WO2018121802A1 - Composición vacunal que comprende un mutante de la interleucina-15 humana - Google Patents

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Yunier Rodriguez Alvarez
Yanelys MORERA DÍAZ
Haydeé GERONIMO PEREZ
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Definitions

  • the present invention relates to the branch of biotechnology, immunology and the pharmaceutical industry, in particular to active immunization with polypeptides comprising a mutated interleukin-1 (IL-15), for the treatment of diseases related to the envelope. -expression of IL-15.
  • IL-15 mutated interleukin-1
  • IL-1 5 The cytokine known as IL-1 5 is a 14-15 kDa glycoprotein, which was simultaneously identified by two groups, as a factor that activates T cells (Grabstein, KH et al., Science 1 994; 264: 965-8; Burton, JD et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1994; 91 (1 1): 4935-9).
  • the messenger ribonucleic acid (RNA) (mRNA) of IL-15 is present in a wide variety of cells and tissues, however the protein is rarely found in the cells or in the culture supernatant of these cells that express the transcript, since there is a strong post-transcriptional control of its expression, at the level of translation and intracellular traffic (Bamford RN et al. J. Immunol 1998; 160: 4418-26; Kurys G. et al., J Biol C em 2000; 275: 30653-9).
  • IL-1 5 The biological effects of IL-1 5 are mediated through binding to a receptor in the cell membrane, composed of three subunits, ⁇ , and ⁇ .
  • the subunit (IL-15Ra) is specific for this cytokine, to which it binds with very high affinity (10 " Kd. 11 ).
  • the ⁇ subunit is shared with IL-2, and the ⁇ subunit is a common receptor for several cytokines, such as IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 and IL-21 (Burton JD et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1994, 91 (1 1) : 4935-9; Giri JG et al., EMBO J. 1995, 14: 3654-63).
  • IL-1 5 is an immunostimulatory cytokine, which promotes the proliferation and functional activity of T, B and NK cells (Giri, JG et al., EMBO J. 1994, 13, 2822-30), activates neutrophils and modifies the secretion of monocinases (Girard D. et al., Blood. 1 996, 88: 31 76-84; Alleva DG et al., J. Immunol. 1997, 159 (6): 2941-51). In addition, it induces the proliferation of CD56 + NK cells, and acts together with IL-12 in the induction of interferon (IFN) ⁇ and tumor necrosis factor (TNFa) (Ross ME and Caligiuri MA Blood. 1997, 89: 910-8; Fehniger TA et al., Transplant Proc. 1999, 31: 1476-8).
  • IFN interferon
  • TNFa tumor necrosis factor
  • IL-15 Unregulated expression or overexpression has been linked to the development of several diseases, including Crohn's disease (Kirman I. and Nielsen OH Am. J. Gastroenterol. 996, 91 (9): 1789 -94), psoriasis (Rückert R. et al., J. Immunol. 2000, 1 65: 2240-50), leukemia (Yamada Y. et al., Blood. 998, 91: 4265-72; Yamada Y y Kamihira S. Leuk Lymphoma. 1999, 35 (1-2): 37-45) and rheumatoid arthritis (RA), (Mclnnes IB Immunology Today. 1998, 19: 75-9).
  • IL-15 induces the expression of IL-17 in the joint of patients with RA, stimulates the release of inflammation mediators, such as IL-6, IL-8, growth factor of granulocytes and macrophages (GM-CSF), and prostaglandin E 2 , suggesting that IL-1 5 plays an important role in the pathogenesis of RA (Ziolkowska M. et al, J Immunol. 2000, 1 64: 2832- 8).
  • IL-15 antagonist molecules have been shown to be effective in animal models. Ruchatz et al. Generated a soluble fragment of the murine receptor ⁇ subunit, and demonstrated that administration of this fragment inhibits collagen-induced arthritis (AIC) in DBA / 1 mice (Ruchatz HJ Immunol. 1998, 160: 5654-60) .
  • Genmab announced the study, in clinical phase I and II, of an anti-IL-15 antibody (HuMax-IL-1 5) (Patent No. US6177079). Although treatment was well tolerated, no significant efficacy was evidenced in a phase II study that involved 10 patients with RA (Baslund B. et al. Arthritis & Rheumatism. 2005, 52: 2686-92). Other studies have been conducted with a chimeric protein consisting of an IL-15 mutant and the Fe fragment of an immunoglobulin, which binds to cells that express the IL-15 receptor.
  • CRB-15 This fusion protein, called CRB-15, has proven effective in a murine model of AIC, reporting that treatment with CRB-15 decreases the incidence and severity of the disease, and prevents the progression of arthritis once established ( Ferrari-Lacraz S. et al., J Immunol 2004, 1 73 (9): 5818-26).
  • the present invention solves the problem set forth above, by providing a vaccine composition characterized in that it comprises a polypeptide containing a human IL-15 mutant identified as SEQ ID No. 1, at least one vaccine adjuvant and pharmaceutically acceptable excipients or vehicles.
  • the IL-15 gene was isolated from monopods activated with lipopolysaccharides, and was amplified by polymerase chain reaction (PCR), using oligonucleotides specific for mutation in the sequence of IL-15. Specifically, Asp 8 and GIn 108 were mutated by Ser. The mutated polypeptide was obtained in said amino acid residues, hereinafter referred to as IL-15Mut, with a purity greater than 95%.
  • the vaccine composition comprises a polypeptide containing the IL-1 5 mutant identified SEQ ID No. 1 (IL-1 5Mut) that is obtained by the recombinant deoxyribonucleic acid (DNA) pathway.
  • IL-1 5Mut IL-1 5 mutant identified SEQ ID No. 1
  • DNA deoxyribonucleic acid pathway
  • the IL-1 5Mut polypeptide was obtained from E. coli, so it is not glycosylated, unlike the autologous protein present in humans.
  • This mutated cytokine is not biologically active in the cell proliferation assay in CTLL-2, since it is not capable of inducing the growth of these cells, which are IL-15 dependent.
  • IL-15Mut competes with native IL-15 for receptor binding, but does not induce signaling by having mutated Asp 8 and GIn 108 residues, which are key residues in the interaction with the ⁇ subunit and ⁇ of the receptor.
  • This element constitutes an advantage with respect to the method proposed by Santos et al. (International Patent Application Publication No. WO 2004/032956), in terms of a lower occurrence of adverse events in treated patients, which are related to proinflammatory activity. of this cytokine.
  • the polypeptide comprising the IL-15 mutant identified as SEQ ID No. 1, which is part of a vaccine composition is a fusion polypeptide.
  • the fusion polypeptide containing the IL-15 mutant identified as SEQ ID No. 1 also comprises T epitopes, at a protein concentration of 200 ⁇ g.
  • an IL-15 mutant was designed consisting of SEQ ID No. 1, recombinantly obtained, with molecular characteristics other than natural cytokine, in terms of the disulfide bridge arrangement. This element favors the development of the immune response by exposure of cryptic or immunodominant epitopes.
