KR20220157366A

KR20220157366A - 인터루킨-6에 대한 면역 반응을 유도시키기 위한 면역원성 접합체

Info

Publication number: KR20220157366A
Application number: KR1020227025719A
Authority: KR
Inventors: 뤼실 드살레; 장-피에르 살레; 장-프랑수아 자귀리
Original assignee: 펩티노브
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-11-29
Also published as: EP3845556A1; CA3163277A1; WO2021136840A1; EP4085070A1; IL294434A; AU2020416990A1; JP2023508777A; BR112022013064A2; US20230131650A1; CN115175927A

Abstract

본 발명은 인터루킨-6 (IL-6) 또는 IL-6 수용체 (IL-6R)의 5 내지 50 아미노산의 서열, 또는 IL-6 또는 IL-6R의 5 내지 50 아미노산의 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함하는 최대로 100 아미노산을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드, 및 담체 단백질을 포함하는 면역원성 접합체에 관한 것으로서, 폴리펩티드는 담체 단백질에 공유적으로 결합되고 담체 단백질은 무독성 돌연변이체 디프테리아 독소이다.

Description

인터루킨-6에 대한 면역 반응을 유도시키기 위한 면역원성 접합체

본 발명은 면역원성 접합체, 이를 포함하는, 약학 조성물, 특히 백신 조성물, 및 인터루킨-6의 과발현 또는 과생산과 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법에서 이의 용도에 관한 것이다.

인터루킨-6 (IL-6)은 특히 면역 세포 증식 및 분화의 조절에 관여되는 필수 사이토카인이다.

IL-6은 염증 과정 동안 강력하게 과생산되고, 이러한 과생산은 많은 질환 예컨대 감염, 급성 또는 만성 염증 질환, 및 또한 암에서 관찰된다.

따라서 IL-6은 몇몇 염증성 질환에서 구동 신호인 것으로 보인다. 인간 질환의 동물 모델의 전임상 연구들은 IL-6 활성의 차단이 증상을 경감시키거나 또는 심지어 질환의 개시를 완전히 예방한다는 것을 보여주었다.

IL-6 신호전달 캐스캐이드는 세포 외부의 사이토카인 또는 이의 수용체를 차단하는 생물제제부터 세포 내부에서 관여되는 키나제 및 전사 인자를 표적화하는 소형 화학 분자에 이르기까지, 치료적 중재를 위한 몇몇 대안을 제공한다. 흥미롭게도, 환자에서, IL-6을 표적화하는 항체는 IL-6 수용체 (IL-6R)를 차단하는 항체와 비교하여 유의하게 더 낮은 양으로 사용될 수 있다. 이것은 가용성 IL-6 수용체 (sIL-6R)가 고농도로 혈청에 존재하기 때문이고, 이들 가용성 수용체가 또한 중화 항-IL-6R 항체를 흡수하기 때문인데, 그들이 또한 세포 표면 상에서 IL-6R 막 수용체를 차단할 수 있어서 IL-6 신호전달을 방지하도록 후자의 경우가 많이 필요하다.

IL-6 농도는 건강한 개체에서 상대적으로 낮고 (혈청 밀리리터 당 수 피코그램), IL-6 사이토카인을 직접적으로 표적화하는 항체는 새롭게 합성되고 방출된 IL-6 분자만을 포획하도록 활성화될 필요가 있다. IL-6의 직접 차단은 IL-6R을 통해서 신호를 전달할 수 있는 다른 사이토카인을 방해하지 않으므로 IL-6의 매우 특이적 억제를 제공한다.

최근 몇년 동안, IL-6 신호전달 경로의 성분을 표적화하는 몇몇 클래스의 치료제가 개발되었다. IL-6을 중화시키거나 또는 이의 신호전달을 방해하는 치료적 중재술의 효능은 다수의 질환에서 IL-6의 주요 유해 역할을 입증하였다.

예를 들어, IL-6R 차단제 토실리주맙은 IL-6 경로에 대해 개발된 최초의 단일클론 항체로서, 성인에서 중등증 내지 중증 활성 류마티스성 관절염 (RA)의 치료를 위해 현재 승인되었다. IL-6R을 표적화하는 다른 단일클론 항체가 개발 중에 있는데, 사릴루맙은 류마티스성 관절염에 대해 승인되었고; NI-1201은 현재 전임상 시험 중이고; 보바릴리주맙은 류마티스성 관절염 및 전신 홍반성 루푸스의 치료를 위해 현재 제II상 임상 시험 중이다.

IL-6을 직접 표적화하는 몇몇 단일클론 항체가 또한 개발되었는데, 류마티스성 관절염, 우울증 및 루푸스 신염 (제II상)의 치료를 위한, 시루쿠맙; 류마티스성 관절염 및 크론병의 치료를 위한, 올로키주맙; 장기 이식 거부의 치료를 위한, 클라자키주맙; 및 캐슬만병의 치료에 권고되고, 또한 다발성 골수종의 치료에서 사용하고자 하는 실룩시맙을 포함한다.

그러나, 모든 이들 수동 면역요법 치료, 즉, 항체, 특히 단일클론 항체의 투여 포함은 상당히 빈번한 장기간 투여를 필요로 하여서, 환자 편안함 및 비용의 관점에서 주요 제약을 수반한다.

이들 단점을 극복하기 위해서, 능동 (또는 백신) 면역요법을 기반으로 IL-6 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 접근법이 개발되었다. 이러한 접근법은 환자 자신에 의해 항-IL-6 항체의 생산을 일으키는 IL-6으로부터 유래되는 면역원성 폴리펩티드를 사용하는 체액성 면역 반응의 유도에 의존한다.

따라서, 문헌 [Desallais et al. (2016) Sci. Rep. 6:19549]은 IL-6-유래 폴리펩티드가 투여된 사이노몰거스 원숭이에서 중화성 인간 항-IL-6 항체의 생산을 기술한다. 그러나, 수득된 항체의 수준은 중간으로 유지되었다.

그러므로, 본 발명의 목적은 능동 면역요법에서 항-IL-6 항체의 생산을 개선하는 것이다.

본 발명은 담체 단백질 CRM-197에 IL-6 유래 폴리펩티드의 접합이 다른 담체 단백질과 비교하여 접합체가 투여된 개체에서 항-IL-6 항체의 생산을 증가시킨다는, 본 발명자에 의한 예상치 못한 발견으로부터 발생된다.

따라서, 본 발명은

- 담체 단백질, 및

- 인터루킨 6 (IL-6) 또는 인터루킨 6 수용체 (IL-6R)의 5 내지 50 아미노산의 서열, 또는 IL-6 또는 IL-6R의 5 내지 50 아미노산의 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함하는 최대로 100 아미노산을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 접합체에 관한 것이고,

적어도 하나의 폴리펩티드는 담체 단백질에 공유 연결되고 담체 단백질은 무독성 돌연변이체 디프테리아 독소이다.

상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체의 일정 구현예에서, 폴리펩티드는 비-펩티드 커플링제를 통해서 담체 단백질에 결합된다.

본 발명은 또한 개체에서, 치료적 치료 방법에서 사용하거나, IL-6의 과생산 또는 과발현과 관련된 질환을 예방하거나 또는 치료하는 방법에서 사용하거나, 또는 IL-6 또는 IL-6R에 대해 백신접종하는 방법, 또는 IL-6 또는 IL-6R에 대해 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용을 위한, 상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 개체에서 IL-6의 과발현 또는 과생산과 관련된 질환을 예방하거나 또는 치료하는 방법에 관한 것으로서, 개체는 상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.

