CN110300762B - 包含人白介素-15的突变体的疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含人白介素‑15(IL‑15)的突变体的疫苗组合物。本发明还涉及所述人IL‑15突变型多肽在制备药物中的用途，所述药物用于与IL‑15的过表达相关的疾病的主动免疫疗法，所述与IL‑15的过表达相关的疾病包括某些自身免疫疾病和血液学瘤形成。向有此需要的个体施用治疗有效量的包含本发明的人IL‑15突变型多肽的疫苗是一种用于治疗与IL‑15的过表达相关的疾病的方法。
Description
发明领域
本发明涉及生物技术、免疫学和制药工业的领域，特别地涉及用包含经突变的白介素-15(IL-15)的多肽进行主动免疫接种，以用于治疗与IL-15的过表达相关的疾病。
现有技术
称为IL-15的细胞因子是一种14-15kDa的糖蛋白，其被两个小组同时鉴定为一种激活T细胞的因子(Grabstein,K.H.等人,Science1994,264:965-8；Burton,J.D.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994,91(11):4935-9)。IL-15的信使核糖核酸(RNA)(mRNA)存在于各种各样的细胞和组织中，但是在表达转录物的细胞中或在这些细胞的培养物上清液中很少发现该蛋白质，这是因为在翻译和细胞内运输的水平上存在强的对于其表达的转录后控制(Bamford R.N.等人,J.Immunol 1998,160:4418-26；Kurys G.等人,J Biol Chem2000,275:30653-9)。
IL-15的生物学效应是通过与在细胞膜上的受体(其由三个亚基α、β和γ组成)的结合来介导的。α亚基(IL-15Rα)特异于该细胞因子，它与该细胞因子以非常高的亲和力相结合(10-11的Kd)。β亚基与IL-2共享，并且γ亚基是几种细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21)的共同受体(Burton J.D.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994,91(11):4935-9；Giri J.G.等人,EMBO J.1995,14:3654-63)。
IL-15是一种免疫刺激性细胞因子，其促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖和功能活性(Giri,J.G.等人,EMBO J.1994,13,2822-30)，激活嗜中性粒细胞，并且改变单核因子的分泌(Girard D.等人,Blood.1996,88:3176-84；Alleva D.G.等人,J.Immunol.1997,159(6):2941-51)。此外，它还诱导CD56+NK细胞的增殖，并且在干扰素(IFN)γ和肿瘤坏死因子(TNFα)的诱导中与IL-12一起起作用(Ross M.E.和Caligiuri M.A.Blood.1997,89:910-8；Fehniger T.A.等人,Transplant Proc.1999,31:1476-8)。
IL-15的不受调控的表达或过表达与几种疾病的发展相关，这些疾病包括克罗恩病(Kirman I.和Nielsen O.H.Am.J.Gastroenterol.1996,91(9):1789-94)、银屑病(Rückert R.等人,J.Immunol.2000,165:2240-50)、白血病(Yamada Y.等人,Blood.1998,91:4265-72；Yamada Y和Kamihira S.Leuk Lymphoma.1999,35(1-2):37-45)和类风湿性关节炎(RA)(McInnes IB.Immunology Today.1998,19:75-9)。
以前的研究暗示，在细胞因子级联中，IL-15领先于TNFα，其作为在T细胞向滑液迁移中的重要因子起作用(Feldmann M.等人,Annu Rev Immunol.1996,14:397-440；McInnesI.B.等人,Nat Med.1997,3:189-95)。另外，Ziolkowska等人描述了，IL-15诱导在具有RA的患者的关节中IL-17的表达，刺激炎症介体例如IL-6、IL-8、粒细胞和巨噬细胞的生长因子(GM-CSF)和前列腺素E2的释放，这暗示IL-15在RA的发病机理中发挥重要作用(ZiolkowskaM.等人,J Immunol.2000,164:2832-8)。