  • non-human primates specifically Chlorocebus sabaeus green monkeys
  • a vaccine composition comprising the IL-15Mut polypeptide, identified as SEQ ID No. 1, using aluminum hydroxide (referred to interchangeably as alumina) and the oil adjuvant Montanide TM ISA-51, generates a Antibody response that inhibits the biological activity of native IL-1 in CTLL-2 cells.
  • This cell line used for neutralization assays, expresses the three subunits of the IL-1 5 receptor, and is dependent on this cytokine to proliferate (Eisenman J. et al. Cytokine. 2002; 20 (3): 121 - 9).
  • the sera showed an inhibition of dose-dependent proliferation.
  • This response is greater when compared to the group of animals that were immunized with the polypeptide identified as SEQ ID No. 2, IL-15 protein obtained in E. coli.
  • immunization with a higher dose of the polypeptide of SEQ ID No. 1 (350 ⁇ ) generates a greater response of neutralizing antibodies, from 1 to 5 days after the second immunization.
  • This aspect constitutes an advantage, since the desired effect is achieved with a smaller number of administrations of the vaccine composition of the invention.
  • the vaccine composition of the invention can be administered by several routes, as is known to those skilled in this field of the art.
  • the amount of vaccine antigen in the composition may vary, depending on the disease to be treated.
  • the amount of antigen (polypeptide comprising a human interleukin-15 (IL-15) mutant identified as SEQ ID No. 1) is in the range of 200-500 ⁇ per dose of vaccine.
  • compositions may contain vaccine adjuvants that are well known in current vaccinology, such as aluminum salts and water-in-oil emulsions, and others that are in development, with a view to generating in the patient the levels of antibodies against IL-15 that are required.
  • vaccine adjuvants that are well known in current vaccinology, such as aluminum salts and water-in-oil emulsions, and others that are in development, with a view to generating in the patient the levels of antibodies against IL-15 that are required.
  • the invention also discloses the use of a polypeptide comprising a human IL-15 mutant, identified as SEQ ID No. 1, to manufacture a medicament for active immunotherapy of a disease related to the overexpression of IL-15. . It is well known by those versed in this field of the art those diseases that present with an aberrant expression, or overexpression, of IL-15.
  • polypeptide comprising a human IL-15 mutant, identified as SEQ ID No. 1, to manufacture a medicament for active immunotherapy of an autoimmune disease, selected from the group consisting of the RA, Crohn's disease, ulcerative colitis and psoriasis.
  • said polypeptide is used for active immunotherapy of a disease related to the overexpression of IL-15, such as hematological malignancies.
  • a disease related to the overexpression of IL-15 such as hematological malignancies.
  • the hematologic malignancy is a leukemia or a lymphoma.
  • the invention also provides a method for the treatment of diseases related to the overexpression of IL-15 characterized in that it comprises the administration to an individual in need of a therapeutically effective amount of a vaccine composition comprising a polypeptide containing a mutant. of human interleukin-15 (IL-15) identified as SEQ ID No. 1.
  • IL-15 human interleukin-15
  • said vaccine composition is suitable for administration in humans, and generates a neutralizing antibody response against autologous IL-15.
  • the method of the invention which comprises active immunization with IL-15Mut (of SEQ ID No. 1) in a formulation suitable for generating neutralizing autoantibodies against IL-15, enables neutralization of unregulated amounts of this cytokine, in patients with autoimmune diseases and hematological malignancies.
  • This method is superior to that proposed in International Patent Application Publication No. WO 2004/032956, if it is taken into account that the antigen used for active immunization lacks biological activity.
  • the method of the invention is useful in the treatment of diseases related to the overexpression of IL-1 5, including RA, psoriasis and inflammatory bowel disease.
  • the active immunotherapy method of the invention can be combined with the administration of other medications, such as anti-inflammatory or antagonists of other cytokines.
  • these medications are, for example, steroid medications, such as corticosteroids, and disease modifiers (such as methotrexate).
  • the method of the invention is also useful in the treatment of diseases such as hematologic malignancies, including leukemias and lymphomas.
  • active immunotherapy using the vaccine composition of the invention can be combined with the administration, to the individual who requires it, of at least one pharmaceutically acceptable cytostatic.
  • the method of the invention is advantageous, since the levels of antibodies generated in the patient themselves are more stable over time than those administered in a passive immunization.
  • the frequency of application of the vaccine compositions comprising the IL-15 mutant is much lower than in a passive immunization with antibodies against the cytokine (in the method of the invention they are spaced for a longer time interval).
  • the amount of protein per dose, and the amount of administrations that are required for vaccination are lower than those required for treatment with IL-15 antagonist molecules, which implies a lower production cost, and higher patients adherence to treatment.
  • Immunization with the polypeptide identified as SEQ ID No. 1 generates antibodies with a greater neutralizing capacity than those obtained in the group that was immunized with the recombinant protein of SEQ ID No. 2.
  • the use of an antigen that is not biologically active results in a lower frequency of unwanted events in patients treated with the vaccine that contains it.
  • FIG. 1 Purity status of IL-15Mut. The chromatographic profiles obtained by phase high performance liquid chromatography are shown. Reverse (RP-HPLC) of: (A) the IL-15Mut and (B) the recombinant IL-15 obtained in E. coli, used as an antigen in the vaccine preparation.
  • FIG. 1 Evaluation of the biological activity of IL-15Mut by the proliferation assay in CTLL-2.
  • A Cell proliferation induced by serial dilutions of native IL-15 (R&D), IL-15Mut, recombinant IL-1 5 obtained in E. coli.
  • B Cell proliferation curve in the presence of serial dilutions of IL-15Mut with a fixed concentration of native IL-1.
  • FIG. 3 Evaluation by solid-phase immunoenzymatic assay (ELISA) of the anti-IL-15 antibody response in monkeys immunized with recombinant IL-15Mut and IL-15 using aluminum hydroxide (A) and Montanide TM ISA-51 (B) as adjuvants.
  • the graphs show the average of the antibody titer values of the three animals of each experimental group, corresponding to 15 days after the second and third immunization.
  • FIG. 4 Evaluation in CTLL-2 cells of the neutralizing capacity of the individual sera of the immunized animals, after the third immunization, using the alumina adjuvant.
  • A Group IL-1 5
  • B Group IL-15Mut at the dose of 200 ⁇ g
  • C Group IL-15Mut at the dose of 350 g
  • D placebo group.
  • the line called Native IL-15 Dilution represents the maximum value of cell proliferation.
  • the line called Minimum represents the minimum proliferation value corresponding to cells grown in culture medium without cytokine.
  • Figure 5 Evaluation in CTLL-2 cells of the neutralizing ability of the mixture of sera from animals immunized with IL-15Mut and recombinant IL1 5.
  • the neutralizing effect of each group is shown, 15 days after the second and third immunization, using the aluminum hydroxide adjuvant (A) or Montanide TM (B).
