys Glu Asn Lys Arg Lys Ile Ser Glu Asp Lys Leu Lys Asn Leu Arg 660 665 670 Ile Lys Leu Ala Leu Leu Leu Gln Lys Leu Gln Leu Gly Gly Pro Glu 675 680 685 Gly Asp Leu Glu Gln Thr Asp Thr Tyr Leu Glu Ala Leu Leu Lys Glu 690 695 700 Asp Asn Leu Leu Phe Gln Asn Asn Leu Asn Lys Val Thr Ile Asp Ala 705 710 715 720 Arg His Arg Leu Pro Leu Glu Lys Asn Glu Lys Thr Ser Glu Asn 725 730 735 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <400> 76 ctgagtatca gctaccatca g 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <400> 77 tctgtagtcc ttcacatatc g 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <400> 78 ttttgtctat ggtgtaggac c 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <400> 79 ggaatggcaa tgatgttaca g 21 <210> 80 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Met Ser Thr Val Lys Glu Gln Leu Ile Glu Lys Leu Ile Glu Asp Asp 1 5 10 15 Glu Asn Ser Gln 20 <210> 81 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Phe Thr Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Pro Leu Glu Tyr Arg Ser 1 5 10 <210> 82 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Phe Asp Ile Lys Leu Leu Arg Asn Ile Pro Arg Trp Thr 1 5 10 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Gly Val Ala Gly Gln Asp Tyr Trp Ala Val Leu Ser Gly Lys Gly 1 5 10 15 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Ser Arg Glu Val Thr Thr Asn Ala Gln Arg 1 5 10 <210> 85 <211> 216 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 tgctcttact ccaaaaagat ggacccaggg ccctgcgggc ctccccctgg ccatggccca 60 ggtcacccac cccctggtcc acatcactga ggaagtagaa gaaaacagga cacaagatgg 120 caagcctgag agaattgccc agctgacctg gaaggaggcc taaaccgcaa tattctcttc 180 ctaataaaca gcctcctaga ggccacattc tattct 216 <210> 86 <211> 227 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 tgctcttact ccaaaaagat ggacccaggt ccgaaggggc actgccactg tggggggcat 60 ggccatcctc caggtcaccc accccctggt ccacatcact gaggaagtag aagaaaacag 120 gacacaagat ggcaagcctg agagaattgc ccagctgacc tggaatgagg cctaaaccac 180 aatcttctct tcctaataaa cagcctccta gaggccacat tctattc 227 <210> 87 <211> 261 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 tgctcttact ccaaaaagat ggacccaggt ccgaaggggc actgccactg tggggggcat 60 ggccatcctc caggtcactg cgggcctccc cctggccatg gcccaggtca cccaccccct 120 ggtccacatc actgaggaag tagaagaaaa caggacacaa gatggcaagc ctgagagaat 180 tgcccagctg acctggaatg aggcctaaac cacaatcttc tcttcctaat aaacagcctc 240 ctagaggcca cattctattc t 261 <210> 88 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 tgctcttact ccaaaaagat ggacccaggt ccgaaggggc actgccactg tggggggcat 60 ggccatcctc caggtcactg cgggccaccc ccccaccatg gtccagggcc ctgcgggcca 120 cccccccacc atggtccagg gccctgcggg cctccccctg gccatggccc aggtcaccca 180 ccccctggtc cacatcactg aggaagtaga agaaaacagg acacaagatg gcaagcctga 240 gagaattgcc cagctgacct ggaatgaggc ctaaaccaca atcttctctt cctaataaac 300 agcctcctag aggccacatt ctattct 327 <210> 89 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Leu Leu Leu Gln Lys Asp Gly Pro Arg Ala Leu Arg Ala Ser Pro Trp 1 5 10 15 Pro Trp Pro Arg Ser Pro Thr Pro Trp Ser Thr Ser Leu Arg Lys 20 25 30 <210> 90 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Met Asp Pro Gly Pro Cys Gly Pro Pro Pro Gly His Gly Pro Gly His 1 5 10 15 Pro Pro Pro Gly Pro His His 20 <210> 91 <211> 36 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Met Ala Gln Val Thr His Pro Leu Val His Ile Thr Glu Glu Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Arg Thr Gln Asp Gly Lys Pro Glu Arg Ile Ala Gln Leu Thr 20 25 30 Trp Lys Glu Ala 35 <210> 92 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Leu Leu Gln Lys Asp Gly Pro Arg Ser Glu Gly Ala Leu Pro Leu Trp 1 5 10 15 Gly Ala Trp Pro Ser Ser Arg Ser Pro Thr Pro Trp Ser Thr Ser Leu 20 25 30 Arg Lys <210> 93 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Met Asp