WO2019129314A1 - Péptido antagonista de la actividad de la interleucina-15 - Google Patents

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seq
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amino acid
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Yunier Rodriguez Alvarez
Hilda Elisa Garay Perez
Osvaldo Reyes Acosta
Ania Cabrales Rico
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the branch of molecular pharmacology and human medicine, in particular, with the obtaining of peptides antagonistic to the activity of interleukin-15 (IL-15), derivatives of said cytokine, which have a greater effect than a peptide antagonist identified above.
  • IL-15 interleukin-15
  • the antagonist peptides of the invention are useful for the treatment of diseases related to the unregulated expression of IL-15 and / or the alpha subunit of the IL-15 receptor (IL-15Ra).
  • IL-15 was initially identified as a T cell activating factor (Grabstein, KH et al., Science 1994, 264, 965-968, Burton, JD et al., Proc. Nati, Acad. Sci. USA 1994, 91 , 4935-4939).
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • the expression of the protein is strongly regulated at the post-transcriptional level (Bamford RN et al., J. Immunol 1998, 160: 4418-4426 ; Kurys G, et al., J Biol Chem 2000, 275: 30653-30659).
  • This cytokine can be expressed as integral membrane protein (Musso et al., Blood 1999, 93: 3531-3539) or in soluble form, acting as a receptor or ligand, respectively.
  • IL-15 expressed as an integral membrane protein when interacting with soluble IL-15Ra, triggers an inverse signaling mechanism. This involves the secretion of pro-inflammatory cytokines (Tumor Necrosis Factor a (TNF-a), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8)) and cell migration (Budagian V. et al. , J. Biol Chem 2004, 40: 42192-42201).
  • TNF-a Tumor Necrosis Factor a
  • IL-6 Interleukin-6
  • IL-8 Interleukin-8
  • IL-15 as a ligand are mediated through binding to a trimeric receptor on the cell membrane, composed of subunits a, b, y and c . These subunits can be co-expressed in the same cell, or it can happen that IL-15 bound to subunit a is presented to neighboring cells that express only subunits b and c , a mechanism known as trans signaling (Burkett PR et al. Exp. Med 2004, 200: 825-834). While the subunits b and c are shared with other cytokines, IL-15Ra is specific for IL-15 (Giri JG et al., EMBO J 1995; 14: 3654-63).
  • IL-15 The unregulated expression of IL-15 has been linked to the pathogenesis and development of autoimmune and inflammatory diseases, such as Crohn's disease (Kirman I., Am. J. Gastroenterol, 1996, 91: 1789-1794), psoriasis (Rückert RJ Immunol 2000, 165: 2240-2250), some types of leukemia (Yamada Y. Leukemia and Lymphoma 1999, 35: 37-45) and rheumatoid arthritis (RA) (Mclnnes IB, Immunology Today 1998, 19: 75-79).
  • Crohn's disease Kerohn's disease
  • psoriasis Rückert RJ Immunol 2000, 165: 2240-2250
  • some types of leukemia Yamada Y. Leukemia and Lymphoma 1999, 35: 37-45
  • RA rheumatoid arthritis
  • IL-15 antagonists could be useful in the treatment of RA and other autoimmune and inflammatory diseases related to the over-expression of this cytokine.
  • muteins (mutated proteins) of IL-15 have been developed that have substitutions in Asp 56 and Gln 156 , and antibodies against receptor subunits, which act as antagonist molecules (patents No. US6, 177,079, US6 , 168,783, US6, 013,480, US6,001, 973, US9, 706, 931, and International Patent Application No. W09741232).
  • Other muteins described by Bernard et al may act as agonists or antagonists of IL-15 (Bernard J. et al., J Biol Chem 2004, 279: 24313-24322).
  • these entities have not resulted in a commercially available drug for the therapy of diseases that cause over-expression of IL-15.
  • an antagonist peptide of IL-15 was identified that blocks the interaction of this cytokine with IL-15Ra (International patent application No. W02006 / 029578).
  • the average inhibitory concentration (IC 50 ) reached by this is 130 mM.
  • Studies of optimization of said antagonist reflected in the Patent Application in Cuba No. 2008-0184, allowed the identification of one more peptide active (IC 50 24 mM,), but less soluble than the starting peptide compound. This low solubility hindered its development as a drug.
  • This invention contributes to solve the aforementioned problem by providing IL-15 activity antagonist peptides which are characterized in that they comprise an amino acid sequence identified as SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12 or a homodimer of these peptides. .
  • peptide antagonists are more active than the one described in the patent application No. W02006 / 029578, since they have an IC50 lower than the starting antagonist. This optimization was achieved by replacing one or two L-shaped residues with their corresponding conformational residues D in the original antagonist.