  • the line called Native IL-15 Dilution represents the maximum value of cell proliferation.
  • the line called Minimum represents the minimum proliferation value corresponding to cells grown in culture medium without cytokine.
  • Example 1 Obtaining the IL-15Mut polypeptide in E. coli.
  • DNA encoding human IL-15 was isolated by RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction, reverse transcription coupled to polymerase chain reaction) from monopods activated with lipopolysaccharides, and amplified by PCR ( T at 60 ° C, 25 cycles), using specific oligonucleotides for the mutation of Asp 8 and Gln 108 by Ser in the sequence of IL-1 5 (oligonucleotide 5 ' CAT GCC ATG GCA AAC TGG GTG AATGTA ATA AGT TCT TTG AAA and oligonucleotide 3 ' C GGGATCCCG TTA AGA AGT GTT GAT GAA CAT AGA GAC AAT).
  • RT-PCR reverse transcription - polymerase chain reaction, reverse transcription coupled to polymerase chain reaction
  • the PCR band was digested with Neo 1 / BamH I (Promega, USA), and cloned into an expression vector in E. coli.
  • the renaturation process was carried out on a 1.6 x 40 cm column (GE Healthcare Life Sciences, USA), packed with Sephadex G-25 Fine (Pharmacia Biotech, Sweden) and equilibrated in 0.1 M Tris buffer and NaCI 0 ,15 M; pH 8.0; at a rate of 7 mL / min.
  • the collected sample was applied to a 1.6x10cm column (GE Healthcare, USA) packed with Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, USA), using a linear gradient elution from 0.2 M to 0.5 M NaCI, at a rate of 2 mL / min.
  • the fraction corresponding to the elution with 0.5M NaCl was applied to a C 4 column (1 0 ⁇ , 1 x 25 cm, Vydac, USA), at a rate of 1 mL / min.
  • the proteins were separated using a mobile phase containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and HPLC grade acetonitrile (AcN), using the following gradient: 0-30% 5 min; 30% 10 min; 30-40% 5 min; 40-50% 30 min; 50-60% 60 min; 60-80% 5 min at 2.5 mL / min. The separation was monitored at 226 nm. Protein concentration was determined by the Bradford method, following the manufacturer's instructions. The IL-15 protein without mutations was also obtained recombinantly in E. coli, as described above (Santos-Savio A. et al. Biotecn Aplic. 2000, 17: 221-4).
  • Example 2 Determination of the purity of IL-15Mut by RP-HPLC.
  • Example 3 Evaluation of the biological activity of IL-15Mut in the CTLL-2 cell line.
  • the proliferation assay in the CTLL-2 cell line was used.
  • the biological activity was measured by stimulation of the proliferation of these cells, using mitochondrial staining with 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliob bromide (MTT) 3- [4, 5- Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Mossman TJ Immunol. Methods. 1983; 65 (1 -2): 55-63), following the procedure described below.
  • IL-15Mut Dilutions of IL-15Mut were co-incubated with 300 pg / mL of native IL-15, in a volume of 20 pL.
  • CTLL-2 cells were previously washed 5 times with RPMI medium, and added to the plate, at a rate of 5x10 3 cells per well, in a volume of 50 pL. It was incubated for 72 h at 37 ° C, 5% C0 2 and 98% relative humidity. Cell viability was determined by staining with MTT.
  • IL-15Mut was not biologically active, since it did not induce proliferation of CTLL-2 cells, unlike recombinant IL-15 (SEQ ID No. 2) and native IL-15, which stimulated a proliferation dose -dependent ( Figure 2).
  • Example 5 Determination of anti-IL-15 antibodies in the serum of immunized animals.
  • anti-ll-15 antibodies were made by an indirect ELISA type system, where the plate was coated with the polypeptide identified as SEQ ID No. 2 (1 pg / mL) in PBS, and incubated for 16 hours at 25 Q C. It was blocked with 1% bovine serum albumin (BSA) (Sigma-Aldrich, USA) at 1% in PBS for 90 min at 37 ° C. It was washed 3 times with wash solution (1x PBS + 0.05% Tween 20). Serial dilutions of the decomplemented sera were made, starting at 1: 5,000 in PBS; Tween 20 0.05% and BSA 0.01% and 100 pL were applied per well of the diluted serum, incubating 90 min at 37 ° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • Example 6 Determination of the neutralizing capacity of sera from immunized animals.
  • This IL-2-dependent line also proliferates in the presence of IL-15 (maximum proliferation is considered that achieved in cells treated with said native cytokine, at 300 pg / mL), while in the absence of cytokine the cells do not proliferate (minimum: cells grown in culture medium without IL-15).
  • maximal proliferation is considered that achieved in cells treated with said native cytokine, at 300 pg / mL
  • minimum cells grown in culture medium without IL-15.
  • serial dilutions of the decomplemented sera were made in a 96-well culture plate in a volume of 30 pL of RPMI medium, supplemented with 10% SFB and gentamicin (50 pg / mL).
  • 20 pL of native IL-15 (300 pg / mL) per well was added, and incubated at 37 ° C for 30 min.
  • CTLL-2 cells were previously washed 5 times with RPMI medium, and added to the plate at a rate of 5x10 3 cells per well, in a volume of 50 pL.
  • Figure 5 shows the neutralizing ability of mixing sera from animals immunized with IL-15Mut and recombinant IL15, determined in CTLL-2 cells.
  • the sera correspond 1 to 5 days after the second and third immunization, using the aluminum hydroxide adjuvant or Montanide TM. It is appreciated that the sera possess neutralizing capacity after the third immunization, when 200 ⁇ g of recombinant IL-1 and IL-15 are administered. However, sera corresponding to the 350 ⁇ g dose showed neutralizing capacity 15 days after the second administration.
  • Table 2 shows the Dl 50 values of the serum mixture corresponding to 15 days after the second and third immunization.
  • the neutralization title for the three experimental groups is shown. It is shown that immunization with a higher dose (350 g) of IL-15Mut (SEQ ID No. 1) generates a greater neutralizing response, from 15 days after the second immunization, when alumina is used as an adjuvant.
  • This aspect constitutes an advantage, taking into account that the desired effect could be achieved with a smaller number of administrations.
  • the Dl 50 values for IL-15Mut are also higher than those achieved for recombinant IL-15, both after second and third administration. .

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Abstract

Composición vacunal que comprende un mutante de la interleucina-15 (IL-15) humana. Uso de dicho polipéptido mutante de IL-15 humana para fabricar un medicamento para la inmunoterapia activa de una enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15, entre las que se encuentran algunas enfermedades autoinmunes y neoplasias hematológicas. La administración a un individuo que lo necesite de una cantidad terapéuticamente efectiva de vacuna, que comprende el polipéptido mutante de la IL-15 humana de la invención, constituye un método para la terapia de enfermedades relacionadas con la sobre-expresión de la IL-15.