본 발명은 또한 개체에서 IL-6 또는 IL-6R에 대해 백신접종하거나, 또는 IL-6 또는 IL-6R에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 개체는 상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체의 유효량이 투여된다.

본 발명은 또한 활성 물질로서 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역원성 접합체를, 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물, 특히 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은, 약학 조성물, 특히 백신은 적어도 하나의 보강제를 더 포함한다.

본 발명은 또한 개체에서, 치료적 치료 방법에서 사용하거나, IL-6의 과발현 또는 과생산과 관련된 질환을 예방하거나 또는 치료하는 방법에서 사용하거나, 또는 IL-6 또는 IL-6R에 대한 백신접종 방법, 또는 IL-6 또는 IL-6R에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용을 위한, 상기 정의된 바와 같은, 약학 조성물, 특히 백신에 관한 것이다.

본 발명은 또한 개체에서 IL-6 과발현 관련 질환을 예방하거나 또는 치료하는 방법에 관한 것으로서, 개체는 상기 정의된 바와 같은 약학 조성물의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.

본 발명은 또한 개체에서 IL-6 또는 IL-6R에 대한 백신접종 방법 또는 IL-6 또는 IL-6R에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 개체는 상기 정의된 바와 같은 약학 조성물의 유효량이 투여된다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체의 제조를 위한 방법에 관한 것으로서, 인터루킨 6 (IL-6) 또는 IL-6 수용체 (IL-6R)의 5 내지 50 아미노산 서열, 또는 IL-6 또는 IL-6R의 5 내지 50 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함하는 최대로 100 아미노산을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를, 무독성 돌연변이체 디프테리아 독소인 담체 단백질과 공유적으로 연결시키는 단계를 포함한다.

도 1은 0일, 13일, 43일, 및 73일 (화살표)에, 5 ㎍ (그룹 1, 작은 원형), 7 ㎍ (그룹 2, 사각형), 10 ㎍ (그룹 3, 위쪽 방향 삼각형), 15 ㎍ (그룹 4, 아래 방향 삼각형), 50 ㎍ (그룹 5, 다이아몬드) 용량의 폴리펩티드, 또는 CRM197 담체 단백질 (그룹 6, 큰 원형)로 각각 면역화된 5마리 토끼의 6개 그룹의 시간 함수 (x-축, 일수)에 따른, 항-hIL-6 항체의 평균 역가₅₀ (y-축, 임의 단위)를 나타낸다.

예비 설명으로서, 용어 "이루어지는"은 "구성되는"의 의미로서, 즉, 개체가 구성요소 또는 몇몇 구성요소"로 이루어지는" 경우에, 개체는 언급된 것들 이외의 다른 구성요소를 포함할 수 없다는 것을 유의해야 한다. 대조적으로, 용어 "포함하는"은 "포괄하는", "함유하는" 또는 "내포하는"을 의미하고, 즉, 개체가 구성요소 또는 구성요소들을 "포함하는" 경우에, 언급된 것들 이외의 다른 구성요소가 또한 개체에 포함될 수 있다. 다른 말로, 개체가 구성요소 또는 구성요소들을 "포함하는" 경우에, 구성요소(들) 및 가능하게 이들 이외의 다른 구성요소로 이루어진다.

폴리펩티드

정의

B-세포 자극성 인자 2 (BSF-2), 세포독성 T-세포 분화 인자 (CDF), 하이브리도마 성장 인자, 또는 인터페론 β-2 (IFN-β-2)라고도 종종 언급되는, 인터루킨 6 (IL-6)은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 다양한 동물 종으로부터의 IL-6의 수많은 서열이 서열 데이터베이스에서 입수가능하다. 예로서, 인간 IL-6은 UniProt/Swissprot 데이터베이스에서 P05231 (SEQ ID NO: 1)로서 기재된다. 역시 예로서, 인간 IL-6 수용체의 알파 서브유닛은 UniProt/Swissprot 데이터베이스에서 참조번호 P08887 (SEQ ID NO: 2) 하에 기재된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 그들 광역 의미에서 둘 이상의 아미노산 잔기의 분자를 의미하고자 사용된다. 아미노산 잔기는 펩티드 결합, 또는 대안적으로 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 그러나, 아미노산 잔기는 바람직하게 펩티드 결합에 의해 함께 연결된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 D-형태 및 L-형태, 및 아미노산 유사체를 포함한, 천연 및 비-천연 또는 합성 아미노산을 포괄한다. "아미노산 유사체"는 하나 이상의 원자에서 상응하는 천연 발생 아미노산과 상이한 비천연 발생 아미노산으로서 이해해야 한다. 예를 들어, 시스테인의 아미노산 유사체는 호모시스테인일 수 있다. 그러나, 아미노산 또는 아미노산 잔기는 바람직하게 천연 발생이다.

본 발명에 따라서 폴리펩티드는 IL-6 또는 IL-6R에 대해서 면역 반응을 유발시킬 수 있어야 하고, 다시 말해서, 예를 들어, 동물, 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼에게, 담체 단백질, 예컨대 CRM-197 또는 KLH에 결합된 이러한 폴리펩티드의 투여가 IL-6 또는 IL-6R에 대해 유도된 항체의 생산을 야기시킨다. 그러므로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 면역원성이고 IL-6 또는 IL-6R의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 특히 ELISA 시험을 구현하여서, 항체가 IL-6 또는 IL-6R에 대해 유도되는지 여부를 결정하는 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.

여기서 이해되는 바와 같이, 2개 펩티드 서열 간 동일성 백분율은 서열의 전체 길이를 따라서 최적 정렬을 수행하고, 아미노산이 각 서열에서 동일한 정렬된 위치의 개수를 결정하고, 그 개수를 2개 서열 중 더 긴 것의 총 아미노산 개수로 나누어서 결정될 수 있다. 최적 정렬은 2개 서열 간 동일성의 최고 백분율을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 IL-6의 "과생산" 및 "과발현"은 동등한 것으로 간주되고, IL-6은 치료하려는 개체의 신체에서 정상 이상의 농도 또는 비생리적 또는 병적 농도로 존재한다는 것을 의미한다.

길이

바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 최대로 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 24, 23, 22, 21 또는 20 아미노산을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 아미노산을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 10 내지 40 아미노산, 보다 바람직하게 15 내지 35 아미노산을 포함한다.

IL-6

바람직하게, 본 발명에 따른 IL-6은 인간 IL-6 (hIL-6), 마우스 IL-6, 원숭이 IL-6, 특히 마카크 IL-6, 말 IL-6, 개 IL-6, 고양이 IL-6, 또는 토끼 IL-6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직하게 본 발명에 따른 IL-6은 인간 IL-6이다.

서열

바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 IL-6 또는 IL-6R의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 아미노산의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 IL-6 또는 IL-6R의 최대로 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 아미노산의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 IL-6 또는 IL-6R의 6 내지 40, 7 내지 35, 또는 8 내지 30 아미노산의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다.

바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 IL-6 또는 IL-6R의 7 내지 35 아미노산의 서열, 또는 IL-6 또는 IL-6R의 7 내지 35 아미노산의 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다.

특히, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 참조로 본 명세서에 편입되는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2013/021284에 기술된 바와 같을 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 IL-6 또는 IL-6R의 아미노산 서열은 IL-6의 서열 58-78, 73-94, 96-111, 122-141, 또는 172-189의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 아미노산, 또는 전부를 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 IL-6 또는 IL-6R의 아미노산 서열은 IL-6의 서열 58-78, 73-94, 96-111, 122-141, 또는 172-189의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 아미노산, 또는 전부로 이루어진다.

바람직하게, 본 발명에 따른 IL-6 또는 IL-6의 아미노산 서열은 IL-6의 서열 58-78, 73-94, 96-111, 122-141, 또는 172-189의 최대로 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 또는 13 아미노산을 포함한다.