IL-15的拮抗剂分子的使用已在动物模型中显示出是有效的。Ruchatz等人产生了鼠类受体的α亚基的可溶性片段，并证明该片段的施用在DBA/1小鼠中抑制由胶原诱导的关节炎(CIA)(Ruchatz H.J.Immunol.1998,160:5654-60)。
其他的IL-15的拮抗剂分子(包括在一个或多个氨基酸残基处的其突变体，和与IL-15相结合并且阻止通过受体的信号转导的单克隆抗体)已受到专利保护(专利号：US6001973、US6177079、US6168783、US6013480)。虽然在前面提及的专利文献中出现了其应用，但是在文献中存在很少的担保其有效性的研究。
2002年5月，Genmab公司宣布了抗-IL-15抗体(HuMax-IL-15)的I和II期临床研究(专利号US6177079)。虽然治疗被良好地耐受，但是在涉及110名具有RA的患者的II期研究中未证明显著的效力(Baslund B.等人,Arthritis&Rheumatism.2005,52:2686-92)。
用由IL-15的突变体和免疫球蛋白的Fc片段组成的嵌合蛋白(其与表达IL-15的受体的细胞相结合)进行了其他研究。命名为CRB-15的该融合蛋白已被证明在CIA的鼠类模型中是有效的，其中报道到用CRB-15进行的治疗降低该疾病的发生率和严重度，并且一旦建立，就阻止关节炎的进展(Ferrari-Lacraz S.等人,J Immunol 2004,173(9):5818-26)。
2003年，Santos等人提出了一种疫苗接种方法，其包括用在大肠杆菌(Escherichia coli)中获得的IL-15进行主动免疫接种(国际专利申请公开号WO 2004/032956)。但是，在那种宿主中获得的蛋白质是在生物学上有活性的，因为它促进依赖于IL-2和IL-15的CTLL-2细胞系的增殖(Santos-Savio A.等人,Biotecn Aplic.2000,17:221-4)。该因素是一个缺点，考虑到被释放并进入循环的少量免疫原将会引发不希望的应答。已知，在生理条件下，该细胞因子是记忆T细胞的生长因子(Kanai T等人,J Immunol.1996,157(8):3681-7；Kanegane H.和Tosato G.Blood.1996,88(1):230-5)。在RA中的炎症过程以T细胞的激活和被募集至滑液为特征(Wilkinson P.C.和Liew F.Y.Exp Med.1995,181:1255-9)，因此用有活性的IL-15分子进行免疫接种可能对于该疾病的发展做出贡献。
仍然令人感兴趣的是获得用于与IL-15的过表达相关的疾病的主动免疫疗法的疫苗，其提供相对于在该类型的疾病的治疗中现存的疗法而言的治疗优点。
发明详述
本发明通过提供一种疫苗组合物而解决了前面提出的问题，所述疫苗组合物的特征在于，其包含含有被标识为SEQ ID No.1的人IL-15的突变体的多肽、至少一种疫苗佐剂和在药学上可接受的赋形剂或载料。
从用脂多糖激活的单核细胞中分离出IL-15的基因，并且采用用于在IL-15的序列中进行突变的特异性寡核苷酸，通过聚合酶链反应(PCR)对其进行扩增。特别地，将Asp8和Gln108突变为丝氨酸。以超过95％的纯度获得在所述氨基酸残基处进行突变的多肽，其在此后被命名为IL-15Mut。
在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物包含通过重组脱氧核糖核酸(DNA)途径而获得的含有被标识为SEQ ID No.1的IL-15的突变体的多肽(IL-15Mut)。为了通过该途径来获得其，可以采用本领域技术人员已知的宿主，例如细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
