BR112019013542A2

BR112019013542A2 - composição de vacina, uso de um polipeptídeo, e, método para o tratamento de doenças associadas à superexpressão da il-15

Info

Publication number: BR112019013542A2
Application number: BR112019013542A
Authority: BR
Inventors: Geronimo Perez Haydeé; Morera Díaz Yanelys; Rodriguez Alvarez Yunier
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2020-02-04
Also published as: ES2892148T3; US20200181254A1; RU2019122635A3; CU20160194A7; CN110300762B; US20220259300A1; MX2019007906A; RU2019122635A; WO2018121802A1; CU24546B1; CN110300762A; RU2745199C2; EP3564264A1; EP3564264B1

Abstract

a invenção refere-se a uma composição de vacina compreendendo um mutante da interleucina-15 humana (il-15). a invenção também refere-se ao uso de dito mutante de polipeptídeo da il-15 humana a fim de produzir um medicamento para a imunoterapia ativa para uma doença relacionada à superexpressão da il-15, incluindo certas doenças autoimunes e neoplasia hematológica. a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina, compreendendo o mutante de polipeptídeo da il-15 humana de acordo com a invenção, a um indivíduo em necessidade, representa um método para o tratamento de doenças relacionadas à superexpressão da il-15.

Description

COMPOSIÇÃO DE VACINA, E, USOS DE UM POLIPEPTÍDEO

Campo da Técnica [001] A presente invenção refere-se ao ramo da biotecnologia, da imunologia e da indústria farmacêutica, em particular com a imunização ativa usando polipeptídeos compreendendo uma interleucina-15 (IL-15) mutada, para o tratamento de doenças associadas à superexpressão da IL-15.

Estado da Técnica Anterior [002] A citocina conhecida como IL-15 é uma glicoproteína de ΜΙ 5 KDa, que foi simultaneamente descrita por dois grupos como um fator de crescimento que ativa as células T (Grabstein KH., et al. Science 1994; 264: 965-8; Burton, JD., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1994; 91: 4935-9). A IL15 mRNA é amplamente expressada em células e tecidos; entretanto, é difícil encontrar a proteína nestas células ou nas células sobrenadantes devido a um forte controle pós-transcricional de sua expressão no nível translacional e no tráfico intracelular (Bamford RN., et al. J. Immunol. 1998; 160: 4418-26; Kurys G., et al. J Biol Chem. 2000; 275: 30653-9).

[003] Os efeitos biológicos da IL-15 são mediados por meio de sua união a um receptor na membrana celular composto de três subunidades: oc, β, e γ. A IL-15Roc é uma subunidade específica e de união de alta afinidade (Kd 10'¹¹) da IL-15, a subunidade β é compartilhada com a IL-2 e a subunidade yé um receptor comum para várias citocinas, tais como: IL-2; IL-4; IL-7; IL-9; IL-15; IL-21 (Bamford RN., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1994; 91: 49359; Giri JG., et al. EMBO J. 1995; 14: 3654-63).

[004] A IL-15 é uma citocina imunoestimuladora que promove a proliferação e a atividade funcional das células T, B e NK (Giri, JG., et al. EMBO J. 1994; 13: 2822-30), ativa neutrófilos e modifica a secreção de monocinas (Girard D., et al. Blood 1996; 88: 3176-84; Alieva DG., et al. J.

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Immunol. 1997; 159: 2941-51). Ademais, esta citocina induz a proliferação das células CD56 NK e age, juntamente com a IL-12, na indução de IFN-γ e no fator de necrose tumoral (TNF)-oc (Ross ME. e Caligiuri MA. Blood 1997; 89: 910-8; Fehniger TA., et al. Transplant Proc. 1999; 31: 1476-8).

[005] A expressão não regulada ou superexpressão da IL-15 tem sido associada com o desenvolvimento de diversas doenças, incluindo a doença de Crohn (Kirman I. e Nielsen OH. Am. J. Gastroenterol. 1996; 91(9): 1789-94), psoríase (Rückert R., et al., J. Immunol. 2000; 165: 2240-50), leucemia (Yamada Y., et al. Blood 1998; 91: 4265-72; Yamada Y. e Kamihira S. Leuk Lymphoma 1999; 35(1-2):37-45) e artrite reumatoide (AR) (Mclnnes IB. Immunology Today 1998; 19: 75-9).