  • Other antagonists identified in the invention are the result of the formation of a homodimer among the most active monomers, chemically bound through the free cisterns present therein.
  • an antagonist of the activity of IL-15 is that entity that blocks the interaction of the cytokine with its receptor, thereby inhibiting the biological effects of the cytokine.
  • a homodimer of the peptides with the amino acid sequence identified as SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12 is that peptide where two identical monomers of said peptides are chemically linked.
  • D amino acids (D-aa) D amino acids
  • Peptide 1 10 peptide variants were generated with a change of L amino acids (L-aa) by D-aa, which were evaluated in a biological activity assay with the CTLL-2 cell line , dependent on IL-15.
  • the application of a small peptide, as an IL-15 antagonist has the advantage of selectively blocking the binding of IL-15 to IL-15Ra; inhibiting the effects of the cytokine due to the interaction with said receptor subunit.
  • the binding capacity of the peptides to IL-15Ra was evaluated by an ELISA-type immunoassay, and its effect on the inhibition of the biological activity of IL-15 was determined in the cell proliferation assay on the CTLL-2 line ( Rodr ⁇ guez- ⁇ lvarez et al., Biotecn Aplic 2014; 31: 291 -6). Additionally, the effect of these peptides on the inhibition of the secretion of two inflammatory cytokines (TNF-a and IL-6) was determined by ex vivo assays with cells isolated from the synovial fluid of patients with RA.
  • peptides can inhibit the effect of reverse signaling, through membrane IL-15, referred to by Budagian et al. In 2004, since they bind to the IL -15Ra, as described in the present invention. Thus, they are useful in inhibiting the binding of soluble IL-15Ra to IL-15 expressed on the membrane of the tumor cell.
  • the peptide is obtained by genetic manipulation or by chemical synthesis.
  • the invention discloses a nucleic acid encoding a peptide comprising the amino acid sequence identified as SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12, since its expression product is capable of binding to IL-15Ra or its soluble fraction, and inhibit the biological activity of the cytokine.
  • a vector that containing said nucleic acid sequences can be used as an alternative for the expression of the antagonist peptide sequences of the invention.
  • compositions comprising an IL-15 antagonist peptide with an amino acid sequence identified as SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12, or a homodimer of one of these peptides, and pharmaceutically excipients acceptable
  • the composition could be of topical application, for the treatment of diseases that manifest in the skin, and in whose lesions the over-expression of IL-15 is detected, such as psoriasis and T cell lymphoma. cutaneous.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it comprises the nucleic acid encoding a peptide comprising the amino acid sequence identified as SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12 and pharmaceutically acceptable excipients.
  • Another aspect of the invention is the use of a peptide comprising the amino acid sequence identified as SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12, or a homodimer of these peptides, for the manufacture of a medicament.
  • the medicament is used for the treatment of diseases related to the overexpression of IL-15.
  • the disease related to overexpression of IL-15 is an autoimmune disease selected from the group consisting of RA, Crohn's disease, ulcerative colitis and psoriasis.
  • the medicament is used for the treatment of prostate or kidney cancer.
  • the invention also contemplates a method for the treatment of a disease related to the overexpression of IL-15 comprising the administration to an individual in need thereof of a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition comprising a peptide with the sequence of amino acids identified as SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12, or a homodimer of these peptides.
  • the method may involve the administration of the pharmaceutical composition comprising the nucleic acid encoding the peptide of sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12.
  • the disease related to the The expression of IL-15 which is treated with the method of the invention is an autoimmune disease selected from the group consisting of RA, Crohn's disease, ulcerative colitis and psoriasis.
  • the selected antagonist peptides are administered alone or in combination with some other drug, such as anti-inflammatory steroidal drugs (such as corticosteroids) and disease-modifying drugs. (for example, methotrexate).
  • the invention discloses a method for the treatment of prostate or kidney cancer comprising administering to an individual in need thereof a therapeutically effective amount of the pharmaceutical compositions comprising a peptide of SEQ ID No. 5 or SEQ. ID No. 12, a homodimer of these peptides or nucleic acids encoding the peptide of sequence SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 12.
  • Figure 1 Union of the identified peptides to IL-15Ra, detected by an ELISA-type system.
  • Figure 2 Effect of the identified peptides on the proliferation of the CTLL-2 line induced by IL-15.
  • FIG. 3 Levels of TNF- ⁇ and IL-6 detected in the supernatant of synovial cells of patients treated with peptides selected for this assay.
  • TNF-a samples from three patients were evaluated (P1 -P3, Panels A-C).
  • IL-6 samples from a patient were evaluated (Panel D).