Pro Gly Pro Lys Gly His Cys His Cys Gly Gly His Gly His 1 5 10 15 Pro Pro Gly His Pro Pro Pro Gly Pro His His 20 25 <210> 94 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Met Ala Ile Leu Gln Val Thr His Pro Leu Val His Ile Thr Glu Glu 1 5 10 15 Val Glu Glu Asn Arg Thr Gln Asp Gly Lys Pro Glu Arg Ile Ala Gln 20 25 30 Leu Thr Trp Asn Glu Ala 35 <210> 95 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Leu Leu Leu Gln Lys Asp Gly Pro Arg Ser Glu Gly Ala Leu Pro Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Trp Pro Ser Ser Arg Ser Leu Arg Ala Ser Pro Trp Pro 20 25 30 Trp Pro Arg Ser Pro Thr Pro Trp Ser Thr Ser Leu Arg Lys 35 40 45 <210> 96 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Met Asp Pro Gly Pro Lys Gly His Cys His Cys Gly Gly His Gly His 1 5 10 15 Pro Pro Gly His Cys Gly Pro Pro Pro Gly His Gly Pro Gly His Pro 20 25 30 Pro Pro Gly Pro His His 35 <210> 97 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Met Ala Ile Leu Gln Val Thr Ala Gly Leu Pro Leu Ala Met Ala Gln 1 5 10 15 Val Thr His Pro Leu Val His Ile Thr Glu Glu Val Glu Glu Asn Arg 20 25 30 Thr Gln Asp Gly Lys Pro Glu Arg Ile Ala Gln Leu Thr Trp Asn Glu 35 40 45 Ala <210> 98 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Leu Leu Leu Gln Lys Asp Gly Pro Arg Ser Glu Gly Ala Leu Pro Leu 1 5 10 15 Trp Gly Ala Trp Pro Ser Ser Arg Ser Leu Arg Ala Thr Pro Pro Pro 20 25 30 Trp Ser Arg Ala Leu Arg Ala Thr Pro Pro Pro Trp Ser Arg Ala Leu 35 40 45 Arg Ala Ser Pro Trp Pro Trp Pro Arg Ser Pro Thr Pro Trp Ser Thr 50 55 60 Ser Leu Arg Lys 65 <210> 99 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Met Asp Pro Gly Pro Lys Gly His Cys His Cys Gly Gly His Gly His 1 5 10 15 Pro Pro Gly His Cys Gly Pro Pro Pro His His Gly Pro Gly Pro Cys 20 25 30 Gly Pro Pro Pro His His Gly Pro Gly Pro Cys Gly Pro Pro Pro Gly 35 40 45 His Gly Pro Gly His Pro Pro Pro Gly Pro His His 50 55 60 <210> 100 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Met Ala Ile Leu Gln Val Thr Ala Gly His Pro Pro Thr Met Val Gln 1 5 10 15 Gly Pro Ala Gly His Pro Pro Thr Met Val Gln Gly Pro Ala Gly Leu 20 25 30 Pro Leu Ala Met Ala Gln Val Thr His Pro Leu Val His Ile Thr Glu 35 40 45 Glu Val Glu Glu Asn Arg Thr Gln Asp Gly Lys Pro Glu Arg Ile Ala 50 55 60 Gln Leu Thr Trp Asn Glu Ala 65 70

Claims (117)

  1. (i) (a) SEQ ID NO: 19 내지 21, 54 내지 57로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산, 또는 상기 핵산 서열에 의하여 코딩되는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 30개 이상 코딩하는 이의 일부와,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산
    으로 이루어진 군 중에서 선택되는 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 6개 이상 포함하는 이의 일부,
    (ii) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 6개 이상 코딩하는 이의 일부,
    (iii) 종양 관련 항원에 결합하는 항체,
    (iv) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산에 상보적인 안티센스 핵산,
    (v) 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열을 6개 이상 포함하는 이의 일부를 발현하는 숙주 세포, 및
    (vi) 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열을 6개 이상 포함하는 이의 일부와 HLA 분자 간의 분리된 복합체
    로 이루어지는 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분을 포함하는 암에 대한 백신화 (vaccination), 암에 대한 치료, 또는 이들 모두에 사용될 수 있는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (ii)의 핵산이 발현 벡터에 존재하는 것인 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 분비하는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 HLA 분자를 추가적으로 발현하는 것인 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 HLA 분자, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부, 또는 상기 HLA 분자와 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 모두 재조합적 방법으로 발현하는 것인 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 HLA 분자를 내생적으로 발현하는 것인 약학 조성물.
