DE69929454T2

DE69929454T2 - Neue aminosäuresequenzen, deren kodierende dns, antikörper dagegen und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69929454T2
Application number: DE69929454T
Authority: DE
Inventors: Yaakov Naparstek; Rina Ulmansky; Yechezkel Kashi
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 1998-11-05
Filing date: 1999-11-04
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2019-11-05
Also published as: AU1072400A; US20020150586A1; ATE315577T1; WO2000027870A1; EP1127064A1; US20050096285A1; AU759303B2; IL142709A0; JP4717213B2; EP1127064B1; CA2350340A1; JP2002530055A; DE69929454D1; CA2350340C; ES2257082T3; US6770281B2; US7247305B2; DK1127064T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft verschiedene Peptide, die zu Regionen von Hitzeschockprotein (HSP) homolog sind, DNA-Sequenzen, die solche Peptide codieren, DNA-Konstrukte, die die DNA-Sequenzen umfassen, Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Peptide gerichtet sind. Die Erfindung betrifft auch aktive Impfstoffe, die ein erfindungsgemäßes Peptid, eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt umfassen, und eine Zusammensetzung zur passiven Immunisierung, die einen erfindungsgemäßen Antikörper umfasst.
Hintergrund der Erfindung
In dieser gesamten Anmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen durch arabische Ziffern in Klammern Bezug genommen. Diese Veröffentlichungen sind hier vollinhaltlich aufgenommen und bilden einen Teil der Beschreibung.
Adjuvans-Arthritis (AA) ist ein experimentelles Modell der Autoimmun-Arthritis, das bei sensitiven Rattenstämmen, wie Lewis- oder Wistar-Inzuchtstämmen, nach Impfung mit hitzeabgetötetem Mycobacterium tuberculosis (MT) in komplettem Feundschen Adjuvans (CFA) induziert werden kann [1–3]. Die Erkrankung kann bei resistenten Rattenstämmen (z.B. Brown-Norway; Fisher [5, 6]) nicht induziert werden, und Lewis-Ratten entwickeln eine Resistenz gegen eine erneute Induktion der Erkrankung nach der Genesung von Arthritis.
Die Erfinder haben zuvor gezeigt, dass eine Resistenz gegen AA an einen suszeptiblen Rattenstamm durch intravenöse Infusion von Immunglobulinen aus den resistenten Stämmen übertragen werden kann und dass Resistenz mit dem Vorliegen von Antikörpern gegen das 65-kD-MT-Hitzeschockprotein (HSP 65) einhergeht [4].
Hitzeschockproteine sind eine Familie hochkonservierter Proteine. Es gibt ~50% Aminosäureidentität zwischen dem mycobakteriellen HSP 65 und Säuger-HSP 60 [21]. Die Rolle des 65-kD-Hitzeschockproteins (HSP 65) von MT bei der Pathogenese von autoimmuner Arthritis sowohl bei Versuchtieren [7, 8] als auch bei Menschen [9–11] wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht. Zum Beispiel beschreiben Barker et al. [32] die Suppression arthritogener Immunantworten bei Mäusen, denen HSP65 und Pristan verabreicht wurde. Das zum Hervorrufen der Antwort verwendete Antigen war Volllängen-HSP65, und es wurde kein Versuch gemacht, die Wirkung spezifischer Subdomänen oder Peptide, die von diesem Protein stammen, zu untersuchen.
AA kann durch einen T-Zell-Klon passiv übertragen werden, der gegen die Reste 180–188 des MT-HSP 65 reaktiv ist, und bei Patienten, die an rheumatoider Arthritis (RA) leiden, hat man eine Verbindung zwischen T-Zell-Antworten auf HSP 65 und frühen Stufen der Gelenkentzündung gefunden [7, 12–14]. Paradoxerweise führt eine Präimmunisierung mit dem mycobakteriellen HSP 65 zu Resistenz gegen die Induktion der Erkrankung durch MT, und es wird angenommen, dass diese schützende Wirkung von T-Zellen, die für HSP 65 spezifisch sind, vermittelt wird [7, 15–16]. Obwohl arthritische Ratten heftige T-Zell-Antworten auf Selbst-HSP und Peptid 180–188 des MT-HSP entwickeln, ist ebenso keines von diesen arthrogen, wenn es in Arthritis-suszeptible Ratten injiziert wird [15, 17]. Diese Ergebnisse und andere legen nahe, dass HSP Epitope enthalten kann, die mit der Erkrankung zusammenhängen, und andere Epitope, die Resistenz verleihen, [5, 19, 20]. Sowohl die pathogene Immunantwort als auch die schützende Wirkung wurden Anti-HSP-T-Zellen zugeschrieben. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die feine Epitopspezifität der Anti-HSP-Antikörper Arthritis-suszeptibler und -resistenter Ratten.
Außerdem haben die Erfinder gefunden, dass naive Lewis-Ratten keine Antikörper für bestimmte Epitope des mycobakteriellen HSP 65 besitzen, die man natürlicherweise in jungen BN- und alten naiven Lewis-Ratten findet und die junge Lewis-Ratten nach Genesung von der Erkrankung erwerben. Eine Analyse der Primär- und Tertiärstruktur des gesamten MT-HSP-65-kD-Moleküls zeigte, dass die "schützenden" Epitope potenzielle B-Zell-Epitope mit einer nicht-konservierten Aminosäuresequenz sind, die man auf der äußeren Oberfläche des Moleküls findet.
Eine Präimmunisierung von Lewis-Ratten mit einem der "schützenden" Epitope vor der Induktion der Erkrankung induzierte Antikörper gegen das gesamte Molekül sowie Resistenz gegen die Krankheitsinduktion. Dieses Peptid entspricht auch dem Selbst-HSP-60-Epitop, gegen das man in den Arthritis-resistenten Ratten, aber nicht in den Arthritis-suszeptiblen naiven Lewis-Ratten Antikörper findet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft B-Zell-Epitop-Peptide, die im Wesentlichen die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 1 angegeben, und biologisch funktionelle Homologe und Derivate davon umfassen.
Genauer gesagt, betrifft die Erfindung B-Zell-Epitop-Peptide mit im Wesentlichen der Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 2 angegeben, und biologisch funktionelle Homologe und Derivate davon und ein B-Zell-Epitop-Peptid mit im Wesentlichen der Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 3 angegeben, und biologisch funktionelle Homologe und Derivate davon.
Außerdem betrifft die Erfindung ein B-Zell-Epitop-Peptid, das im Wesentlichen die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 4 angegeben, und biologisch funktionelle Homologe und Derivate davon umfasst.
Die erfindungsgemäßen B-Zell-Epitop-Peptide können synthetische Peptide und chemisch modifizierte Peptide sein.
Die erfindungsgemäßen B-Zell-Epitop-Peptide sind in der Lage, eine Immunität gegen autoimmune und/oder entzündliche Störungen zu verleihen.
Unter einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Nucleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes B-Zell-Epitop-Peptid codiert, und DNA-Konstrukte, die dieses umfassen.
