ES2267836T3

ES2267836T3 - Chaperonina 10 de m. tuberculosis y sus usos.

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Publication number: ES2267836T3
Application number: ES01983701T
Authority: ES
Inventors: Anthony Robert Milnes Dept. Of Med. Mic. Coates
Original assignee: Helperby Therapeutics Ltd
Current assignee: Helperby Therapeutics Ltd
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2021-11-16
Also published as: GB2389852B; GB2390366B; JP4648956B2; JP2008179646A; JP2004513925A; HK1060521A1; JP2004525085A; CY1106394T1; JP4890733B2; AU1511702A; JP2008214347A; GB0028122D0; AU2002223817A1; DE60127159D1; CY1105619T1; WO2002040517A2; GB0311389D0; EP1693068B1; CA2429897A1; ATE355845T1

Abstract

El uso de una composición farmacéutica en la producción de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio causada por eosinófilos, y la hiperreactividad del tracto respiratorio, en el que la composición farmacéutica contiene una molécula de ácido nucleico que incluye: (i) la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o (ii) una secuencia que posee más de 66%, p.e. 70% ó 75%, de preferencia más de 80 %, p.e. más de 90% ó 95% de identidad con la secuencia (i) o una secuencia que hibridiza con la secuencia (i) bajo condiciones de 2 x SCC, 65oC (donde SCC = 0, 15M de NaCl, 0, 015M de citrato de sodio, pH 7, 2), que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la secuencia codificada por la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o (iii) un fragmento de la secuencia (i) o (ii) que codifica para un fragmento de proteína funcionalmente equivalente;y un excipiente, un disolvente o un portador farmacéuticamente aceptables.

Description

Chaperonina 10 de M. tuberculosis y sus usos.

La presente invención se refiere a el uso de un polipéptido de aproximadamente 10 kDa (o la molécula de ácido nucleico que codifica para él) o moléculas funcionalmente equivalentes, o fragmentos de las mismas, obtenidos a partir de Mycobacterium tuberculosis o procariontes relacionados, para el tratamiento de enfermedades alérgicas de las vías respiratorias y enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio debida a los eosinófilos y la hiperreactividad del tracto respiratorio a los métodos de estimulación de la producción de mediadores de la respuesta inmune p.e. citoquinas, in vitro.

Se cree que las chaperoninas estimulan al sistema inmune a muchos niveles simultáneamente, incluyendo a los monocitos, los macrófagos, las células similares a los fibroblastos, quizás otro tipo de células, y las células T. Las defensas inmunes en mamíferos pueden dividirse en la defensa "innata" y la defensa "adaptativa". Las que se encuentran listas en todo momento se consideran innatas. Ante un reto, se activa la inmunidad adaptativa en la forma de linfocitos B y linfocitos T. Se sabe que las chaperoninas actúan directamente sobre los mecanismos de la defensa innata, particularmente sobre los fagocitos. También estimulan una poderosa respuesta inmune adaptativa, o sea, mediante la producción de anticuerpos y la estimulación de los linfocitos T que, en algunos casos, puede ser protectora. Además inducen la secreción de citoquinas que se piensa que sea importante para las defensas del hospedero. Sin embargo, en ciertos casos, se piensa que la presencia de las chaperoninas puede resultar dañina para el hospe-
dero.

Ragno et al (1996) Clin. Exp. Immunol. 103, 384-390 mostraron que una solución acuosa de una proteína de choque térmico de 10 kDa (hsp10) obtenida de Mycobacterium tuberculosis demoró el inicio y la severidad de la artritis inducida por adyuvantes (AA) en ratas. La AA es un modelo de enfermedades autoinmunes, que están asociadas con una sobrerreactividad basal de las células Th-1. No existe ninguna sugerencia de que la hsp10 pudiese encontrar uso en el tratamiento de dolencias alérgicas como el asma, la rinitis, la fiebre del heno, el eczema, la anafilaxis y otras similares que, por el contrario de las enfermedades autoinmunes (sobrerreactividad Th-1) están asociadas a una sobrerreactividad basal de las células Th-2.

El papel de las chaperoninas en las enfermedades autoinmunes es controversial. Aunque la infección/inmunidad por organismos que contienen chaperoninas es universal, y las personas saludables poseen respuestas de células T a las autochaperoninas, incluyendo la producción de anticuerpos específicos para las chaperoninas, la enfermedad autoinmune clásica es bastante rara. Por tanto, la ocurrencia de reacciones inmunes a las chaperoninas puede ser incidental y poco importante.

Sin embargo, la teoría del mimetismo molecular sugiere que las chaperoninas se encuentran involucradas en la enfermedad autoinmune, y se basa en el alto nivel de conservación de la secuencia aminoacídica que se aprecia entre las chaperoninas de origen microbiano y las de mamíferos. La teoría propone que, durante la infección con un amplio espectro de microorganismos, los epítopos de las chaperoninas que son compartidos entre los microorganismos y los mamíferos estimulan los linfocitos T. De acuerdo con esta teoría, un elevado nivel de presentación por parte de las chaperoninas de epítopos de chaperoninas compartidos rompe la tolerancia a las chaperoninas propias y como resultado se desarrolla la enfermedad autoinmune.

Se ha encontrado que las chaperoninas obtenidas a partir de tumores producen efectos necróticos sobre dichos tumores. Se ha sugerido que esto pueda deberse a la estimulación del reconocimiento inmunológico de los antígenos tumorales aunque los mecanismos para ello sean desconocidos. Por tanto, aparentemente, las chaperoninas inducen la inmunidad adaptativa protectora contra las infecciones bacterianas y el cáncer.

Las reacciones alérgicas, como el asma, están relacionadas con respuestas inmunes inapropiadas o mal dirigidas. Por ejemplo, se incrementa la incidencia del asma y no se han encontrado aun terapias efectivas para tratar todos los casos. Los tratamientos actuales con frecuencia utilizan los glucocorticoides inmunosupresores, los agonistas beta, el cromoglicato, los modificadores de leucotrienos, etc, que poseen numerosos efectos colaterales.

En dichas reacciones alérgicas aparecen altos niveles de IgE y predominan las respuestas inmunes de los linfocitos T auxiliares 2 (Th2) sobre las respuestas Th1, lo cual da como resultado una respuesta inflamatoria. Se piensa que las respuestas Th1 son esencialmente protectoras contra las infecciones microbianas, y son promovidas por citoquinas, en particular la interleuquina 12 (IL12), IL-2 y el interferón-\gamma. Por otro lado, las respuestas Th2, sobre el fondo genético adecuado, están asociadas con daños alérgicos nocivos para los tejidos.

