DE69923832T2

DE69923832T2 - Hemmung der tnf-aktivität mit zusammensetzungen enthaltend heparin und lösliche tnf rezeptoren

Info

Publication number: DE69923832T2
Application number: DE69923832T
Authority: DE
Inventors: Dan Aderka; Eshed (Englender), Talma
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2019-12-31
Also published as: CA2322229A1; JP2002534375A; WO2000040225A2; CA2322229C; EP1058544B1; ES2237959T3; WO2000040225A3; AU1796100A; DK1058544T3; EP1058544A1; ATE289506T1; IL127851A0; US6608044B1; AU780203B2; IL138024A; DE69923832D1; PT1058544E

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren und Arzneimittel zur Hemmung der Aktivität des Tumornekrosefaktors (TNF) gerichtet.
Technischer Hintergrund
Tumornekrosefaktor (TNF) ist ein proinflammatorisches Cytokin, das von einem breiten Spektrum von Zellen produziert wird. Er spielt bei der Abwehr des Wirtes eine Schlüsselrolle, wobei er komplexe zelluläre Reaktionen unterschiedlicher und sogar gegensätzlicher Natur vermittelt (Aggarwal et al., 1996). Im Überschuß kann TNF schädliche systemische Wirkungen ausüben. Zwei spezifische Zelloberflächen-Rezeptoren hoher Affinität, der p55-TNF-Rezeptor (p55 TNF-R) und der p75-TNF-Rezeptor (p75 TNF-R), dienen als Übertragungselemente, wobei das intrazelluläre Signal für Zellreaktionen auf TNF bereitgestellt wird. Die extrazellulären Teile der TNF-Rs, die als lösliche TNF-Rs bekannt sind, wurden früher als TBP-I bzw. TBP-II bezeichnet (vgl. Wallach, US-Patent Nr. 5,359,037 und Tartaglia et al., 1992; Loetscher et al., 1991).
Die biologischen Wirkungen von TNF hängen von dessen Konzentration und der Stelle der Erzeugung ab. In geringen Konzentrationen kann TNF wünschenswerte Homöostase- und Abwehrfunktionen hervorbringen. Durch diese Wirkungen können zum Beispiel Tumorzellen oder virusinfizierte Zellen zerstört und die antibakteriellen Aktivitäten von Granulocyten gesteigert werden. Auf diese Weise trägt TNF zum Schutz des Organismus gegen infektiöse Krankheitserreger und zur Genesung von einer Verletzung bei. In höheren Konzentrationen kann TNF jedoch systemisch oder in bestimmten Geweben mit anderen Cytokinen, insbesondere Interleukin-1, zusammenwirken, wobei viele Entzündungsreaktionen verschlimmert werden.
Darüber hinaus ist jetzt bekannt, dass die Wirkungen von TNF-α, hauptsächlich auf das Gefäßsystem, eine Hauptursache für Symptome von septischem Schock sind (Tracey et al., 1986). Bei einigen Krankheiten kann TNF einen übermäßigen Gewichtsverlust (Kachexie) verursachen, indem die Aktivitäten von Adipocyten supprimiert werden und Anorexie bewirkt wird.
Es hat sich herausgestellt, dass TNF (zusammen mit Interleukin-2) die folgenden Wirkungen induziert: Fieber, Schlaf mit einem langsamen Phasenwechsel, hämodynamischer Schock, erhöhte Produktion des Proteins der akuten Phase, verminderte Produktion von Albumin, Aktivierung von vaskulären Endothelzellen, erhöhte Expression von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes, verminderte Menge von Lipoprotein-Lipase, verminderte Menge von Cytochrom P450, erhöhte Plasmaspiegel von Zink und Eisen, Fibroblasten-Proliferation, erhöhte Menge von Kollagenase in Synovialzellen, erhöhte Aktivität der Cyclo-Oxygenase, Aktivierung von T-Zellen und B-Zellen und Induzierung der Cytokin-Sekretion, nämlich der von TNF selbst, von Interleukin-1 und von Interleukin-6.