상기 번호매김은 신호 펩티드를 함유하는 기준 서열을 기반으로 하고, 예로서, 인간 IL-6 및 쥣과동물 IL-6에 대한 것이 제공된다:

· 인간 IL-6 (hIL-6):

서열 58 내지 78: RYIIDGISALRKETCNKSNMC (SEQ ID NO: 3)

서열 73 내지 94: NKSNMCESSKEALAENNLNLPK (SEQ ID NO: 4)

서열 96 내지 111: AEKDGCFQSGFNEETC (SEQ ID NO: 5)

서열 122 내지 141: FEVYLEYLQNRFESSEEQAR (SEQ ID NO: 6)

서열 172 내지 189: NASLLTKLQAQNQWLQDM (SEQ ID NO: 7)

서열 196 내지 212: RSFKEFLQSSLRALRQM (SEQ ID NO: 8)

· 쥣과동물 IL-6 (mIL-6):

서열 58 내지 78: VLWEIVEMRKELCNGNSDCMN (SEQ ID NO: 9)

서열 73 내지 94: NSDCMNNDDALAENNLKLPEIG (SEQ ID NO: 10)

서열 96 내지 111: NDGCYQTGYNQEICLL (SEQ ID NO: 11)

서열 122 내지 141: SYLEYMKNNLKDNKKDKARV (SEQ ID NO: 12)

서열 172 내지 189: ALLTDKLESQKEWLRTKT (SEQ ID NO: 13)

서열 196 내지 211: SLEEFLKVTLRSTRQT (SEQ ID NO: 14).

따라서, 바람직하게, 상기 정의된 폴리펩티드는 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 IL-6 서열 중 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 아미노산, 또는 전부를 포함하거나, 또는 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 IL-6 서열 중 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 아미노산, 또는 전부로 이루어진다:

· RYIIDGISALRKETCNKSNMC,

· NKSNMCESSKEALAENNLNPK,

· AEKDGCFQSGFNEETC,

· FEVYLEYLQNRFESSEEQAR,

· NASLLTKLQAQNQWLQDM, 및

· RSFKEFLQSSLRALRQM.

더 나아가서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 각각 상기 정의된 IL-6 또는 IL-6R 서열 또는 변이체 서열의 몇몇 반복부, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10 또는 20 반복부를 포함할 수 있다.

변이체 서열

본 발명에 따른 IL-6 또는 IL-6R 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는, 본 발명에 따른 변이체 서열은 바람직하게 본 발명에 따른 IL-6 또는 IL-6R 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 동일성을 갖게 될 것이다. 매우 바람직하게, 이러한 변이체 서열은 최대로 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10 아미노산을 가질 것이다.

고리화

바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 고리화된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 고리화될 수 있고, 즉 당업자에게 공지된 임의 종류의 방법에 따라서, 전체 폴리펩티드가 고리를 형성하거나 또는 이의 일부가 고리를 형성한다.

폴리펩티드에 존재하는 작용기에 의존하여, 이러한 고리화는 몇몇 상이한 방식으로, 예컨대, 이의 C-말단부에서 이의 N-말단부로, 이의 N-말단부에서 측쇄로, 측쇄로부터 이의 C-말단부로, 또는 2개 측쇄 간에, 일어날 수 있다. 고리화에 관여되는 측쇄 모이어티는 특히 -NH₂, -COOH, 및 -SH 기를 포함한다.

폴리펩티드의 고리화의 다양한 방식 중에서, 폴리펩티드의 2개 N-말단부 및 C-말단부 간에 펩티드 결합의 형성, 락탐화, 락톤화, 또는 폴리펩티드의 2개 시스테인 (C) 간에 디술피드의 형성을 언급할 수 있다. 특히, 시스테인 간 디술피드 결합이 형성되는 경우에, 즉, 2개 시스테인의 -SH 라디칼 간에 형성되는 경우에, 시스테인은 이미 IL-6 또는 IL-6R 서열에 존재할 수 있거나, 또는 그들은 이들 서열 내에 첨가되어, 변이체 서열을 형성하거나, 또는 그들 N-말단(들) 및/또는 C-말단(들)에 첨가될 수 있다.

변형

본 발명에 따른 폴리펩티드는 특히 지방산 또는 아세틸 기에 의한, 번역후 변형, 예컨대 글리코실화, 메틸화, 아실화, 아미드화, 또는 인산화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 N-말단은 아세틸화될 수 있거나, 또는 이의 C-말단은 아미드화에 의해 변형될 수 있다.

추가 서열

바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본 발명에 따른 IL-6 또는 IL-6R 서열이외에도, 하나 이상의 추가 서열을 포함한다.

본 발명에 따른 이들 추가 서열은 특히 이들 추가 서열을 포함하지 않지만 유사한 폴리펩티드와 비교하여 본 발명에 따른 폴리펩티드의 개선된 구조적 양상 또는 개선된 가용성을 가능하게 하는 물리화학적 특징을 제공할 수 있다.

특히 본 발명에 따른 추가 서열은 특히 담체 분자에 대한 결합에 유용한, 하나 이상의 펩티드 링커 서열을 포함할 수 있다. 이러한 펩티드 링커 서열은 전형적으로 1 내지 10, 특히 1 내지 6, 및 특히 2 내지 5 아미노산을 포함한다.

본 발명에 따른 특히 바람직한 링커 서열은 서열 EGEZ (SEQ ID NO: 15)이고, 여기서 Z는 특히 시스테인 (C), 티로신 (Y), 및 리신 (K)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 특히 시스테인 (C) 및 티로신 (Y)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 담체 단백질에 대한 결합을 허용하는 아미노산이다. 특히 바람직하게 Z는 티로신 (Y)이다. 유리하게, EGEZ 서열은 하기 실시예 4, 5, 및 6에 표시된 바와 같이 양호한 면역 반응을 유지시키면서 가용성을 개선시킨다.

다른 바람직한 링커 서열은 특히 시스테인 (C), 티로신 (Y), 및 리신 (K)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 특히 시스테인 (C) 및 티로신 (Y)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 담체 단백질에 대한 결합을 허용하는 아미노산 Z이다. 특히 바람직하게 Z는 티로신 (Y)이다.

대안적으로, 추가 서열(들)은 또한 IL-6 또는 IL-6R 이외의 단백질에 속하는 에피토프를 포함할 수 있어서, 이들 다른 단백질에 대한 면역 반응을 유발시키거나 또는 생성시킬 수 있게 한다.

더 나아가서, 본 발명에 따른 추가 서열은 또한 외생성, 바람직하게 유니버설, T 에피토프(들) 서열을 포함할 수 있다. 유리하게, 이들 추가 T 에피토프 서열은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 면역원성을 증강시킬 수 있다.

제조

본 발명에 따른 폴리펩티드는 당분야에 공지된 임의 방법, 및 특히 화학 합성을 통해서 제조될 수 있다. 또한 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 재조합 경로를 통해서 제조하는 것도 가능하다.

담체 단백질

본 발명에 따른 담체 단백질은 무독성 돌연변이체 디프테리아 독소, 즉, 돌연변이유발법을 통해서 수득된 디프테리아 톡소이드이다. 유리하게, 이러한 돌연변이체 디프테리아 독소는 약학적으로 허용가능하다.

본 발명에 따른 담체 단백질은 바람직하게 CRM197, CRM176, CRM228, CRM45, CRM9, CRM102, CRM103, 및 CRM107로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특히 바람직하게, 본 발명에 따른 담체 단백질은 CRM197이다.