Sin embargo, se ha sugerido que, en otras condiciones, como las enfermedades autoinmunes, p.e., la artritis por adyuvante, las respuestas Th1 sobrerreactivas son las causantes de esta enfermedad. La conversión de las respuestas Th1 a Th2, o de las respuestas Th2 a Th1 puede, por tanto tener utilidad en el tratamiento de los desórdenes antes descritos.

Aunque se conoce que las bacterias como L. monocytogenes, M. bovis y M. tuberculosis pueden convertir las respuestas Th2 a Th1, no se han identificado las moléculas responsables de dicha conversión.

Lo que sugiere el conocimiento actual, sin embargo, es que se encuentra implicada una proteína de choque térmico, hsp65, de M. leprae que es capaz de inducir las respuestas Th1 (Lowrie et al., 1999, Nature, 400, p269-271; Bonato et al., 1998, Infect. Immun., 66, p169-175). El homólogo, hsp65 de M. tuberculosis, tiene la capacidad de estimular los monocitos humanos para sintetizar citoquinas proinflamatorias y activar monocitos y células del endotelio vascular humano (Friedland et al., 1993, Clin. Exp. Immunol., 91, p5862; Peetermans et al., 1995, Infect. Immunol., 63, p3454-3458; Verdegaal, et al., 1996, J. Immunol., 157, p369-376).

Sorprendentemente, se ha encontrado recientemente que otra proteína es capaz de afectar la inmunidad de un individuo y que puede utilizarse para el tratamiento o la prevención de enfermedades alérgicas del tracto respiratorio, y las enfermedades respiratorias causadas por la inflamación del tracto respiratorio debida a los eosinófilos y la hiperreactividad del tracto respiratorio.

Se ha encontrado, sorpresivamente, que esta proteína obtenida a partir de Mycobacterium tuberculosis posee propiedades ventajosas para el tratamiento de las dolencias antes mencionadas. Dicha molécula de 10 kDa ha sido denominada chaperonina 10 de Mycobacterium tuberculosis (Mtcpn 10).

Cpn 10, que es una chaperonina y una proteína de choque térmico se encuentra bajo control transcripcional discreto de las moléculas cpn 60.1 y 60.2.

La invención, por tanto, proporciona moléculas tales como cpn 10 de Mycobacterium que poseen propiedades incrementadas para el tratamiento o la prevención de enfermedades del tracto respiratorio y enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio debida a los eosinófilos y la hiperreactividad del tracto respiratorio. Las aplicaciones terapéuticas o profilácticas pueden lograrse mediante el uso de moléculas de ácidos nucleicos o péptidos/proteínas, como se discutirá con más detalles más adelante en este documento.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición farmacéutica que contiene una molécula de ácido nucleico que incluye:

(i): la secuencia nucleotídica de la Figura 1 o,

(ii): una secuencia que posee más de 66%, p.e., 70 ó 75%, de preferencia, más de 80%, p.e., más de 90% ó 95% de identidad con la secuencia (i) (de acuerdo con la prueba que se describe más adelante en este documento) o una secuencia que hibridice con la secuencia (i) bajo condiciones de 2 x SSC, 65ºC (donde SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sodio, pH 7,2), que codifica para una proteína funcionalmente equivalente a la secuencia codificada por el nucleótido de la Figura 1, o

(iii): un fragmento de cualquiera de las secuencias (i) y (ii), que codifique para un fragmento de proteína funcionalmente equivalente; y un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

Para la producción de un medicamento para la prevención o el tratamiento de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio debida a los eosinófilos y la hiperreactividad del tracto respiratorio. Como se mencionó anteriormente, los efectos terapéuticos y profilácticos pueden lograrse utilizando moléculas de ácidos nucleicos o péptidos/proteínas.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido que incluye:

(i): la secuencia aminoacídica de la Figura 1, o

(ii): una secuencia que tiene más de 60%, p.e., 65% ó 70%, de preferencia, más de 95% de homología con la secuencia (i) (de acuerdo con la prueba que se describe más adelante en este documento) que proporciona una proteína funcionalmente equivalente, o

(iii): un fragmento funcionalmente equivalente de cualquiera de las secuencias (i) o (ii); y un excipiente, diluyente, o portador farmacéuticamente aceptable.

Para la producción de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio producida por los eosinófilos, y la hiperreactividad del tracto respiratorio.

"Moléculas de ácidos nucleicos" de acuerdo con la invención puede ser ADN, ADNc, o ARN, de preferencia, ADN, de simple o doble cadena. Los derivados de las secuencias nucleotídicas capaces de codificar para polipéptidos funcionalmente equivalentes pueden obtenerse mediante el uso de métodos convencionales, bien conocidos en la técnica.

Las moléculas de ácidos nucleicos empleadas en la invención pueden constar solamente de secuencias derivadas de la Figura 1 (o secuencias relacionadas, funcionalmente equivalentes), o pueden incluir secuencias adicionales, tales como secuencias estructurales o funcionales, p.e., secuencias que controlan la transcripción y/o la expresión (particularmente en células de mamíferos), o secuencias que incluyen la secuencia de un componente proteico adicional que puede formar una proteína de fusión que puede poseer propiedades específicas, p.e., actuar como una señal para la secreción. Por tanto, por ejemplo, la secuencia puede encontrarse en la forma de un vector que contenga las moléculas de ácidos nucleicos descritas en el presente documento. Los vectores apropiados incluyen plásmidos y virus.

El término "Polipéptidos", tal como se usa aquí, incluye tanto proteínas de tamaño completo, como secuencias peptídicas menores, p.e., fragmentos proteicos, según se describe en el presente documento. Tales polipéptidos pueden prepararse mediante cualquier medio conveniente, e.g., mediante aislamiento a partir del organismo procarionte que constituye la fuente de los mismos, o mediante métodos recombinantes, mediante la expresión de la molécula de ácido nucleico específica en una célula hospedera, unida de forma operativa a una secuencia de control de la expresión, o un vehículo de clonaje de ADN recombinante, o un vector que contenga tal molécula de ADN recombinante, o mediante síntesis química o bioquímica (ex vivo).

El término "Identidad de secuencia", como se usa en este documento en relación con secuencias nucleotídicas, hace referencia al valor obtenido al evaluar la secuencia utilizando el programa ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucl. Acids. Res., 22, p4673-4680) usando los parámetros siguientes:

: Parámetros de los alineamientos de pares de secuencias, Método: riguroso, Matriz: IUB, Penalización por la apertura de una hendidura: 15,00, Penalización por la extensión de una hendidura: 6,66;

: Parámetros del alineamiento múltiple, Matriz: IUB, Penalización por la apertura de una hendidura: 15,00, porciento de identidad para demora: 30, Matriz negativa: no, Penalización por la extensión de una hendidura: 6,66, Peso de las transiciones en el ADN: 0,5.