Aufgrund seiner pleiotropen Wirkung hat man angenommen, dass TNF an einer Vielzahl pathologischer Zustände in vielen unterschiedlichen Organen des Körpers beteiligt ist. In Blutgefäßen fördert TNF hämorrhagischen Schock, reguliert die Thrombomodulin-Menge in Endothelzellen herunter und erhöht die Prokoagulans-Aktivität. Er bewirkt die Adhäsion von weißen Blutkörperchen und wahrscheinlich von Blutplättchen an die Wände von Blutgefäßen und kann so Prozesse fördern, die sowohl zu Atherosklerose als auch Vaskulitis führen.
TNF aktiviert Blutzellen und bewirkt die Adhäsion von Neutrophilen, Eosinophilen, Monocyten/Makrophagen sowie T- und B-Lymphocyten. Durch Induzierung von Interleukin-6 und Interleukin-8 steigert TNF die Chemotaxis von Entzündungszellen und deren Eindringen in Gewebe. TNF spielt daher eine Rolle bei der Gewebeschädigung bei Autoimmunerkrankungen, Allergien und Transplantatabstoßung.
TNF ist auch als Cachectin bezeichnet worden, weil es die Stoffwechselaktivitäten von Adipocyten moduliert und zu dem Stoffwechselabfall und der Kachexie, die Krebs, chronische Infektionen, chronisches Herzversagen und chronische Entzündung begleiten, beiträgt. TNF kann auch eine Rolle bei der Gewebeschädigung bei Autoimmunerkrankungen, Allergien und Transplantatabstoßung spielen.
TNF übt auch Stoffwechselwirkungen auf Skelett- und Herzmuskel aus. Er übt auch starke Wirkungen auf die Leber aus: er setzt den Stoffwechsel von Albumin und Cytochrom P450 herab und erhöht die Produktion von Fibrinogen, saures α-Glycoprotein (AGP) und anderen Proteinen der akuten Phase. Er kann auch eine Nekrose des Darms bewirken.
Im Zentralnervensystem durchdringt TNF die Blut-Hirn-Schranke und induziert Fieber, erhöhten Schlaf und Anorexie. Eine erhöhte TNF-Konzentration steht auch mit multipler Sklerose im Zusammenhang. Er bewirkt auch Nebennierenblutung und beeinträchtigt die Produktion von Steroidhormonen, erhöht die Menge von Collagenase und PGE-2 in der Haut und bewirkt den Abbau von Knochen und Knorpel, indem Osteoclasten aktiviert werden.
TNF ist daher an der Pathogenese vieler unerwünschter Entzündungszustände und an Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung, Vaskulitis und Atherosklerose beteiligt. Er scheint eine Rolle bei Herzversagen, der Reaktion auf Krebs und Anorexia nervosa zu spielen. Aus diesem Grunde hat man nach Mitteln zur Hemmung der Aktivität von TNF gesucht, um auf diesem Wege eine Vielzahl von Krankheiten zu bekämpfen.
Bei der Untersuchung von Möglichkeiten, dem schädlichen Potential von TNF bei bestimmten klinischen Zuständen entgegen zu wirken, suchten Forscher nach natürlichen TNF-Inhibitoren (Engelmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Seckinger et al., 1989; Olsson et al., 1989). Solche Mittel, die zuerst in Urin entdeckt wurden, waren strukturell mit den extrazellulären Cytokin-Bindungsdomänen der beiden membranassoziierten TNF-Rs identisch (Nophar et al., 1990). Diese abgestoßenen löslichen TNF-Rs (sTNF-Rs) können mit den Zelloberflächen-Rezeptoren um TNF konkurrieren und so die Cytokin-Aktivität blockieren.