CRM197은 디프테리아 독소의 유전적으로 해독된 형태이다. 이것은 글리신 (G)이 글루탐산 (E)으로 치환되어서, ADP-리보실트랜스퍼라제 활성의 상실을 초래하는, 위치 52에 고유한 돌연변이를 갖는다. 그러나, 이것은 접합을 위해 이용가능한 리신 (K)의 모든 아민 라디칼을 보유한다. CRM197은 535 아미노산 (58.4 kDa)을 갖고 디술피드 브릿지를 통해서 연결된 2개 서브유닛으로 이루어진다. 이것은 GenBank 등록 번호 1007216A (SEQ ID NO: 16) 하에 기재되어 있다. 이것은 재조합적으로 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria), 및 또한 다른 박테리아 예컨대 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 또는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli)에 의해 생산될 수 있다.

커플링제

바람직하게 본 발명에 따른 커플링제는 비-펩티드성이다.

커플링제는 이종이작용성, 예컨대 N-γ-말레이미도부티릴-옥시숙신이미드 (GMBS) 에스테르 및 술포-GMBS 유도체, m-말레이미도벤조일-n-히드록시숙신이미드 (MBS) 에스테르 및 술포-MBS 유도체, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 술포-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC), 카르보디이미드, 비스디아조늄-벤지딘 (BDB) 또는 글루타르알데히드일 수 있다. 커플링제의 사용은 특히 참조로 본 명세서에 편입되는, 참고서 "The Protein Protocols Handbook" (2002)의 "Production of Antisera Using Peptide Conjugates" 장에 기술된다.

GMBS, MBS, SMCC 또는 술포-SMCC가 사용될 때, 그들은 바람직하게 시스테인 (C)에 부착되고, 이것이 펩티드 서열에 존재하지 않으면, 특히 이의 N-말단부 또는 C-말단부에 첨가될 수 있다.

접합체

바람직하게, 본 발명에 따른 면역원성 접합체의 폴리펩티드는, 임의로 C-말단 측면 상에 상기 정의된 추가의 펩티드 링커 서열 EGEZ 또는 Z가 첨가되는, 서열 SSKEALAENNLNLPK (SEQ ID NO: 17), 보다 특히 서열 ESSKEALAENNLNLPK (SEQ ID NO: 18), 및 여전히 보다 특히 서열 ESSKEALAENNLNLPKC (SEQ ID NO: 19), 서열 AESSKEALAENNLNLPKC (SEQ ID NO: 20) 또는 서열 CESSKEALAENNLNLPKC (SEQ ID NO: 21)을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 바람직하게 또한 이러한 폴리펩티드는 상기 정의된 커플링제에 의해서 상기 정의된 담체 단백질 CRM197에 연결된다.

따라서, 바람직하게, 상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체는 하기 식 (I)의 것이다:

[(AESSKEALAENNLNLPKC)-GMB]-CRM197 (I)

상기 식에서,

· 폴리펩티드는 서열 AESSKEALAENNLNLPKC로 이루어지고,

· 담체 단백질은 CRM197이고,

· 폴리펩티드는 N-γ-말레이미도부티릴- (GMB) 커플링제를 통해서 담체 단백질에 공유적으로 연결되고,

· 괄호는 폴리펩티드가 C-말단 시스테인 (C) 및 N-말단 알라닌 (A) 간 펩티드 결합의 형성을 통해서 고리화된다는 것을 의미하고,

· 대괄호는 적어도 하나의 폴리펩티드가 담체 단백질에 결합한다는 것을 의미한다.

또한 바람직하게, 상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체는 하기 식 (II)의 것이다:

[아세틸-(CESSKEALAENNLNLPKC)-(X)_i-Z-GMB]-CRM197, (II)

상기 식에서,

· 폴리펩티드는 서열 CESSKEALAENNLNLPKC-(X)_i-Z로 이루어지고,

· 담체 단백질은 CRM197이고,

· 괄호는 폴리펩티드의 CESSKEALAENNLNLPKC 서열 부분이 C-말단 및 N-말단 시스테인 (C) 간 디술피드 결합의 형성을 통해서 고리화된다는 것을 의미하고,

· 아세틸- 은 N-말단 시스테인 (C)의 유리 -NH₂ 작용기가 아미드 결합을 형성하여 아세틸 기에 의해 보호된다는 것을 의미하고,

· (X)는 1 내지 5 아미노산의 임의의 펩티드 서열, 특히 EGE를 나타내고,

· i는 0 또는 1이고,

· Z는 티로신 (Y) 또는 시스테인 (C)을 나타내고,

또한 바람직하게, 상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체는 하기 식 (III)의 것이다:

[아세틸-(CESSKEALAENNLNLPKC)-(X)_i-Y-GMB]-CRM197, (III)

상기 식에서,

· 폴리펩티드는 서열 CESSKEALAENNLNLPKC-(X)_i-Y로 이루어지고,

· 담체 단백질은 CRM197이고,

· (X)는 1 내지 5 아미노산의 임의 펩티드 서열, 특히 EGE를 나타내고,

· i는 0 또는 1, 특히 0이고,

또한 바람직하게, 상기 정의된 바와 같은 면역원성 접합체는 하기 식 (IV)의 것이다:

[아세틸-(CESSKEALAENNLNLPKC)-(X)_i-C-GMB]-CRM197, (IV)

상기 식에서,

· 폴리펩티드는 서열 CESSKEALAENNLNLPKC-(X)_i-C로 이루어지고,

· 담체 단백질는 CRM197이고,

· i는 0 또는 1이고,

약학 조성물 , 특히 백신 조성물

상기 정의된 면역원성 접합체와 함께 투여될 수 있거나 또는 상기 정의된, 약학 조성물, 특히 백신 조성물에 존재할 수 있는 보강제 중에서, 명반 (알루미나 히드록시드), MONTANIDE™ ISA 51 VG, MONTANIDE™ ISA 720 VG, 임의의 유중수 에멀션 또는 임의의 수중유 에멀션을 비롯하여, 일반적으로 과학 문헌에 공지된 모든 보강제를 언급할 수 있다.

또한 면역조절제, 예컨대 예를 들어, MP40을 본 발명에 따른 면역원성 접합체와 함께 투여하거나, 또는 면역조절제, 예컨대 예를 들어 MP40을 본 발명에 따른, 약학 조성물, 특히 백신 조성물에 첨가하는 것이 가능하다.

치료적 용도

본 발명에 따른 면역원성 접합체 또는 이를 포함하는 약학 조성물, 특히 백신 조성물은 능동 면역화를 목적으로 하고, 과생산되거나 또는 과발현되는 IL-6에 결합하여 이것이 작용하는 것을 방지하는 항체의 생산을 유도시켜서 염증성 사이토카인 IL-6의 과생산 또는 과발현과 관련된 모든 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 IL-6의 과생산 또는 과발현과 관련된 질환은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:

- 만성 염증성 장 질환 예컨대 크론병 및 출혈성 직결장염 또는 궤양성 대장염;

- 관절염성 질환 예컨대 류마티스성 관절염, 소아 관절염, 건선성 관절염, 골관절염, 난치성 류마티스성 관절염, 만성 비-류마티스성 관절염, 강직성 척추염;

- 만성 염증성 뼈 질환 또는 IL-6 관련 질환, 특히 골다공증 또는 임의의 골 재흡수 질환;

- 감염과 연관된 만성 염증성 또는 IL-6-관련 질환 예컨대 패혈성 쇼크, 내독소 쇼크, 패혈증, C형 간염, 말라리아, AIDS 또는 다른 HIV-관련 감염;