Unter noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Impfstoffe, die als Wirkstoff eine wirksame Impfstoffmenge mindestens eines erfindungsgemäßen B-Zell-Epitop-Peptids oder eine erfindungsgemäße Nucleinsäure umfassen. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe sind besonders zum Verleihen von Immunität gegen autoimmune oder entzündliche Störungen geeignet.
Außerdem betrifft die Erfindung noch Antikörper, die gegen die erfindungsgemäßen B-Zell-Epitop-Peptide gerichtet sind, und Zusammensetzungen, die sie umfassen. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind besonders zur passiven Impfung gegen autoimmune oder entzündliche Störungen geeignet.
Beschreibung der Figuren
1 Aminosäurevergleich von drei HSP-60-Sequenzen Mycobacterium tuberculosis, Ratten-HSP 60 und humanes HSP 60 (Sequenzen P06806, P19227 und P10809, entsprechend SEQ ID: Nr. 6, 7 bzw. 8) wurden mit dem Pileup-Programm des GCG-Wisconsin Package v9.0 verglichen. Die konservierten Regionen sind angedeutet (Konsensus). Fette, unterstrichene Reste geben die bevorzugten Peptide wieder.
2 Dreidimensionale Struktur des E.-coli-GroEL-GroES-Komplexes
Der heptamere GroES-Ring ist in dunkelgrau dargestellt. Die beiden heptameren GroEL-Ringe sind in hellgrau gezeigt. Die Peptide 6–7 (Aminosäuren 31–52) und 31 (Aminosäuren 181–197) sind ebenfalls angegeben.
3a–3b Die Stellung der Peptide 6, 7 und 31 im HSP-65-Monomer
Die Stellung der Peptide 6, 7 und 31 im HSP-65-Monomer ist in einer Sekundärstrukturkonfiguration (3a) und im Raummodell (3b) angegeben.
4 Impfung mit HSP-Peptiden
Eine Impfung gegen AA mit den HSP-Peptiden 6, 7 und R5 ist gezeigt. PBS wurde als Kontrolle eingesetzt.
5 Das schützende Motiv in den Peptiden 6, 7 und R5
Das gemeinsame Motiv in den Peptiden 6, 7 und R5, V-E-WG-P, ist dargestellt.
6 Restriktionskarte von pTARGET Eine Restriktionskarte des Plasmids pTARGET ist gezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft B-Zell-Epitop-Peptide, die im Wesentlichen die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 1 angegeben, und biologisch funktionelle Homologe und Derivate davon umfassen.
Vorzugsweise hat das B-Zell-Epitop-Peptid nach der ersten Ausführungsform der Erfindung im Wesentlichen die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 2 angegeben, oder im Wesentlichen die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 3 angegeben.
Die Erfindung betrifft ferner ein B-Zell-Epitop-Peptid, das im Wesentlichen die Aminosäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 4 angegeben, und biologisch funktionelle Homologe und Derivate davon umfasst.
Die Erfindung betrifft auch eine Nucleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes B-Zell-Epitop-Peptid codiert.
Genauer gesagt, betrifft die Erfindung eine DNA-Sequenz, die im Wesentlichen die Nucleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID Nr. 5 angegeben, und biologisch funktionelle Derivate davon umfasst. Diese Nucleinsäuresequenz codiert ein B-Zell-Epitop-Peptid mit im Wesentlichen der durch SEQ ID Nr. 4 angegebenen Sequenz.
Die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Mit dem Ausdruck "biologisch funktionelle Homologe und Derivate" sind alle Varianten, einschließlich Deletion, Substitution und/oder Insertion eines Aminosäurerestes in den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen oder einer Nucleinsäure in den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen, die die biologische Aktivität der Peptide nicht verändern, oder Peptide, die durch die Nucleinsäuresequenzen codiert werden, gegen Autoimmunerkrankungen gemeint. Somit soll dieser Ausdruck so verstanden werden, dass er Peptide mit ähnlicher Struktur, Peptide oder deren Derivate, die von den schützenden Antikörpern erkannt werden, und/oder Peptide oder deren Derivate, die nach Immunisierung schützende Antikörper induzieren können, bezeichnet.
Die Erfindung betrifft ferner DNA-Konstrukte, die die erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz oder funktionelle Homologe und Derivate davon umfassen. Die erfindungsgemäßen Konstrukte können außerdem zusätzliche Elemente, wie Promotoren, regulatorische und Kontrollelemente, Translations-, Expressions- und andere Signale, die einsatzfähig mit der erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenz verbunden sind, umfassen.
Die Erfindung betrifft auch einen Impfstoff, der als Wirkstoff eine wirksame Impfstoffmenge mindestens eines erfindungsgemäßen B-Zell-Epitop-Peptids enthält. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe sind besonders dazu bestimmt, Immunität gegen entzündliche und Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel rheumatoide Arthritis oder Adjuvans-Arthritis, zu verleihen.
Mit dem Ausdruck "wirksame Impfstoffmenge" ist eine Menge gemeint, die ausreicht, um das Immunsystem direkt oder indirekt zu stimulieren und Immunität gegen entzündliche und Autoimmunerkrankungen zu verleihen. Eine solche wirksame Menge wird je nach der Schwere der Erkrankung, dem Alter, Geschlecht und Gewicht des Patienten sowie dem allgemeinen Zustand des Patienten und anderen Überlegungen, die dem behandelnden Arzt bekannt sind, bestimmt. Bevorzugte Dosen pro Injektion können 0,02–2 mg/kg Körpergewicht betragen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können alternativ als Wirkstoff mindestens eine erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz umfassen.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können gegebenenfalls außerdem pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel, Additive, Excipienten und Adjuvantien umfassen. Mit den Ausdrücken "pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel, Additive, Excipienten und Adjuvantien" ist jedes inerte, nicht-toxische Material gemeint, das zur effizienten Zufuhr des Wirkstoffs beitragen kann.
Der Begriff "Antikörper", wie in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können in Kaninchen, Hühnern, Mäusen, Ratten, Schafen oder ähnlichen Säugern erzeugt werden. Die Erzeugung polyklonaler Antikörper gegen Peptide ist in den obengenannten Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc., Kapitel 9, beschrieben.
Monoklonale Antikörper können aus B-Zellen, die aus der Milz oder den Lymphknoten von immunisierten Tieren, insbesondere Ratten oder Mäusen, entnommen wurden, durch Fusion mit immortalisierten B-Zellen unter Bedingungen, die das Wachstum von Hybridzellen begünstigen, hergestellt werden. Für die Fusion muriner B-Zellen ist die Zelllinie Ag-8 bevorzugt.
Die Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper ist in vielen Artikeln und Lehrbüchern, wie in dem vorstehend genannten Kapitel 2 von Current Protocols in Immunology, beschrieben. Das dortige Kapitel 9 beschreibt die Immunisierung von Labortieren mit Peptiden. Milz- oder Lymphknotenzellen dieser Tiere können auf die gleiche Weise, wie Milz- oder Lymphknotenzellen von mit Protein immunisierten Tieren, zur Erzeugung monoklonaler Antikörper, wie im dortigen Kapitel 2 beschrieben, verwendet werden.