  7. 제1항, 제4항, 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 항원 제시 세포인 것인 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 이들 항체의 단편인 것인 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체가 치료제 또는 진단제와 결합되어 있는 것인 약학 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항, 제8항, 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 또는 이들의 혼합물을 추가적으로 포함하는 것인 약학 조성물.
  11. 삭제
  12. 제1항에 있어서, 상기 암은 폐종양, 유방 종양, 전립선 종양, 흑색종, 결장 종양, 결장 종양의 전이, 신장 세포 암종, 자궁 경부 암종, 결장 암종 또는 유방 암종인 것인 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제6항, 제8항, 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 종양 관련 항원이 SEQ ID NO: 22 내지 24, 58 내지 61, 81, 82로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산의 30개 이상의 서열을 포함하는 이들의 일부를 포함하는 것인 약학 조성물.
  14. (a) SEQ ID NO: 19 내지 21, 54 내지 57로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산, 또는 상기 핵산 서열에 의하여 코딩되는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 30개 이상 코딩하는 이의 일부와,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산
    으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 종양 관련 항원을 사용하여, 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현을 특징으로 하는 질병의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여, 환자로부터 분리된 시료 중에서
    (i) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 6개 이상 코딩하는 그 일부를 검출하는 것,
    (ii) 종양 관련 항원 또는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 6개 이상 포함하는 그 일부를 검출하는 것,
    (iii) 종양 관련 항원에 대한 항체를 검출하는 것,
    (iv) 종양 관련 항원 또는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열을 6개 이상 포함하는 그 일부에 특이적인 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구를 검출하는 것 중 한 가지 이상을 포함하는,
    (i) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산,
    (ii) 종양 관련 항원,
    (iii) 상기 종양 관련 항원에 대한 항체, 및
    (iv) 종양 관련 항원에 특이적인 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구 중 한 가지 이상을 검출하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 검출이
    (i) 상기 생물학적 시료를 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그 일부, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부, 상기 항체 또는 상기 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구와 특이적으로 결합하는 제제와 접촉시키고,
    (ii) 상기 제제와 상기 핵산 또는 그 일부, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부, 상기 항체 또는 상기 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구 간의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 핵산 또는 그 일부를 상기 핵산 또는 상기 그 일부에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그 일부에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 항체를 상기 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩타이드를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. (a) SEQ ID NO: 19 내지 21, 54 내지 57로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산, 또는 상기 핵산 서열에 의하여 코딩되는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 30개 이상 코딩하는 이의 일부,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특성을 갖는 질병에 걸린 환자 또는 상기 질병에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터 분리된 시료를 상기 질병이 퇴행중인지, 진행중인지 또는 시작되었는지를 측정하기 위하여
    (i) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 6개 이상 코딩하는 그 일부의 양,
    (ii) 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 6개 이상 포함하는 그 일부의 양,
    (iii) 종양 관련 항원에 결합하는 항체의 양,
    (iv) 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열을 6개 이상 포함하는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 세포 용해성 T 세포 또는 사이토카인 분비 T 세포의 양
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 파라미터에 대하여 모니터링하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 핵산 또는 그 일부의 양을 상기 핵산 또는 그 일부에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부의 양을 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 항체의 양을 상기 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩타이드를 사용하여 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제16항 내지 제18항 및 제20항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로브, 항체, 또는 단백질 또는 펩타이드를 검출 가능한 방법으로 표지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제17항 또는 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체 또는 이들 항체의 단편인 것인 방법.