在本发明的一个实施方案中，多肽IL-15Mut是从大肠杆菌中获得的，因此没有被糖基化，这与在人中存在的自体蛋白质不同。该经突变的细胞因子在CTLL-2上的细胞增殖测定法之中不是在生物学上有活性的，因为它不能够诱导这些细胞的生长，其是依赖于IL-15的。在CTLL-2细胞中，IL-15Mut与天然IL-15竞争与受体的结合，但是由于已经使残基Asp8和Gln108(其是在与受体的β和γ亚基的相互作用中的关键残基)进行了突变而不诱导信号传导。该因素是相对于由Santos等人所提出的方法(国际专利申请公开号WO 2004/032956)而言的一个优点，关于在所治疗的患者中与该细胞因子的促炎活性相关的不利事件的较少发生。
在本发明的一个方面，构成疫苗组合物的一部分的所述含有被标识为SEQ IDNo.1的IL-15的突变体的多肽为融合多肽。在一个特别的实施方案中，所述含有被标识为SEQ ID No.1的IL-15的突变体的融合多肽还以200μg的蛋白质浓度包含T表位。
在本发明中，设计了以重组方式获得的由SEQ ID No.1组成的IL-15的突变体，其在关于二硫桥的布置方面具有不同于天然细胞因子的分子特征。该因素通过暴露隐蔽或免疫显性表位而有利于免疫应答的发展。
为了证明所提出的构思，在本发明中使用了非人灵长类动物，尤其是绿猴(Chlorocebus sabaeus)，这是由于它是相对于人而言在IL-15的氨基酸序列中具有最高同源性(～97％的相似性)的物种(Grabstein K.H.等人,Science.1994,264(5161):965-8)。证明了，通过采用氢氧化铝(不加区别地称为氧化铝)和含油佐剂MontanideTM ISA-51，用包含被标识为SEQ ID No.1的多肽IL-15Mut的疫苗组合物对所述灵长类动物进行主动免疫接种在CTLL-2细胞中产生了抑制天然IL-15的生物学活性的抗体应答。被用于中和测定法的该细胞系表达IL-15的受体的三个亚基，并且依赖于该细胞因子来进行增殖(Eisenman J.等人,Cytokine.2002,20(3):121-9)。在该测定法中，血清显示出剂量依赖性的增殖抑制。该应答是更高的，如果与用被标识为SEQ ID No.2的多肽(在大肠杆菌中获得的IL-15蛋白)进行免疫接种的动物组相比较。还证明了，用更高剂量(350μg)的SEQ ID No.1的多肽进行免疫接种产生更大的中和抗体应答，从第二次免疫接种后15天起。该方面是一个优点，因为用更少次数的本发明的疫苗组合物的施用实现了所希望的效果。
考虑到在SEQ ID No.1的经突变的多肽与猿猴的IL-15之间的高的相似性百分比，用该经突变的蛋白质进行免疫接种产生了针对天然IL-15的中和抗体应答是出人意料的。但是，在本发明中证明，用被标识为SEQ ID No.1的经突变的多肽进行免疫接种产生了针对自体IL-15的中和自身抗体。此外，通过施用那种多肽(SEQ ID No.1)而产生的中和抗体应答比在用在大肠杆菌中通过重组途径获得的IL-15(SEQ ID No.2)进行主动免疫接种之后所获得的那种更大，这是令人惊讶的。
本发明的疫苗组合物可以通过几种途径来进行施用，正如本领域技术人员所已知的。在所述组合物中疫苗抗原的量可以根据待治疗的疾病而变化。在本发明的一个实施方案中，抗原(含有被标识为SEQ ID No.1的人白介素-15(IL-15)的突变体的多肽)的量在200-500μg/剂疫苗的范围内。在有此需要的个体的免疫接种过程中，可以施用重复剂量，并且所述组合物可以包含在目前的疫苗接种学中众所周知的疫苗佐剂，例如铝盐和油包水乳状液，和处于开发中的其他佐剂，以便在患者中产生所需要的针对IL-15的抗体水平。
本发明还揭示了含有被标识为SEQ ID No.1的人IL-15的突变体的多肽在制备药物中的用途，所述药物用于与IL-15的过表达相关的疾病的主动免疫疗法。随着IL-15的异常表达或过表达一起经常出现的那些疾病是本领域技术人员所熟知的。
在本发明的一个实施方案中，使用含有被标识为SEQ ID No.1的人IL-15的突变体的多肽来制备药物，所述药物用于从由下列各项组成的组中选择的自身免疫疾病的主动免疫疗法：RA、克罗恩病、溃疡性结肠炎和银屑病。
在本发明的另一个方面，将所述多肽用于与IL-15的过表达相关的疾病(例如血液学瘤形成)的主动免疫疗法。在一个特别的实施方案中，所述血液学瘤形成为白血病或淋巴瘤。