Der Begriff "Antikörper" soll auch sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente davon, wie zum Beispiel Fv, Fab und F(ab')2, die zur Antigenbindung in der Lage sind, beinhalten. Fab- und F(ab')2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie werden schneller aus dem Kreislauf ausgeschieden und können weniger unspezifische Gewebebindung aufweisen als ein intakter Antikörper.
Von einem Antikörper wird gesagt, er sei "gerichtet gegen" ein Molekül, wenn er in der Lage ist, spezifisch mit dem Molekül zu reagieren und dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Begriff "Epitop" soll den Teil eines Moleküls bezeichnen, der in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, und der auch durch den Antikörper erkannt werden kann. Epitope oder "Antigendeterminanten" bestehen gewöhnlich aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten, und haben spezifische dreidimensionale Struktureigenschaften sowie spezifische Ladungseigenschaften.
Ein "Antigen" ist ein Molekül oder ein Teil eines Moleküls, das in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, und das zusätzlich in der Lage ist, in einem Tier die Produktion eines Antikörpers zu induzieren, der zur Bindung an ein Epitop dieses Antigens in der Lage ist. Ein Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop haben. Die obengenannte spezifische Reaktion soll andeuten, dass das Antigen auf eine hochselektive Weise mit seinem entsprechenden Antikörper und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die durch andere Antigene hervorgerufen werden können, reagiert.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können in Form von Zusammensetzungen für die Verwendung bei passiver Immunisierung bereitgestellt werden. Während solche Zusammensetzungen gewöhnlich durch Injektion verabreicht werden, ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung allein auf diesen Weg beschränkt ist. In der Regel werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen jedoch durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht. Gelegentlich können auch der intravenöse oder intraperitoneale Weg zur Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden.
Zusätzlich zum Wirkstoff (d.h. dem Antikörper) können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch ein Puffermittel, ein Mittel, das dessen Osmolarität einstellt, und gegebenenfalls ein oder mehrere weitere Additive, wie Träger, wie im Stand der Technik bekannt, umfassen.
Ein bevorzugtes Puffermittel ist phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), in der ebenfalls die Osmolarität eingestellt wird.
Eine bevorzugte Zusammensetzung weist keinen Träger auf. Solche Formulierungen werden vorzugsweise zur Verabreichung durch Injektion, einschließlich intramuskulärer und intravenöser Injektion, verwendet.
Die Herstellung pharmazeutischer und immunisierender Zusammensetzungen ist im Stand der Technik bekannt und wurde in vielen Artikeln und Lehrbüchern beschrieben, siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. Hrsg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990.
Es wurde gezeigt, dass die Entwicklung von Autoimmun-Diabetes bei der NOD-Maus durch das Vorliegen von T-Zellen, die gegen das p277-Peptid des HSP 60 reaktiv sind, gekennzeichnet ist. Es wurde ferner gezeigt, dass das p277-Peptid als therapeutischer Impfstoff zum Aufhalten von NOD-Diabetes verwendet werden kann [28]. Es wurde gezeigt, dass das p277-Peptid auch Autoimmun-Diabetes aufhält, der durch das Streptozotocin-Toxin induziert wurde [29]. Ebenso können die erfindungsgemäßen Impfstoffe auch zum Unterdrücken einer Autoimmunerkrankung verwendet werden.
Ferner können die erfindungsgemäßen Impfstoffe auch zur Verhinderung von Rückfällen von Autoimmunerkrankungen, die viele Autoimmunerkrankungen kennzeichnen, verwendet werden. Prävention eines Rückfalls ist daher Teil des therapeutischen Ansatzes gegen diese Störungen. Es wurde gezeigt, dass das obige Peptid p277 Diabetes bei NOD-Mäusen verhindert, indem es die Anti-p277-Immunität in einem frühen Lebensstadium abschaltet. Es wurde später gezeigt, dass es einen Autoimmunvorgang sogar dann aufhält, wenn dieser weit fortgeschritten ist [28].
Eine weitere Möglichkeit ist, dass Antikörper gegen das HSP-Molekül eine Entzündung unterdrücken, indem sie die proinflammatorische Wirkung des HSP auf das angeborene Immunsystem hemmen. Es wurde gezeigt, dass mycobakterielles HSP65 die Freisetzung proinflammatorischer Cytokine aus menschlichen monozytischen Zellen induziert [18], und von Säuger-HSP60 wurde gezeigt, dass es mit IFN-γ synergistisch wirkt und proinflammatorische Cytokine, wie IL-12 und IL-15, fördert [31]. Die Induktion von Anti-Mycobakterien-/Anti-Selbst-HSP-Antikörpern kann solche proinflammatorischen Wirkungen unterdrücken.
Spezifische Immunglobuline (Antikörper) werden üblicherweise zur Prävention und Behandlung von Infektionskrankheiten (d.h. viraler Hepatitis) verwendet. Dies wird als passive Impfung bezeichnet. Immunglobuline können auch zur Unterdrückung oder Verhinderung von Rückfällen von Autoimmunerkrankungen, wie ITP (immune thrombocytopenische Purpura), Myasthenia Gravis (MG) und anderen Autoimmunerkrankungen, verwendet werden [30].
Somit betrifft die Erfindung unter einem weiteren Aspekt einen Antikörper, der gegen mindestens ein erfindungsgemäßes B-Zell-Epitop-Peptid oder funktionelle Homologe und Derivate davon, die die Produktion des genannten Antikörpers induzieren können, gerichtet ist.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können polyklonale oder monoklonale Antikörper sein.
Unter noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zur passiven Immunisierung, umfassend mindestens einen erfindungsgemäßen Antikörper, die gegebenenfalls außerdem pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel, Additive, Excipienten und Adjuvantien umfassen kann. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist besonders zur passiven Impfung oder Immunisierung gegen und zur Behandlung von Autoimmun- oder inflammatorischen Störungen, zum Beispiel rheumatoider Arthritis, bestimmt.
Die Erfindung wird auf Basis der folgenden Beispiele, die nur veranschaulichend sind und die Erfindung in keiner Weise beschränken, detaillierter beschrieben. Viele Modifikationen und Varianten der vorliegenden Erfindung sind angesichts der vorliegenden Lehren möglich. Es sollte daher selbstverständlich sein, dass die Erfindung innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche anders ausgeführt werden kann als spezifisch beschrieben.