[006] Estudos anteriores sugeriram que a IL-15 precede a TNF-oc na cascata de citocinas, agindo como um fator importante na migração de células T para o fluido sinovial (Feldmann M., et al. Annu Rev Immunol. 1996; 14: 397-440; Mclnnes IB., et al. Nat Med. 1997; 3: 189-95). Adicionalmente, Ziolkowska et al. relatou que a IL-15 induz a expressão da IL-17 nas articulações de pacientes com AR e estimula a liberação por sinoviócitos de diversos mediadores inflamatórios, tais como IL-6, IL-8, GM-CSF e prostaglandina E₂; sugerindo um papel importante para a IL-15 na patogênese da AR (Ziolkowska M., et al. J Immunol. 2000; 164: 2832-8).

[007] O uso das moléculas antagonistas da IL-15 demonstrou ser eficaz nos modelos animais. Ruchatz et al. gerou um fragmento solúvel a partir da subunidade alfa do receptor de murina (IL-15Roc) e demonstrou que este fragmento inibiu a artrite induzida por colágeno em camundongos DBA/1 (Ruchatz H., et al. J. Immunol. 1998; 160: 5654-60).

[008] Outras moléculas antagonistas de IL-15 já foram patenteadas, incluindo mutantes da IL-15 em um ou mais resíduos de aminoácidos e anticorpos monoclonais contra a maturação da IL-15 que previne a transdução de sinais por meio de seu receptor (Patentes Nos.: US6001973, US6177079,

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US6168783, US6013480). Embora o uso delas seja descrito nos documentos de patente mencionados acima, há poucos estudos na literatura que apoiem a eficácia.

[009] Em maio de 2002, Genmab anunciou a fase de estudos clínicos I e II de um anticorpo anti-IL-15 (HuMax-IL-15) (Patente No.: US6177079). Embora o tratamento tenha sido bem tolerado, nenhuma eficácia significante foi demonstrada em uma fase de estudos envolvendo 110 pacientes com AR (Baslund B., et al. Arthritis & Rheumatism. 2005; 52: 2686-92). Outros estudos foram realizados com uma proteína quimérica consistindo em um mutante da IL-15 e o fragmento de Fe de uma imunoglobina, que se une a células expressando o receptor IL-15. Essa proteína de fusão, chamada de CRB-15, demonstrou ser eficaz em um modelo de murina de artrite induzida por colágeno, onde a CRB-15 diminui a incidência e a severidade da doença, e previne a progressão da artrite uma vez estabelecida (Ferrari-Lacraz S., et al. J Immunol. 2004; 173(9):5818-26).

[0010] Em 2003, Santos et al. propôs um método de vacinação que incluía a imunização ativa com IL-15 obtida a partir da Escherichia coli (Pedido de Patente Internacional, Publicação No. WO 2004/032956). Entretanto, a proteína obtida neste hospedeiro é biologicamente ativa uma vez que promove a proliferação de CTLL-2, uma linha celular dependente de IL2/IL-5 (Santos-Savio A., et al. Biotecnol. Apl. 2000; 17: 221-4). Este elemento é uma desvantagem, levando em consideração que quantidades pequenas do imunógeno que são liberadas e entram na circulação poderíam desencadear uma resposta indesejada. Esta citocina, sob condições fisiológicas, é conhecida como sendo um fator de crescimento de células T de memória (Kanai T., et al. J Immunol. 1996; 157(8): 3681-7; Kanegane H. e Tosato G. Blood 1996; 88(1): 230-5). O processo inflamatório na AR é distinguido pela ativação e recrutamento de células T para sinovial (Wilkinson PC. e Liew FY. Exp Med. 1995; 181: 1255-9), então a imunização

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4/16 com uma molécula IL-15 ativa pode contribuir com o desenvolvimento da doença.

[0011] Permanece assim o interesse de se obter vacinas para a imunoterapia ativa em doenças associadas à superexpressão da IL-15, o que oferece vantagens terapêuticas em relação às terapias atuais destinadas ao tratamento deste tipo de doenças.

Descrição Detalhada da Invenção [0012] A presente invenção resolve o problema mencionado acima ao prover uma composição de vacina distinguida pelo fato de que contém um polipeptídeo que compreende um mutante da IL-15 humana identificada como SEQ ID No. 1, pelo menos um adjuvante de vacina e excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[0013] O gene da IL-15 foi isolado dos monócitos ativados por lipopolissacarídeos (LPS) e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR), usando oligonucleotídeos específicos para a mutação na sequência de IL-15. Especificamente, o Asp 8 e Gin 108 foram substituídos por Ser. O polipeptídeo mutado foi obtido com as modificações nos resíduos de aminoácido mencionados acima, daqui em diante referido como IL-15Mut, com uma pureza maior que 95%.