Con relación a las secuencias aminoacídicas, el término "identidad de secuencia" hace referencia a las secuencias que poseen el valor mencionado cuando la misma se evalúa utilizando el programa ClustalW (Thompson et al., 199a, supra) utilizando los parámetros siguientes: Parámetros de los alineamientos de pares de secuencias, Método: riguroso, Matriz: PAM, Penalización por la apertura de una hendidura: 10,00, Penalización por la extensión de una hendidura: 0,10; Parámetros del alineamiento múltiple, Matriz: PAM, Penalización por la apertura de una hendidura: 10,00, porciento de identidad para demora: 30, Penalización de hendiduras en los extremos: sí, Distancia de separación de las hendiduras: 0, Matriz negativa: no, Penalización por la extensión de una hendidura: 0,20, Penalizaciones por apertura de hendiduras en residuos específicos: sí, Penalización por la apertura de hendiduras hidrofílicas: sí, Residuos hidrofílicos: GPSNDQEKR. La identidad de secuencia en un residuo determinado se dirige a incluir residuos idénticos que solo han sido derivatizados.

Proteínas o fragmentos de proteínas "funcionalmente equivalentes" hace referencia a proteínas o fragmentos relacionados con, o derivados de, la secuencia aminoacídica de la Figura 1, donde la secuencia aminoacídica ha sido modificada mediante la sustitución, adición y/o deleción de un único o múltiples aminoácidos (p.e. entre 1 y 50, p.e. entre 10 y 30, de preferencia de 1 a 5 bases) pero que, no obstante, mantiene su actividad funcional, p.e. suprime la eosinofilia inducida mediante ovoalbúmina, por ejemplo, mediante la reducción del número de eosinófilos en más de 10%, p.e. más de 25%, con preferencia particular, más de 50% y/o un incremento en la producción de citoquinas específicas, tales como la interleuquina-1\beta (IL-1\beta), IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, el receptor de la IL-12, el factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), el interferón-\gamma y el factor estimulante de la formación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) p.e. en más de 10 veces, de preferencia, más de 100 veces de incremento por encima de los niveles normales y/o estimulación de las respuestas Th1.

Dentro del significado de variantes de "adición" se incluyen proteínas o polipéptidos de fusión amino y/o carboxilo terminal, que incluyen una proteína o polipéptido adicional fusionado a la secuencia polipeptídica.

De preferencia particular son los equivalentes que existen en la naturaleza, tales como variaciones biológicas, p.e. variantes alélicas, geográficas o alotípicas y derivados preparados mediante las técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden prepararse proteínas o fragmentos funcionalmente equivalentes, ya sea mediante síntesis química de péptidos, o por vía recombinante utilizando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria, o ruptura enzimática, y/o ligación de ácidos nucleicos.

La invención se dirige, de modo particular, a los homólogos y moléculas relacionadas, obtenidas a partir de diferentes procariontes, p.e. a partir de géneros, especies, o cepas bacterianos, en particular a partir del género Mycobacterium, p.e., homólogos obtenidos a partir del complejo de Mycobacterium tuberculosis, que incluye a M. tuberculosis, M. bovis y M. africanum. Tales secuencias pueden encontrarse, en sí mismas, modificadas, en particular, derivatizadas, siempre que mantengan aun su funcionalidad.

Pueden prepararse derivados de las proteínas mediante modificaciones posteriores a la síntesis/aislamiento o mediante modificaciones durante la síntesis, p.e., empleando residuos modificados, o la expresión de moléculas de ácidos nucleicos modificadas, cuando sea apropiado.

De acuerdo con la invención, pueden producirse fragmentos funcionalmente equivalentes mediante la truncación, p.e., mediante la remoción de los extremos N y/o C terminal de un péptido, o mediante selección de una región apropiada de un dominio activo, p.e., una región epitópica que mantenga su funcionalidad. Tales fragmentos pueden producirse a partir de la secuencia de la Figura 1 o pueden producirse a partir de una proteína funcionalmente equivalente a la que se muestra en la Figura 1.

Se pondrá de manifiesto que cuando se seleccionan fragmentos funcionales, los mismos pueden no mostrar todas las funciones atribuidas a las moléculas originales. Por tanto, las proteínas o fragmentos funcionalmente equivalentes hacen referencia a la retención de propiedades funcionales relevantes, de manera que el fragmento retenga la utilidad de acuerdo con la invención, p.e. reducir la eosinofilia, incrementar la producción de citoquinas específicas y/o estimular la respuesta inmune Th1, como se mencionó anteriormente. De preferencia, los fragmentos tienen entre 6 y 99 residuos de longitud, p.e. 15 a 99 residuos, de preferencia de 6 a 30, de 10 a 25, de 15 a 50, o de 15 a 30 residuos. Fragmentos particularmente preferidos de la secuencia mostrada en la Figura 1 son los derivados de, o que constan de, los residuos siguientes:

1-25

1-58

25-99

51-99

75-99

También se utilizan, en composiciones de la invención, secuencias/fragmentos de ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes, comparables a la secuencia presentada en la Figura 1. Estas secuencias se definen en referencia a las proteínas/péptidos funcionalmente equivalentes (como se definió con anterioridad) para los que codifican.

El término "hibridización" se usa en este documento en referencia a aquellas secuencias que se unen bajo condiciones no estrictas (6 x SSC/50% de formamida a temperatura ambiente) y se despegan en condiciones estrictas p.e. 2 x SSC, 65ºC (donde SSC = 0,15 M NaCL, 0,015 M de citrato de sodio, pH 7,2).

El término "farmacéuticamente aceptable" tal como se le utiliza en el presente documento se refiere a ingredientes que son compatibles con otros ingredientes de las composiciones, además de ser fisiológicamente aceptables para el receptor.

Las composiciones farmacéuticas, de acuerdo a la invención, pueden formularse de manera convencional utilizando ingredientes fácilmente accesibles. Por tanto, el ingrediente activo (p.e. la molécula de ácido nucleico o la proteína/péptido) puede incorporarse, opcionalmente, junto a otras sustancias activas, con uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes convencionales, para producir preparaciones farmacéuticas convencionales, tales como tabletas, píldoras, polvos, caramelos, atomizadores, parches, elíxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, siropes, aerosoles (sólidos o en un medio líquido), pomadas, cápsulas de gelatina suaves y duras, supositorios, soluciones inyectables estériles, polvos empaquetados estériles, y otros similares.