Die folgenden Beispiele zeigen die Anti-MT-HSP-Antikörperantwort verschiedener Ratten und ihre Korrelation mit Suszeptibilität für die Induktion von Arthritis. Nur eine beschränkte Anzahl von Epitopen im bakteriellen HSP-Molekül wird durch Rattenantikörper erkannt. Das Repertoire dieses Antikörpers unterscheidet sich zwischen resistenten und suszeptiblen Stämmen. Es wurde gefunden, dass resistente Stämme auf Peptide, die man auf der äußeren Oberfläche des Moleküls findet, sowie auf das gesamte Molekül reagieren. Dagegen reagierten Antikörper von naiven Lewis-Ratten mit einer kleineren Anzahl von Peptiden, die auf der äußeren Oberfläche des Moleküls weniger exponiert sind, und reagierten nicht mit intaktem HSP. Das Vorliegen von Antikörpern gegen einige der Epitope sowie das gesamte MT-HSP kann mit Resistenz gegen die Induktion von Arthritis in Verbindung gebracht werden, und sie wurden daher als "schützende" Epitope bezeichnet.
Es wurde zuvor beschrieben, dass die T-Zell-Antwort auf bakterielles HSP eine Determinantenstreuung zeigt. Die vorliegenden Daten, die in den folgenden Beispielen genannt sind, zeigen, dass es auch eine deutliche B-Zell-Determinantenstreuung gibt, und dass diese Streuung auch spontan, nämlich ohne absichtliche Impfung, erfolgen kann. Die B-Zell-Epitope, unterscheiden sich von den T-Zell-Epitopen, wie gezeigt wird. Diese Beobachtung ist von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung.
Junge naive Lewis-Rattett erkannten nur zwei bakterielle Epitope: die Peptide 40 und 63. Vier Monate alte Lewis-Ratten erkannten zusätzlich die Peptide 6, 36 und 45, und neun Monate alte Lewis-Ratten erkannten die Peptide 7 und 31 zusätzlich zu allen anderen erwähnten Peptiden. Die Erkennung dieser Peptide geht auch mit der Erkennung des gesamten bakteriellen HSP-Moleküls einher.
Das B-Zell-Epitop-Repertoire der jungen BN-Ratten ist ähnlich demjenigen alter Lewis-Ratten, einschließlich nur eines zusätzlichen Peptids, Peptid 59. Lewis-Ratten, die mit CFA immunisiert wurden, reagierten auf alle vorstehend genannten Peptide sowie auf zwei zusätzliche Peptide, nämlich 21 und 84.
Obwohl die Anti-HSP-Peptid-Antikörper, die man in naiven alten Lewis-Ratten und in naiven jungen BN-Ratten findet, als natürliche Antikörper bezeichnet werden, ist es möglich, dass sie als Antwort auf eine Exposition dieser Ratten gegenüber Umwelt-Pathogenen hervorgerufen wurden (wie es "natürliche" Antikörper tatsächlich immer sein können) und dass die Epitopstreuung als Antwort auf diese Pathogene in BN-Ratten schneller, früher und stärker erfolgt als in der Lewis-Ratte. Lewis-Ratten müssen mit CFA immunisiert werden, um die natürliche Antwort von BN-Ratten nachzuahmen. Die Ähnlichkeit des Antikörperrepertoires der naiven BN-Ratten mit demjenigen der immunisierten Lewis-Ratte unterstützt diese Möglichkeit.
Die Art der B-Zell-Epitope und die Korrelation zwischen Erkennung bestimmter Epitope und dem gesamten Molekül kann anhand der nachstehend dargestellten Primär- und Tertiärstrukturanalyse des Moleküls besser verstanden werden.
Um zu sehen, ob die schützenden Anti-HSP-Antikörper durch Immunisierung mit den "schützenden" Peptiden induziert werden können, wurden Lewis-Ratten mit den verschiedenen Peptiden ohne Freundsches Adjuvans immunisiert. Die Immunisierung mit drei Peptiden, den bakteriellen Peptiden 6 und 7 und dem Säuger-Peptid 5, führte zur Produktion von Antikörpern gegen bakterielles Peptid 6 sowie zu einer Anti-HSP-Antwort, was zeigte, dass Antikörper gegen ein "externes" Peptid zur Erkennung des gesamten Moleküls führen. Eine Induktion dieser Antikörper führte auch zu Krankheitsresistenz.
Obwohl der Mechanismus der Erkrankungsresistenz, die durch die natürlichen sowie die induzierten Anti-HSP-Antikörper induziert wird, noch nicht aufgeklärt wurde, ist es möglich, dass die Antikörper gegen MT-HSP die frühen Schritte der Induktion pathogener T-Zellen gegen das Peptid hemmen, indem sie in die Antigenprozessierung oder die T-Zell-Erkennung der pathogenen Epitope eingreifen. Alternativ können sie die Effektorschritte der pathogenen Antwort durch Bindung an das Selbst-HSP-kreuzreagierende Zielantigen verhindern.
Die T-Zell-Antwort AA-suszeptibler Lewis- und AA-resistenter WKA-Wistar-Ratten gegen das bakterielle HSP 65 kD wurde gründlich untersucht. Es wurde gezeigt, dass in den frühen Post-Immunisierungsstadien die Lewis-T-Zellen auf mehrere Determinanten reagieren, die man am N-Terminus sowie am Carboxyterminus des Moleküls findet, wohingegen später eine Verschiebung zu carboxyterminalen Epitopen entwickelt wurde. Die frühe T-Zell-Antwort von Wistar-Ratten war ähnlich derjenigen der späten Antwort der Lewis-Ratten. Weil die 3D-Struktur des Moleküls nicht zeigt, dass sich die carboxy- und N-terminalen Stellen an unterschiedlichen Stellungen des Moleküls befinden, ist es nicht überraschend, dass die B-Zell-Epitope entlang des gesamten Moleküls ohne eine Auswahl entweder des Carboxy- oder des N-Terminus des Moleküls gefunden wurden.
Ein Vergleich zwischen den veröffentlichten dominanten T-Zell-Epitopen und den erfindungsgemäßen B-Zell-Epitopen ergab keine gemeinsamen Epitope. Im Gegensatz dazu geht das Fehlen natürlicher Antikörper gegen bestimmte Epitope, wie 6, 7 oder 31 bei den naiven Lewis-Ratten, mit einer frühen T-Zell-Antwort gegen diese Epitope einher, wohingegen das Vorliegen von Antikörpern gegen Epitope, wie 40 und 63, mit einem Fehlen einer frühen T-Zell-Antwort einhergeht. Auf Basis dieser Korrelationen kann vorgeschlagen werden, dass das Vorliegen natürlicher Antikörper gegen bestimmte Epitope tatsächlich die T-Zell-Antwort gegen sie hemmen kann, wohingegen das es Fehlen von Antikörpern den T-Zellen gestattet, auf diese Epitope zu reagieren. Zum Beispiel können AA-suszeptible Lewis-Ratten, die keine natürlichen Antikörper gegen das bakterielle Peptid 31 haben, eine T-Zell-Antwort gegen dieses Peptid entwickeln, und diese pathogenen T-Zellen können Arthritis induzieren.