[0014] Em uma modalidade da invenção, a composição de vacina compreende um polipeptídeo contendo o mutante IL-15 identificado SEQ ID No. 1 (IL-15Mut), que foi obtido por tecnologia de ácido desoxirribonucleico (DNA) recombinante. Para obter esta molécula, hospedeiros, os quais são conhecidos aos versados na técnica, tais como bactérias, leveduras, células de mamíferos, etc, podem ser empregados.

[0015] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo IL-15Mut foi obtido a partir de E. coli, então não está glicosilado, diferentemente da proteína autóloga presente no humano. Esta citocina mutada não é biologicamente ativa no ensaio de proliferação celular em CTLL-2, uma vez

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5/16 que não é capaz de induzir o crescimento destas células, que são dependentes da IL-15. Nas células CTLL-2, a IL-15Mut compete com a IL-15 nativa para união ao receptor, mas não induz sinalização por ter mutado os resíduos Asp 8 e Gin 108, que são resíduos chaves para a interação com as subunidades β e γ do receptor. Este elemento é uma vantagem sobre o método proposto por Santos e al. (Pedido de Patente Internacional, Publicação No. WO 2004/032956), em relação a uma menor ocorrência de eventos adversos, em respeito a uma atividade pró-inflamatória desta citocina, nos pacientes tratados.

[0016] Em um aspecto da presente invenção, o polipeptídeo compreendendo o mutante IL-15 identificado como SEQ ID No. 1, a qual é parte de uma composição de vacina, é um polipeptídeo de fusão. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo de fusão compreendendo o mutante IL15 identificado como SEQ ID No. 1 também compreende epítopos T, em uma concentração de proteína de 200 mg.

[0017] Na presente invenção, foi projetado um mutante IL-15 que corresponde à SEQ ID No. 1 obtido por tecnologia de DNA recombinante; com características estruturais diferentes da citocina natural em relação à localização das pontes dissulfeto. Este elemento promove o desenvolvimento da resposta imune por exposição de epítopos crípticos ou imunodominantes.

[0018] Para demonstrar o conceito proposto nessa invenção, primatas não humanos {Chlorocebus sabaeus) foram usados; levando em consideração que esta é a espécie com a maior homologia na sequência de aminoácidos da IL-15, com relação ao humano (-97% de semelhança) (Grabstein KH., et al. Science 1994; 264(5161):965-8). Foi demonstrado que a imunização ativa de tais primatas, com uma composição de vacina compreendendo o polipeptídeo IL-15Mut identificado como SEQ ID No. 1, usando hidróxido de alumínio (altemativamente chamado de Alumina) e o adjuvante oleoso Montanide ™ ISA-51, gera uma resposta de anticorpos que inibem a atividade biológica da

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IL-15 nativa nas células CTLL-2. Esta linha celular, usada para ensaios de neutralização, expressa as três subunidades do receptor da IL-15, e é dependente desta citocina para proliferar (Eisenman J., et al. Cytokine 2002; 20(3): 121-9). Neste ensaio, os soros mostraram uma inibição da proliferação dependente de dose. Esta resposta é maior quando comparada ao grupo de animais imunizados com o polipeptídeo identificado como SEQ ID No. 2 (proteína IL-15 obtida em E. colí). Os resultados também mostraram que a imunização com uma dose maior (350 mg) do polipeptídeo da SEQ ID No. 1 gera uma resposta de anticorpos neutralizantes maior a partir dos 15 dias após a segunda imunização. Este aspecto é uma vantagem, sendo que o efeito desejado é alcançado com um número menor de administrações da composição de vacina da presente invenção.

[0019] Considerando a alta porcentagem de semelhança entre o polipeptídeo mutado da SEQ ID No. 1 e a IL-15 símia, é inesperado que a imunização com esta proteína mutada gere uma resposta de anticorpo neutralizante contra a IL-15 nativa. Entretanto, a presente invenção demonstra que a imunização com o polipeptídeo mutado identificado como SEQ ID No. 1 gera anticorpos neutralizantes contra a IL-15 autóloga. Adicionalmente, é surpreendente que a resposta de anticorpos neutralizantes gerada por administração deste polipeptídeo (SEQ ID No. 1) é maior do que a obtida por imunização ativa com a IL-15 recombinante (SEQ ID No. 2).