本发明还提供了用于治疗与IL-15的过表达相关的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有此需要的个体施用治疗有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含含有被标识为SEQ ID No.1的人白介素-15(IL-15)的突变体的多肽。如已陈述的，所述疫苗组合物适合于在人中进行施用，并且产生针对自体IL-15的中和抗体应答。
本发明的方法(其包括用在合适的制剂中的IL-15Mut(SEQ ID No.1)进行主动免疫接种以产生针对IL-15的中和自身抗体)使得能够在具有自身免疫疾病或血液学瘤形成的患者中中和不受调控的量的该细胞因子。该方法优于在国际专利申请公开号WO 2004/032956中所提出的方法，如果考虑到用于主动免疫接种的抗原缺乏生物学活性。
本发明的方法在治疗与IL-15的过表达相关的疾病(包括RA、银屑病和炎症性肠病)中是有用的。特别地，在这些病理学状况中，中和细胞因子IL-15的活性的抗体的产生是有利的。在罹患这些疾病的患者中，可以将本发明的主动免疫疗法方法与其他药物(例如抗炎药或其他细胞因子的拮抗剂)的施用相组合。在这些药物中包括，例如，类固醇药物例如皮质类固醇，和疾病过程的修饰剂(例如，氨甲蝶呤)。
此外，本发明的方法在治疗疾病例如血液学瘤形成(其中包括白血病和淋巴瘤)中也是有用的。在所述情景下，可以将采用本发明的疫苗组合物的主动免疫疗法与向有此需要的个体施用至少一种在药学上可接受的细胞生长抑制剂相组合。
本发明的方法是有利的，因为在患者自身中产生的抗体水平随时间比在被动免疫接种中所施用的那些更稳定。另一方面，包含IL-15的突变体的疫苗组合物的施加频次比在用针对该细胞因子的抗体进行的被动免疫接种中低得多(在本发明的方法中，它们以更大的时间间隔来隔开)。此外，每剂的蛋白质的量以及对于疫苗接种来说所需要的施用量比对于用IL-15的拮抗剂分子进行的治疗来说所需要的量低，这意味着更低的生产成本和患者对于治疗的更高的依从性。
用被标识为SEQ ID No.1的多肽进行免疫接种产生具有比在用SEQ ID No.2的重组蛋白质进行免疫接种的组中所获得的那些更大的中和能力的抗体。使用在生物学上没有活性的抗原导致在用包含其的疫苗进行治疗的患者中更低频率的不希望事件。
附图简述
图1.IL-15Mut的纯度状况。显示了在疫苗制备物中用作抗原的下述组分的通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)而获得的色谱特性谱图：(A)IL-15Mut；和(B)在大肠杆菌中获得的重组IL-15。
图2.通过在CTLL-2上的增殖测定法来评价IL-15Mut的生物学活性。(A)通过天然IL-15(R&D)、IL-15Mut、在大肠杆菌中获得的重组IL-15的系列稀释物所诱导的细胞增殖。(B)在具有固定浓度的天然IL-15的IL-15Mut的系列稀释物存在下的细胞增殖曲线。
图3.通过固相免疫酶测定法(酶联免疫吸附测定法(ELISA))来评价在用IL-15Mut和重组IL-15进行免疫接种的猴中的抗-IL-15抗体应答，其中使用氢氧化铝(A)和MontanideTM ISA-51(B)作为佐剂。在所述图中描绘了相应于在第二次和第三次免疫接种后15天的每个实验组中三只动物的抗体滴度值的平均值。
图4.通过采用氧化铝这一佐剂，在第三次免疫接种后，在CTLL-2细胞中评价经免疫接种的动物的个体血清的中和能力。(A)IL-15组，(B)以200μg的剂量的IL-15Mut组，(C)以350μg的剂量的IL-15Mut组，和(D)安慰剂组。名称为“天然IL-15稀释物”的线表示细胞增殖的最大值。名称为“最小”的线表示增殖的最小值，其相应于在没有细胞因子的培养基中生长的细胞。
图5.在CTLL-2细胞中评价用IL-15Mut和重组IL-15进行免疫接种的动物的血清的混合物的中和能力。显示了在第二次和第三次免疫接种后15天每个组的中和效应，其中使用氢氧化铝(A)或MontanideTM(B)这样的佐剂。名称为“天然IL-15稀释物”的线表示细胞增殖的最大值。名称为“最小”的线表示增殖的最小值，其相应于在没有细胞因子的培养基中生长的细胞。
实施方案的详细描述/实施例
实施例1.在大肠杆菌中获得多肽IL-15Mut