  • SEQ ID No. 1 also referred to as Peptide 1
  • Peptide 2 to Peptide 1 1 corresponds to the amino acid sequences identified with the same number (SEQ ID No. 2 - SEQ ID No. 1 1).
  • peptides with two D-aa were designed to combine the amino acid residues that would result in the greatest antagonistic effect with respect to Peptide 1.
  • Peptide 13 (whose sequence corresponds to SEQ ID No. 12) was designed.
  • Peptide 15 (whose sequence corresponds to SEQ ID No. 13).
  • Peptide 14 was designed as a homodimer of the peptide of SEQ ID NO. 12, and Peptide 16, as a homodimer of the peptide of SEQ ID NO. 13
  • the monomeric peptides were synthesized by the Fmoc / tBu strategy in syringes.
  • Fmoc-AM-MBHA resin was used at 0.54 mmol / g, and the synthesis protocol was followed with mechanical agitation (Field GB and Noble RL Int.J. Peptide Protein Res. 1990; 35 (3): 161 -214).
  • the dimerization of the peptide was carried out by oxidation of the cistern with 20% dimethylsulfoxide (Andreu D. et al., Peptide Synthesis Protocols, Flumana Press Inc .: Totowa, New Jersey, 1994; .
  • Example 2 Evaluation of the binding capacity of the peptides to IL-15Ra.
  • Proliferation of the CTLL-2 line is dependent on IL-15.
  • the effect of the peptides identified on the Proliferation of the CTLL-2 line induced by IL-15 is summarized in Figure 2A and 2B.
  • Peptide 1 was included in all the assays.
  • Figure 2A shows the results of those synthetic peptides that showed similar behavior to Peptide 1 in this biological activity assay.
  • Figure 2B shows the behavior of the proliferation of said cell line in the presence of peptides that had a better IL-15 antagonistic effect than Peptide 1.
  • Example 4 Evaluation of the effect of selected peptides on the secretion of TNF- ⁇ and IL-6 in synovial cells of patients with RA.
  • IL-15 may be an attractive target for the treatment of RA.
  • This cytokine induces the expression of others classified as inflammatory, such as TNF-a and IL-6.
  • TNF-a and IL-6 are currently biological therapies approved by the United States Food and Drug Administration for the treatment of RA.
  • Peptide 5 Peptide 12, Peptide 13 and Peptide 14, selected for this assay, were more active than the original antagonist (Peptide 1) in inhibiting the secretion of TNF-a.
  • Figure 3A, 3B, and 3C the secretion of IL-6
  • Figure 3D the secretion of IL-6
  • 2-Lys 1 is a D amino acid to
  • 7-Lys 6 is a D amino acid to ⁇ 400> 7
  • Ala-Lys 1 and D are amino acids to

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Abstract

La presente invención revela un péptido antagonista de la actividad de la Interleucina-15 (IL-15) que se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, o un homodímero de estos péptidos, así como un ácido nucleico que codifica para el péptido con la secuencia identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12. Las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos o los ácidos nucleicos que codifican para dichas secuencias son parte de la invención. Además, provee el uso de un péptido antagonista de la IL-15 que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, o un homodímero de estos péptidos, para la fabricación de un medicamento. La invención contempla un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15, del cáncer de próstata y riñón.

Description

PÉPTIDO ANTAGONISTA DE LA ACTIVIDAD DE LA INTERLEUCINA-15
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con la rama de la farmacología molecular y la medicina humana, en particular, con la obtención de péptidos antagonistas de la actividad de la lnterleucina-15 (IL-15), derivados de dicha citocina, que poseen mayor efecto que un antagonista peptídico identificado anteriormente. Por su actividad biológica, los péptidos antagonistas de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la expresión no regulada de la IL-15 y/o de la subunidad alfa del receptor de IL-15 (IL-15Ra).
Estado de la técnica anterior
La IL-15 se identificó inicialmente como un factor activador de células T (Grabstein, K.H. et al., Science 1994, 264, 965 -968; Burton, J.D. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1994, 91 , 4935-4939). A pesar de la amplia distribución del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de la IL-15, la expresión de la proteína está fuertemente regulada a nivel post-transcripcional (Bamford RN. et al., J. Immunol 1998, 160: 4418-4426; Kurys G, et al., J Biol Chem 2000, 275: 30653-30659). Esta citocina puede expresarse como proteína integral de membrana (Musso et al. Blood 1999, 93: 3531 -3539) o en forma soluble, actuando como receptor o ligando, respectivamente. La IL-15 expresada como proteína integral de membrana, al interactuar con la IL-15Ra soluble, desencadena un mecanismo de señalación inversa. Este involucra la secreción de citocinas pro-inflamatorias (Factor de Necrosis Tumoral a (TNF-a), lnterleucina-6 (IL-6), lnterleucina-8 (IL-8)) y la migración celular (Budagian V. et al., J. Biol Chem 2004, 40: 42192-42201 ).