Wechselwirkungen zwischen den TNF-Rs und ihrem Liganden sind jedoch viel komplexer als anfangs gedacht. In physiologischen Konzentrationen zerfallen die trimeren und biologisch aktiven TNF-Moleküle, wobei sie zu inaktiven monomeren Formen dissoziieren (Petersen et al., 1989; Aderka et al., 1992). Die Zugabe von sTNF-Rs zu den TNF-Trimeren fördert die Bildung von Komplexen zwischen ihnen, wodurch die aktiven, trimeren Formen von TNF bewahrt und deren Zerfall verhindert wird (Aderka et al., 1991; De Groote et al., 1993). Dieser biologisch aktive TNF kann von diesem Komplex dissoziieren und freien TNF, der abgebaut wurde, ersetzen, sodass auf diese Weise eine konstante Konzentration von freiem, biologisch aktivem, trimerem Cytokin aufrechterhalten wird. Diese reversible Wechselwirkung zwischen den löslichen Rezeptoren und ihrem Liganden erweitert die Funktionen, die den TNF-Rezeptoren zugeschrieben werden können. In ihrer löslichen Form können die TNF-Rs als:

(a) TNF-Antagonisten (wenn sie, bezogen auf TNF, im großen Überschuß vorliegen),
(b) TNF-Trägerproteine (zwischen Körperkompartimenten),
(c) Reservoirs für biologisch aktiven TNF mit langsamer Freisetzung,
(d) Stabilisatoren der biologisch aktiven Form von TNF (die auch die Halbwertszeit von TNF verlängern können), und
(e) TNF-„Puffer" dienen, indem die Wirkungen hoher Konzentrationen von TNF gehemmt und dieser den Zellen in einer geringen und wohl eingestellten Menge präsentiert wird (Aderka et al., 1992).

Die Funktionen der TNF-Rezeptoren sind daher nicht auf die Signalübertragung beschränkt, sondern umfassen für deren lösliche Formen extrazelluläre regulatorische Funktionen, die die lokale und systemische Verfügbarkeit von biologisch aktivem TNF beeinflussen.
TNF und Krankheit
Die Untersuchung von Patienten mit septischem Schock aufgrund von Meningokokkämie zeigte, dass bei Patienten mit tödlichem Ausgang das TNF/sTNF-Rs-Verhältnis im Vergleich zu den Patienten, bei denen die Gesundheit wiederhergestellt wurde, höher war, was vermuten läßt, dass zwischen dem Liganden und seinen Inhibitoren eine entscheidende Gleichgewichtsstörung bestand (Girardin et al., 1994). Der bevorzugte nächste Schritt schien darin zu bestehen, das im Überschuss vorliegende TNF zu neutralisieren.
Tatsächlich stellte sich heraus, dass dimere Fc-Fusionskonstrukte von p55 sTNF-R, nicht jedoch von p75 sTNF-R, Mäuse vor letalen Dosen von LPS schützten (Evans et al., 1994), wenn sie nicht später als 1-3 Stunden nach LPS-Gabe verabreicht wurden (Peppel et al., 1991; Mohler et al., 1993; Ashkenazi et al., 1991; Lesslauer et al., 1991). Dies lässt vermuten, dass die Symptome von septischem Schock auftreten, wenn die anfangs erzeugten hohen TNF-Konzentrationen während des engen Zeitfensters nicht durch entsprechende Konzentrationen von löslichen Rezeptoren gepuffert werden.