[0020] A composição de vacina da presente invenção pode ser administrada por diversas vias, como é conhecido àqueles versados na técnica. A quantidade do antígeno vacinai na composição pode variar, dependendo da doença a ser tratada. Em uma modalidade da invenção, a quantidade de antígeno (polipeptídeo compreendendo um mutante da IL-15 humana identificada como SEQ ID No. 1) está na faixa de 200 a 500 mg por dose de vacina. No curso da imunização do paciente, repetidas doses podem ser administradas e as composições podem conter adjuvantes de vacinas que

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7/16 são bem conhecidas na vacinação atual, tais como sais de alumínio e emulsões água em óleo, e outros que estão em desenvolvimento; a fim de gerar no paciente os níveis de anticorpos contra a IL-15 que são necessários.

[0021] A invenção também descreve o uso de um polipeptídeo que compreende um mutante da IL-15 identificado como SEQ ID No. 1 para fabricar um medicamento para a imunoterapia ativa de uma doença associada à superexpressão da IL-15. São bem conhecidas àqueles versados neste campo da técnica as doenças envolvendo a expressão aberrante ou superexpressão da IL-15.

[0022] Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo compreendendo o mutante da IL-15 humano identificado como SEQ ID No. 1 é usado para fabricar um medicamento para a imunoterapia ativa de uma doença autoimune selecionada a partir do grupo que consiste em AR, doença de Crohn, colite ulcerativa e psoríase.

[0023] Em um outro aspecto da invenção, dito polipeptídeo é usado para a imunoterapia ativa de uma doença associada com a superexpressão da IL-15, tal como malignidades hematológicas. Em uma modalidade particular, a neoplasia hematológica é leucemia ou um linfoma.

[0024] A invenção também provê um método para o tratamento de doenças associadas com a superexpressão da IL-15. E distinguida por compreender a administração a um indivíduo que necessita de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de vacina que compreende um polipeptídeo compreendendo um mutante da IL-15 humano identificado como SEQ ID No. 1. Conforme declarado acima, dita composição de vacina é adequada para administração em humanos, e gera uma resposta de anticorpos neutralizantes contra a IL-15 autóloga.

[0025] O método da invenção, compreendendo a imunização ativa com a IL-15Mut (da SEQ ID No. 1) em uma formulação adequada para gerar anticorpos neutralizantes contra a IL-15, permite a neutralização de

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8/16 quantidades não reguladas desta citocina em pacientes com doenças autoimunes e malignidades hematológicas. Este método é superior àquele proposto no Pedido de Patente Internacional No. WO 2004/032956, levando em consideração que o antígeno usado para a imunização ativa carece de atividade biológica.

[0026] O método da invenção é útil para o tratamento de doenças associadas com a superexpressão da IL-15, incluindo AR, psoríase e doenças inflamatórias intestinais. Particularmente nestas patologias, a geração de anticorpos que neutralizam a atividade da IL-15 é vantajosa. Em pacientes afetados por estas doenças, o método de imunoterapia ativa da invenção pode ser combinado com a administração de outros medicamentos, tais como antiinflamatórios ou antagonistas de outras citocinas. Estes medicamentos incluem, por exemplo, fármacos esteroides, tais como corticosteroides e fármacos antirreumáticos que modificam a doença tradicionais (por exemplo, metotrexato).

[0027] O método da invenção também é útil para o tratamento de doenças tais como as malignidades hematológicas, nas quais a leucemia e linfomas são encontrados. Neste contexto, a imunoterapia ativa empregando a composição de vacina da invenção pode ser combinada com a administração, ao indivíduo em necessidade da mesma, de pelo menos um citostático farmaceuticamente aceitável.

[0028] O método da invenção é vantajoso, uma vez que os níveis de anticorpos gerados no próprio paciente são mais estáveis ao longo do tempo do que aqueles administrados por imunização passiva. Por outro lado, a frequência da aplicação das composições de vacina compreendendo o mutante da IL-15 é muito menor do que uma imunização passiva com anticorpos contra a citocina (no método desta invenção, elas são separadas por um intervalo de tempo mais longo). Adicionalmente, as quantidades de proteína por dose e a quantidade de administrações necessárias para a vacinação são

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9/16 menores do que aquelas necessárias para o tratamento com outras moléculas de antagonistas da IL-15, o que implica em um custo menor de produção e maior aderência ao tratamento.

[0029] A imunização com o polipeptídeo identificado como SEQ ID No. 1 gera anticorpos com uma capacidade neutralizante maior do que aqueles obtidos no grupo imunizado com a proteína recombinante da SEQ ID No. 2. O uso de um antígeno que não é biologicamente ativo resulta em uma frequência menor de eventos indesejáveis em pacientes com a vacina que o contém.