Los efectos biológicos de la IL-15 como ligando son mediados a través de la unión a un receptor trimérico de la membrana celular, compuesto por las subunidades a, b, y yc. Estas subunidades pueden co-expresarse en una misma célula, o puede ocurrir que la IL-15 unida a la subunidad a sea presentada a células vecinas que expresan solamente las subunidades b y yc, mecanismo conocido como señalización en trans (Burkett P.R. et al. J Exp. Med 2004, 200: 825-834). Mientras que la subunidades b y yc son compartidas con otras citocinas, la IL-15Ra es específica para la IL-15 (Giri JG et al. EMBO J 1995;14: 3654-63). La expresión no regulada de la IL-15 se ha vinculado con la patogénesis y el desarrollo de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, como la enfermedad de Crohn (Kirman I., Am. J. Gastroenterol. 1996, 91 : 1789-1794), la psoriasis (Rückert R. J. Immunol 2000, 165: 2240-2250), algunos tipos de leucemias (Yamada Y. Leukemia and Lymphoma 1999, 35: 37-45) y la artritis reumatoide (AR) (Mclnnes I.B., Immunology Today 1998, 19: 75-79).
Las evidencias experimentales mostradas en los trabajos de Mclnnes y Ziolkowska avalan a la IL-15 como un blanco terapéutico atractivo, particularmente en la AR. Éstas incluyen: elevadas concentraciones de IL-15 en el fluido sinovial, expresión incrementada en células de la membrana sinovial, estimulación de la secreción de TNF -a, IL-6 e IL-17, y de la migración de células T hacia el fluido sinovial de pacientes con AR (Mclnnes I.B. et al., Nat Med 1997, 3: 189-195; Ziolkowska M. et al., J Immunology 2000,164: 2832-2838). En un modelo animal de la enfermedad, Yoshihara y colaboradores demostraron que la IL-15 exacerba la artritis inducida por colágeno, en un ratón transgénico para esta citocina (Yoshihara K. et al., Eur J. Immunol. 2007, 37: 2744-2752). Todos estos elementos sugieren que los antagonistas de la IL-15 podrían ser útiles en el tratamiento de la AR y de otras enfermedades autoinmunes e inflamatorias relacionadas con la sobre-expresión de esta citocina.
En este sentido, se han desarrollado muteínas (proteínas mutadas) de la IL-15 que poseen sustituciones en el Asp56 y Gln156, y anticuerpos contra las subunidades del receptor, que actúan como moléculas antagonistas (patentes No. US6, 177,079, US6, 168,783, US6, 013,480, US6,001 ,973, US9, 706, 931 , y Solicitud internacional de patente No. W09741232). Otras muteínas descritas por Bernard y colaboradores pueden actuar como agonistas o antagonistas de la IL-15 (Bernard J. et al. J Biol Chem 2004, 279: 24313-24322). Sin embargo, estas entidades no han redundado en un fármaco comercialmente disponible para la terapia de enfermedades que cursan con la sobre-expresión de la IL-15.
En el 2006 se identificó un péptido antagonista de la IL-15 que bloquea la interacción de esta citocina con IL-15Ra (Solicitud internacional de patente No. W02006/029578). La concentración inhibitoria media (IC50) alcanzada por este es de 130 mM. Estudios de optimización de dicho antagonista, reflejados en la Solicitud de patente en Cuba No. 2008-0184, permitieron la identificación de un péptido más activo (IC50 24 mM,), pero menos soluble que el compuesto peptídico de partida. Esta baja solubilidad dificultó su desarrollo como fármaco.
Teniendo en cuenta la elevada afinidad de la IL-15 por la IL-15Ra, resulta necesario identificar entidades moleculares con una actividad inhibitoria mayor que los antagonistas ya descritos, que permitan la obtención de fármacos más eficaces en el tratamiento de la AR, y de otras enfermedades autoinmunes e inflamatorias relacionadas con la sobre-expresión de IL-15.
Explicación de la invención
Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado, al proporcionar péptidos antagonistas de la actividad de la IL-15 que se caracterizan porque comprenden una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12 o un homodímero de estos péptidos.
Estos antagonistas peptídicos son más activos que el descrito en la solicitud de patente No. W02006/029578, ya que poseen una IC50 menor que el antagonista de partida. Esta optimización se logró mediante la sustitución de uno o dos residuos de conformación L, por sus correspondientes residuos de conformación D en el antagonista original. Otros antagonistas identificados en la invención son el resultado de la formación de un homodímero entre los monómeros más activos, enlazados químicamente a través de las cisternas libres presentes en ellos. A los efectos de la presente invención, un antagonista de la actividad de IL-15 es aquella entidad que bloquea la interacción de la citocina con su receptor, inhibiendo de esta forma los efectos biológicos de la citocina.