通过RT-PCR(反转录聚合酶链反应)从用脂多糖激活的单核细胞中分离出编码人IL-15的DNA，并且使用用于在IL-15的序列中将Asp 8和Gln 108突变成Ser的特异性寡核苷酸(5′寡核苷酸CAT GCC ATG GCA AAC TGG GTG AATGTA ATA AGT TCT TTG AAA和3′寡核苷酸C GGGATCCCG TTA AGA AGT GTT GAT GAA CAT AGA GAC AAT)，通过PCR(Ta 60℃，25个循环)对其进行扩增。将PCR条带用Nco I/BamH I(Promega,USA)进行消化，并且克隆到大肠杆菌表达载体中。用8M尿素从可溶性级分中提取作为内含体而获得的IL-15Mut。在装填有Sephadex G-25Fine(Pharmacia Biotech,Sweden)并在0.1M Tris缓冲液和0.15M NaCl(pH8.0)中进行平衡的1.6x40cm的柱(GE Healthcare Life Sciences,USA)上，按照7mL/分钟进行复性过程。将所收集的样品施加至装填有Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare,USA)的1.6x10cm的柱(GE Healthcare,USA)，其中使用从0.2M至0.5M NaCl的线性洗脱梯度，按照2mL/分钟。将相应于用0.5M NaCl进行的洗脱的级分施加至C4柱(10μΜ,1x25cm,Vydac,USA)，按照1mL/分钟。使用包含0.1％三氟乙酸(TFA)和HPLC级乙腈(AcN)的流动相，使用下列梯度，以2.5mL/分钟来分开蛋白质：0-30％5分钟；30％10分钟；30-40％5分钟；40-50％30分钟；50-60％60分钟；60-80％5分钟。在226nm处监测分开情况。遵循制造商的说明书，通过Bradford方法来测定蛋白质浓度。还在大肠杆菌中以重组方式获得了没有突变的IL-15蛋白，按照以前已经描述的(Santos-Savio A.等人,Biotecn Aplic.2000,17:221-4)。
实施例2.通过RP-HPLC来测定IL-15Mut的纯度
检查从主要RP-HPLC纯化峰收集的样品以评估纯度百分比。遵循制造商的说明书，用试剂套件“Modified Lowry Protein Assay Kit”(Thermo Scientific,USA)，通过改进的Lowry方法来测定蛋白质浓度。将50μg的每种样品施加在Chromolith Performance C8柱(4.6x100mm,2μm,Merck,USA)上，其中具有在15分钟内0-80％AcN/0.1％TFA的梯度，以2.5mL/分钟的流速。在226nm处检测信号。通过程序Image J v1.32来进行纯度测定。按照在图1中所看出的，以96％的纯度获得IL-15Mut，而以98％的纯度获得没有突变的重组IL-15。
实施例3.在CTLL-2细胞系中评价IL-15Mut的生物学活性
为了评价IL-15Mut的生物学活性，使用在CTLL-2细胞系上的增殖测定法。按照下面所描述的程序，采用用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT)进行的线粒体染色(Mossman T.J.Immunol.Methods.1983,65(1-2):55-63)，通过这些细胞的增殖的刺激来测量生物学活性。在96-孔培养板(Costar,USA)中，在50μL的体积的补充有10％胎牛血清(FBS)和50μg/mL庆大霉素的RPMI培养基中，从25ng/mL的浓度开始，进行重组IL-15、天然IL-15(R&D,USA)和IL-15Mut的系列稀释。另外，在30μL的经补充的RPMI培养基中，从6μg/mL开始，进行经突变的IL-15的系列稀释。在20μL的体积中，将IL-15Mut的稀释物与300pg/mL的天然IL-15一起共温育。事先将CTLL-2细胞用RPMI培养基洗涤5次，并且在50μL的体积中按照5×103个细胞/孔添加至平板。在37℃、5％CO2和98％的相对湿度下温育72小时。通过用MTT进行染色来测定细胞生存力。IL-15Mut不是在生物学上有活性的，因为它不诱导CTLL-2细胞的增殖，这与重组IL-15(SEQ ID No.2)和天然IL-15(它们以剂量依赖性方式刺激增殖)不同(图2)。
实施例4.在绿猴中的免疫接种流程