Zu der zunehmenden Verwirrung trägt bei, dass eine Neutralisierung von TNF mit einem gegen TNF gerichteten monoclonalen Ab (Abraham et al., 1995; Kaul et al., 1996) oder einem p55 sTNF-R-IgG1 (Leighton et al., 1996) bei Patienten mit schwerer Sepsis oder septischem Schock zu widersprüchlichen Ergebnissen führt. Bei einer Untersuchung erwiesen sich die Antikörper als unwirksam (Abraham et al., 1995), während bei der anderen die Verabreichung der Antikörper nur für die Patienten von Nutzen war, deren Grundlinien-Spiegel an Interleukin-6 höher als 1000 pg/ml war, bei Patienten mit geringerem Interleukin-6-Spiegel jedoch die Mortalität erhöht wurde (Kaul et al., 1995). Bei einem anderen Versuch nach dem Zufallsprinzip wiesen Sepsis-Patienten, denen ein rekombinantes Dimer, das aus sTNF-R und dem Fc-Teil von IgG1 bestand, verabreicht worden war, im Vergleich zu Patienten, die mit einem Placebo behandelt worden waren (30%), eine höhere Mortalität auf (48-53%) (Suffredini et al., 1994; Fisher et al., 1996). Interessanterweise war die Mortalität der Patienten umso höher, je höher die verabreichte Dosis der sTNF-Rs war (Fisher et al., 1996). Es wurde vermutet, dass die wirksame Entfernung des im Blutkreislauf befindlichen TNF zur Verschlimmerung der systemischen Infektion führen könnte (Fisher et al., 1996). Im Gegensatz dazu war bei einer vor kurzem durchgeführten Untersuchung die Verabreichung von ähnlichen löslichen Fc-Rezeptor-Konstrukten für Sepsis-Patienten trotz deren Interleukin-6-Serumspiegel offensichtlich von Nutzen, wobei im Vergleich zu Placebo-behandelten Individuen die Mortalität um 36% vermindert wurde (Leighton et al., 1996). Diese widersprüchlichen Daten vermitteln den Eindruck, dass die Verabreichung von sTNF-Rs einen sehr engen therapeutischen Index aufweisen könnte und es schwierig ist, diesen auf den einzelnen Kranken zu übertragen. Eine zu große Menge der Rezeptoren kann TNF vollständig neutralisieren, wobei sich die systemische Infektion verschlimmert, während eine zu geringe Menge der Rezeptoren TNF nicht ausreichend neutralisieren kann, was zu septischem Schock und dem Tod des Patienten führen kann. Die tatsächliche Herausforderung besteht in der Feinabstimmung der sTNF-R-Dosis, die es erlaubt, dass geringe TNF-Spiegel ihre Schutzwirkungen ausüben. Paradoxerweise können daher Dosen von sTNF-Rs, die niedriger als die bisher eingesetzten sind (Fisher et al., 1996), für Patienten mit septischem Schock eher von Nutzen sein als höhere.
Da die Neutralisierung von TNF nicht vollständig sein sollte, sondern auf das Verbleiben geringer Mengen an biologisch aktivem TNF abzielen sollte, die die gewünschten vorteilhaften Wirkungen ausüben, können vielleicht natürliche lösliche TNF-Rezeptoren für diesen Zweck ideal geeignet sein.
TNF ist auch bei der Pathogenese von Morbus Crohn, einer chronischen und zur Behinderung führenden Störung des Darms, ein zentrales Cytokin und stellt daher ein Hauptziel für eine spezifische Immuntherapie dar (Braegger et al., 1992; MacDonald et al., 1990; Breese et al., 1994). Tatsächlich wurde durch die Behandlung von Morbus Crohn-Patienten mit chimären monoclonalen Antikörpern gegen TNF eine spektakuläre Remission bei Patienten induziert, die auf eine herkömmliche Therapie nicht ansprachen (van Dullemen et al., 1995). Ob Präparate von sTNF-Rs mit langsamer Freisetzung (Eliaz et al., 1966) identische Wirkungen auf den Verlauf dieser Krankheit ausüben, muss noch bestimmt werden.
Bei einer anderen Autoimmunstörung, nämlich rheumatoider Arthritis, wurde gezeigt, dass Serum-sTNF-Rs zur Überwachung der Krankheitsaktivität geeignet sein können (Cope et al., 1992; Roux-Lombard et al., 1993). Es zeigte sich, dass trotz des Vorliegens hoher Mengen an TNF-Inhibitoren in Gelenken, die von rheumatoider Arthritis betroffen waren, diese Inhibitoren nicht ausreichten, die TNF-Aktivität zu neutralisieren (Cope et al., 1992). Eine Doppelblinduntersuchung nach dem Zufallsprinzip, bei der die Verabreichung von gegen TNF gerichteten chimären monoclonalen Antikörpern an Patienten mit rheumatoider Arthritis verglichen wurde, führte zu einer eindrucksvollen klinischen Remission (Levine et al., 1994). Kürzlich wurde gezeigt, dass der Einbau der sTNF-Rs in polymere Systeme wie Ethylen-Vinylacetat-Copolymere oder Polymilchsäure-Glykolsäure und deren subkutane Injektion systemisch natürliche p55 sTNF-Rs in hohen Konzentrationen mit einer konstanten Rate über längere Zeiträume (mehr als einen Monat) bereitstellen kann (Eliaz et al., 1966). Es ist daher möglich, dass sich sTNF-Rs auch bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis als therapeutisch wirksam erweisen.