Description

COMPOSICIÓN VACUNAL QUE COMPRENDE UN MUTANTE DE LA
INTERLEUCINA-15 HUMANA
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con la rama de la biotecnología, la inmunología y la industria farmacéutica, en particular con la inmunización activa con polipéptidos que comprenden una interleucina-1 5 (IL-15) mutada, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobre-expresión de la IL-15.
Estado de la técnica anterior
La citocina conocida como IL-1 5 es una glicoproteína de 14-15 kDa, que fue identificada simultáneamente por dos grupos, como un factor que activa células T (Grabstein, K.H. et al., Science 1 994; 264: 965-8; Burton, J.D. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1994; 91 (1 1 ): 4935-9). El ácido ribonucleico (ARN) mensajero (ARNm) de la IL-15 está presente en una amplia variedad de células y tejidos, sin embargo la proteína es raramente encontrada en las células o en el sobrenadante de cultivo de estas células que expresan el transcripto, ya que existe un fuerte control post-transcripcional de su expresión, a nivel de la traducción y del tráfico intracelular (Bamford R.N. et al. J. Immunol 1998; 160: 4418-26; Kurys G. et al., J Biol C em 2000; 275: 30653-9).
Los efectos biológicos de la IL-1 5 son mediados a través de la unión a un receptor en la membrana celular, compuesto por tres subunidades , β, y γ. La subunidad (IL-15Ra) es específica para esta citocina, a la cual se une con muy alta afinidad (Kd de 10"11). La subunidad β es compartida con la IL-2, y la subunidad γ es un receptor común para varias citocinas, como la IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21 (Burton J.D. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1994, 91 (1 1 ): 4935-9; Giri J.G. et al., EMBO J. 1995, 14: 3654-63).
La IL-1 5 es una citocina inmunoestimuladora, que promueve la proliferación y actividad funcional de las células T, B y NK, (Giri, J.G. et al., EMBO J. 1994, 13, 2822-30), activa neutrófilos y modifica la secreción de monocinas (Girard D. et al., Blood. 1 996, 88: 31 76-84; Alleva D.G. et al., J. Immunol. 1997, 159(6): 2941 -51 ). Además, induce la proliferación de las células NK CD56+, y actúa junto con la IL-12 en la inducción de interferón (IFN) γ y factor de necrosis tumoral (TNFa) (Ross M.E. y Caligiuri M.A. Blood. 1997, 89: 910-8; Fehniger T.A. et al., Transplant Proc. 1999, 31 : 1476-8).
La expresión no regulada o sobre-expresión de la IL-15 se ha relacionado con el desarrollo de varias enfermedades, incluyendo la enfermedad de Crohn (Kirman I. y Nielsen O.H. Am. J. Gastroenterol. 1 996, 91 (9):1789-94), psoriasis (Rückert R. et al., J. Immunol. 2000, 1 65: 2240-50), leucemia (Yamada Y. et al., Blood. 1 998, 91 : 4265-72; Yamada Y y Kamihira S. Leuk Lymphoma. 1999, 35(1 -2):37-45) y artritis reumatoide (AR), (Mclnnes I.B. Immunology Today. 1998, 19: 75-9).
Estudios previos sμgieren que la IL-1 5 precede al TNF en la cascada de citocinas, actuando como un factor importante en la migración de células T hacia el fluido sinovial (Feldmann M. et al., Annu Rev Immunol. 1 996, 14: 397-440; Mclnnes I.B. et al., Nat Med. 1997, 3:189-95). Adicionalmente, Ziolkowska y colaboradores describieron que la IL-15 induce la expresión de IL-17 en la articulación de pacientes con AR, estimula la liberación de mediadores de la inflamación, como la IL-6, la IL-8, el factor de crecimiento de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), y la prostaglandina E2, sμgiriendo que la IL-1 5 desempeña un papel importante en la patogénesis de la AR (Ziolkowska M. et al, J Immunol. 2000, 1 64:2832-8).
El uso de moléculas antagonistas de IL-15 ha mostrado ser efectivo en modelos animales. Ruchatz y colaboradores generaron un fragmento soluble de la subunidad α del receptor murino, y demostraron que la administración de este fragmento inhibe la artritis inducida por colágeno (AIC) en ratones DBA/1 (Ruchatz H. J. Immunol. 1998, 160: 5654-60).
Se han protegido por patentes otras moléculas antagonistas de IL-1 5, que incluyen mutantes de esta en uno o más residuos de aminoácidos, y anticuerpos monoclonales que se unen a la IL-1 5 e impiden la traducción de las señales a través del receptor (Patentes No. US6001 973, US6177079, US61 68783, US6013480). Su aplicación aparece en los documentos de patentes antes mencionados, pero existen pocos estudios en la literatura que avalen su efectividad.
En mayo del año 2002 la compañía Genmab anunció el estudio, en fase clínica I y II, de un anticuerpo anti-IL-15 (HuMax-IL-1 5) (Patente No. US6177079). Aunque el tratamiento fue bien tolerado, no se evidenció eficacia significativa en un estudio fase II que involucró 1 10 pacientes con AR (Baslund B. et al. Arthritis & Rheumatism. 2005, 52:2686-92). Otros estudios se han realizado con una proteína quimérica que consiste en una mutante de IL-15 y el fragmento Fe de una inmunoglobulina, que se une a células que expresan el receptor de IL-15. Esta proteína de fusión, denominada CRB-15, ha demostrado ser efectiva en un modelo murino de AIC, reportándose que el tratamiento con CRB-15 disminuye la incidencia y la severidad de la enfermedad, y previene la progresión de la artritis una vez establecida (Ferrari-Lacraz S. et al., J Immunol 2004, 1 73(9):5818-26).
En el año 2003, Santos y colaboradores propusieron un método de vacunación que comprendía la inmunización activa con IL-15, obtenida en Escherichia coli (Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 2004/032956). Sin embargo, la proteína obtenida en ese hospedero es biológicamente activa, ya que promueve la proliferación de la línea celular CTLL-2, dependiente de IL-2 e IL-1 5 (Santos-Savio A. et al. Biotecn Aplic. 2000, 17:221 -4). Este elemento constituye un inconveniente, teniendo en cuenta que pequeñas cantidades del inmunógeno que se liberen, y entren en circulación, desencadenarían una respuesta no deseada. Se conoce que esta citocina, en condiciones fisiológicas, es un factor de crecimiento de células T de memoria (Kanai T et al., J Immunol. 1996, 1 57(8):3681 -7; Kanegane H. y Tosato G. Blood. 1 996, 88(1 ):230-5). El proceso inflamatorio en la AR se caracteriza por una activación y reclutamiento de células T hacia la sinovial (Wilkinson P.C. y Liew F.Y. Exp Med. 1995, 181 :1255-9), por lo que la inmunización con una molécula de IL-15 activa puede contribuir al desarrollo de la enfermedad. Sigue siendo de interés la obtención de vacunas para la inmunoterapia activa de enfermedades relacionadas con la sobre-expresión de la IL-1 5, que ofrezcan ventajas terapéuticas con respecto a las terapias que existen en el tratamiento de este tipo de enfermedades.