将动物即绿猴(Chlorocebus sabaeus)分为6个组，每个组3只动物：安慰剂组，其接受在氢氧化铝佐剂(Brenntag Biosector,Denmark)中的磷酸盐盐水缓冲液(PBS)溶液；用200μg的佐以氢氧化铝的被标识为SEQ ID No.2的多肽进行免疫接种的组(IL-15组)；和其他两个组，其接受200μg或350μg的与氢氧化铝(其在这两种情况下均以1.8mg/mL的浓度)相组合的被标识为SEQ ID No.1的多肽。此外，还包括其他两个实验组，其用200μg的在MontanideTM ISA-51佐剂中的被标识为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的多肽(50:50v/v)进行免疫接种。免疫原的施用通过皮下途径在肩胛间区域的几个位点处进行，其中接种500μL的总体积。进行3次免疫接种，在第一次和第二次之间间隔15天的时间段，和在第二次和第三次免疫接种之间间隔两个月。在开始所述免疫接种流程前(免疫前血清)以及在第二次和第三次免疫接种后15天，采集血液样品以用于获得血清。将所获得的血清通过在56℃下温育30分钟来去补体。在所述流程期间，记录动物的生命体征、温度、心率和体重。
实施例5.测定在经免疫接种的动物的血清中的抗-IL-15抗体
通过ELISA类型的间接系统来进行抗-IL-15抗体的测定，其中将平板用在PBS中的被标识为SEQ ID No.2的多肽(1μg/mL)进行包被并且在25℃下温育16小时。将平板用在PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,USA)在37℃下封闭90分钟。用洗涤溶液(1xPBS+0.05％Tween 20)洗涤3次。从1:5,000开始在PBS、0.05％Tween 20和0.01％BSA中进行去补体的血清的系列稀释，并且施加100μL/孔的经稀释的血清，在37℃下温育90分钟。洗涤3次，并且添加与过氧化物酶相缀合的抗人IgG的Fc这一缀合物(在PBS中的1:10,000稀释物)。在37℃下温育1小时。进行5次洗涤，并且添加过氧化物酶的底物(100μL/孔)。大约在15分钟时，用50μL的0.5M H2SO4来终止反应。在平板阅读设备上读取在450nm处的吸光度。将抗体滴度视为这样的血清稀释度，其相应于在最小稀释度下达到每只动物的免疫前血清的在450nm处的光密度(OD)值的至少两倍。数据通过使用程序GraphPad Prism 6来进行加工。所获得的结果显示在图3中，其表明当采用氧化铝和MontanideTM佐剂时，用经突变的IL-15多肽(相应于SEQ ID No.1)进行的主动免疫接种均产生了抗-IL-15抗体应答。
实施例6.测定经免疫接种的动物的血清的中和能力
通过在CTLL-2细胞系上的细胞增殖测定法来进行测定。该细胞系(其依赖于IL-2)在IL-15存在下也进行增殖(最大增殖被认为是在用300pg/mL的所述天然细胞因子进行处理的细胞中所达到的)，而在该细胞因子不存在下所述细胞不增殖(最小：在没有IL-15的培养基中生长的细胞)。在该测定法中，检测出与IL-15相结合并且阻止通过其受体的信号转导的分子，因为它们抑制该细胞系的增殖。
为了评价在猴的血清中存在的抗体的中和能力，在96-孔培养板中，在30μL的体积的补充有10％FBS和庆大霉素(50μg/mL)的RPMI培养基中，进行去补体的血清的系列稀释(初始稀释度1:100)。添加20μL的天然IL-15(300pg/mL)/孔，并且在37℃下温育30分钟。事先将CTLL-2细胞用RPMI培养基洗涤5次，并且在50μL的体积中按照5×103个细胞/孔添加至平板。在37℃、5％CO2和98％的相对湿度下温育72小时(Rodríguez Y.等人,BiotecnologíaAplicada.2014,31:291-6)。使用以从1μg/mL的初始浓度开始的系列稀释物的抗-IL-15中和抗体(Mab 2471,R&D,USA)作为阳性对照。通过用MTT进行染色来测定细胞生存力。将平均抑制稀释度(ID50)或中和滴度表示为对于以至少50％抑制细胞增殖来说所需要的血清稀释度，并且通过程序Curve Expert 1.3.8.0版来进行测定。在图4中所显示的结果之中，观察到用SEQ ID No.1(IL-15Mut)和SEQ ID No.2(重组IL-15)的多肽(与氢氧化铝佐剂一起)进行免疫接种的动物的血清的抗体在CTLL-2细胞中对于由天然IL-15诱导的增殖所产生的抑制。在表1中反映了在每个实验组(3只动物/组)内独个动物的血清的ID50值。如果比较接受相同剂量(200μg)的IL-15Mut(SEQ ID No.1)和重组IL-15(SEQ ID No.2)的动物的中和滴度，那么可以看出对于经突变的细胞因子来说中和滴度是更大的。