- 심혈관계의 만성 염증성 또는 IL-6-관련 질환, 예컨대 아테롬성 동맥경화증, 허혈 후 재관류 손상, 관상 동맥 질환, 혈관염, 예컨대 베체트병 또는 베게너 육아종증;

- 자가면역 질환 예컨대 경피증, 전신 경피증, 홍반성 루푸스, 특히 파종성, 다발성 경화증, 또는 건선;

- 이식편 대 숙주병, 이식 거부, 및 외상을 포함한, 이식-관련 질환;

- 알레르기, 특히 알레르기성 천식, 및 지연성 과민 반응과 관련된 피부 장애;

- 면역결핍증, 예컨대 특발성 면역결핍증 (CVID);

- 호흡기계의 만성 염증성 또는 IL-6 관련 질환, 특히 호흡 곤란 증후군 또는 폐 섬유증;

- 만성 염증성 또는 IL-6-관련 성분을 갖는 암, 예컨대 원형세포종, 직결장암, 난소암, 림프증식성 증후군, 다발성 골수종, 특히 난치성 다발성 골수종, 또는 골수증식성 증후군;

- 당뇨병, 특히 소아 당뇨병;

- 아밀로이드증, 특히 알츠하이머병;

- 포도막염, 특히 이의 재발 형태;

- 악액질; 및

- 자궁내막증.

투여

바람직하게, 투여 당 투여되는 본 발명에 따른 면역원성 접합체의 양, 즉, 투여되는 면역원성 접합체의 단위 용량은 3 ng 내지 3 g, 보다 바람직하게 300 ng 내지 900 ㎍, 보다 더 바람직하게 15 ㎍ 내지 450 ㎍, 및 가장 바람직하게 30 ㎍ 내지 300 ㎍이다. 접합체의 이들 단위 용량은 각각 본 발명에 따른 폴리펩티드의 단위 용량, 바람직하게 1 ng 내지 1 g, 보다 바람직하게 100 ng 내지 300 ㎍, 보다 더 바람직하게 5 ㎍ 내지 150 ㎍, 및 가장 바람직하게 10 ㎍ 내지 100 ㎍에 상응한다.

바람직하게, 본 발명에 따른, 약학 조성물, 특히 백신 조성물은 3 ng 내지 3 g, 보다 바람직하게 300 ng 내지 900 ㎍, 보다 더 바람직하게 15 ㎍ 내지 450 ㎍, 및 가장 바람직하게 30 ㎍ 내지 300 ㎍의 용량으로 본 발명에 따른 면역원성 접합체를 포함한다. 바람직하게 또한 본 발명에 따른, 약학 조성물, 특히 백신 조성물은 1 ng 내지 1 g, 보다 바람직하게 100 ng 내지 300 ㎍, 여전히 보다 바람직하게 5 ㎍ 내지 150 ㎍, 및 가장 바람직하게 10 ㎍ 내지 100 ㎍의 용량으로 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함한다.

유리하게, 본 발명에 따른 용량은 폴리펩티드에 대해 유도된 항체의 생산이 담체 단백질에 대해 유도된 항체에 비해서 유리할 수 있도록, 즉 1을 초과하는 폴리펩티드에 대해 유도된 항체의 역가 대 담체 단백질에 대해 유도된 항체의 역가의 비율이 유리할 수 있게 한다. 특정 이론에 국한하고 싶지 않지만, 본 발명자는 담체 단백질에 대해서 생산된 항체가 너무 많이 존재하면, 이들 항체가 본 발명에 따른 면역원성 접합체로 수행되는 후속 면역화에서 면역 반응을 차단하므로, 담체 단백질에 대한 항체 반응의 역가를 폴리펩티드에 대해 유도된 항체의 것에 비해서 충분히 낮게 유지시키는 것이 유리하다고 믿는다.

면역원성 접합체의 투여는 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 비내를 포함한, 점막, 또는 복강내 경로에 의해 가능하다.

용량 용법은 양호한 항-IL-6 또는 항-IL-6R 항체 반응이 발생될 때까지, 프라이밍을 위해서 2주마다 1회 내지 1년에 1회에서, 부스터 용량으로, 예를 들어, 만족할만한 유리한 항체 활성을 유지하게 하는 간격으로 2개월 마다 1회 내지 1년에 1회의 범위일 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 개체는 동물, 특히 포유동물, 특히 인간이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 개체는 IL-6을 과생산 또는 과발현하거나, 또는 IL-6을 과생산 또는 과발현할 위험성에 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 개체는 50세 이상, 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상, 또는 90세 이상이다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에서 더욱 설명될 것이다.

실시예

실시예 1

화학적으로 합성된 펩티드 (CESSKEALAENNLNLPKC)Y (SEQ ID NO: 22)는 한편으로는 담체 단백질 CRM197 (Pfenex, USA) 및 다른 한편으로 담체 단백질 KLH (Keyhole limpet hemocyanin, SIGMA)에 접합된다.

펩티드는 C-말단에 시스테인 및 티로신이 첨가된 인간 IL-6의 78-93 영역 (상기 밑줄 부분)에 상응한다. 시스테인은 디술피드 결합을 통해서 펩티드의 N-말단 시스테인과 고리화 (괄호 부분)를 가능하게 한다. 담체 단백질과의 접합은 표준 방법에 따라서 비스-디아조-벤지딘 (BDB, PolyPepide Laboratories, Strasbourg France)과 티로신을 통해서 수행된다.

이들 접합체의 생산을 일반적으로 아미노산 분석 (AAA) 어세이 방법을 통해 결정하여 KLH 및 CRM197에 대해 1:2의 범위로 표준 펩티드/담체 단백질 질량 비율을 야기시킨다. 달리 말해서, 담체 단백질에 접합된 펩티드의 총 질량의 300 ㎍ 당, 200 ㎍의 KLH 및 100 ㎍의 펩티드가 존재하고, CRM197에 대한 접합체의 경우에, 200 ㎍의 CRM197 및 100 ㎍의 펩티드가 존재한다고 결정된다.

이들 접합체는 MONTANIDE™ ISA 51 VG (또는 축약하여 ISA 51) (SEPPIC, France)를 보강제로서 사용하여, 50 ㎕의 접합체에 대해 50 ㎕의 MONTANIDE™ ISA 51 VG를 함유하는 혼합물이, 근육내로, 각 면역화에 대해 300 ㎍의 접합체의 주사 용량으로, 투여된, Swiss 마우스 (Charles River Laboratories, Ecully, France)에서의 면역화 실험에서 시험된다. 따라서 8마리 마우스의 2개 그룹이 D0, D14, D28, D42에 KLH-접합된 펩티드 및 CRM197-접합된 펩티드에 대해 면역화된다. 마우스는 D54에 희생시켜서, 그들 혈액을 수집하고, 이렇게 제조된 혈청은 ELISA에 의해 측정된 그들 인간 항-IL-6 항체 수준에 대해 평가된다 (Desallais et al. (2016) Sci. Rep. 6:19549). 희생 당일에, 마우스는 잘 지내서 (윤기나는 모질, 체중 유지, 정상 분변), 면역원성 접합체에 대한 면역화는 사용된 용량에서 독성 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다.

2개 그룹, KLH 및 CRM197에 대해 수득된 항-IL-6 항체 역가는 하기 표에 요약되어 있다:

동일한 접합체 용량에 대해, 항-IL-6 항체 역가는 KLH 접합체와 비교하여 CRM197 접합체에서 유의하게 더 높는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2

실시예 1에서와 동일한 화합물은 D1, D15, D30, D45에, MONTANIDE™ ISA 51 VG를 보강제로서 사용하여, 250 ㎕의 MONTANIDE™ ISA 51 VG/250 ㎕의 접합체의 혼합물로 수행된 마카크 원숭이의 피하 면역화에서 시험된다. 300 ㎍의 KLH 접합체 및 300 ㎍의 CRM197 접합체는 각각 4마리 동물의 2개 그룹에 대한 각 면역화에서 투여된다.