Explicación de la invención
La presente invención resuelve el problema antes planteado, al proveer una composición vacunal caracterizada porque comprende un polipéptido que contiene un mutante de la IL-15 humana identificado como SEQ ID No. 1 , al menos un adyuvante vacunal y excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
El gen de la IL-15 fue aislado a partir de monocitos activados con lipopolisacáridos, y se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reactiorí), empleando oligonucleótidos específicos para la mutación en la secuencia de la IL-15. Específicamente se mutaron el Asp 8 y GIn 108 por Ser. Se obtuvo el polipéptido mutado en dichos residuos aminoacídicos, denominado en lo adelante IL-15Mut, con una pureza superior al 95%.
En una materialización de la invención, la composición vacunal comprende un polipéptido que contiene el mutante de IL-1 5 identificado SEQ ID No. 1 (IL-1 5Mut) que se obtiene por la vía del ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante. Para su obtención por esta vía, se pueden emplear los hospederos que son conocidos por los versados en este campo de la técnica, tales como bacterias, levaduras, células de mamíferos, etc.
En una realización de la invención, el polipéptido IL-1 5Mut se obtuvo a partir de E. coli, por lo que no está glicosilado, a diferencia de la proteína autóloga presente en el humano. Esta citocina mutada no es biológicamente activa en el ensayo de proliferación celular en CTLL-2, ya que no es capaz de inducir el crecimiento de estas células, que son dependientes de IL-15. En las células CTLL-2, la IL-15Mut compite con la IL-15 nativa por la unión al receptor, pero no induce señalización por tener mutados los residuos Asp 8 y GIn 108, que son residuos claves en la interacción con la subunidad β y γ del receptor. Este elemento constituye una ventaja con respecto al método propuesto por Santos y colaboradores (Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 2004/032956), en cuanto a una menor ocurrencia de eventos adversos en los pacientes tratados, que se relacionen con la actividad proinflamatoria de esta citocina.
En un aspecto de la presente invención el polipéptido que comprende el mutante de IL-15 identificado como SEQ ID No. 1 , que forma parte de una composición vacunal, es un polipéptido de fusión. En una realización particular, el polipéptido de fusión que contiene el mutante de IL-15 identificado como SEQ ID No. 1 también comprende epítopes T, en una concentración proteica de 200 μg.
En la presente invención se diseñó un mutante de la IL-15 que consiste en la SEQ ID No. 1 , obtenida de forma recombinante, con características moleculares diferentes a la citocina natural, en cuanto a la disposición de los puentes disulfuro. Este elemento favorece el desarrollo de la respuesta inmune por exposición de epítopes crípticos o inmunodominantes.
Para demostrar el concepto planteado, en esta invención se utilizaron primates no humanos, específicamente monos verdes Chlorocebus sabaeus, por ser la especie con mayor homología en la secuencia de aminoácidos de la IL-15 respecto al humano (-97% de similitud) (Grabstein K.H. et al. Science. 1994; 264(5161 ):965-8). Se demostró que la inmunización activa de dichos primates con una composición vacunal que comprende el polipéptido IL-15Mut, identificado como SEQ ID No. 1 , empleando hidróxido de aluminio (denominado indistintamente alúmina) y el adyuvante oleoso Montanide™ ISA-51 , genera una respuesta de anticuerpos que inhiben la actividad biológica de la IL-1 5 nativa, en las células CTLL-2. Esta línea celular, empleada para los ensayos de neutralización, expresa las tres subunidades del receptor de la IL-1 5, y es dependiente de esta citocina para proliferar (Eisenman J. et al. Cytokine. 2002; 20(3):121 -9). En este ensayo, los sueros mostraron una inhibición de la proliferación dosis-dependiente. Esta respuesta es mayor si se compara con el grupo de animales que se inmunizaron con el polipéptido identificado como SEQ ID No. 2, proteína IL-15 obtenida en E. coli. También se demuestra que la inmunización con una mayor dosis del polipéptido de SEQ ID No. 1 (350 μο) genera una mayor respuesta de anticuerpos neutralizantes, desde los 1 5 días posteriores a la segunda inmunización. Este aspecto constituye una ventaja, ya que se alcanza el efecto deseado con un menor número de administraciones de la composición vacunal de la invención.
Teniendo en cuenta el alto por ciento de similitud entre el polipéptido mutado de SEQ ID No. 1 y la IL-15 de simio resulta inesperado que la inmunización con esta proteína mutada genere una respuesta de anticuerpos neutralizantes contra la IL-15 nativa. Sin embargo, en la presente invención se demuestra que la inmunización con el polipéptido mutado identificado como SEQ ID No. 1 genera autoanticuerpos neutralizantes contra la IL-1 5 autóloga. Además, la respuesta de anticuerpos neutralizantes generada por la administración de ese polipéptido (SEQ ID No. 1 ) es mayor que la obtenida tras la inmunización activa con IL-1 5 obtenida por vía recombinante en E. coli (SEQ ID No. 2), lo que es sorprendente.
La composición vacunal de la invención se puede administrar por varias rutas, tal como es conocido por los versados en este campo de la técnica. La cantidad de antígeno vacunal en la composición puede variar, según la enfermedad a tratar. En una materialización de la invención, la cantidad de antígeno (polipéptido que comprende un mutante de la interleucina-15 (IL-15) humana identificado como SEQ ID No. 1 ) se encuentra en el rango de 200-500 μ§ por dosis de vacuna. En el curso de la inmunización del individuo que lo requiere, se pueden administrar reiteradas dosis, y las composiciones pueden contener adyuvantes vacunales que son bien conocidos en la vacunología actual, como las sales de aluminio y las emulsiones de agua en aceite, y otros que se encuentran en desarrollo, con vistas a generar en el paciente los niveles de anticuerpos contra la IL-15 que se requieren.
La invención también revela el uso de un polipéptido que comprende un mutante de la IL-15 humana, identificado como SEQ ID No. 1 , para fabricar un medicamento para la inmunoterapia activa de una enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15. Es bien conocido por los versados en este campo de la técnica aquellas enfermedades que cursan con una expresión aberrante, o sobre-expresión, de la IL- 15.
En una realización de la invención, se hace uso del polipéptido que comprende un mutante de la IL-15 humana, identificado como SEQ ID No. 1 , para fabricar un medicamento para la inmunoterapia activa de una enfermedad autoinmune, seleccionada del grupo compuesto por la AR, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa y la psoriasis.
En otro aspecto de la invención, se utiliza dicho polipéptido para la inmunoterapia activa de una enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15, como las neoplasias hematológicas. En una realización particular la neoplasia hematológica es una leucemia o un linfoma.
La invención también provee un método para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobre-expresión de la IL-15 caracterizado porque comprende la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición vacunal que comprende un polipéptido que contiene un mutante de la interleucina-15 (IL-15) humana identificado como SEQ ID No. 1 . Como se ha expresado, dicha composición vacunal es adecuada para su administración en humanos, y genera una respuesta de anticuerpos neutralizantes contra la IL-15 autóloga.