Wie zuvor erwähnt, gab es keine eindeutige Korrelation zwischen Krankheitsresistenz und dem Vorliegen von Anti-HSP-Antikörpern. Junge naive Lewis-Ratten hatten keine nachweisbaren Antikörper gegen das HSP-Molekül, wohingegen neun Monate alte Lewis-Ratten diese Antikörper in einem signifikanten Titer entwickelten. Parallel zur Entwicklung der Anti-HSP-Antwort wurden die alten Ratten auch resistent gegen die Induktion von Arthritis. Junge Lewis-Ratten erwarben sowohl die Antikörper als auch Erkrankungsresistenz nach Immunisierung mit CFA, und die natürlicherweise resistenten BN-Ratten hatten spontan Anti-HSP-Antikörper, ohne dass eine Immunisierung nötig war. Es ist daher möglich, dass diese Antikörper das bakterielle HSP unmittelbar nach der Immunisierung binden und verhindern, dass es für den zellulären Zweig des Immunsystems zugänglich ist.
Wie zuvor bemerkt, sind die Epitope, die von den B-Zellen aus dem bakteriellen HSP "ausgewählt" werden, Epitope, die sehr wahrscheinlich infolge von Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen relativ wenig Homologie mit dem Selbst-HSP haben.
Eine Analyse des Anti-Selbst(Ratte)-HSP-Antikörper-Repertoires zeigte tatsächlich, dass es eine beschränkte Zahl von Epitopen gibt, die von den Ratten-Immunglobulinen im Selbst-HSP-Molekül erkannt werden. Naive junge Lewis-Ratten reagierten weder auf ein Selbst-Peptid noch auf das gesamte Selbst-HSP-60- Molekül. BN- und Post-AA-Lewis-Ratten, die mit 8–10 bakteriellen HSP-Epitopen reagierten, reagierten nur auf zwei Epitope im Selbst-HSP, die Peptide M5 und M30, sowie auf das gesamte Selbst-HSP-Molekül.
Eine Expression des Säuger- (oder Selbst-) HSP wird in entzündeter Synovialis von Ratten mit AA herauf reguliert [22], und es wurde eine kreuzreaktive Immunerkennung zwischen dem mycobakteriellen HSP 65 kD und endogenem Selbst-HSP 60 kD auf T-Zell-Ebene gefunden (23–25].
Weil die Anti-Selbst-Antikörper nur in den resistenten Ratten gefunden wurden, ist es möglich, dass Antikörper, die mit dem Selbst-HSP kreuzreagieren, dieses vor den pathogenen T-Zellen verbergen und somit als schützende Antikörper wirken können.
Es ist interessant festzustellen, dass eines der zwei selbstschützenden Epitope das Selbst-Peptid 5 ist, das das homologe Ratten-Epitop zu dem bakteriellen schützenden Peptid 6 ist. Außerdem führte eine Immunisierung mit den bakteriellen Peptiden 6 und 7 und mit dem Säuger-Peptid 5 zur Produktion von Anti-bakterielles-HSP-6- und Anti-bakterielles-HSP-Antikörpern sowie zum Schutz gegen Erkrankungsinduktion. Betrachten der Primärstruktur dieser drei Peptide führt zu dem Schluss, dass sie ein gemeinsames Motiv (V--E--W G-P) exprimieren, bei dem es sich um das schützende Motiv dieser Peptide handeln könnte (5).
Daher kann die humorale Immunantwort gegen das bakterielle HSP auf eine begrenzte Zahl potenzieller B-Zell-Epitope abzielen. Diese Epitope sind Peptidabfolgen, die sich zwischen den Aminosäuren befinden, die als Krümmer und Spacer wirken, und man findet sie in nicht-konservierten Teilen des Moleküls. Die Erkennung von B-Zell-Epitopen, die auf der Oberfläche des Moleküls exponiert sind, führt zur Bindung des gesamten Moleküls und geht mit Resistenz gegen die Induktion von Arthritis einher.
Diese Resistenz tritt in einigen Rattenstämmen natürlicherweise auf, wohingegen sie in anderen mit dem Alter oder nach Immunisierung mit HSP erworben werden kann. Eine Immunisierung mit einigen der "schützenden" Epitope kann sowohl zu Erkrankungsresistenz als auch zu dem serologischen Profil führen, das in den resistenten Stämmen vorhanden ist.
Die vorliegende Erfindung kann auch ein Verfahren zum Vorhersagen von Suszeptibilität/Prädisposition für die Entwicklung von Autoimmun-Arthritis bereitstellen. Im Rattensystem wurde gezeigt, dass naive junge Lewis-Ratten keine Antikörper gegen Peptid 6 des HSP besitzen und dass sie für die Entwicklung von Arthritis nach Exposition oder Immunisierung durch HSP suszeptibel sind. Auf ähnliche Weise können gesunde Individuen, denen Subgruppen von Antikörpern gegen HSP-spezifische Peptide fehlen, für das Einsetzen von Arthritis suszeptibel sein. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Test zur Untersuchung und Bestimmung von Suszeptibilität/Prädisposition für Arthritis bereit. Der Test kann mittels ELISA durchgeführt werden, in dem die Peptide an die feste Phase gebunden und Serumproben hinzugefügt werden, gefolgt von Zugabe von Anti-Human-IgGs. Andere bekannte immunologische Analysetechniken können ebenfalls verwendet werden.
Die Erfindung kann anhand der folgenden Beispiele, die nur veranschaulichend sind und die Erfindung nicht darauf beschränken, detaillierter beschrieben werden.
Beispiele
Materialien
Tiere: Weibliche Inzucht-Lewis-Ratten, 6 Wochen oder 9 Monate alt, wurden von Harlan Lab., Israel, erhalten. Weibliche Brown-Norway- (BN-) Ratten, 6 Wochen alt, wurden von Harlan Sprague-Dawley, USA, erhalten.
Antigene und Antikörper: Rekombinantes HSP 65 von Mycobacterium tuberculosis war ein Geschenk von Dr. M. Singh (The WHO Recombinant Protein Bank, Deutschland). Rekombinantes Säuger-HSP 60 wurde von StressGen Biothec. Corp. (Victoria, BC, Kanada) bezogen.
Synthetische Peptide von MT-HSP 65 waren ein Geschenk von Dr. L. Adorini (The Roche Milano Ricerche, Mailand, Italien). Synthetische Peptide des Säuger-HSP 60 waren ein Geschank von Dr. I. Cohen (The Weizmann Institute, Rehovot, Israel). Mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziege-Anti-Ratte-IgG wurden von Jackson ImmunoResearch Lab. Inc. (Avonsdale, PA) bezogen.
Verfahren
Induktion und klinische Untersuchung von Adjuvans-Arthritis: Lewis-Ratten wurde 1 mg Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco, Detroit, MI) in komplettem Freundschen Adjuvans (Difco) subkutan an der Schwanzbasis injiziert. Die Schwere der Arthritis (Arthritis-Index) wurde blind wie folgt bewertet: 0 – keine Arthritis; 1 – Gelenkröte; 2 – Röte und Schwellen des Gelenks. Die Knöchel- und die Tarsus-Metatarsus-Gelenke jeder Pfote wurden bewertet. Es kann eine maximale Bewertung von 16 erhalten werden, aber eine Bewertung über 8 deutet auf eine schwere Erkrankung.