En el contexto de la invención, un homodímero de los péptidos con la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12 es aquel péptido donde dos monómeros idénticos de dichos péptidos están enlazados químicamente. Como se conoce que la introducción de D aminoácidos (D-aa) en un péptido aumenta su estabilidad, fue sorprendente que en la invención algunas sustituciones de este tipo abrogaran la capacidad como antagonista de la actividad de la IL-15 que poseía el péptido de partida, denominado en la invención como Péptido 1. En la invención se generaron 10 variantes peptídicas con un cambio de L aminoácidos (L- aa) por D-aa, que se evaluaron en un ensayo de actividad biológica con la línea celular CTLL-2, dependiente de la IL-15. También se obtuvo el homodímero del péptido identificado con la SEQ ID No. 5. Adicionalmente, se diseñaron dos péptidos con dos D-aa cada uno (Péptido 13 y Péptido 15), y por síntesis química se obtuvo el dímero correspondiente (Péptido 14 y Péptido 16).
En general, la aplicación de un péptido de pequeña talla, como antagonista de IL-15, tiene la ventaja de bloquear selectivamente la unión de la IL-15 a la IL-15Ra; inhibiendo los efectos de la citocina debidos a la interacción con dicha subunidad receptora.
La capacidad de unión de los péptidos a la IL-15Ra se evaluó mediante un inmunoensayo tipo ELISA, y su efecto sobre la inhibición de la actividad biológica de la IL-15 se determinó en el ensayo de proliferación celular en la línea CTLL-2 (Rodríguez-Álvarez et al., Biotecn Aplic 2014; 31 :291 -6). Adicionalmente, se determinó el efecto de estos péptidos sobre la inhibición de la secreción de dos citocinas inflamatorias (TNF-a e IL-6), mediante ensayos ex vivo con células aisladas del fluido sinovial de pacientes con AR.
En estos experimentos se demostró que solo cuatro variantes, denominadas como Péptido 5, Péptido 12, Péptido 13 y Péptido 14, son más activas que el Péptido 1 en la inhibición de la proliferación de células CTLL-2 inducida por la IL-15, y en la secreción de IL-6 y TNF-a. Estos péptidos son completamente solubles, lo que representa una ventaja con respecto al péptido de la solicitud de patente cubana No. 2008-0184. El mayor efecto lo mostró el Péptido 12, con una IC50 de 8 mM. Este péptido también fue más activo que el antagonista original (Péptido 1 ) en la inhibición de la secreción del TNF-a e IL-6 inducida por la IL-15Ra, en células sinoviales de pacientes con AR.
Estos péptidos antagonistas (Péptido 5, Péptido 12, Péptido 13 y Péptido 14) pueden inhibir el efecto de señalización inversa, a través de la IL-15 de membrana, referido por Budagian y colaboradores en el 2004, ya que se unen a la IL-15Ra, como se describe en la presente invención. De este modo, son útiles en la inhibición de la unión de la IL-15Ra soluble a la IL-15 expresada en la membrana de la célula tumoral. En una realización de la invención el péptido se obtiene por manipulación genética o por síntesis química.
En otro aspecto, la invención revela un ácido nucleico que codifica para un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, ya que su producto de expresión es capaz de unirse a la IL-15Ra o a su fracción soluble, e inhibir la actividad biológica de la citocina. Un vector que contenga dichas secuencias de ácido nucleico puede ser usado como alternativa para la expresión de las secuencias peptídicas antagonistas de la invención.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende un péptido antagonista de la IL-15 con una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, o un homodímero de uno de estos péptidos, y excipientes farmacéuticamente aceptables. En la invención, la composición podría ser de aplicación tópica, para el tratamiento de enfermedades que se manifiestan en la piel, y en cuyas lesiones se detecta la sobre-expresión de la IL-15, tales como la psoriasis y el linfoma de células T cutáneo.
En una realización de la invención, la composición farmacéutica se caracteriza porque comprende el ácido nucleico que codifica para un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12 y excipientes farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de la invención es el uso de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, o un homodímero de estos péptidos, para la fabricación de un medicamento. En una realización de la invención, el medicamento se utiliza para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobre-expresión de la IL-15. En una realización particular, la enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 es una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo compuesto por la AR, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa y la psoriasis. En otra realización, el medicamento se utiliza para el tratamiento del cáncer de próstata o de riñón.