El método de la invención, que comprende la inmunización activa con la IL-15Mut (de SEQ ID No. 1 ) en una formulación adecuada para generar autoanticuerpos neutralizantes contra la IL-15, posibilita la neutralización de cantidades no reguladas de esta citocina, en pacientes con enfermedades autoinmunes y neoplasias hematológicas. Este método es superior al propuesto en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 2004/032956, si se tiene en cuenta que el antígeno empleado para la inmunización activa carece de actividad biológica. El método de la invención es útil en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobre-expresión de IL-1 5, entre ellas la AR, la psoriasis y la enfermedad inflamatoria intestinal. Particularmente en estas patologías, la generación de anticuerpos que neutralicen la actividad de la citocina IL-1 5 resulta ventajosa. En los pacientes aquejados de esas enfermedades, el método de inmunoterapia activa de la invención se puede combinar con la administración de otros medicamentos, como los antiinflamatorios o antagonistas de otras citocinas. Dentro de esos medicamentos están, por ejemplo, los medicamentos esteroideos, como los corticosteroides, y los modificadores del curso de la enfermedad (como el metotrexato).
El método de la invención es útil, además, en el tratamiento de enfermedades como las neoplasias hematológicas, dentro de las que se encuentran las leucemias y los linfomas. En dicho contexto, se puede combinar la inmunoterapia activa que emplea la composición vacunal de la invención con la administración, al individuo que lo requiere, de al menos un citostático farmacéuticamente aceptable.
El método de la invención es ventajoso, ya que los niveles de anticuerpos generados en el propio paciente son más estables en el tiempo que los administrados en una inmunización pasiva. Por otra parte, la frecuencia de aplicación de las composiciones vacunales que comprenden el mutante de IL-15 es mucho menor que en una inmunización pasiva con anticuerpos contra la citocina (en el método de la invención están espaciadas por un mayor intervalo de tiempo). Además, la cantidad de proteína por dosis, y la cantidad de administraciones que se requieren para la vacunación, son inferiores a las que se requieren para el tratamiento con moléculas antagonistas de IL-15, lo que implica un menor costo de producción, y mayor adherencia de los pacientes al tratamiento.
La inmunización con el polipéptido identificado como SEQ ID No. 1 genera anticuerpos con una mayor capacidad neutralizante que los obtenidos en el grupo que se inmunizó con la proteína recombinante de SEQ ID No. 2. La utilización de un antígeno que no es biológicamente activo resulta en una menor frecuencia de eventos no deseados en los pacientes tratados con la vacuna que lo contiene.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Estado de pureza de la IL-15Mut. Se muestran los perfiles cromatográficos obtenidos mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC, del inglés reversed phase-high performance liquid chromatography) de: (A) la IL-15Mut y (B) la IL-15 recombinante obtenida en E. coli, usadas como antígeno en la preparación vacunal.
Figura 2. Evaluación de la actividad biológica de la IL-15Mut mediante el ensayo de proliferación en CTLL-2. (A) Proliferación celular inducida por diluciones seriadas de la IL-15 nativa (R&D), IL-15Mut, IL-1 5 recombinante obtenida en E. coli. (B). Curva de proliferación celular en presencia de diluciones seriadas de la IL-15Mut con una concentración fija de la IL-1 5 nativa.
Figura 3. Evaluación mediante ensayo inmunoenzimático en fase sólida (ELISA, del inglés enzyme-linked immunosorbent assay), de la respuesta de anticuerpos anti-IL- 15 en los monos inmunizados con IL-15Mut e IL-15 recombinante, usando hidróxido de aluminio (A) y Montanide™ ISA-51 (B) como adyuvantes. En los gráficos, se representa la media de los valores del título de anticuerpos de los tres animales de cada grupo experimental, correspondientes a 15 días después de la segunda y de la tercera inmunización.
Figura 4. Evaluación en las células CTLL-2 de la capacidad neutralizante de los sueros individuales de los animales inmunizados, después de la tercera inmunización, empleando el adyuvante alúmina. (A) Grupo IL-1 5, (B) Grupo IL- 15Mut a la dosis de 200 μg, (C) Grupo IL-15Mut a la dosis de 350 g, y (D) grupo placebo. La línea denominada Dilución IL-15 nativa representa el máximo valor de proliferación celular. La línea denominada Mínimo representa el mínimo valor de proliferación correspondiente a células crecidas en medio de cultivo sin citocina. Figura 5. Evaluación en las células CTLL-2 de la capacidad neutralizante de la mezcla de los sueros de los animales inmunizados con la IL-15Mut y la IL1 5 recombinante. Se muestra el efecto neutralizante de cada grupo, 15 días después de la segunda y tercera inmunización, usando el adyuvante hidróxido de aluminio (A) o Montanide™ (B). La línea denominada Dilución IL-15 nativa representa el máximo valor de proliferación celular. La línea denominada Mínimo representa el mínimo valor de proliferación correspondiente a células crecidas en medio de cultivo sin citocina. Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización
Ejemplo 1. Obtención del polipéptido IL-15Mut en E. coli.
El ADN que codifica para la IL-15 humana fue aislado por RT-PCR (del inglés reverse transcription - polymerase chain reaction, transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa) de monocitos activados con lipopolisacáridos, y se amplificó mediante PCR (Ta 60°C, 25 ciclos), usando oligonucleótidos específicos para la mutación del Asp 8 y Gln 108 por Ser en la secuencia de la IL-1 5 (oligonucleótido 5' CAT GCC ATG GCA AAC TGG GTG AATGTA ATA AGT TCT TTG AAA y oligonucleótido 3' C GGGATCCCG TTA AGA AGT GTT GAT GAA CAT AGA GAC AAT). La banda de PCR se digirió con Neo 1/BamH I (Promega, EUA), y se clonó en un vector de expresión en E. coli. La IL-1 5Mut, obtenida como cuerpos de inclusión, fue extraída de la fracción insoluble con urea 8M. El proceso de renaturalización se llevó a cabo en una columna de 1 ,6x40 cm (GE Healthcare Life Sciences, EUA), empacada con Sephadex G-25 Fine (Pharmacia Biotech, Suecia) y equilibrada en tampón Tris 0,1 M y NaCI 0,1 5 M; pH 8,0; a razón de 7 mL/min. La muestra colectada se aplicó a una columna de 1 ,6x10cm (GE Healthcare, EUA) empacada con Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, EUA), usando un gradiente lineal de elución desde 0,2 M hasta 0,5 M de NaCI, a razón de 2 mL/min. La fracción correspondiente a la elución con 0,5M de NaCI se aplicó a una columna C4 (1 0 μΜ, 1 x25 cm, Vydac, EUA), a razón de 1 mL/min. Las proteínas se separaron usando una fase móvil que contenía ácido trifluoroacético (TFA) 0,1 % y acetonitrilo (AcN) grado HPLC, usando el siguiente gradiente: 0-30% 5 min; 30% 10 min; 30-40% 5 min; 40-50% 30 min; 50-60% 60 min; 60-80% 5 min a 2,5 mL/min. La separación fue monitoreada a 226 nm. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford, siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína IL-15 sin mutaciones también se obtuvo de forma recombinante en E. coli, según se ha descrito anteriormente (Santos-Savio A. et al. Biotecn Aplic. 2000, 17:221 -4).