Breve Descrição dos Desenhos [0030] Figura 1. Pureza da IL-15Mut. Perfil cromatográfico por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC, em inglês reversed phase-highperformance liquid cromatography) da IL-15Mut (A) e IL-15 recombinante (B) obtida na E. coli, usada como antígeno na preparação da vacina.

[0031] Figura 2. Avaliação da atividade biológica da IL-15Mut por ensaio de proliferação celular da CTLL-2. (A) Proliferação celular induzida por diluições em série da IL-15 nativa (R&D), IL-15Mut e IL-15 recombinante obtida na E. coli. (B) Curva de proliferação celular na presença de diluições em série da IL-15Mut com uma concentração fixa da IL-15 nativa.

[0032] Figura 3. Avaliação por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA, em inglês enzyme-linked immunosorbent assay) da resposta dos anticorpos anti-IL-15 em macacos imunizados com IL-15Mut ou IL-15, usando hidróxido de alumínio (A) ou Montanida™ ISA-51 (B) como adjuvante. Os gráficos representam os valores médios dos títulos dos anticorpos nos três animais em cada grupo experimental, correspondendo a 15 dias após a segunda e a terceira imunização.

[0033] Figura 4. Avaliação em células CTLL-2 da capacidade

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10/16 neutralizante dos soros individuais após a terceira imunização usando Alum como adjuvante. (A) grupo IL-15, (B) grupo IL-15Mut a dose de 200 mg, (C) grupo IL-15Mut a dose de 350 mg, e (D) grupo placebo. A linha chamada diluição da IL-15 nativa representa o maior valor de proliferação celular e a linha chamada mínimo indica o valor de proliferação mínimo para células CTLL-2 crescidas em um meio de cultura livre de citocina.

[0034] Figura 5. Avaliação em células CTLL-2 da capacidade neutralizante da mescla de soros dos animais imunizados com IL-15Mut e IL15 recombinante. Os efeitos neutralizantes de cada grupo, 15 dias após as segunda e terceira imunizações, usando hidróxido de alumínio (A) ou Montanide ™ (B) como adjuvante, são mostrados. A linha chamada diluição da IL-15 nativa representa o maior valor de proliferação celular e a linha chamada mínimo indica o valor de proliferação mínimo para células CTLL-2 crescidas em um meio de cultura livre de citocina.

Descrição Detalhada das Modalidades/Exemplos de Realização Exemplo 1. Obtenção do polipeptídeo IL-15Mut em E. coli [0035] O DNA que codifica a IL-15 humana foi isolado dos monócitos ativados por lipossacarídeos e foi amplificado por PCR (temperatura de anelamento 60°C por 25 ciclos), usando oligonucleotídeos específicos para a mutação da Asp 8 e Gin 108 por Ser na sequência da IL-15 (oligonucleotídeo CAT GCC ATG GCA AAC TGG GTG AATGTA ATA AGT TCT TTG AAA e oligonucleotídeo 3' C GGGATCCCG TTA AGA AGT GTT GAT GAA CAT AGA GAC AAT). O produto de PCR foi digerido com Nco I/BamH I (Promega, EUA) e clonado em um vetor de expressão na E. coli. A IL-15Mut, obtida como corpos de inclusão, foi solubilizada com ureia 8M. O processo de renaturação foi realizado em uma coluna de 1,6 x 40 cm (GE Healthcare Life Sciences, EUA) empacada com Sephadex G-25 Fine (Pharmacia Biotech, Suécia) e equilibrado com tampão 0,1 M Tris e 0,15 M NaCl; pH 8,0 na razão de fluxo de 7 mL/min. A amostra

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11/16 coletada foi aplicada a uma coluna de 1,6 x 10 cm (GE Healthcare, EUA) empacada com Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, EUA), usando um gradiente linar de eluição de a partir de 0,2 M a 0,5 M NaCl, em uma razão de fluxo de 2 mL/min. A amostra eluída com 0,5 M NaCl foi aplicada a uma coluna C4 (1 x 25, 10 pm, Vydac, EUA), em um fluxo de 1,0 mL/min. As proteínas foram separadas usando uma fase móvel contendo ácido trifluoroacético (TFA) 0,1% e acetonitrila grau HPLC); empregando o seguinte gradiente: 0 a 30% em 5 min; 30% por 10 min; 30 a 40% em 5 min; 40 a 50% em 30 min; 50 a 60% em 60 min; 60 a 80% em 5 min em um fluxo de 2,5 mL/min. A separação das proteínas foi monitorada a 226 nm. O método de Bradford foi empregado para determinar a concentração de proteína total, de acordo com as instruções do fabricante. A proteína IL-15 não mutada foi obtida também de forma recombinante na E. coli, conforme previamente descrito (Santos-Savio A., et al. Biotecnol. Apl. 2000; 17: 2214).