表1.相应于在第三次免疫接种后15天的动物的血清的ID50值
图5显示了在CTLL-2细胞中测定的用IL-15Mut和重组IL-15进行免疫接种的动物的血清的混合物的中和能力。所述血清相应于在第二次和第三次免疫接种(采用氢氧化铝或MontanideTM佐剂)后15天。可以看出，当施用200μg的IL-15Mut和重组IL-15时，在第3次免疫接种后血清具有中和能力。但是，在第二次施用后15天，相应于350μg的剂量的血清显示出中和能力。
表2汇集了相应于在第二次和第三次免疫接种后15天的血清混合物的ID50值。显示了关于三个实验组的中和滴度。证明了当使用氧化铝作为佐剂时，自第二次免疫接种后15天起，用更高剂量(350μg)的IL-15Mut(SEQ ID No.1)进行免疫接种产生更大的中和应答。这一方面是一个优点，考虑到用更少的施用次数可以达到所希望的效应。在用MontanideTM佐剂进行免疫接种的组(其中比较了200μg的剂量)中，对于IL-15Mut的ID50值也高于对于重组IL-15所达到的，在第二次和第三次施用后均如此。
表2.相应于在第二次和第三次免疫接种后15天的血清混合物的ID50值
序列表
<110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA
<120> 包含人白介素-15的突变体的疫苗组合物
<130> Vacuna IL-15 mutada
<140> CU 2016-0194
<141> 30.12.2016
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 人白介素-15的突变体
<400> 1
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Ser Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 3
<211> 42
<212> ADN
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 用于获得白介素-15的突变体的5'寡核苷酸
<400> 3
catgccatgg caaactgggt gaatgtaata agttctttga aa 42
<210> 4
<211> 40
<212> ADN
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 用于获得白介素-15的突变体的3'寡核苷酸
<400> 4
cgggatcccg ttaagaagtg ttgatgaaca tagagacaat 40
1
Claims (4)
1.疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含多肽、至少一种疫苗佐剂和在药学上可接受的赋形剂或载料，所述多肽为由SEQ ID No.1组成的人白介素-15(IL-15)的突变体，其中所述至少一种疫苗佐剂选自铝盐和油包水乳状液。
2.包含多肽的疫苗组合物在制备药物中的用途，所述多肽为由SEQ ID No.1组成的人白介素-15(IL-15)的突变体，所述药物用于治疗选自自身免疫疾病和血液学瘤形成的与IL-15的过表达相关的疾病，其中所述自身免疫疾病选自由类风湿性关节炎(RA)、克罗恩病、溃疡性结肠炎和银屑病组成的组，并且其中所述血液学瘤形成为白血病或淋巴瘤。
3.根据权利要求2的用途，其中所述药物另外还与抗炎药物或其他细胞因子的拮抗剂相组合。
4.根据权利要求2的用途，其中所述药物另外还与在药学上可接受的细胞生长抑制剂相组合。
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