TNF, TNF-Rs und das Herz
In Seren von Patienten mit Herzversagen sind erhöhte Konzentrationen von TNF und dessen löslichen Rezeptoren nachgewiesen worden (Levine et al., 1990). TNF kann bei diesem Zustand zu einer beeinträchtigten Herzmuskelkontraktion beitragen, da es sich zeigte, dass er eine signifikante Herabsetzung der Myocyten-Verkürzung hervorruft (Cunnion, 1990). Ganze Herzen, die mit Serum von Tieren, die 18-22 Stunden zuvor mit TNF behandelt worden waren, perfundiert wurden, zeigten darüber hinaus im Vergleich zu Kontrollen eine signifikante Beeinträchtigung und verminderte Geschwindigkeit der Relaxation (DeMeules et al., 1992). Ähnliche beeinträchtigende Wirkungen können dem Herzmuskel möglicherweise zugefügt werden, wenn das Herz ständig TNF, der im Blutkreislauf von Patienten mit Herzversagen zirkuliert, ausgesetzt ist (Levine et al., 1990). Eine Neutralisierung des Cytokins mit sTNF-rs kann zur Behandlung von Herzversagen geeignet sein.
Hemmung von TNF
Es ist berichtet worden, dass Heparin TNF bindet (Lantz et al., 1991). Die Signifikanz dieser Beobachtung wurde jedoch nie untersucht. Die Wirkungen von Heparin scheinen den Wirkungen von TNF genau entgegengesetzt zu sein, wie in Lantz et al. in Tabelle I gezeigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Heparin und/oder eines Derivats davon in Kombination mit einem löslichen TNF-Rezeptor zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der biologischen Aktivität von TNF.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Bereitstellung von Arzneimitteln, die Heparin und/oder ein Derivat davon in Kombination mit mindestens einem löslichen TNF-Rezeptor umfassen, zur Hemmung der biologischen Aktivität von TNF.
Die Erfindung betrifft ferner die Bereitstellung eines Kits zur gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verabreichung einer solchen Zusammensetzung, der die aktiven Inhaltsstoffe zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger sowie Anweisungen zur Verwendung umfasst.
Es hat sich herausgestellt, dass Heparin und Heparine mit niedrigem Molekulargewicht die biologische Cytokin-Aktivität von TNF hemmen, insbesondere wenn sie mit einem weiteren TNF bindenden Protein wirken. Heparin ist ein natürliches TNF bindendes Protein und vernetzt wahrscheinlich TNF mit dessen Rezeptoren p55 TNF und p75 TNF. Dies hemmt die biologische Cytokin-Aktivität von TNF, indem vermutlich die Trimerisierung der TNF-Rezeptoren gestört wird. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung stellen die vorstehende Theorie über die Wirkung auf, ohne jedoch daran gebunden zu sein. Durch Verabreichung von Heparin oder einem Derivat davon zusammen mit einem löslichen TNF-Rezeptor wird daher die biologische Aktivität von TNF gehemmt und die Störungen, die durch im Überschuss vorliegenden TNF verursacht werden, können erfolgreich behandelt werden. Heparin oder ein Derivat davon kann gleichzeitig mit dem TNF-Rezeptor verabreicht werden, entweder in Form separater Zusammensetzungen oder in Form von Zusammensetzungen, die sowohl Heparin oder ein Derivat davon als auch mindestens einen löslichen TNF-Rezeptor enthalten.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1A und 1B sind Diagramme, die die Hemmung der TNF-Aktivität durch Heparin (1A) und Clexane^® (1B) zeigen.
2 ist ein Diagramm, das die Wirkung einer Vorbehandlung von Zellen mit Heparin auf die TNF-Cytotoxizität als Funktion der Zeit, in der die Zellen vor TNF-Zugabe mit Heparin behandelt wurden, zeigt.