Exemplo 2. Determinação da pureza da IL-15Mut por RP-HPLC [0036] As amostras coletadas a partir dos picos principais de purificação na RP-HPLC foram verificadas para estimar a porcentagem de pureza. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Lowry modificado, com o conjunto de reagentes “Modified Lowry Protein Assay Kit” (Thermo Scientific, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A análise do RP-HPLC foi conduzida com 50 pg de proteínas purificadas em coluna Cromolith Performance Cs (4,6 x 100 mm, 2 pm, Merck, EUA) usando um gradiente de a partir de 0 a 80% de AcN/0,1% TFA em 15 min, em uma razão de fluxo de 2,5 mL/min. O comprimento de onda foi detectado a 226 nm. A pureza foi determinada usando o programa J vl.32. A IL-15Mut foi obtida com uma pureza de 96%, conforme visto na Figura 1; enquanto a IL-15 recombinada não mutada foi obtida com 98% de pureza.

Exemplo 3. Avaliação da atividade biológica da IL-15Mut na linha

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12/16 celular CTLL-2 [0037] A fim de avaliar a atividade biológica da IL-15Mut, o ensaio de proliferação na linha celular CTLL-2 foi realizado. A atividade biológica medida por estimulação da proliferação das células CTLL-2, usando coloração mitocondrial com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazólio (MTT, do inglês 3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide) (Mossman TJ. Immunol. Methods 1983; 65(12): 55-63), seguindo o procedimento descrito abaixo. Diluições em série duplas de IL-15 recombinante, IL-15 nativa (R&D, EUA) e IL-15Mut (concentração de partida 25 ng/mL) foram realizadas em placas de 96 alvéolos (Costar, EUA) em um volume de 50 pL de meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 50 pg/mL de gentamicina. Adicionalmente, diluições em série da IL-15 mutada a partir de 6 pg/mL, foram realizados em 30 pL de meio RPMI suplementado. As diluições da IL-15Mut foram coincubadas com 20 pL de 300 pg/mL da IL-15 nativa. Então, as células CTLL-2 previamente lavadas com meio RPMI foram adicionadas em quantidades de 5 x 10³ células/alvéolo em 50 pL. A placa foi incubada por 72 h a 5% de CO2, 37° e 98% de umidade relativa. A viabilidade celular foi determinada por coloração com MTT. A IL-15Mut não foi biologicamente ativa, uma vez que não induziu a proliferação de células CTLL-2, diferentemente da IL-15 recombinante (SEQ ID No. 2) e a IL-15 nativa, que estimulam a proliferação dependente de dose (Figura 2).

Exemplo 4. Esquema de imunização em macacos verdes [0038] Os animais (macacos verdes Chlorocebus sabaeus) foram divididos em 6 grupos de 3 animais cada um. Um grupo placebo,que recebeu uma solução de tampão de fosfato salino (PBS) em um adjuvante de hidróxido de alumínio (Brenntag Biosector, Dinamarca), um grupo imunizado com 200 pg do polipeptídeo identificado como SEQ ID No. 2 (grupo IL-15), e dois outros grupos, que receberam 200 pg ou 350 pg do polipeptídeo

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13/16 identificado como SEQ ID No. 1 combinado com hidróxido de alumínio a uma concentração de 1,8 mg/mL. Adicionalmente, dois outros grupos experimentais imunizados com 200 pg do polipeptídeo identificado como SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2 em adjuvante Montanide ™ ISA-51 (50:50 v/v) foram incluídos. A administração do imunógeno foi realizada de maneira subcutânea em diversos sítios da região interescapular em um volume total de 0,5 mL. As três imunizações foram realizadas, com um intervalo de 15 dias entre a primeira e a segunda, e 2 meses entre a segunda e a terceira. As amostras de sangue foram coletadas antes do início do esquema (soro préimune) e 15 dias após as segunda e terceira imunizações. A complementação foi inativada por incubação dos soros a 56°C por 30 minutos. Sinais vitais, temperatura, ritmo cardíaco e peso corporal foram registrados ao longo do esquema inteiro.

Exemplo 5. Determinação de anticorpos anti-IL-15 em soro de animais imunizados.