La invención también contempla un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 que comprende la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende un péptido con la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, o un homodímero de de estos péptidos. En otro aspecto, el método puede involucrar la administración de la composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico que codifica para el péptido de secuencia SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12. En una realización particular, la enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 que se trata con el método de la invención es una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo compuesto por la AR, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa y la psoriasis. En el método de tratamiento de la AR de la presente invención, los péptidos antagonistas seleccionados se administran solos o en combinación con algún otro fármaco, como por ejemplo con medicamentos esteroidales anti-inflamatorios (como los corticoesteroides) y medicamentos modificadores del curso de la enfermedad (por ejemplo, el metotrexato).
En otro aspecto, la invención revela un método para el tratamiento del cáncer de próstata o de riñón que comprende la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido de SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, un homodímero de estos péptidos o ácidos nucleicos que codifican para el péptido de secuencia SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Unión de los péptidos identificados a la IL-15Ra, detectada mediante un sistema tipo ELISA.
Figura 2. Efecto de los péptidos identificados sobre la proliferación de la línea CTLL-2 inducida por IL-15. A. Evaluación de los péptidos 3, 4, 6, 7, 10, 11 y 15. B. Evaluación de los péptidos 2, 5, 8, 9, 12, 13, 14 y 16. En todos los ensayos se evaluó el Péptido 1.
Figura 3. Niveles de TNF-a e IL-6 detectados en el sobrenadante de células sinoviales de pacientes tratadas con péptidos seleccionados para este ensayo. Para TNF-a se evaluaron las muestras de tres pacientes (P1 -P3, Paneles A-C). Para IL-6 se evaluaron las muestras de un paciente (Panel D). Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización
Ejemplo 1. Síntesis de péptidos que comprenden D-aminoácidos.
Diseño
A partir del péptido identificado en la lista de secuencia de esta invención como SEQ ID No. 1 (también referido como Péptido 1 ), se diseñó un panel de péptidos en los que se realizó la sustitución puntual de cada residuo aminoacídico de conformación L por el mismo residuo con conformación D. En esta invención, del Péptido 2 al Péptido 1 1 le corresponden las secuencias de aminoácidos identificadas con el mismo número (SEQ ID No. 2 - SEQ ID No. 1 1 ). También se diseñó el homodímero químico del péptido de SEQ ID NO. 5, que se denominó Péptido 12.
Adicionalmente, se diseñaron péptidos con dos D-aa, para combinar los residuos aminoacídicos que resultaran en el mayor efecto antagonista respecto al Péptido 1. De esta forma, se diseñó el Péptido 13 (cuya secuencia se corresponde con la SEQ ID No. 12) y el Péptido 15 (cuya secuencia se corresponde con la SEQ ID No. 13). Además, se diseñó el Péptido 14, como un homodímero del péptido de SEQ ID NO. 12, y el Péptido 16, como un homodímero del péptido de SEQ ID NO. 13.
Síntesis de péptidos
Los péptidos monoméricos se sintetizaron por la estrategia Fmoc/tBu en jeringuillas. Se utilizó la resina Fmoc-AM-MBHA a 0,54 mmol/g, y se siguió el protocolo de síntesis con agitación mecánica (Field GB y Noble RL. Int. J. Peptide Protein Res. 1990; 35(3):161 -214). En variantes deseadas, la dimerización del péptido se llevó a cabo por oxidación de la cisterna con dimetilsulfóxido al 20% (Andreu D. et al. Peptide Synthesis Protocols. Flumana Press Inc.: Totowa, New Jersey, 1994; gi l í 6). Todos los péptidos se purificaron por cromatografía de Fase Reversa (RP- HPLC), y se corroboró su secuencia por espectrometría de masas (ESI-MS). Todos se obtuvieron con más del 95% de pureza, y hubo correspondencia entre la masa obtenida y la esperada según la secuencia de aminoácidos correspondiente, como se aprecia en la Tabla 1.
Tabla 1. Caracterización de las variantes peptídicas obtenidas.
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Ejemplo 2. Evaluación de la capacidad de unión de los péptidos a la IL-15Ra.
Una vez que se obtuvieron y se caracterizaron los péptidos sintéticos, se determinó su capacidad de unión a la IL-15Ra. Esta evaluación se realizó mediante un ensayo tipo ELISA. Además, se calculó el % de inhibición de la formación del complejo IL- 15/IL-15Ra que presenta cada péptido. Tanto el procedimiento para el ensayo tipo ELISA, como la ecuación empleada para calcular el % de inhibición de la formación del complejo IL-15/IL-15Ra se detallan en el artículo publicado por Santos y colaboradores en el 2012 (Santos A. et al. J. Pept. Sci. 2012; 18: 25-29).