Como se mencionó anteriormente, las composiciones pueden incluir, además moléculas que auxilian o incrementan la acción de las moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos descritos anteriormente en el presente documento, p.e. talidomida (y análogos de la misma) ciclofosfamida en dosis bajas, LPS, citoquinas, quemoquinas, oligodesoxirribonucleótidos CpG y otros agentes inmunomoduladores y/o antiinflamatorios, tales como antagonistas de citoquinas o glucocorticosteroides.

Así, por ejemplo, las composiciones pueden utilizarse junto a ingredientes activos para inmunoterapias p.e. en vacunas contra cáncer. Las preparaciones apropiadas para la inmunoterapia/vacunas que pueden incluir moléculas de ácidos nucleicos/polipéptidos, como se describe en el presente documento, incluyen vacunas subunitarias o tratamientos basados en antígenos específicos par tumores o antígenos o anticuerpos asociados a tumores, anticuerpos antiidiotípicos o preparaciones que contengan células enteras para la vacunación o la terapia. Cuando se usan para la terapia o la vacunación, las moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos descritos en el presente documento pueden proporcionar (o codificar para) un antígeno que produzca como resultado una respuesta inmune específica dirigida a dicho antígeno y/o tenga como resultado una respuesta inmune general y no específica. En el último caso, en el que se utilizan composiciones que contienen otros ingredientes activos, las moléculas de ácidos nucleicos/polipéptidos descritos en el presente documento actúan como adyuvantes y pueden utilizarse para dicho propósito.

Se pueden formular preparaciones preventivas o terapéuticas que incluyan uno o más adyuvantes adecuados, p.e. Adyuvante Incompleto de Freund, BCG, Montanide, hidróxido de aluminio, saponina, Quil A, o formas más purificadas de los mismos, muramil dipéptido, aceites minerales o vegetales, Novasome o copolímeros de bloques no iónicos, o DEAE dextrana, en presencia de uno ó mas portadores o diluyentes aceptables. Los portadores aceptables incluyen medios líquidos tales como solución salina.

Ejemplos de portadores, excipientes y diluyentes adecuados son la lactosa, la dextrosa, la sucrosa, el sorbitol, el manitol, los almidones, la goma de acacia, el fosfato de calcio, los aglinatos, la goma tragacanta, la gelatina, el silicato de calcio, la celulosa microcristalina, la polivinilpirrolidona, la celulosa, los siropes de agua, el agua, agua/etanol, agua/glicol, agua/polietilén glicol, propilén glicol, metil celulosa, metilhidroxibenzoatos, propil hidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio, aceite mineral o sustancias grasas tales como grasa gruesa o mezclas adecuadas de las mismas. Las composiciones de la invención pueden formularse de manera que proporcionen una liberación rápida, sostenida o demorada del ingrediente activo luego de su administración al paciente, mediante el empleo de procedimientos bien conocidos en la técnica.

Las composiciones pueden presentarse en una forma de dosificación apropiada, por ejemplo, como emulsiones, o en liposomas, niosomas, microesferas, nanopartículas o similares.

Si se requiere, las composiciones pueden contener también una porción que dirija a un blanco al ingrediente activo y que se encuentre unida a este, p.e un ligando que se una específica y selectivamente a un receptor endógeno para permitir su direccionamiento a un tipo celular o una localización particular, tal como un direccionamiento a linfocitos, monocitos, macrófagos, células endoteliales, células epiteliales, células sanguíneas, eritrocitos, plaquetas, eosinófilos, neutrófilos, células asesinas naturales, células dendríticas, células del cerebro, células del corazón, células pulmonares, células de islotes, células renales, células cancerosas, células de glándulas hormonales, la piel, los huesos, las articulaciones, la médula ósea, la mucosa gástrica, los nódulos linfáticos, los grupos de Peyers, el omentum y otros tejidos inmunológicos.

Las composiciones antes descritas poseen utilidad para el tratamiento o la profilaxis del cáncer, las reacciones alérgicas y/o las dolencias tipificadas por la respuesta inmune de tipo Th2 y/o las dolencias asociadas a la eosinofilia.

Si se le considera de manera alternativa, al presente invención proporciona un uso para el tratamiento o la prevención de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio debida a los eosinófilos y la hiperreactividad del tracto respiratorio, a cuyos pacientes se les administre una composición farmacéutica como se describe anteriormente en el presente documento.

Además, la presente invención proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico que contiene:

(i): la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o

(ii): una secuencia que posee más de 66%, p.e. 70% ó 75%, de preferencia más de 80%, p.e. más de 90% ó 95% de identidad con la secuencia (i) (de acuerdo con la prueba descrita con anterioridad en el presente documento) o una secuencia que hibridiza con la secuencia (i) bajo condiciones de 2 x SSC, 65ºC (donde SSC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sodio, pH 7,2) que codifica para una proteína funcionalmente equivalente a la secuencia codificada por la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o (iii) un fragmento de la secuencia (i) o (ii) que codifica para un fragmento de proteína funcionalmente equivalente; o

un polipéptido que contiene

(i): la secuencia aminoacídica de la Figura 1, o

(ii): una secuencia que tiene más de 60%, p.e. 65% ó 70%, de preferencia más de 90% ó 95% de homología con la secuencia (i) (de acuerdo con la prueba descrita anteriormente en el presente documento) que proporciona una proteína funcionalmente equivalente, o

(iii): un fragmento funcionalmente equivalente de la secuencia (i) o (ii);

en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades alérgicas del tracto respiratorio y enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio causada por los eosinófilos, y una hiperreactividad del tracto respiratorio.

Tal como se define en el presente documento, el término tratamiento se refiere a la reducción, el alivio o la eliminación de uno o más síntomas de la dolencia que se está tratando, en relación con los síntomas antes del tratamiento. Por ejemplo, los síntomas que pueden modificarse comprenden la eosinofilia, la dismunición de la secreción de determinadas citoquinas, una respuesta inmune corrida hacia Th2, el tamaño de un tumor (p.e. al detener la proliferación, causar la diferenciación, o mediante la inducción o estimulación de respuestas inmunes antitumorales, o causando la muerte de algunas células), la respuesta alérgica, la presencia de autoanticuerpos, etc., que se tratan para lograr los efectos, en particular, como se define con respecto a la propiedades funcionales o los polipéptidos funcionalmente equivalentes.

La "prevención" de una dolencia se refiere a la demora o la prevención del inicio de una enfermedad, o a la reducción de su severidad, según resulta de la evaluación de la apariencia o la duración de uno o más síntomas de dicha condición.