  25. 제14항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질병은 암인 것인 방법.
  26. 제14항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 SEQ ID NO: 22-24, 58-61, 81, 82로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적 아미노산 서열을 30개 이상 포함하는 이들의 일부를 포함하는 것인 방법.
  27. (a) SEQ ID NO: 19 내지 21, 54 내지 57로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산, 또는 상기 핵산 서열에 의하여 코딩되는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 30개 이상 코딩하는 이의 일부,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 가지는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 특성을 갖는 질병을 치료, 진단 또는 모니터링하기 위한 것으로서, 상기 종양 관련 항원에 결합하고 치료제 또는 진단제에 커플링되는 것이 특징인 항체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 또는 인간화된 항체, 또는 이들 항체의 단편인 것인 항체.
  29. (i) (a) SEQ ID NO: 19 내지 21, 54 내지 57로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산, 또는 상기 핵산 서열에 의하여 코딩되는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 30개 이상 코딩하는 이의 일부,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현이 특징인 질병에 걸린 환자로부터 면역 반응성 세포를 함유하는 시료를 제공하는 것과,
    (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 6개 이상을 포함하는 그 일부에 대한 세포 용해성 또는 사이토카인 방출 T 세포의 생산에 유리한 조건 하에서, 상기 시료를 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현하는 숙주 세포와 접촉시키는 것
    에 의하여 제조되어, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 발현하는 세포를 용해시키기 위하여 상기 환자 내로 도입되는,
    종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현이 특징인 질병에 걸린 환자를 치료하기 위한 세포 용해성 T 세포 또는 사이토카인 방출 T 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 HLA 분자를 재조합적으로 발현하는 것인 세포 용해성 T 세포 또는 사이토카인 방출 T 세포.
  31. 제30항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부에 결합하는 HLA 분자를 내생적으로 발현하는 것인 세포 용해성 T 세포 또는 사이토카인 방출 T 세포.
  32. (i) 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현이 특징인 질병과 관련하여 세포가 발현하는 핵산인,
    (a) SEQ ID NO: 19 내지 21, 54 내지 57로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산, 또는 상기 핵산 서열에 의하여 코딩되는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 30개 이상 코딩하는 이의 일부,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 핵산을 동정하는 것과,
    (ii) 상기 핵산 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 6개 이상을 코딩하는 핵산의 일부를 포함하는 핵산을 사용하여 숙주 세포를 형질 감염시키는 것과,
    (iii) 상기 형질 감염된 세포를 배양하여 상기 핵산을 발현시키는 것
    에 의하여 제조되는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현이 특징인 질병을 갖는 환자를 치료하기 위한 형질 감염된 숙주 세포,
    여기에서, 상기 형질 감염된 숙주 세포 또는 그의 추출물은 상기 질병과 관련된 환자의 세포에 대한 면역 반응을 증가시키기 위하여 환자 내로 도입된다.