Die 3A und 3B zeigen den Einfluss der Entfernung des Überstandes auf die cytotoxischen Wirkungen von TNF.
4A zeigt die Wechselwirkungen von Heparin mit p55 sTNF-R und TNF.
4B zeigt die Wechselwirkungen von Clexane^® mit p55 sTNF-R und TNF.
5A zeigt die Wechselwirkung von Heparin mit p75 sTNF-R und TNF.
5B zeigt die Wechselwirkungen von Clexane^® mit p75 sTNF-R und TNF.
6A zeigt die Wirkung von Heparin, das zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach TNF-Anwendung zugegeben wurde.
6B zeigt die Wirkung von Clexane^®, das zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach TNF-Anwendung zugegeben wurde.
7 veranschaulicht die Wechselwirkungen zwischen TNF, löslichen TNF-Rezeptoren und Heparin oder einem Heparin mit niedrigem Molekulargewicht.
8 zeigt das Gleichgewicht zwischen TNF und dessen löslichen Rezeptoren.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Es ist entdeckt worden, dass Heparin oder ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht die Wirkung von sTNF-Rs verstärken kann, offensichtlich eher in synergistischer als lediglich in additiver Weise.
Heparin ist ein Glycosaminoglycan, ein hochsulfatiertes Mucopolysaccharid, das aus einer heterogenen Reihe sich wiederholender Disaccharid-Einheiten besteht, die aus D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure in 1,4-Glycosid-Bindung an Glucosamin bestehen. Jede der sich wiederholenden Einheiten enthält zwei Sulfatester und eine N-Sulfat-Gruppe. Heparin ist die am stärksten anionisch geladene organische Säuresubstanz, die jemals aus einem lebenden biologischen System isoliert worden ist. Heparin kommt in vielen verschiedenen Körpergeweben vor, wobei jedoch die Lunge, der Intestinaltrakt, die Leber und Mastzellen besonders reich an Heparin sind. Bei Heparin handelt es sich um eine Familie linearer Polymere, die sich in Kettenlänge und Molekulargewicht unterscheiden, wobei seine genaue Gesamtzusammensetzung nicht bekannt ist.
Handelsüblich wird Heparin aus tierischen Geweben extrahiert, am häufigsten aus Rinder-Lungen und der Darmschleimhaut von Rinder-, Schafs-, Schweine- und Ziegenarten. In jeder Arzneiflasche von therapeutisch eingesetztem Heparin ist ein eine große Bandbreite von Molekülarten im Bereich von 2000 bis 25 000 Dalton vorhanden. Die Wirksamkeit von Heparin wird in Einheiten definiert, wobei eine Einheit die Menge von Heparin ist, die die Koagulation von Schafsplasma durch den Prozess der Rekalzifizierung verhindert. Verschiedene Extrakte von Heparin können hinsichtlich ihrer Wirksamkeit schwanken, d.h. die Wirksamkeit von 1 mg, bezogen auf das Gewicht, kann im Bereich von 80-170 Einheiten liegen. Die Weltgesundheitsorganisation hat Referenzstandards für Heparin erstellt.
Heparin zeigt seine Hemmwirkung auf den Ablauf der Blutkoagulationskaskade durch mindestens zwei unterschiedliche Mechanismen. Erstens wird die Serinprotease-Hemmwirkung von Antithrombin III mehrfach gesteigert, wenn Heparin mit den Lysin-Resten von Antithrombin III bei hoher Affinität in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 Komplexe bildet. Zweitens kann Heparin aufgrund seiner hohen Polyanionen-Ladungsdichte die Wirkung der als Koagulans wirkenden positiv geladenen aktivierten Glycoprotein-Serinproteasen neutralisieren. Heparin induziert auch den Abbau von Histamin durch Lipoprotein-Lipase und Histaminase und besitzt auch entzündungshemmende Eigenschaften.