Los cánceres que pueden prevenirse o tratarse, incluyen tumores malignos y premalignos, o benignos e incluyen carcinomas, sarcomas, glioma, melanoma y la enfermedad de Hodgkin, incluyendo cánceres de la vejiga, los riñones, el páncreas, el cerebro, la cabeza y el cuello, el pecho, el intestino, la próstata, los pulmones y los ovarios y las leucemias y los linfomas.

Las dolencias alérgicas que pueden tratarse o prevenirse incluyen los eczemas, la dermatitis, la rhinitis, las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio, el síndrome de hipereosinofilia, y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio causada por los eosinófilos y la hiperreactividad del tracto respiratorio, tales como el asma alérgica, el asma intrínseca, la aspergilosis broncopulmonar alérgica, la neumonía provocada por eosinófilos, la broquiectasis bronquitis alérgica, el asma ocupacional, el síndrome de la enfermedad del tracto respiratorio reactivo, la enfermedad pulmonar intersticial y el síndrome hipereosinofílico.

De preferencia, no obstante, la composición se utiliza para el tratamiento del asma. En una característica preferida adicional, la composición se utiliza para tratar las enfermedades respiratorias, en las cuales la eosinofilia desempeña algún papel, p.e., las alergias (como se describe anteriormente, en particular el asma) y la eosinofilia pulmo-
nar.

Los enfermos que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, en particular, primates, animales domésticos y de cría. O sea, los animales a los que debe aplicarse, de preferencia, el tratamiento incluyen a ratones, ratas, cobayos, gatos, perros, cerdos, cabras, ovejas, caballos y, con particular preferencia, humanos.

Como se mencionó anteriormente, de acuerdo a la invención, se pueden utilizar tanto moléculas de ácidos nucleicos como polipéptidos. En casos en los que se emplean moléculas de ácidos nucleicos, las mismas son aplicadas de forma conveniente de una manera que permita su expresión en el paciente, proporcionando, de esa manera, una forma de terapia génica. Por tanto, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento que contienen una molécula de ácido nucleico pueden usarse en métodos de terapia génica.

Así, por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos pueden proveerse en un liposoma, micela u otro vehículo portador adecuado que puede contener componentes de direccionamiento que permitan dirigir el mismo a células de interés.

Alternativamente, se puede empaquetar las moléculas en otros "vehículos" tales como virus, plásmidos o células (en particular células transfectadas que concuerden con la especie) que son bien conocidas en la técnica para este fin, lo que permite la expresión de la molécula residente.

Se conocen bien técnicas adecuadas para la transfección, que incluyen la electroporación, la microinyección, la lipofección, la adsorción, al transfección viral y la fusión de protoplastos.

La administración de las composiciones de la invención puede llevarse a cabo a través de cualquiera de las vías convencionales, p.e. mediante inhalación, por vía nasal, por vía oral, por vía rectal o parenteral, sea por inyección intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, o intravenosa. El tratamiento o la profilaxis mediante la aplicación tópica de una composición, p.e., una pomada en la piel también son posibles. Opcionalmente, se puede realizar la administración a intervalos, p.e. 2 o más aplicaciones, p.e 2-4 aplicaciones a intervalos de una hora, un día, una semana, o un mes, p.e. varias veces al día, o cada 3-5 días, o cada dos semanas, cada mes o cada tres meses.

Se ha observado, en un trabajo realizado acerca de la molécula relacionada cpn 60.2, que al vía de administración puede afectar la respuesta inmune que se genera. Por ejemplo, cuando Mtcpn 60.2 se administra por vía intranasal, se estimula un cambio de Th2 a Th1 aunque se registra el cambio contrario cuando se le administra por vía intraperitoneal. Por tanto, al vía de administración debe llevar en consideración la enfermedad que se vaya a tratar y, así, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, puede ser adecuada la administración intraperitoneal, mientras que en el tratamiento o la prevención de enfermedades alérgicas particulares puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante administración por vía intranasal.

En los métodos profilácticos de la invención, la administración (convenientemente oral o mediante inhalación o mediante inyección subcutánea o intramuscular) se realiza, de preferencia, a intervalos más extendidos, p.e, intervalos de 2-12 semanas. Para fines terapéuticos, la administración (convenientemente oral o mediante inhalación o mediante inyección subcutánea o intramuscular) se realiza de 1 a 4 veces durante un mismo día o a lo largo de 2 días.

El ingrediente activo de la composición de la invención puede incluir desde aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 99% en peso de la formulación, de preferencia desde aproximadamente 0,1% hasta aproximadamente 50%, por ejemplo 10%. De preferencia, las composiciones se formulan en forma de una dosis unitaria, p.e. con cada dosis conteniendo desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 1 g del ingrediente activo, p.e. 0,05 mg hasta 0,5 g, para un humano, p.e. 1-100 mg.

La dosificación exacta del componente activo a ser administrada y la extensión del curso del tratamiento dependerán, desde luego, de un número de factores que incluyen, por ejemplo, la edad y el peso del paciente, la dolencia específica que requiere tratamiento y su severidad, y la vía de administración. Por lo general, sin embrago, una dosis efectiva puede encontrarse en el rango desde aproximadamente 0,1 \mug/kg hasta aproximadamente 14 mg/kg, de preferencia de 0,1 a 1 mg/kg, p.e desde aproximadamente 1 mg hasta 1 g de polipéptido por día, en dependencia del animal que se esté tratando, y de la forma de dosificación, tomada como una dosis única. Así, por ejemplo una dosis diaria adecuada para un adulto puede estar desde 7 \mug hasta 1 g, p.e. 10 mg hasta 1 g por día, p.e. de 25 a 500 mg del polipéptido por día.

Dosificaciones similares o menores pueden utilizarse cuando se emplean las moléculas de ácidos nucleicos que se describe en el presente documento, p.e. desde aproximadamente 0,2 ng/kg hasta aproximadamente 2,5 mg/kg (p.e. desde aproximadamente 0,2 ng/kg hasta aproximadamente 2 ng/kg o desde aproximadamente 1,5 ng/kg hasta aproximadamente 2,5 mg/kg), como desde aproximadamente 14 ng hasta aproximadamente 175 mg para un adulto. Sin embrago, en los casos en que las moléculas de ácidos nucleicos se empaquetan en células o vectores, se pueden requerir cantidades proporcionalmente superiores o inferiores, en dependencia de la longitud del ADN que no codifica para el polinucleótido y las secuencias que ejercen influencia sobre el nivel de la expresión, p.e. cantidades 5 o 10 veces superiores, p.e. las moléculas de ácidos nucleicos descritas en el presente documento, empaquetadas en un vector, pueden utilizarse desde aproximadamente 1,0 ng/kg hasta aproximadamente 12,5 mg/kg.