Ejemplo 2. Determinación de la pureza de la IL-15Mut mediante RP-HPLC.
Las muestras colectadas de los picos principales de la purificación en RP-HPLC se chequearon para estimar el porciento de pureza. La concentración de proteína se determinó mediante el método de Lowry modificado, con el juego de reactivos "Modified Lowry Protein Assay Kif (Thermo Scientific, EUA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aplicaron 50 pg de cada muestra en una columna Chromolith Performance C8 (4.6 x 100 mm, 2 μιη, Merck, EUA) con un gradiente de 0-80% de AcN/TFA 0,1 % en 15 min, a un flujo de 2,5 mL/min. La señal se detectó a 226 nm. La determinación de la pureza se realizó mediante el programa Image J v1 .32. La IL-15Mut se obtuvo con una pureza del 96%, según se aprecia en la Figura 1 , mientras que la IL-15 recombinante sin mutar se obtuvo con un 98% de pureza.
Ejemplo 3. Evaluación de la actividad biológica de la IL-15Mut en la línea celular CTLL-2.
Con el objetivo de evaluar la actividad biológica de la IL-15Mut se utilizó el ensayo de proliferación en la línea celular CTLL-2. La actividad biológica fue medida por estimulación de la proliferación de estas células, empleando la tinción mitocondrial con bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliob (MTT, del inglés 3-[4,5- Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromidé) (Mossman T. J. Immunol. Methods. 1983; 65(1 -2):55-63), siguiendo el procedimiento descrito a continuación. Se realizaron diluciones seriadas de la IL-15 recombinante, de la IL-15 nativa (R&D, EUA) y de la IL-15Mut, a partir de una concentración de 25 ng/mL, en una placa de cultivo de 96 pocilios (Costar, EUA), en un volumen de 50 pL de medio RPMI, suplementado con suero fetal bovino (SFB) 10% y gentamicina 50 pg/mL. Adicionalmente, se realizaron diluciones seriadas de la IL-15 mutada a partir de 6 pg/mL, en 30 pL de medio RPMI suplementado. Las diluciones de la IL-15Mut se co-incubaron con 300 pg/mL de la IL-15 nativa, en un volumen de 20 pL. Las células CTLL-2 se lavaron previamente 5 veces con medio RPMI, y se adicionaron a la placa, a razón de 5x103 células por pocilio, en un volumen de 50 pL. Se incubó por 72 h a 37°C, 5% de C02 y 98% de humedad relativa. La viabilidad celular se determinó mediante tinción con MTT. La IL-15Mut no fue biológicamente activa, ya que no indujo la proliferación de las células CTLL-2, a diferencia de la IL-15 recombinante (SEQ ID No. 2) y de la IL-15 nativa, que estimularon una proliferación dosis-dependiente (Figura 2).
Ejemplo 4. Esquema de inmunización en monos verdes.
Los animales, monos verdes {Chlorocebus sabaeus), se dividieron en 6 grupos, de 3 animales cada uno: un grupo placebo, que recibió solución de tampón fosfato salino (PBS) en adyuvante hidróxido de aluminio (Brenntag Biosector, Dinamarca), un grupo inmunizado con 200 pg del polipéptido identificado como SEQ ID No. 2 adyuvada en hidróxido de aluminio (grupo IL-15), y otros dos grupos, que recibieron 200 pg o 350 pg del polipéptido identificado como SEQ ID No. 1 , combinado con hidróxido de aluminio, que en ambos casos fue a una concentración de 1 .8 mg/mL. Además, se incluyeron otros dos grupos experimentales, inmunizados con 200 pg del polipéptido identificado como SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, en adyuvante Montanide™ ISA-51 , (50:50 v/v). La administración del inmunógeno se realizó por vía subcutánea, en varios sitios de la región interescapular, inoculando un volumen total de 500 μΙ_. Se realizaron 3 inmunizaciones, espaciadas por un periodo de 15 días entre la primera y la segunda, y dos meses entre la segunda y la tercera inmunización. Se tomaron muestras de sangre, para obtener el suero, antes de comenzar el esquema de inmunización (suero preinmune) y 15 días después de la segunda y tercera inmunización. El suero obtenido se descomplementó, por incubación a 56°C durante 30 min. Durante el esquema, se tomaron los signos vitales, la temperatura, el ritmo cardíaco y el peso corporal de los animales.
Ejemplo 5. Determinación de anticuerpos anti-IL-15 en el suero de los animales inmunizados.
La determinación de anticuerpos anti-ll-15 se hizo mediante un sistema indirecto tipo ELISA, donde la placa se recubrió con el polipéptido identificado como SEQ ID No. 2 (1 pg/mL) en PBS, y se incubó durante 16 horas a 25QC. Se bloqueó con albúmina de suero bovino (BSA, del inglés bovine serum albumin) (Sigma-Aldrich, EUA) al 1%, en PBS durante 90 min a 37°C. Se lavó 3 veces con solución de lavado (PBS 1x + Tween 20 al 0,05%). Se realizaron diluciones seriadas de los sueros descomplementados, a partir de 1 :5 000 en PBS; Tween 20 0,05% y BSA 0,01 % y se aplicaron 100 pL por pocilio del suero diluido, incubando 90 min a 37°C. Se lavó 3 veces, y se adicionó el conjpgado anti-Fc de la IgG humana conjpgado a peroxidasa (dilución 1 :10 000 en PBS). Se incubó durante 1 h a 37°C. Se realizaron 5 lavados y se añadió el sustrato de la peroxidasa (100 pL por pocilio). La reacción se detuvo aproximadamente a los 15 min, con 50 pL de H2S04 0,5 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un equipo lector de placas. El título de anticuerpos se consideró como la dilución del suero que corresponde al menos con el doble del valor de la densidad óptica (DO) a 450 nm del suero preinmune de cada animal a la menor dilución. Los datos fueron procesados utilizando el programa GraphPad Prism 6. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3, que indica que la inmunización activa con el polipéptido mutado de IL-15, correspondiente a la SEQ ID No. 1 , genera una respuesta de anticuerpos anti-IL-15, tanto cuando se emplea el adyuvante alúmina como el Montanide™.
Ejemplo 6. Determinación de la capacidad neutralizante de los sueros de animales inmunizados.