Dot-Blot-Test: Die Antigene wurden in PBS gelöst, und Proben von 1 μg wurden auf Nitrocellulose-Papier adsorbiert. Das Papier wurde luftgetrocknet und mit 1% BSA in PBS für 20 min inkubiert, um die unspezifische Bindung zu blockieren. Die Proben wurden dann in PBS-0,05% Tween gewaschen und mit Rattensera, die 1:100 in BSA-PBS verdünnt waren, für 90 min bei Raumtemp. inkubiert. Die Proben wurden gewaschen und mit Ziege-Anti-Ratte-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert und 1:1000 in BSA-PBS verdünnt war, für 90 min bei RT inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde die Farbreaktion durch Zugabe eines Gemischs von BCIP-NBT (Sigma-Fast, Sigma) zu den Zellen für 15 min entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Leitungswasser gestoppt.
ELISA: Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen (Corning) wurden mit Säuger-HSP 60 oder mycobakteriellem HSP 65 (10 μg/ml) in Carbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet.
Nach ausgiebigem Waschen mit PBS-0,05% Tween wurden die Platten mit Blockierungspuffer, der 1% BSA (Sigma) enthielt, für 60 min bei RT inkubiert.
Die HSP-Peptide wurden an gemäß Kasprzyk et al. [26] mit Glutaraldehyd vorbehandelte Platten gebunden. Kurz gesagt, wurden die Platten mit 100 μl/Vertiefung 5% w/v Glutaraldehyd in PBS für 1 Stunde bei Raumtemp. beschichtet. Die Platten wurden gründlich mit PBS gewaschen, und die Peptide (1 μg/100 μl) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden trockengeschüttelt und mit 1% BSA in PBS blockiert.
Die entweder mit HSP oder Peptiden beschichteten Platten wurden erneut gewaschen und mit Rattensera, die 1:100 in PBS-0,01% Tween verdünnt waren, für 90 min bei Raumtemp. inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Platten mit Ziege-Anti-Ratte-IgG oder -IgM, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert waren, für 60 min bei RT inkubiert. Das Vorliegen von Antikörpern wurde durch Zugabe des Substrats PNP (NP 100, Chemicon, Temecula, CA) zu den Platten sichtbar gemacht. Die optische Dichte wurde photometrisch bei 405 nm gemessen.
Aminosäurevergleich: Die Programme "Pileup" und "pretty" (GCG-Wisconsin Package, v.9.0) wurden zum Vergleich der Aminosäuresequenzen von drei HSP 60 (Mycobacterium tuberculosis, Ratte und Mensch) verwendet.
Strukturanalyse: Das RasMol-Programm v.2.6 und die 3D-Struktur des E. coli-GroEL-GroES-Komplexes (pdb ID: 1AON Referenz) wurden zur Analyse der Position von Epitopen verwendet.
Weil die Kristallstruktur von MT-HSP 65 kD noch nicht vollständig bekannt ist, wurde ein dreidimensionales Modell der Tertiärstruktur von MT-HSP 65 kD auf Basis der aufgeklärten Kristallstruktur von GroEL aus E. coli (pdb ID: 1GRL) als Matrize verwendet. Dieses Modell wurde durch Programme zur vergleichenden Proteinmodellierung aufgebaut.
Modulation von AA durch mycobakterielle und Säuger-HSP-Peptide: Von HSP 65 stammende Peptide wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das Auftreten oder die Schwere von AA bei Lewis-Ratten zu modulieren, untersucht. Die Ratten wurden mit 100 μg von jedem Peptid in PBS drei Wochen (3W), 2W und 1W vor der Induktion von AA durch MT immunisiert. Kontroll-Ratten erhielten PBS. Um das Vorhandensein von Antikörpern zu testen, wurden die Ratten vor der Injektion von MT und 30 Tage nach der MT-Injektion geblutet.
Herstellung eines DNA-Impfstoffs: Eine synthetische Oligo-DNA mit der SEQ ID: Nr. 5, die das in Tabelle 1 dargestellte Oligopeptid Mycobacterium tuberculosis HSP 65 kD Nr. 6 codierte, wurde in den kommerziell erhältlichen Säuger-Expressionsvektor pTARGET (Promega, Madison, WI, USA) mit der in 6 dargestellten Restriktionskarte kloniert. Die Klonierung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
Das Plasmidkonstrukt wurde dann in den E. coli-JM109-Stamm übertragen und zur weiteren Plasmidreinigung unter Verwendung des DNA-Reinigungssystems Wizard Plus Maxipreps-Kit (Programa, Madison, WI, USA) im großen Maßstab vermehrt.
Tierimpfung: Lewis-Ratten wurden mit Bupivaccine (Astra) zwei Tage vor der Impfung und der späteren Erkrankungsinduktion vorbehandelt. Den Ratten wurden dann zweimal 100 μg des DNA-Konstrukts in den Musculus tibialis anterior mit einem einwöchigen Intervall zwischen den Injektionen injiziert.
ERGEBNISSE
Die Wechselwirkung von Ratten-IgG mit gesamtem mycobakteriellem HSP 65 und seinen Peptiden
Frühere, von den Erfindern durchgeführte Experimente zeigten, dass IgGs von AA-resistenten Ratten (d.h. BN oder Fisher) sowie von Lewis-Ratten, die von AA genesen waren, (Post-AA-Lewis-Ratten) in der Lage waren, die Induktion von AA in naiven Lewis-Ratten zu unterdrücken, und in einem Dot-Blot-Test an bakterielles HSP 65 banden. Um eine quantitativere Untersuchung dieser Bindung zu erhalten, wurde die Wechselwirkung von IgGs aus diesen Ratten mit dem gesamten Molekül des mycobakteriellen HSP 65, von dem bekannt ist, dass es in Lewis-Ratten mit AA einhergeht, durch Dot-Blot und ELISA getestet.
Es wurde gefundenen, dass IgGs von 6–8 Wochen alten BN-Ratten und Post-AA-Lewis-Ratten stark mit dem HSP reagierten, während keine Reaktion gefunden wurde, wenn IgGs von naiven Lewis-Ratten getestet wurden. Interessanterweise wurde gefunden, dass IgGs von neun Monate alter naiver Lewis-Ratte ebenfalls mit dem HSP reagierten.
Um die Epitope zu definieren, die von den Antibakterielles-HSP-Antikörpern erkannt werden, testeten die Erfinder mittels Dot-Blot die Wechselwirkung von IgGs aus naiven jungen BN-Ratten und Post-AA-Lewis-Ratten mit 90 synthetischen 16-mer-Peptiden von mycobakteriellem 65 kD HSP. IgGs aus naiven jungen Lewis-Ratten dienten als Kontrolle.