Como se mencionó anteriormente, la familia de polipéptidos definida en el presente documento y las moléculas de ácidos nucleicos que las codifican estimulan la producción de un conjunto de citoquinas. Esto permite, por tanto, el uso de estos compuestos con el propósito expreso de estimular la producción de estas citoquinas sea o no que esto ocurra en una situación terapéutica/profiláctica. Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método in vitro para la estimulación de la producción de citoquinas en una célula, obtenida a partir de un paciente con una enfermedad alérgica del tracto respiratorio y/o una enfermedad respiratoria caracterizada por la inflamación del tracto respiratorio causada por los eosinófilos y una hiperreactividad del tracto respiratorio en la
que:

una molécula de ácido nucleico que contiene:

(i): la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o

(ii): una secuencia que posee más de 66%, p.e. 70% ó 75%, de preferencia más de 80%, p.e. más de 90% ó 95% de identidad con la secuencia (i) (de acuerdo con la prueba descrita con anterioridad en el presente documento) o una secuencia que hibridiza con la secuencia (i) bajo condiciones de 2 x SSC, 65ºC (donde SCC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sodio, pH 7,2) que codifica para una proteína funcionalmente equivalente a la secuencia codificada por la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o

(iii): un fragmento de la secuencia (i) o (ii) que codifica para un fragmento de proteína funcionalmente equivalente; o

un polipéptido que contiene

(i): la secuencia aminoacídica de la Figura 1, o

(ii): una secuencia que posee más de 60%, p.e. 65% ó 70%, de preferencia más de 80%, p.e. más de 90% ó 95% de homología con la secuencia (i) (de acuerdo con la prueba descrita con anterioridad en el presente documento) que proporciona una proteína funcionalmente equivalente, o

(iii): un fragmento funcionalmente equivalente a las secuencias (i) o (ii); se administran a dicha célula.

Tales métodos pueden llevarse a cabo in vitro, p.e. en células, tejidos u órganos fuera del cuerpo. Esta metodología puede, por ejemplo, utilizarse en métodos de investigación para identificar la molécula o moléculas que reaccionan con, o se unen a, o son activadas por, las moléculas de la invención, p.e. las moléculas receptoras de cpn10. Como corolario de tales métodos, se puede utilizar la estimulación de la producción de citoquinas para medir la presencia de las moléculas de la invención.

Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método in vitro para evaluar la presencia o la concentración de un polipéptido o un péptido de la invención en una muestra, cuando dicha muestra de aplica a una célula que ha sido obtenida a partir de un paciente que sufre una enfermedad alérgica del tracto respiratorio y /o una enfermedad respiratoria caracterizada por la inflamación del tracto respiratorio causada por los eosinófilos, y una hiperreactividad del tracto respiratorio y se mide el nivel de producción de una o más citoquinas y se les compara con el nivel de producción de dicha una o más citoquinas en una muestra control en la que el incremento por encima de los niveles de control proporciona una correlación con la presencia o la concentración de dicho polipéptido o péptido en dicha muestra.

Tal como se usa en este documento, el término "control" se refiere a una muestra que no contiene las moléculas de la invención o fragmentos que incrementen la producción de la(s) citoquina(s) que se miden. En caso necesario, se pueden generar curvas patrón utilizando moléculas de la invención para permitir la realización de una evaluación cuantitativa de la presencia o concentración de dichas moléculas, aunque también puede realizarse evaluaciones cualitativas. Este método también puede utilizarse para identificar moléculas de la invención.

Esto puede producir efectos terapéuticos o profilácticos beneficiosos, en cuyo caso, la invención se extiende para abarcar las moléculas de ácidos nucleicos y los polipéptidos como se describió anteriormente para su utilización en el tratamiento de dolencias que pueden resultar aliviadas, eliminadas o prevenidas mediante el incremento de citoquinas específicas, y la utilización de tales moléculas para la preparación de medicamentos con tal propósito.

De preferencia, las citoquinas que se incrementan p.e. un incremento de más de 10 ó más de 100 veces con respecto a los niveles normales se seleccionan del grupo que comprende a la IL-1\beta, la IL-2, la IL-6, la IL-8, la IL-10, la IL-12, el TNF\alpha, el interferón-\gamma y el GM-CSF.

Definiciones

: "ENFERMEDAD AUTOINMUNE". Este término pretende abarcar los casos en que puede demostrarse que el proceso autoinmune contribuye a la patogénesis de una enfermedad. Tales enfermedades, por lo regular, se encuentran asociadas con una respuesta inmune de linfocito T auxiliar de tipo 1 (Th-1).

: "DOLENCIAS ALÉRGICAS". Este término pretende abarcar las dolencias asociadas a una respuesta inmune de linfocito T auxiliar de tipo 2 (Th-2). En la reacción alérgica se manifiestan elevados niveles de IgE y la respuesta inmune Th-2 predomina sobre la respuesta Th-1, lo que provoca una respuesta inflamatoria. Ejemplos de dolencias alérgicas incluyen las siguientes: asma, rhinitis/fiebre del heno, eczema y anafilaxis.

: "ADYUVANTE". Este término pretende abarcar cualquier sustancia que, cuando se incorpora a, o se administra junto con, un antígeno, potencia la respuesta inmune.

: "Mtcpn 10", "cpn 10", "hsp 10", y "Pep 10" se utilizan de manera intercambiable a lo largo de la especificación, para hacer referencia a las secuencias aminoacídicas mostradas en la Figura 1.

A continuación, se describirá la invención en más detalle, por medio de los siguientes Ejemplos no limitantes en los cuales:

La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica y aminoacídica de la cpn 10 de M. tuberculosis;

La Figura 2 muestra la reducción de los niveles de eosinófilos en ratones con eosinofilia pulmonar inducida por ovoalbúmina, después de la administración de 5 dosis de Mtcpn 10 ("Pep 10").

Las Figuras 3 y 4 muestran los niveles de IL4 (Fig 3) y de INF-\gamma (Fig. 4) detectados en los BALs.

Materiales

Expresión y purificación de las proteínas chaperonina 60 de M. tuberculosis (cpn 10) las preparó el Prof. M. Singh (Centro Colaboradore de la OMS, Alemania) utilizando cromatografía convencional como se describe a continuación.