Como se observa en la Figura 1 , todos los péptidos evaluados reconocieron la IL- 15Ra inmovilizada en la placa de ELISA. Ni la sustitución de L-aa por D-aa en el péptido antagonista de partida, ni la dimerización química de algunos de los nuevos péptidos diseñados, afectaron la capacidad de unión de estas entidades peptídicas a la IL-15Ra.
Los mayores % de inhibición de la formación del complejo IL-15/IL-15Ra se obtuvieron para Péptido 5, Péptido 12, Péptido 13 y Péptido 14, con 92, 96, 89 y 92%, respectivamente. Estos % de inhibición son mayores que el reportado por Santos y colaboradores en el 2012 para el Péptido 1 , que fue del 70%. Ejemplo 3. Efecto de los péptidos sobre la proliferación de la línea celular CTLL-2.
La proliferación de la línea CTLL-2 es dependiente de IL-15. Entidades moleculares que se unen a la IL-15 o a su subunidad receptora, inhiben la proliferación de esta línea. Para evaluar la capacidad antagonista de los péptidos diseñados y obtenidos en la presente invención, se siguió el procedimiento descrito por Santos y colaboradores en el 2012. El efecto de los péptidos identificados sobre la proliferación de la línea CTLL-2 inducida por IL-15 se resume en la Figura 2A y 2B. En todos los ensayos se incluyó el Péptido 1. La Figura 2A recoge los resultados de aquellos péptidos sintéticos que mostraron un comportamiento similar al Péptido 1 en este ensayo de actividad biológica. Por su parte, la Figura 2B muestra el comportamiento de la proliferación de dicha línea celular en presencia de péptidos que tuvieron mejor efecto antagonista de IL-15 que el Péptido 1.
La realización de este ensayo colorimétrico permitió, además, calcular la IC50 de cada péptido, para una concentración fija de IL-15 de 300 pg/mL. Los valores de IC50 para cada péptido se muestran en la Tabla 2. Producto de las sustituciones de residuos de conformación L por conformación D, se encontraron péptidos, como el Péptido 3, Péptido 4, Péptido 6, Péptido 7, Péptido 10, Péptido 1 1 y Péptido 15, que muestran igual o menor efecto antagonista que el péptido original, tal como se aprecia en dicha tabla. Estos péptidos tuvieron una IC50 igual o mayor que la exhibida por el Péptido 1. Por su parte, el Péptido 2, Péptido 5, Péptido 8, Péptido 9, Péptido 12, Péptido 13, Péptido 14 y Péptido 16 mostraron un mayor efecto antagonista (menor IC50) que el Péptido 1.
Tabla 2. Valor de la IC50 de los péptidos evaluados en el ensayo de proliferación celular de la línea CTLL-2.
Figure imgf000010_0001
En este ensayo, el mayor efecto antagonista sobre la proliferación inducida por la IL- 15 lo mostró el Péptido 12, homodímero químico del péptido de SEQ ID NO. 5, que posee la sustitución puntual de la L-Ala por D-Ala. En este, el residuo Cys está comprometido en la formación del enlace disulfuro entre los dos monómeros. Este péptido es tres veces más activo que su forma monomérica (Péptido 5), y 16 veces más activo que el péptido original (Péptido 1 ). El Péptido 13, que contiene dos D-aa en su secuencia, resultó tan activo como el Péptido 5, o sea más activo que Péptido 1. Sin embargo, la otra variante con dos D-aa (Péptido 15) es menos activa que el Péptido 1.
En correspondencia con los resultados obtenidos en las células CTLL-2, los péptidos con mayor efecto antagonista (Péptido 5, Péptido 12, Péptido 13 y Péptido 14) mostraron porcientos de inhibición de la formación del complejo IL-15/IL-15Ra superiores al descrito para el Péptido 1.
En su conjunto, los resultados obtenidos indican que no es obvio que la sustitución de L-aa por D-aa, a partir del Péptido 1 , redunde en un mayor efecto antagonista de la IL-15, aunque se conozca que la introducción de D-aa en un péptido mejore su estabilidad. De todos los residuos posibles, solo la sustitución de la alanina garantiza este efecto. Tampoco se puede anticipar que el doble cambio de L-aa por D-aa, mejore la capacidad como antagonista, ya que el Péptido 13 y el Péptido 15, que contienen dos D-aa en su secuencia mostraron un comportamiento opuesto.
Ejemplo 4. Evaluación del efecto de péptidos seleccionados sobre la secreción de TNF-a e IL-6 en células sinoviales de pacientes con AR.