[0039] A determinação de anticorpos anti-IL-15 foi feita por meio de um sistema indireto tipo ELISA, onde as placas foram cobertas com o polipeptídeo identificado como SEQ ID No. 2 (1 pg/mL) em PBS, e houve incubação durante 16 horas a 25°C. As placas foram bloqueadas com albumina de soro bovino a 1% (BSA, em inglês bovine serum albumin, Sigma-Aldrich, EUA) em PBS por 90 min a 37°C seguida por 3 lavagens com Tween 20 a 0,05% em PBS. Soros diluídos em PBS, Tween 20 a 0,05% e BSA a 0,01% (diluição inicial 1:5.000) foram adicionados a alvéolos em um volume de 100 pL e incubados por 90 min a 37°C. Os alvéolos foram lavados 3 vezes e incubados com conjugado anti-Fc da IgG humana conjugado a peroxidase (diluição 1:10.000 em PBS). Após a incubação por lha 37°C, as placas foram lavadas 5 vezes e incubadas com 100 pL de solução de substrato. A reação foi interrompida aos 15 min a adição de 50 pL de solução de ácido sulfúrico 0,5 Mea absorvância a 450 nm foi medida com um leitor

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14/16 de placa ELISA. O título dos anticorpos foi considerado como a diluição do soro maior rendendo pelo menos o dobro do valor da densidade óptica (OD) a 450 nm do soro pré-imune de cada animal. Os dados foram processados usando o programa GraphPad Prism v6.05 (GraphPad Software, Inc.). Os resultados obtidos são mostrados na Figura 3; o que indica que a imunização ativa com o polipeptídeo mutado da IL-15 9correspondendo a SEQ ID No. 1) gera uma resposta de anticorpos anti-IL-15 tanto quando usando alumina ou Montanide ™ como adjuvante.

Exemplo 6. Determinação da capacidade neutralizante dos soros de animais imunizados [0040] Para avaliar a capacidade neutralizante dos soros, o ensaio da proliferação celular de CTLL-2 foi realizada. Esta linha celular dependente da IL-2 também prolifera na presença da IL-15 (proliferação máxima corresponde a células incubadas com 300 pg/mL da IL-15 nativa), ao passo que na ausência da citocina as células não proliferam (mínimo: células crescidas em um meio de cultura sem IL-15). Neste ensaio, as moléculas que se unem a IL-15 e impedem a translação de sinal por meio de seu receptor são detectadas porque elas inibem a proliferação desta linha celular.

[0041] Para avaliar a capacidade neutralizante de anticorpos dos macacos imunes, diluições em séries duplas de soros inativados por calor (diluição inicial 1:100) foram realizadas em placas de 96 alveolares em um volume de 30 30 pL do meio RPMI suplementado com FBS 10% e 50 pg/mL de gentamicina. Então 300 pg/mL da IL-15 humana nativa (R&D, EUA) em um volume de 20 pL foram adicionados a cada alvéolo e a placa foi incubada a 37°C por 30 min. Em seguida, células CTLL-2 previamente lavadas foram adicionadas em quantidades de 5 x 10³ células/alvéolos em 50 pL e a placa foi incubada por 72 h a 5% CO2, 37°C e 98% de umidade relativa (Rodríguez Y., et al. Biotecnol. Apl. 2014; 31: 291-6). MAB2471(R&D, EUA), um anticorpo neutralizante anti-IL-15 humana foi usado como um controle

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15/16 positivo a uma concentração de partida de 1 pg/mL (diluições em séries duplas). A viabilidade celular foi determinada por coloração com MTT. Os títulos neutralizantes dos soros foram expressados como a diluição de soros que é necessária para inibir a ploriferação em pelo menos 50% (ID50) e foram calculados usando o Curve Expert Program versão 1.3.8.0. A Figura 4 mostra o efeito inibidor do soro na proliferação induzida por IL-15 nativa em células CTLL-2. Estes soros foram isolados a partir de animais imunizados com o polipeptídeo da SEQ ID No. 1 (IL-15Mut) e SEQ ID No. 2 (IL-15 recombinante) usando hidróxido de alumínio como adjuvante. Os valores de ID50 de soro a partir dos animais individuais dentro de cada grupo experimental (3 animais por grupo) foram mostrados na Tabela 1. Ao comparar os títulos de neutralização dos animais recebendo a mesma dose (200 pg) de IL-15Mut (SEQ ID No. 1) e de IL-15 recombinante (SEQ ID No. 2), foi verificado serem maiores para a citocina mutada.