Purificación de la cpn 10 recombinante

El antígeno de 10 kDa se expresó en una cepa recombinante de E. coli (inducida por IPTG) como una proteína de fusión con la proteína de unión de maltosa (MBP) utilizando un vector pMAL-c disponible comercialmente (New England Biolabs). La purificación inicial se llevó a cabo en una columna de afinidad de amilosa. A continuación la proteína de fusión se digirió con el factor X_{a} y el antígeno de 10 kDa se purificó todavía más mediante una columna de intercambio aniónica, se dializó contra bicarbonato de amonio a 10 mM, se alicuotó y se liofilizó.

Se tomó gran cuidado en comprobar cada baño de proteína para evitar la contaminación por LPS, utilizando el ensayo de Limulus (Tasbona et al., 1998, J. Immunol., 161, 1414-1421). Cuando se detectaba contaminación por LPS, la misma se eliminaba en una columna de afinidad con polimixina B, y se recalculaban los niveles de LPS. La chaperoninas recombinantes, con bajos niveles de LPS se continuaron purificando en una columna Reactiva Roja, para eliminar proteínas y péptidos contaminantes (Tabona et al., 1998, supra).

Se determinaron los efectos in vitro de cpn 10 sobre la producción de Il-1\beta, IL-6, IL-8, IL-10, IL-2, TNF\alpha y GM-CSFen PBMCs humanos, utilizando un ELISA de dos sitios, como se describe en Tabona et al., 1998, supra.

Ejemplo 1

La cpn de Mycobacterium tuberculosis elimina el asma en el ratón

Este ejemplo muestra por primera vez que en un modelo murino de inflamación alérgica, la proteína cpn 10 de M. tuberculosis inhibe el reclutamiento de eosinófilos al tracto respiratorio en ratones inmunizados. Estos datos muestran que Mctpn 10 modula la inflamación del tracto respiratorio en los ratones y, por tanto, posee importantes implicaciones para el tratamiento y la prevención de enfermedades alérgicas.

Métodos

Modelo de inflamación murino: Se ha desarrollado un modelo murino de inflamación alérgica que permite la cuantificación del reclutamiento de los eosinófilos y los linfocitos T en el tracto respiratorio, en respuesta al reto por un antígeno. Además, se utiliza un sistema de monitoreo pulmonar de lo más moderno, que permite la determinación de los cambios de la mecánica pulmonar en respuesta a los agonistas bronconstrictores in vivo.

Protocolo de inmunización: Ratones de 6 a 8 semanas de edad C57B1/6 de tipo salvaje (proveedor local) se inmunizaron con ovoalbúmina (10 \mug mediante inyección intraperitoneal; en 1 mg de hidróxido de aluminio) el día 0 y se repitió 7 días después. Los días 14, 15 y 16 se colocó a los ratones en un contenedor de plexiglás (12 L) y se les expuso a una solución de ovoalbúmina nebulizada (10 mg/ml; De Vilibiss Ultraneb 90). Se inyectaron ratones Sham inmunizados de tipo salvaje con 1 mg de hidróxido de aluminio los días 0 y 7 y también se retaron con ovoalbúmina los días 14-16. La exposición a aerosol se llevó a cabo mediante exposición tres veces al día durante 20 minutos a intervalos de una hora y se llevó a cabo el lavado broncoalveolar, la colecta de los pulmones para la inmunohistoquímica y la mecánica pulmonar 24 h después del último reto de aerosol.

Aunque la ovoalbúmina no es un alergeno respiratorio que los sujetos asmáticos encuentren con frecuencia, las respuestas Th2 que se observan en modelos murinos de inflamación son análogas a las que se aprecian a continuación de la inmunización con polvo casero conteniendo ácaros. El perfil de citoquinas Th2 que generan ambos alergenos es similar. La ventaja de utilizar ovoalbúmina es que se encuentra fácilmente disponible y la actividad específica de este alergeno no cambia de una muestra a otra y, por tanto, se puede controlar la dosis de antígeno de una muestra a otra.

Tratamiento con BCG: Seis días después de la inmunización con ovoalbúmina (10 \mug), se inyectó a los ratones con BCG (log de unidades viables de BCG: -4, -5 y -6) por vía intravenosa. Al séptimo día, los ratones recibieron una inyección de estimulación con ovoalbúmina (10 \mug). El día número 13, los ratones recibieron una segunda administración de BCG en la misma dosis y vía descritas para el día 6. El día número 14, se situó a los ratones en una caja de plexiglás y se les expuso, tres veces, a ovoalbúmina nebulizada (solución al 1%) durante un período de 30 minutos, con intervalos de 1 hora. Este procedimiento se repitió los días 15 y 16. 24 horas después de la última exposición a ovoalbúmina, se anestesió a los ratones y se llevó a cabo un lavado alveolar para el conteo de eosinófilos.

Tratamiento con cpn 10: Se inmunizaron ratones provenientes del mismo lote de animales con ovoalbúmina y se trataron con Mtcpn 10 (10 \mug/animal) mediante goteo directo a la tráquea. Se trató a los ratones con Mctpn 10 el día número 6 y el día número 13 y luego 30 minutos antes del comienzo del protocolo de reto los días número 14, 15, y 16 (un total de 5 tratamientos).

Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 2. Hubo una supresión significativa del reclutamiento de eosinófilos al tracto respiratorio luego del reto con ovoalbúmina, lo que sugiere un efecto protector de Mtcpn 10 ("Pep10") en el asma.

Mediciones de citoquinas

Investigamos el efecto de cpn 10 sobre la producción de citoquinas en el suero y el lavado colectados 24 horas después del último reto. Llevamos a cabo mediciones de IL-4, IL-5 e INF-\gamma en muestras colectadas a partir de grupos de ratones tratados con 10 \mug de cpn 10 y 56 \mug de 60.1, ambos administrados siguiendo un esquema de tratamiento de cinco dosis.

No fue posible detectar niveles de citoquinas en el suero 24 horas después del último reto y no se detectó IL5 en ninguna muestra en este período. Los niveles de IL4 e INF-\gamma detectados en los BALs se muestran en las Figura 3 y la Figura 4.

Una ventaja importante de cpn 10 es que puede proporcionar un agente profiláctico, lo que se diferencia de un agente que es utilizado para tratar los síntomas agudos. En otras palabras, el tratamiento con cpn 10 puede impedir que las dolencias alérgicas, tales como el asma aparezcan.

En este ejemplo se describe el uso de cpn 10 en la prevención y el tratamiento del asma. Las personas entrenadas comprenderán que los resultados obtenidos son relevantes para otras dolencias alérgicas, tales como la rhinitis/la fiebre del heno, el eczema y la anafilaxis, porque todas las dolencias alérgicas tienen un mecanismo común (actividad incrementada de las células Th-2). Por tanto, si cpn 10 puede inhibir el asma, también debe inhibir las otras dolencias alérgicas.