Es conocido que la IL-15 puede ser un blanco atractivo para el tratamiento de la AR. Esta citocina induce la expresión de otras clasificadas como inflamatorias, como el TNF-a y la IL-6. Contra estas dos proteínas se han desarrollado numerosos fármacos, que actualmente constituyen terapias biológicas aprobadas por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos, para el tratamiento de la AR.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, resulta importante evaluar el efecto de antagonistas de la IL-15 sobre la secreción de TNF-a e IL-6, mediante ensayos ex vivo con células sinoviales de pacientes con AR. Para la determinación del efecto de péptidos seleccionados sobre la secreción de TNF-a, se realizó un procedimiento antes descrito (Santos A. et al. J. Pept. Sci. 2012; 18: 25-29). Los niveles de TNF- a se determinaron mediante un inmunoensayo tipo ELISA comercialmente disponible (R&D, EUA). Esta medición se realizó en el sobrenadante de cultivo de células sinoviales de tres pacientes con AR (P1 , P2, P3).
Se evaluó, además, el efecto de los mismos péptidos sobre la secreción de IL-6, mediada por la unión de la IL-15Ra soluble a la IL-15 presente en la membrana de las células sinoviales de un paciente con AR (P1 ), siguiendo lo descrito en un reporte anterior (Machado A. C. aai, Arthritis. 2012, Article ID 943156). El ensayo se realizó en placas de 96 pocilios, incubando 2x105 células/pozo, estimuladas o no con la IL-15Ra (100 ng/mL) y tratadas con 100 pg/mL de los péptidos seleccionados (Péptidos 1 , 5, 12, 13 y 14). Después de 48 h de incubación, se colectó el sobrenadante de cultivo, y se determinaron los niveles de IL-6, mediante un sistema ELISA comercial (R&D, EUA).
Como se muestra en la Figura 3, el Péptido 5, el Péptido 12, el Péptido 13 y el Péptido 14, seleccionados para este ensayo, fueron más activos que el antagonista original (Péptido 1 ) en la inhibición de la secreción de TNF-a (Figura 3A, 3B, y 3C) y de la secreción de IL-6 (Figura 3D).
LISTA DE SECUENCIAS
<110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA
<120> PÉPTIDO ANTAGONISTA DE LA ACTIVIDAD DE LA
INTERLEUCINA-15
<130> Antag IL15 Daa
<140> CU 2017-0177
<141> 29.12.2017
<160> 13
<170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 1
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Peptido
2-Lys 1 es un D aminoácido
<400> 2
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
3-Val es un D aminoácido
<400> 3
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10 <210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido 4- Thr es un D aminoácido
<400> 4
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido 5- Ala es un D aminoácido
<400> 5
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
6-Met es un D aminoácido
<400> 6
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
7-Lys 6 es un D aminoácido <400> 7
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
8-Cys es un D aminoácido
<400> 8
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
9-Phe es un D aminoácido
<400> 9
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
10-Leu 9 es un D aminoácido
<400> 10
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
11-Leu 10 es un D aminoácido
<400> 11
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
13-Lys 1 y Ala son D aminoácidos
<400> 12
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial : Peptido
15-Ala y Cys son D aminoácidos
<400> 13
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
Figure imgf000016_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un péptido antagonista de la actividad de la lnterleucina-15 (IL-15) que se caracteriza porque comprende una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, o un homodímero de estos péptidos.
2. El péptido según la reivindicación 1 que se obtiene por manipulación genética o por síntesis química.
3. El péptido según la reivindicación 1 donde el homodímero se obtiene a partir de dos monómeros de péptido que se enlazan a través del residuo cisterna libre.
4. Un ácido nucleico caracterizado porque codifica para un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12.
5. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un péptido antagonista de la IL-15 que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, o un homodímero de estos péptidos, y excipientes farmacéuticamente aceptables.
6. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4 y excipientes farmacéuticamente aceptables.
7. Uso de un péptido antagonista de la IL-15 que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 12, o un homodímero de estos péptidos para la fabricación de un medicamento.
8. El uso según la reivindicación 7 donde el medicamento se utiliza para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobre-expresión de la IL- 15.
9. El uso según la reivindicación 8 caracterizado porque la enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 es una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo compuesto por la artritis reumatoide (AR), la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa y la psoriasis
10. El uso según la reivindicación 7 donde el medicamento se utiliza para el tratamiento del cáncer de próstata y de riñón
1 1. Un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la sobre expresión de la IL-15 caracterizado porque comprende la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 5 o la reivindicación 6.
12. El método según la reivindicación 1 1 donde la enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 se selecciona del grupo compuesto por la AR, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa y la psoriasis.
13. Un método para el tratamiento del cáncer de próstata o de riñón caracterizado porque comprende la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la reivindicación 5 o la reivindicación 6.
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