[0042] Tabela 1. Os valores ID50 de soro de animais correspondendo a 15 dias após a terceira imunização._____________________________________

Imunógeno/Dose	Animais	Títulos de Neutralização (IDso)
IL-15/200 gg	1	1946
IL-15/200 gg	2	859
IL-15/200 gg	3	280
IL-15Mut/200 gg	1	3547
IL-15Mut/200 gg	2	809
IL-15Mut/200 gg	3	3238
IL-15Mut/350 gg	1	2273
IL-15Mut/350 gg	2	5218
IL-15Mut/350 gg	3	1171

[0043] A Figura 5 mostra a capacidade neutralizante nas células CTLL-2 da mescla de soros de animais imunizados com IL-15Mut e IL-15 recombinante. Os soros avaliados correspondem a 15 dias após as segunda e terceira imunizações, usando hidróxido de alumínio ou Montanide ™ como adjuvante. E observado um efeito neutralizante de soros após a terceira imunização em animais imunizados com 200 pg de IL-15Mut IL-15 recombinante. Entretanto, os soros correspondentes à dose de 350 pg mostraram um efeito neutralizante a 15 dias após a segunda administração.

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16/16 [0044] A Tabela 2 resume os valores de ID50 da mescla de soros correspondendo a 15 dias após as segunda e terceira imunizações, mostrando os títulos neutralizantes para os três grupos experimentais. A imunização com uma dose maior (350 pg) de IL-15Mut (SEQ ID No. 1) gera uma resposta neutralizante maior a 15 dias após a segunda imunização, quando alumina é usada como adjuvante. Isso é uma vantagem, levando em consideração que o efeito desejado podería ser alcançado com menos administrações. A dose de 200 pg foi administrada em combinação com Montanide como adjuvante. Neste caso, os valores D50 para o grupo de IL-15Mut são também maiores do que aqueles alcançados para o grupo IL-15 recombinante após as segunda e terceira inoculações.

[0045] Tabela 2. Os valores ID50 da mescla de soros correspondendo a 15 dias após as segunda e terceira imunizações._________________________

Imunógeno/Dose	Número de imunizações	Adjuvante	Títulos de neutralização (IDso)
IL-15/200 gg	2	Hidróxido de alumínio	80
IL-15Mut/200 gg	2	Hidróxido de alumínio	206
IL-15Mut/350 gg	2	Hidróxido de alumínio	1308
IL-15/200 gg	3	Hidróxido de alumínio	1256
IL-15Mut/200 gg	3	Hidróxido de alumínio	2836
IL-15Mut/350 gg	3	Hidróxido de alumínio	3576
IL-15/200 gg	2	Montanide™ IS A-51	50
IL-15Mut/200 gg	2	Montanide™ IS A-51	175
IL-15/200 gg	3	Montanide™ IS A-51	1154
IL-15Mut/200 gg	3	Montanide™ IS A-51	1952

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que contém um polipeptídeo que compreende um mutante da interleucina-15 humana (IL-15) identificada como SEQ ID No. 1, pelo menos um adjuvante de vacina e excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende o mutante da IL-15 identificado como SEQ ID No. 1 é obtido por tecnologia de DNA recombinante.
3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende o mutante da IL-15 identificado como SEQ ID No. 1 é um polipeptídeo e fusão.
4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende epítopos T.
5. Uso de um polipeptídeo que compreende um mutante da IL15 identificada como SEQ ID No. 1, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para a imunoterapia ativa de doenças associadas com a superexpressão da IL-15.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a doença associada à superexpressão IL-15 é uma doença autoimune selecionado a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide (RA), doença de Crohn, colite ulcerativa e psoríase.
7. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a doença associada à superexpressão da IL-15 é uma neoplasia hematológica.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a neoplasia hematológica é uma leucemia ou linfoma.

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9. Uso de um polipeptídeo que compreende um mutante da IL15 humana identificada como SEQ ID No. 1, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma composição de vacina para o tratamento de doenças associadas à superexpressão da IL-15.
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença associada à superexpressão IL-15 é uma doença autoimune selecionado a partir do grupo que consiste em RA, doença de Crohn, colite ulcerativa e psoríase.
11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença associada à superexpressão da IL-15 é uma neoplasia hematológica.
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a neoplasia hematológica é uma leucemia ou linfoma.
13. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu adicionalmente fármacos anti-inflamatórios ou antagonistas de outras citocinas.
14. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu adicionalmente pelo menos um citostático farmaceuticamente aceitável.