Estos datos demuestran por primera vez que Mtcpn 10 puede suprimir la inflamación provocada por los eosinófilos en un modelo murino de asma. Esto muestra que esta proteína tiene el potencial para modular las inflamaciones del tracto respiratorio en el ratón, lo que tiene importantes implicaciones para el tratamiento y la prevención de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio, y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio causada por eosinófilos, y la hiperreactividad del tracto respiratorio.

Claims

1. El uso de una composición farmacéutica en la producción de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio causada por eosinófilos, y la hiperreactividad del tracto respiratorio, en el que la composición farmacéutica contiene una molécula de ácido nucleico que incluye:

(i): la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o

(ii): una secuencia que posee más de 66%, p.e. 70% ó 75%, de preferencia más de 80%, p.e. más de 90% ó 95% de identidad con la secuencia (i) o una secuencia que hibridiza con la secuencia (i) bajo condiciones de 2 x SCC, 65ºC (donde SCC = 0,15 M de NaCl, 0,015 M de citrato de sodio, pH 7,2), que codifica una proteína funcionalmente equivalente a la secuencia codificada por la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o

(iii): un fragmento de la secuencia (i) o (ii) que codifica para un fragmento de proteína funcionalmente equivalente; y un excipiente, un disolvente o un portador farmacéuticamente aceptables.

2. El uso de una composición farmacéutica en la producción de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio causada por eosinófilos y la hiperreactividad del tracto respiratorio, en el que una composición farmacéutica contiene un polipéptido que incluye:

(i): la secuencia aminoacídica de la figura 1, o

(ii): una secuencia que posee más de 60%, p.e. 65% ó 70%, de preferencia más de 80%, p.e. más de 90% ó 95% de homología con la secuencia (i), que proporciona una proteína funcionalmente equivalente, o (iii) un fragmento funcionalmente equivalente de cualquiera de las secuencias (i) o (ii); y un excipiente, un disolvente o un portador farmacéuticamente aceptables.

3. El uso, como se reivindica en las Reivindicación 2, en el que los fragmentos poseen entre 6 y 99 residuos de longitud.

4. El uso, como se reivindica en la Reivindicación 3, en el que las longitudes de los fragmentos se encuentran entre 6 y 60.

5. El uso, como se reivindica en la Reivindicación 3, en el cual los fragmentos se obtienen a partir de, o consisten en, al menos uno de los siguientes fragmentos de residuos de la secuencia mostrada en la Figura 1:

1-25

1-58

25-99

51-99

75-99.

6. El uso, como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, en el que la enfermedad respiratoria tratada es al menos una de las dolencias siguientes: rhinitis alérgica, asma alérgica, asma intrínseca, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonía provocada por eosinófilos, bronquiectasis bronquitis alérgica, asma ocupacional, síndrome de la enfermedad reactiva del tracto respiratorio, enfermedad pulmonar intersticial o síndrome hipereosinofílico.

7. El uso, como se reivindica en la Reivindicación 6, en el que la enfermedad respiratoria es el asma.

8. El uso, como se reivindica en la Reivindicación 6, en el que la enfermedad respiratoria es rinitis alérgica.

9. El uso de una composición farmacéutica como se definió en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 en la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio, caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio causada por eosinófilos, y la hiperreactividad del tracto respiratorio, en el que un medicamento contiene una dosis terapéutica o profilácticamente efectiva, o una pluralidad de dosis, de la composición.

10. Un método in vitro para la estimulación de la producción de citoquinas en una célula obtenida a partir de un paciente que padece una enfermedad alérgica del tracto respiratorio y/o una enfermedad respiratoria caracterizada por la inflamación del tracto respiratorio causada por eosinófilos, y la hiperreactividad del tracto respiratorio, en el que el método incluye la administración de una composición que contiene una molécula de ácido nucleico que incluye:

(i): la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o

un polipéptido que incluye:

(i): la secuencia aminoácidica de la figura 1, o

11. Un método, como se reivindica en la Reivindicación 10, en el que la producción de citoquinas se incrementa al menos 10 veces en comparación con los niveles normales.

12. Un método, como se reivindica en las Reivindicaciones 10 ú 11, en el que las citoquinas se seleccionan a partir de al menos una de las del grupo que incluye a la IL-1 \beta, la IL-2, la IL-6, la IL-8, la IL-10, la IL-12, el TNF-\alpha, el interferón \gamma y el GM-CSF.

13. El uso de una composición farmacéutica en la producción de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades alérgicas del tracto respiratorio y las enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación del tracto respiratorio causada por eosinófilos, y la hiperreactividad del tracto respiratorio, mediante la estimulación de la producción de citoquinas en una célula enferma, en el que dicha composición contiene una molécula de ácido nucleico que incluye:

(i): la secuencia nucleotídica de la Figura 1, o

un polipéptido que incluye:

(i): la secuencia aminoácidica de la figura 1, o

(ii): una secuencia que posee más de 60%, p.e. 65% ó 70%, de preferencia más de 80%, p.e. más de 90% ó 95% de homología con la secuencia (i), que proporciona una proteína funcionalmente equivalente, o (iii) un fragmento funcionalmente equivalente de cualquiera de las secuencias (i) o (ii)

y un excipiente, un disolvente o un portador farmacéuticamente aceptables.

14. Un uso, como se reivindica en la Reivindicación 13, en el que la producción de citoquina se incrementa al menos 10 veces en relación con los niveles normales.

15. Un uso, como se reivindica en las Reivindicaciones 10 ú 11, en el que las citoquinas se seleccionan a partir de al menos una de las del grupo que incluye a la IL-1 \beta, la IL-2, la IL-6, la IL-8, la IL-10, la IL-12, el TNF-\alpha, el interferón \gamma y el GM-CSF.

16. Un método in vitro para la evaluación de la presencia o la concentración de un polipéptido o péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en una muestra, en el que una muestra se aplica a una célula obtenida a partir de un paciente que padece una enfermedad alérgica del tracto respiratorio y/o una enfermedad respiratoria caracterizada por la inflamación del tracto respiratorio causada por eosinófilos, y la hiperreactividad del tracto respiratorio, y el nivel de la producción de una o más citoquinas se mide y se compara con el nivel de producción de dichas una o más citoquinas, en una muestra control en la que el incremento por encima de los niveles de control proporciona una correlación con la presencia o concentración de dicho polipéptido o péptido en dicha muestra.