혈액 샘플 및 혈청 조제물은 D57에 채취되고, 인간 IL-6에 대한 항체 역가는 ELISA를 통해 측정된다. 실험 전반에서, 원숭이는 그들 전신 상태에 대해 평가되었고 그들은 잘 지내서 (정상 활동, 만족할만한 식욕, 체중 유지, 정상 분변), 면역원성 접합체에 대한 면역화가 사용된 용량에서 독성 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다.

2개 그룹, KLH 및 CRM197에 대해 수득된 항-IL-6 항체 역가는 하기 표에 요약된다:

다시, 우리는 CRM197 접합체에 대한 면역화 이후에 수득된 역가가 KLH에 대해 수득된 것에 비해서 평균 및 중간값이 유의하게 더 높다는 것을 알았다.

실시예 3

화학적으로 합성된 펩티드 시클로(LTKLQAQNQWLQDMC) (SEQ ID NO: 23)는 시스테인의 -SH 기를 통해서 담체 단백질 CRM197 또는 KLH에 접합된다. 접합은 표준 방법 ("User guide GMBS and SulfoGMBS" Thermo-Fisher)에 따라서 이기능성 커플링제 N-γ-말레이미도부티릴 숙신이미드 (GMBS, Thermo-Fisher 22309)를 사용해 수행된다. 펩티드는 C-말단 시스테인이 첨가되는, 인간 IL-6의 서열 176-189 (상기 밑줄 부분)를 포함하고, 락탐화를 통해서 고리화된다 (상기 괄호 부분).

이들 접합체의 생산은 KLH에 대해 1:2 및 CRM197에 대해 1:2의 추정 표준 펩티드 대 담체 단백질 질량 비율을 야기시킨다. 달리 말해서, 총 펩티드 접합체 질량 중 300 ㎍ 마다, KLH 접합체 경우 200 ㎍의 KLH 및 100 ㎍의 펩티드가 존재하고, CRM197 접합체의 경우도 유사하게 (100 ㎍의 펩티드 대 200 ㎍의 CRM197) 결정된다.

이들 접합체는 보강제로서, MONTANIDE™ ISA 51 VG (50 ㎕의 접합체에 대해 50 ㎕의 MONTANIDE™ ISA 51 VG)를 사용하여, 각 면역화에 대해 450 ㎍의 접합체의 용량이 근육내 경로를 통해서, 마우스의 면역화 실험에서 시험된다. 8마리 마우스의 2개 그룹이 D0, D14, D28, D42에 KLH-접합된 펩티드 및 CRM197-접합된 펩티드에 대해 면역화된다. 마우스는 D54에 희생되어, 그들 혈액이 수집되고, 이렇게 제조된 혈청은 ELISA를 통해 측정된 그들 인간 항-IL-6 항체 수준에 대해 평가된다. 희생 당일에, 마우스는 잘 지내서 (윤기나는 모질, 체중 유지, 정상 분변), 면역원성 접합체에 대한 면역화가 사용된 용량에서 독성 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다.

2개 그룹, KLH 및 CRM197에 대해 수득된 항-hIL-6 항체 역가는 하기 표에 요약된다:

동일한 접합체 용량에 대해, 항체 역가는 KLH 접합체에 비해서 CRM197 접합체 경우에 다시 한번 유의하게 더 높다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 4

화학적으로 합성된 펩티드 (CIDKQIRYIIDGISALRKETC)EGEC (SEQ ID NO: 24)는 한편으로 담체 단백질 CRM197 또는 다른 한편으로 KLH에 접합된다. 펩티드는 디술피드 결합의 형성을 통한 펩티드의 고리화 (상기 괄호 부분)를 허용하는 2개 시스테인이 측접한 인간 IL-6의 서열 53 내지 71 (상기 밑줄 부분)을 포함한다. 접합은 이기능성 커플링제 N-γ-말레이미도부티릴 숙신이미드 (GMBS)를 사용하여 C-말단 시스테인을 통해 획득된다. 서열 EGEC의 링커 펩티드가 존재한다.

이들 접합체의 생산은 KLH의 경우 1:2 및 CRM197의 경우 1:2의 추정된 표준 펩티드 대 담체 단백질 질량 비율을 야기한다. 달리 말해서, 총 펩티드 접합체 질량의 300 ㎍ 당, KLH 접합체 경우에 200 ㎍의 KLH 및 100 ㎍의 펩티드가 존재하고 CRM197 접합체 경우도 유사하게 (100 ㎍의 펩티드 대 200 ㎍의 CRM197) 결정된다.

이들 접합체는 MONTANIDE™ ISA51 VG를 보강제로서 사용하고, 피하로 D1, D15, D45에 수행되는 6마리 뉴질랜드 흰색 (NZW) 토끼 (Charles River)의 2개 그룹의 면역화 동안 시험된다. 이러한 경우에, 토끼는 각 면역화 시에 450 ㎍의 접합체 (펩티드-KLH 또는 대안적으로 펩티드-CRM197)가 면역화된다. MONTANIDE™ ISA 51 VG가 주사되는 부피는 400 ㎕ (200 ㎕의 MONTANIDE™ ISA 51 VG와 200 ㎕의 접합체)이다.

혈액 샘플 및 이들 샘플로부터 혈청 제조는 D60에 수행된다. 인간 IL-6에 대한 항체 역가는 ELISA를 통해 측정되었다. 희생 당일에, 토끼는 잘 지내서 (윤기나는 모질, 유지된 체중, 정상 분변), 면역원성 접합체에 대한 면역화는 사용된 용량에서 독성 효과를 갖지 않았다는 것을 보여준다.

2개 그룹, KLH 및 CRM197에 대해 수득된 역가는 하기 표에 요약된다:

다시, 우리는 CRM197 접합체에 대한 면역화 이후 수득된 역가가 KLH에 대해 수득된 것에 비해서 평균 및 중간값에서 유의하게 더 높다는 것을 알 수 있다.

실시예 5

화학적으로 합성된 펩티드 (A) (CLQAQNQWLQDTMC)Y (SEQ ID NO: 25) 및 (B) (CLQAQNQWLQDTMC)EGEY (SEQ ID NO: 26)는 CRM197 담체 단백질에 접합된다. 펩티드는 고리화를 위해서 N-말단 및 C-말단에 시스테인이 첨가된, 인간 IL-6의 잔기 179-189를 포괄하는 서열 (상기 밑줄 부분)을 포함한다. 펩티드는 시스테인 간 디술피드 결합을 형성하여 고리화되고 (밑줄 부분), 이들 펩티드의 CRM197에 대한 커플링은 이기능성 커플링제를 사용해 말단 티로신을 통해 수행되고, 사용된 이기능성 커플링제는 BDB이다. 펩티드 (B)는 서열 EGE의 삼중펩티드로 이루어진 링커 서열을 제외하고 펩티드 (A)와 동일하다.

이들 접합체의 생산은 1:2의 추정된 표준 펩티드 대 담체 단백질 중량 비율을 야기한다. 달리 말해서, 총 접합체 중량의 300 ㎍ 당, 200 ㎍의 CRM197 및 100 ㎍의 펩티드가 존재한다고 결정된다.