Nur 10 von den 90 getesteten Peptiden (Tabelle 2) reagierten mit den getesteten Immunglobulinen. Alle Ratten-Immunoglobuline reagierten mit zwei Peptiden: 40 (Reste 235–250) und 63 (Reste 373–388). Wenn diese Ratten altern, erwerben sie Antikörper gegen zusätzliche Peptide, und ein ähnliches Profil wie das alter Lewis-Ratten wird bei jungen naiven BN-Ratten gefunden, und Lewis-Ratten, die mit CFA immunisiert wurden, reagierten auch mit den Peptiden 21 (Reste 121–136) und 84 (Reste 499–514). Es wird darauf hingewiesen, dass, obwohl naive Lewis-Ratten nicht das gesamte Molekül von HSP 65 kD erkennen, ihre IgGs mit bestimmten Peptiden dieses Moleküls ohne irgendeine Wirkung auf die Suszeptibilität für AA Wechselwirken können.
Bindung von Ratten-IgGs an das Säuger-HSP 60 und seine Peptide
Frühere Studien haben gezeigt, dass bestimmte bakterielle HSP-Peptide Selbst-HSP-reaktive T-Zellen mit Erkrankungs-supprimierendem regulatorischem Potenzial hervorrufen können. Um das Anti-Selbst-HSP-Antikörper-Repertoire dieser Ratten zu untersuchen, wurde die Reaktivität von IgGs von naiven und Post-AA-Lewis-Ratten sowie von naiven BN-Ratten gegen gesamtes Säuger-HSP 60 mittels ELISA getestet.
Die in Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass naive und vier Monate alte Lewis-Ratten keine Anti-Selbst-HSP-60-Antikörper besitzen, wohingegen neun Monate alte Lewis-Ratten, junge BN-Ratten und Post-AA-Lewis-Ratten eine signifikante Bindung an Selbst-HSP aufwiesen (Tabelle 3). Einige naive Lewis-Ratten besaßen sehr niedrige Konzentrationen der Antikörper.
Tabelle 3 Antikörper gegen Säuger-HSP-60-Peptide
Immunglobuline von naiven Lewis- und BN-Ratten und Post-AA-Lewis-Ratten wurden mittels Dot-Blot hinsichtlich der Bindung an 38 synthetische 20-mer-Peptide des Säuger-HSP 60 getestet. Es wurde gefunden, dass IgGs, die von BN- und Post-AA-Lewis-Ratten, aber nicht von naiven Lewis-Ratten stammten, nur mit 2 Peptiden reagierten: Peptid 5 (Reste 61-80) und Peptid 30 (Reste 436-455). Eine quantitative Analyse dieser Bindung sowie der Bindung von Immunglobulinen von vier und neun Monate alten Lewis-Ratten bestätigten die Dot-Blot-Befunde (Tabelle 3).
Aminosäurevergleich
Die HSP 60-Familie ist stark konserviert: MT-HSP 65 und seine Säuger-Homologe (Ratte oder Mensch) zeigen 48% Identität. In 1 werden die drei Aminosäuresequenzen von MT-HSP 65, HSP 60 aus Ratte und Mensch verglichen. Die Konsensussequenzen dieser drei Proteine sind ebenfalls dargestellt. Die Epitope, von denen gefunden wurde, dass sie für diese Studie relevant sind, sind fett und unterstrichen dargestellt.
3D-Strukturanalyse
Die Tertiärstrukturanalyse spielt eine wichtige Rolle für die B-Zell-Epitop-Erkennung. Bei einem ersten Ansatz wurde ein einfaches Computerprogramm bereitgestellt, das durch Screening der Primärstruktur des Peptids vorhersagen konnte, wo potenzielle B-Zell-Epitope zu finden waren. Der Algorithmus basiert auf einer früheren Analyse des basischen Myelinproteins von Warren et al. [27] zur Lokalisierung potenzieller Epitope für B-Zellen. Deren Analyse zufolge können zwei Sorten von Aminosäuren definiert werden:

• "Molekulare Spacer": Dabei handelt es sich um kurzkettige Reste (Seitenketten von einem Kohlenstoffatom oder weniger), die eine molekulare Lücke für benachbarte langkettige Aminosäuren bereitstellen könnten. Drei Aminosäuren, die in diese Definition passen, sind: Glycin (G), Alanin (A) und Serin (S).
• "Molekulare Krümmer": Prolin- (P-) Reste, die Unterbrechungen der Sekundärstruktur hervorrufen können.

Eine minimale Länge von 9 Resten wurde für diese potenziellen Epitope eingestellt. Nach diesen Regeln wurden sechs Reihen von aufeinanderfolgenden langkettigen Resten (Seitenketten mit zwei Kohlenstoffatomen oder mehr) gefunden, die sich zwischen molekularen Spacern und/oder molekularen Krümmern befanden (Tabelle 4).
Tabelle 4 Potenzielle Epitope von MT-HSP 65 kD
Das Peptid wurde mit einem Computerprogramm gescreent, und aufeinanderfolgende langkettige Reste (Seitenketten mit zwei Kohlenstoffatomen oder mehr), die sich zwischen molekularen Spacern und/oder molekularen Krümmern befanden, sind dargestellt (die 6 ersten Peptide). Die beiden Peptide darunter sind die aufeinanderfolgende Kette, die höchstens einen molekularen Spacer (Glycin) enthält.
Anhand an diese Regeln angepasster Aminosäuresequenzen wurden fünf von sechs Reihen identifiziert, von denen gefunden wurde, dass sie experimentell von B-Zell-Antikörpern erkannt werden (Tabelle 1). Um mehr Epitope zu finden, wurde das Programm folglich mit einer kleinen Änderung, nämlich der Suche nach Epitopen, die höchstens einen molekularen Spacer (G, S oder A) enthalten, laufen gelassen. Die minimale Länge wurde auf 12 Reste (anstelle von vorher 9) eingestellt, um den Hintergrund zu verringern (d.h. eine Strafe von drei Resten wurde eingestellt, um die Lücke zu kompensieren). Zwei neue Sequenzen wurden identifiziert, von denen auch gefunden wurden, dass sie experimentell durch B-Zell-Antikörper erkannt werden, (31, 45; siehe Tabelle 1). In diesen beiden Fällen war der molekulare Spacer Glycin.
Um die Implikationen der Tertiärstruktur von MT-HSP 65 kD besser zu verstehen und diese verschiedenen Aminosäuresequenzen auf dem gesamten Molekül zu lokalisieren, wurde ein Modell für die Tertiärstruktur von MT-HSP 65 kD auf Basis der Kristallstruktur von E. coli-GroEL (3) verwendet.
Die Strukturanalyse bestätigte, dass die experimentell erkannten Epitope, die sich auf der Oberfläche des Proteins befinden, eine potenzielle Stelle für Antikörperbindung bereitstellen können. Die Peptide 6, 7, 21, 31, 59 waren diejenigen, von denen gefunden wurde, dass sie am meisten exponiert sind, wohingegen die Peptide 36, 40, 45, 63 und 84 teilweise exponiert sind.
Das einzige potenzielle Epitop, das nicht experimentell erkannt wurde, (Reste 318–331) scheint im Molekül "verborgen" zu sein.