  33. 제32항에 있어서, 상기 면역 응답이 B 세포 응답 또는 T 세포 응답을 포함하는 것인 형질 감염된 숙주 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 면역 응답이 상기 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 아미노산 6개 이상의 서열을 포함하는 그 일부를 제시하는 숙주 세포에 특이적이거나, 또는 상기 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 아미노산 6개 이상의 서열을 포함하는 그 일부를 발현하는 환자의 세포에 특이적인 세포 용해성 또는 사이토카인 방출 T 세포의 생산을 포함하는 T 세포 응답인 것인, 형질 감염된 숙주 세포.
  35. 제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 비증식적인 것인 세포 용해성 T 세포 또는 사이토카인 방출 T 세포.
  36. 제32항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 비증식적인 것인 형질 감염된 숙주 세포.
  37. 제27항 또는 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질병이 암인 것인 항체.
  38. 제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질병이 암인 것인 세포 용해성 T 세포 또는 사이토카인 방출 T 세포.
  39. 제32항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질병이 암인 것인 형질 감염된 숙주 세포.
  40. 제27항 또는 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 종양 관련 항원이 SEQ ID NO: 22 내지 24, 58 내지 61, 81, 82로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열 30개 이상을 포함하는 그 일부를 포함하는 것인 항체.
  41. 제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 종양 관련 항원이 SEQ ID NO: 22 내지 24, 58 내지 61, 81, 82로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열 30개 이상을 포함하는 그 일부를 포함하는 것인 세포 용해성 T 세포 또는 사이토카인 방출 T 세포.
  42. 제32항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 종양 관련 항원이 SEQ ID NO: 22 내지 24, 58 내지 61, 81, 82로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열 30개 이상을 포함하는 그 일부를 포함하는 것인 형질 감염된 숙주 세포.
  43. (a) SEQ ID NO: 20, 21, 54-57로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산.
  44. SEQ ID NO: 23, 24, 58 내지 61로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산.
  45. 제43항 또는 제44항에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  46. 제43항 또는 제44항에 기재된 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  47. 제45항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  48. 제43항에 기재된 핵산에 의하여 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드.
  49. SEQ ID NOs: 23, 24, 58 내지 61로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 단백질 또는 폴리펩타이드.
  50. (a) SEQ ID NO: 19 내지 21, 54 내지 57로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산, 또는 상기 핵산 서열에 의하여 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 연속적인 아미노산을 30개 이상 코딩하는 이의 일부,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산에 의하여 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체.
  51. 제50항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 22 내지 24, 58 내지 61, 81, 82로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 단백질 또는 폴리펩타이드의 연속적인 아미노산 서열 30개 이상을 포함하는 이의 일부를 포함하는 것인 항체.
  52. 제50항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체 또는 이들 항체의 단편인 것인 항체.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체와 치료제 또는 진단제와의 콘쥬게이트.
  54. 제53항에 있어서, 상기 치료제 또는 진단제가 독소인 콘쥬게이트.
  55. (a) SEQ ID NO: 19 내지 21, 54 내지 57로 이루어지는 군으로부터 선택된 핵산 서열로 구성된 핵산, 또는 상기 핵산 서열에 의하여 코딩되는 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산을 30개 이상 코딩하는 이의 일부,
    (b) 핵산 (a)에 대하여 축퇴된 핵산과,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현 검출용 키트로서,
    (i) 상기 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 6개 이상을 코딩하는 그 일부를 검출하기 위한 제제와,
    (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 6개 이상을 포함하는 그 일부를 검출하기 위한 제제와,
    (iii) 상기 종양 관련 항원에 결합하는 항체를 검출하기 위한 제제와,
    (iv) 상기 종양 관련 항원 또는 상기 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열 6개 이상을 포함하는 그 일부와 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 T 세포의 검출을 위한 제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제제
    를 1종 이상 포함하는 키트.
  56. 제55항에 있어서, 상기 종양 관련 항원 또는 그 일부를 코딩하는 핵산의 검출을 위한 제제가 상기 핵산의 선택적인 증폭을 위한 핵산 분자인 키트.
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