이들 화합물은 MONTANIDE™ ISA 51 VG가 보강제로서 사용되고, 피하로, D1, D15, D45에 수행되는 6마리 마우스의 2개 그룹의 면역화에서 시험된다. 이러한 경우에, 마우스는 각 면역화에 대해서 300 ㎍의 접합체가 면역화된다. MONTANIDE™ ISA 51 VG로 주사되는 부피는 200 ㎕ (100 ㎕의 MONTANIDE™ ISA 51 VG와 100 ㎕의 접합체)이다.

혈액 샘플 및 이들 샘플로부터의 혈청 제조는 D54에 수행된다. 항-인간 IL-6 항체 역가는 ELISA에 의해 수행된다. 희생 당일에, 마우스는 잘 지내서 (윤기나는 모질, 유지된 체중, 정상 분변), 면역원성 접합체에 대한 면역화가 사용된 용량에서 독성 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다.

2개 그룹에 대해 수득된 역가는 하기 표에 요약된다:

EGE 링커 펩티드를 보유하는 펩티드에 대한 면역화 이후 수득된 역가는 링커 펩티드가 없는 펩티드에 대해 수득된 것에 비해서 평균 및 중간값에서 유의하게 더 높은 것을 확인할 수 있다.

실시예 6

화학적으로 합성된 펩티드 (A) (CFQSGFNEETC)Y (SEQ ID NO: 27) 및 (B) (CFQSGFNEETC)EGEY (SEQ ID NO: 28)는 CRM197 담체 단백질에 접합된다. 펩티드는 인간 IL-6의 서열 101 내지 111 (상기 밑줄 부분, 시스테인 (C)은 천연임)을 포함한다. 펩티드는 2개 시스테인 간에 디술피드 결합을 형성하여 고리화된다. CRM197에 대한 이들 펩티드의 커플링은 이기능성 커플링제 BDB를 사용해 말단 티로신을 통해서 획득된다.

이들 화합물은 MONTANIDE™ ISA 51 VG를 보강제로서 사용하고, 피하로, D1, D15, D45에 수행된 6마리 마우스의 2개 그룹의 면역화에서 시험된다. 이러한 경우에, 마우스는 각 면역화 동안에 300 ㎍의 접합체로 면역화된다. MONTANIDE™ ISA 51 VG로 주사된 부피는 200 ㎕ (100 ㎕ MONTANIDE™ ISA 51 VG와 100 ㎕의 접합체)이다.

혈액 샘플 및 이들 샘플로부터의 혈청 제조는 D54에 수행된다. 항-인간 IL-6 항체 역가는 ELISA를 통해 수행되었다. 희생 당일에, 마우스는 잘 지내서 (윤기나는 모질, 유지된 체중, 정상 분변), 면역원성 접합체에 대한 면역화가 사용된 용량에서 독성 효과를 갖지 않는다는 것을 보여준다.

2개 그룹에 대해 수득된 역가는 하기 표에 요약된다:

다시, EGE 링커 펩티드를 보유하는 펩티드에 대한 면역화 이후에 수득된 역가는 링커 펩티드가 없는 펩티드에 대해 수득된 것에 비해서 평균 및 중간값에서 유의하게 더 높다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7

화학적으로 합성된 펩티드 (CESSKEALAENNLNLPKC)Y (SEQ ID NO: 22)는 실시예 1에 이미 기술된 바와 같이, 담체 단백질 CRM197 (Pfenex, USA)에 접합된다. MONTANIDE™ ISA 51 VG를 보강제로서 사용하고, 250 ㎕의 MONTANIDE™ ISA 51 VG/250 ㎕의 접합체의 혼합물로, D0, D15, D30, D45, D60, 및 D75에 수행된 10마리 마카크 원숭이의 3개 그룹의 피하 면역화에서 3개 용량이 시험된다: 600 ㎍의 접합체 (즉, 200 ㎍의 펩티드), 300 ㎍의 접합체 (즉, 100 ㎍의 펩티드), 150 ㎍의 접합체 (즉, 50 ㎍의 펩티드).

혈액 샘플 및 혈청 제조는 D30, D45, D60, D75 및 D90에 수행되었고 항-인간 IL-6 및 항-CRM197 역가는 ELISA에 의해 수행되었다. 하기 표에서, 3개 그룹에 대한 항-IL6 및 항-CRM197 역가를 비롯하여, 비율 (항-IL6/항-CRM197)이 제공된다.

놀랍게도, 150 ㎍의 접합체 (즉, 접합체에 존재하는 50 ㎍의 펩티드), 즉, 최저 용량으로 면역화된 그룹은 600 ㎍ 또는 300 ㎍의 접합체로 면역화된 그룹의 것만큼 양호한 항-IL6 역가를 보여주고, 특히 비율 (항-IL6/항-CRM197)은 600 ㎍의 접합체 (즉, 접합체에 존재하는 200 ㎍의 펩티드에 상응)로 면역화된 그룹의 경우에 비해서 모든 시점에서 이 그룹에 대해 더 양호하다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 8

화학적으로 합성된 펩티드 (CESSKEALAENNLNLPKC)Y (SEQ ID NO: 22)는 실시예 1에 이미 기술된 바와 같이 담체 단백질 CRM197 (Pfenex, USA)에 접합된다. 5마리 면역화된 토끼의 그룹의 피하 면역화에서 5개 상이한 용량으로 시험된다: 5 ㎍의 펩티드 (즉, 15 ㎍의 접합체), 7 ㎍의 펩티드 (즉, 21 ㎍의 접합체), 10 ㎍의 펩티드 (즉, 30 ㎍의 접합체), 15 ㎍의 펩티드 (즉, 45 ㎍의 접합체), 50 ㎍의 펩티드 (즉, 150 ㎍의 접합체). 토끼는 250 ㎕의 MONTANIDE™ ISA 51 VG/250 ㎕의 접합체의 혼합물의 피하 주사를 통해서 D0, D13, D43, 및 D73에 면역화되었다.

혈청은 D0, D13, D30, D43, D60, D73, D90, 및 D104에 수집되었고, IL6에 대한 항체 반응은 ELISA를 통해 측정되었다. 면역화의 결과는 도 1 의 그래프로 제공되며, 여기서 각 점은 그룹의 5마리 토끼에 대해 수득된 역가의 평균을 나타낸다.

CRM197 단독은 항-IL6 항체를 유도하지 않지만, CRM197-접합된 펩티드로 면역화된 모든 그룹은 항-IL6 항체를 생산한다는 것을 확인할 수 있다. 놀랍게도, 우리는 10 ㎍의 펩티드 (즉, 30 ㎍의 접합체)의 용량이 50 ㎍의 펩티드 (즉, 150 ㎍의 접합체)의 용량과 동등한 항체 수준을 제공한다는 것을 관찰하였다.