Obwohl es eine deutliche Homologie zwischen MT-HSP 65 kD und Säuger-HSP 60 kD gibt, zeigten die meisten der Peptide, von denen gefunden wurde, dass sie von den Anti-MT-HSP-65-Antikörpern erkannt werden, keine große Restehomologie zu Säuger-HSP. Dies kann auf die Selbst-Toleranz zurückzuführen sein, die die Ratten vor der Entwicklung einer autoimmunen Autoantikörper-Antwort gegen ihr eigenes HSP 60 schützt. Zwei Peptide, 6 und 45, schienen nicht mit dieser Regel überein zu stimmen, da sie Stellen mit hoher Homologie zu Selbst-HSP aufwiesen.
Diese Befunden lassen sich für beide Peptide wie folgt erklären:
Peptid 6 (Reste 31–46): Es wurde gefunden, dass Antikörper an Peptid 7 (Reste 37–52), die den polymorphen Teil dieses Peptids überlappen, aber nicht an Peptid 5 (Reste 25–40) binden, das die zum Säuger-HSP homologe Region darstellt. Daher scheint es, dass diese Antikörper gegen die polymorphe (nicht-Selbst-) Region von Peptid 6 (Reste 40–46) gerichtet sind. Es kann auch eine Hypothese im Hinblick auf die "schützende" Fähigkeit dieses Peptids liefern, eine partielle Homologie mit der Säuger-HSP-60-Sequenz kann für diese Schutzwirkung verantwortlich sein.
Peptid 45 (Reste 265–280): Dieses Peptid kann in zwei aufeinanderfolgende Regionen unterteilt werden:
eine ist polymorph (Reste 265–271) und die zweite stark konserviert (Reste 271–280). Eine Analyse der dreidimensionalen Struktur zeigt, dass die polymorphe Region die exponierte Region ist, wohingegen die konservierte Region im gesamten Molekül "verborgen" zu sein scheint (nicht dargestellt). Daher ist es möglich, dass die Antikörper, die Peptid 45 binden, hauptsächlich gegen die exponierte polymorphe Region gerichtet sind.
Keine Besonderheit im Hinblick auf die Sekundärstruktur und die Verteilung von hydrophoben/polaren Resten in diesen Epitopen wurde (sowohl experimentell als auch computererkannt) festgestellt. In der Regel neigen die experimentell erkannten Epitope dazu, hydrophob zu sein (9–12 hydrophobe Reste von 16), mit Ausnahme von Peptid 59, das stark polar ist (13 Reste von 16).
Siehe die Figuren: 2 zeigt die Stellung der bakteriellen Peptide 6, 7 und 31 auf der dreidimensionalen Struktur des E. coli-GroEL-GroES-Komplexes, und 3 zeigt, wie beschrieben, die Peptide an einem Modell von MT-HSP 65 auf Basis der Struktur von GroEL von E. coli mit einer Raum- und einer Sekundärstruktur-Darstellung.
Analyse der Fähigkeit von Peptiden, gegen AA zu immunisieren
Um zu testen, ob eine aktive Immunisierung mit bakteriellen oder Säuger-HSP-Peptiden, die von schützenden Immunglobulinen erkannt werden, einen Schutz gegen AA induzieren kann, wurden Lewis-Ratten mit den mycobakteriellen Peptiden 6, 7, 21, 31, 36, 45, 84, die Antikörper aus resistenten Lewis-Ratten banden, ("schützende" Peptide), mit einigen nicht-reaktiven mycobakteriellen HSP-65-Peptiden: Peptid 26 (Reste 151–166), 28 (Reste 163–178) oder mit Peptid 70 (Reste 415–430) und mit dem Säuger-Peptid 5 immunisiert.
Sie wurden den Ratten 3-mal intraperitoneal (IP) mit einwöchigen Intervallen zwischen den Injektionen vor der Induktion von AA mit MT injiziert.
4 zeigt, dass nur eine Präimmunisierung von Ratten mit den bakteriellen Peptiden 6 und 7 und dem Säuger-Peptid 5 zu einer signifikanten Unterdrückung der Schwere der Erkrankung führte.
Eine Immunisierung mit diesen "schützenden" Peptiden führte auch zur Produktion von Antikörpern gegen Peptid 6 sowie gegen das gesamte MT-HSP 65 (Tabelle 5). Tabelle 5 Anti-HSP-Antikörper in immunisierten Lewis-Ratten

O.D.: < 0,15 = –; 0,16 – 0,45 = +; 0,46 – 0,75 = ++; > 0,75 = +++

Literatur:

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

B-Zell-Epitop-Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 angegeben ist.
B-Zell-Epitop-Peptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID Nr. 2 angegeben ist.
8-Zell-Epitop-Peptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID Nr. 3 angegeben ist.
B-Zell-Epitop-Peptid, umfassend die Aminosäuresquenz, die durch SEQ ID Nr. 4 angegeben ist.
B-Zell-Epitop-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das ein synthetisches Peptid ist.
Chemisch modifiziertes Peptid nach Anspruch 5.
B-Zell-Epitop-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das Immunität gegen Autoimmun- und/oder Entzündungskrankheiten verleihen kann.
Nukleinsäuresequenz, die für ein B-Zell-Epitop-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.
DNA-Sequenz nach Anspruch 8
DNA-Sequenz nach Anspruch 9, umfassend die Nukleinsäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 5 angegeben ist.
DNA-Konstrukt, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8.
DNA-Konstrukt, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 9 oder 10.
Impfstoff, umfassend als Wirkstoff eine wirksame Impfstoffmenge mindestens eines B-Zell-Epitop-Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, optional weiterhin umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, Additiv oder Hilfsmittel.
Impfstoff, umfassend als wirksamen Bestandteil eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 9 bis 10 oder das DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 11 und 12, optional weiterhin umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, Additiv oder Hilfsmittel.
Impfstoff nach Anspruch 13 oder 14, zum Verleihen von Immunität gegen Autoimmun- oder Entzündungskrankheiten.
Impfstoff nach Anspruch 15 zum Verleihen von Immunität gegen Arthritis.
Antikörper, der gegen ein B-Zell-Epitop-Peptid gerichtet ist, umfassend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 angegeben ist.
Antikörper, der gegen ein B-Zell-Epitop-Peptid gerichtet ist, mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 2 angegeben ist.
Antikörper, der gegen ein B-Zell-Epitop-Peptid gerichtet ist, mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 3 angegeben ist.
Antikörper, der gegen ein B-Zell-Epitop-Peptid gerichtet ist, umfassend die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 4 angegeben ist.
Zusammensetzung zur passiven Immunisierung gegen eine Autoimmun- oder Entzündungskrankheit, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 17 bis 20.
Zusammensetzung nach Anspruch 21 zur Verhinderung oder Behandlung einer Autoimmun- oder Entzündungskrankheit.
Verfahren zum Vorhersagen der Suszeptibilität/Prädisposition eines Individuums für Arthritis durch Testen einer Serumprobe des Individuums auf das Vorliegen von Antikörpern, die gegen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 gerichtet sind, durch geeignete Immunoassaytechniken.