La determinación se hizo mediante el ensayo de proliferación celular en la línea CTLL-2. Esta línea, dependiente de IL-2, también prolifera en presencia de IL-15 (máximo de proliferación se considera la alcanzada en células tratadas con dicha citocina nativa, a 300 pg/mL), mientras que en ausencia de la citocina las células no proliferan (mínimo: células crecidas en medio de cultivo sin IL-15). En este ensayo las moléculas que se unen a la IL-15 e impiden la traducción de la señal, a través de su receptor, se detectan porque inhiben la proliferación de esta línea.
Para evaluar la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en el suero de los monos, se realizaron diluciones seriadas de los sueros descomplementados (dilución inicial 1 :100), en una placa de cultivo de 96 pocilios en un volumen de 30 pL de medio RPMI, suplementado con SFB 10% y gentamicina (50 pg/mL). Se adicionaron 20 pL de IL-15 nativa (300 pg/mL) por pocilio, y se incubó a 37°C durante 30 min. Las células CTLL-2 se lavaron previamente 5 veces con medio RPMI, y se adicionaron a la placa a razón de 5x103 células por pocilio, en un volumen de 50 pL. Se incubó por 72 h a 37°C, 5% de C02 y 98% de humedad relativa (Rodríguez Y. et al., Biotecnología Aplicada. 2014; 31 : 291 -6). Se usó como control positivo un anticuerpo neutralizante anti-IL-15 (Mab 2471 , R&D, EUA), en diluciones seriadas a partir de una concentración inicial de 1 pg/mL. La viabilidad celular se determinó mediante tinción con MTT. La dilución inhibitoria media (Dl50), o título de neutralización, se expresó como la dilución del suero requerida para inhibir la proliferación celular en al menos un 50%, y se determinó a través del programa Curve Expert Versión 1 .3.8.0. En los resultados mostrados en la Figura 4 se observa la inhibición que producen los anticuerpos del suero de animales inmunizados con el polipéptido de SEQ ID No. 1 (IL-15Mut) y la SEQ ID No. 2 (IL-15 recombinante), con el adyuvante hidróxido de aluminio, sobre la proliferación inducida por la IL-15 nativa en las células CTLL-2. Los valores de Dl50, del suero de los animales individuales dentro de cada grupo experimental (3 animales por grupo) se reflejan en la Tabla 1. Si se comparan los títulos de neutralización de los animales que recibieron la misma dosis (200 μg) de IL-1 5Mut (SEQ ID No. 1 ) y de IL-15 recombinante (SEQ ID No. 2), se aprecia que son mayores para la citocina mutada.
Tabla 1. Valores de Dl50 del suero de los animales, correspondientes a 1 5 días después de la tercera inmunización.
Inmunógeno/Dosis Animal Título de neutralización
(DI»)
IL- 15/200 μQ 1 1946
IL- 15/200 μς 2 859
IL- 15/200 μQ 3 280
IL-15Mut/200 μQ 1 3547
IL-15Mut/200 μQ 2 809
IL-15Mut/200 μβ 3 3238
IL-15Mut/350 μQ 1 2273
IL-15Mut/350 μQ 2 5218
IL-15Mut/350 μQ 3 1 171
La Figura 5 muestra la capacidad neutralizante de la mezcla de los sueros de los animales inmunizados con la IL-15Mut y la IL15 recombinante, determinada en las células CTLL-2. Los sueros corresponden a los 1 5 días después de la segunda y tercera inmunización, empleando el adyuvante hidróxido de aluminio o Montanide™. Se aprecia que los sueros poseen capacidad neutralizante después de la tercera inmunización, cuando se administran 200 μg de IL-1 5Mut e IL-15 recombinante. Sin embargo, los sueros correspondientes a la dosis de 350 μg mostraron capacidad neutralizante a los 15 días después de la segunda administración.
La Tabla 2 recoge los valores de Dl50 de la mezcla de sueros correspondientes a 15 días después de la segunda y la tercera inmunización. Se muestra el título de neutralización para los tres grupos experimentales. Se demuestra que la inmunización con una mayor dosis (350 g) de la IL-15Mut (SEQ ID No. 1 ) genera una mayor respuesta neutralizante, desde los 15 días posteriores a la segunda inmunización, cuando se utiliza alúmina como adyuvante. Este aspecto constituye una ventaja, teniendo en cuenta que se podría alcanzar el efecto deseado con un menor número de administraciones. En los grupos inmunizados con el adyuvante Montanide™, donde se comparó la dosis de 200 μg, los valores de Dl50 para la IL- 15Mut también son superiores a los alcanzados para la IL-15 recombinante, tanto después de segunda como de tercera administración.
Tabla 2. Valores de Dl50 de la mezcla de sueros, correspondientes a 1 5 días después de la segunda y la tercera inmunización.
Figure imgf000016_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1 ) Una composición vacunal caracterizada porque comprende un polipéptido que contiene un mutante de la interleucina-15 (IL-1 5) humana identificado como SEQ ID No. 1 , al menos un adyuvante vacunal y excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
2) La composición vacunal según la reivindicación 1 caracterizada porque el polipéptido que contiene el mutante de IL-1 5 identificado SEQ ID No. 1 se obtiene por la vía del ADN recombinante.
3) La composición vacunal según la reivindicación 1 caracterizada porque el polipéptido que contiene el mutante de IL-15 identificado como SEQ ID No. 1 es un polipéptido de fusión.
4) La composición vacunal según la reivindicación 3 caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende epítopes T.
5) Uso de un polipéptido que comprende un mutante de la interleucina-15 (IL- 15) humana identificado como SEQ ID No. 1 para fabricar un medicamento para la inmunoterapia activa de una enfermedad relacionada con la sobre- expresión de la IL-15.
6) El uso de la reivindicación 5 caracterizado porque la enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 es una enfermedad autoinmune que se selecciona del grupo compuesto por la artritis reumatoide (AR), la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa y la psoriasis.
7) El uso de la reivindicación 5 caracterizado porque la enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 es una neoplasia hematologica.
8) El uso de la reivindicación 7 caracterizado porque la neoplasia hematologica es una leucemia o un linfoma.
9) Un método para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sobre- expresión de la interleucina-15 (IL-1 5) caracterizado porque comprende la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición vacunal que comprende un polipéptido que contiene un mutante de la interleucina-1 5 (IL-15) humana identificado como SEQ ID No. 1 .
10) El método de la reivindicación 9 caracterizado porque la enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 es una enfermedad autoinmune que se selecciona del grupo compuesto por la artritis reumatoide (AR), la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa y la psoriasis.
1 1 ) EI método de la reivindicación 9 caracterizado porque la enfermedad relacionada con la sobre-expresión de la IL-15 es una neoplasia hematológica.
12) El método de la reivindicación 1 1 caracterizado porque la neoplasia hematológica es una leucemia o un linfoma.
13) El método según la reivindicación 10 caracterizado porque adicionalmente se administran al individuo medicamentos antiinflamatorios o antagonistas de otras citocinas.
14) El método según la reivindicación 1 1 caracterizado porque adicionalmente se administra al individuo al menos un citostático farmacéuticamente aceptable.
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