서열 식별자의 요약:

SEQUENCE LISTING <110> PEPTINOV SAS CONSERVATOIRE NATIONAL DES ARTS ET METIERS <120> IMMUNOGENIC CONJUGATE FOR INDUCING AN IMMUNE RESPONSE AGAINST INTERLEUKIN-6 <130> B000112WO <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr 35 40 45 Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile 50 55 60 Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser 65 70 75 80 Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala 85 90 95 Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu 100 105 110 Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr 115 120 125 Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln 130 135 140 Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His 180 185 190 Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala 195 200 205 Leu Arg Gln Met 210 <210> 2 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg 20 25 30 Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro 35 40 45 Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys 50 55 60 Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 65 70 75 80 Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 90 95 Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val 100 105 110 Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125 Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr 130 135 140 Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155 160 Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys 165 170 175 Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met 180 185 190 Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe 195 200 205 Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val 210 215 220 Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp 225 230 235 240 Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255 Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270 Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285 Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser 290 295 300 Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320 Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr 325 330 335 Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350 Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu 355 360 365 Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile 370 375 380 Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly 385 390 395 400 Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu 405 410 415 Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val 420 425 430 Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro 435 440 445 Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr 450 455 460 Phe Phe Pro Arg 465 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 3 Arg Tyr Ile Ile Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn 1 5 10 15 Lys Ser Asn Met Cys 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 4 Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn 1 5 10 15 Asn Leu Asn Leu Pro Lys 20 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 5 Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 6 Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Gln Ala Arg 20 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 7 Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln 1 5 10 15 Asp Met <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 8 Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln 1 5 10 15 Met <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 9 Val Leu Trp Glu Ile Val Glu Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn 1 5 10 15 Ser Asp Cys Met Asn 20 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 10 Asn Ser Asp Cys Met Asn Asn Asp Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu 1 5 10 15 Lys Leu Pro Glu Ile Gly 20 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 11 Asn Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys Leu Leu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 12 Ser Tyr Leu Glu Tyr Met Lys Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asp 1 5 10 15 Lys Ala Arg Val 20 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 13 Ala Leu Leu Thr Asp Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr 1 5 10 15 Lys Thr <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 sequence <400> 14 Ser Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val Thr Leu Arg Ser Thr Arg Gln Thr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Cys (C), Tyr (Y), Lys (K) <400> 15 Glu Gly Glu Xaa 1 <210> 16 <211> 535 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 16 Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg 180 185 190 Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val 195 200 205 Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 210 215 220 Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu 225 230 235 240 Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu 245 250 255 His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val 260 265 270 Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu 290 295 300 Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala 305 310 315 320 Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp 340 345 350 Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe 355 360 365 Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His 370 375 380 Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr 385 390 395 400 Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His 405 410 415 Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val 420 425 430 Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr 435 440 445 His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile 450 455 460 Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly 465 470 475 480 Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu 500 505 510 Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser 515 520 525 Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser 530 535 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 variant sequence <400> 17 Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 variant sequence <400> 18 Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 variant sequence <400> 19 Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys 1 5 10 15 Cys <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 variant sequence <400> 20 Ala Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro 1 5 10 15 Lys Cys <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 variant sequence <400> 21 Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro 1 5 10 15 Lys Cys <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide according to the invention <400> 22 Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro 1 5 10 15 Lys Cys Tyr <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide according to the invention <400> 23 Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Cys 1 5 10 15 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide according to the invention <400> 24 Cys Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Ile Asp Gly Ile Ser Ala Leu 1 5 10 15 Arg Lys Glu Thr Cys Glu Gly Glu Cys 20 25 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide according to the invention <400> 25 Cys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Cys Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide according to the invention <400> 26 Cys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Cys Glu Gly Glu 1 5 10 15 Tyr <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide according to the invention <400> 27 Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys 1 5 10 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide according to the invention <400> 28 Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Glu Gly Glu Tyr 1 5 10 15

Claims

- 담체 단백질, 및
- 인터루킨 6 (IL-6) 또는 인터루킨 6 수용체 (IL-6R)의 5 내지 50 아미노산의 서열, 또는 IL-6 또는 IL-6R의 5 내지 50 아미노산의 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함하는 최대로 100 아미노산을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하고,
폴리펩티드는 담체 단백질에 공유적으로 연결되고 담체 단백질은 무독성 돌연변이체 디프테리아 독소인, 면역원성 접합체.
제1항에 있어서, 담체 단백질은 CRM197인 면역원성 접합체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드는 IL-6 또는 IL-6R의 7 내지 35 아미노산 서열, 또는 IL-6 또는 IL-6R의 7 내지 35 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함하는 것인 면역원성 접합체.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리펩티드는 고리화되는 것인 면역원성 접합체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리펩티드는 하기 서열:
· RYIIDGISALRKETCNKSNMC,
· NKSNMCESSKEALAENNLNPK,
· AEKDGCFQSGFNEETC,
· FEVYLEYLQNRFESSEEQAR,
· NASLLTKLQAQNQWLQDM, 및
· RSFKEFLQSSLRALRQM
로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 적어도 5 아미노산을 포함하는 것인 면역원성 접합체.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리펩티드는 비-펩티드 커플링제를 통해서 담체 단백질에 연결되는 것인 면역원성 접합체.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하기 식 (I)의 면역원성 접합체:
[(AESSKEALAENNLNLPKC)-GMB]-CRM197 (I)
(식에서,
· 폴리펩티드는 서열 AESSKEALAENNLNLPKC로 이루어지고,
· 담체 단백질은 CRM197이고,
· 폴리펩티드는 N-γ-말레이미도부티릴- (GMB) 커플링제를 통해서 담체 단백질에 공유적으로 연결되고,
· 괄호는 폴리펩티드가 C-말단 시스테인 (C) 및 N-말단 알라닌 (A) 간 펩티드 결합의 형성에 의해 고리화된다는 것을 의미하고,
· 대괄호는 적어도 하나의 폴리펩티드가 담체 단백질에 연결된다는 것을 의미함).
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하기 식 (II)의 면역원성 접합체:
[아세틸-(CESSKEALAENNLNLPKC)-(X)_i-Z-GMB]-CRM197, (II)
(식에서,
· 폴리펩티드는 서열 CESSKEALAENNLNLPKC-(X)_i-Z로 이루어지고,
· 담체 단백질은 CRM197이고,
· 폴리펩티드는 N-γ-말레이미도부티릴-(GMB) 커플링제를 통해서 담체 단백질에 공유적으로 연결되고,
· 괄호는 폴리펩티드의 CESSKEALAENNLNLPKC 서열 부분이 C-말단 및 N-말단 시스테인 (C) 간 디술피드 결합의 형성을 통해 고리화된다는 것을 의미하고,
· 아세틸- 은 N-말단 시스테인 (C)의 유리 -NH₂ 작용기가 아미드 결합을 형성하여 아세틸 기에 의해 보호된다는 것을 의미하고,
· (X)는 1 내지 5 아미노산의 임의의 펩티드 서열을 나타내고,
· i는 0 또는 1이고,
· Z는 티로신 (Y) 또는 시스테인 (C)을 나타내고,
· 대괄호는 적어도 하나의 폴리펩티드가 담체 단백질에 결합한다는 것을 의미함).
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 개체에서, 치료적 치료 방법, 또는 IL-6의 과생산과 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법에서 사용을 위한 것인, 면역원성 접합체.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 개체에서, IL-6 또는 IL-6R에 대한 백신접종 방법, 또는 IL-6 또는 IL-6R에 대한 면역 반응 유도 방법에서 사용을 위한, 면역원성 접합체.
활성 물질로서 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 면역원성 접합체를, 임의로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 부형제와 함께 포함하는 것인, 약학 조성물, 특히 백신 조성물 .
제11항에 있어서, 적어도 하나의 보강제를 더 포함하는 것인 약학 조성물, 특히 백신 조성물.
제11항 또는 제12항에 있어서, 개체에서, 치료적 치료 방법, 또는 IL-6의 과생산과 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법에서 사용을 위한 것인 약학 조성물, 특히 백신 조성물.
제11항 또는 제12항에 있어서, 개체에서, IL-6 또는 IL-6R에 대한 백신접종 방법, 또는 IL-6 또는 IL-6R에 대한 면역 반응 유도 방법에서 사용을 위한, 약학 조성물, 특히 백신 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 면역원성 접합체를 제조하는 방법으로서, 인터루킨 6 (IL-6) 또는 IL-6 수용체 (IL-6R)의 5 내지 50 아미노산 서열, 또는 IL-6 또는 IL-6R의 5 내지 50 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 변이체 서열을 포함하는 최대로 100 아미노산을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드를 무독성 돌연변이체 디프테리아 독소인 담체 단백질과 공유적으로 연결시키는 단계를 포함하는 것인 제조 방법.