Seit Mitte der 1940er Jahre ist Heparin allgemein verwendet worden, hauptsächlich zur prophylaktischen Verhinderung und Behandlung von thrombotischen Erkrankungen wie tiefer Venenthrombose, Lungenembolie und Myokardinfarkt. Eine weitere hauptsächliche Verwendung von Heparin besteht in der Verhinderung der Blutkoagulation in extrakorporalen Systemen, sodass Nierendialyse, Herz-Bypass-Operationen, Herz-, Lungen-, Leber- und Nierentransplantationen, extrakorporale Lungen-Bypass-Sauerstoffanreicherung und extrakorporale Kreislauf-Membranultrafiltration ermöglicht werden. Niedrige Dosen von Heparin mit niedrigem Molekulargewicht werden verwendet, um die Bildung intravaskulärer Thromben prophylaktisch zu verhindern. Auch Fragmente, Peptide und synthetisch hergestellte Peptide von Heparin sind verwendet worden.
Bei Tiermodellen hat sich gezeigt, dass Heparin die Fähigkeit von Autoimmun-T-Lymphocyten, ihr Zielorgan zu erreichen, herabsetzt (Lider et al., 1990). Es hat sich auch gezeigt, dass Heparin experimentell erzeugte Autoimmunerkrankungen bei Ratten supprimiert und das Überleben von Allotransplantaten in einem Maus-Modell für Hauttransplantation verlängert, wenn es in niedrigen Dosen von etwa 5 Mikrogramm bei Mäusen und 20 Mikrogramm bei Ratten verwendet und einmal täglich injiziert wurde (Lider et al., 1989).
Man kann davon ausgehen, dass die den beobachteten Wirkungen zugrunde liegenden Mechanismen eine Hemmung der Freisetzung des Enzyms bzw. der Enzyme, das/die für das Durchdringen der Gefäßwand erforderlich ist/sind, aus den T-Lymphocyten umfassen, wobei es sich hauptsächlich um das Enzym Heparanase handelt, das spezifisch die Glycosaminglycan-Einheit der subendothelialen extrazellulären Matrix, die die Blutgefäße auskleidet, angreift (Naparstek et al., 1984). In dem Modell der experimentellen Autoimmunerkrankung Encephalomyelitis steht die Expression des Enzyms Heparanase mit der Fähigkeit der Autoimmun-T-Lymphocyten im Zusammenhang, die Blutgefäßwände zu durchdringen und das Gehirn anzugreifen.
Ein niedriges Molekulargewicht aufweisende Heparine mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 3000-6000, beispielsweise die in dem europäischen Patent EP 0014184 offenbarten Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, stammen von Heparin. Einige Heparine mit niedrigem Molekulargewicht sind unter unterschiedlichen Handelsnamen wie Fragmin^® (vgl. US-Patent Nr. 4,303,651), Fraxiparin^®, Fraxiparine^® (US-Patente Nr. 4,486,420 und Nr. 4,692,435), Lovenox^® (Europäisches Patent 40144) und Clexane^® (US-Patent Nr. 3,948,917) im Handel erhältlich.
Es gibt mehrere unterschiedliche Möglichkeiten zur Herstellung von Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht: Anreicherung mittels Fraktionierung mit Ethanol und/oder Molekularsieb-Verfahren, z.B. Gelfiltration oder Membranfiltration des in Standard-Heparin vorhandenen Heparins mit niedrigem Molekulargewicht und gesteuerte chemische (mittels salpetriger Säure, wbw-Eliminierung oder Periodat-Oxidation) oder enzymatische (mittels Heparinase) Depolymerisation. Die Bedingungen zur Depolymerisation können sorgfältig gesteuert werden, um Produkte mit dem gewünschten Molekulargewicht zu erhalten. Üblicherweise wird eine Depolymerisation mittels salpetriger Säure verwendet. Auch die Benzylester von Heparin können mittels wbw-Eliminierung depolymerisiert werden, wobei der gleiche Typ von Fragmenten wie bei der enzymatischen Depolymerisation unter Verwendung von Heparinasen erhalten wird. Ein niedriges Molekulargewicht aufweisendes Heparin mit einer geringen Antikoagulans-Aktivität, das die chemische Grundstruktur von Heparin beibehält, kann mittels Depolymerisation unter Verwendung von Periodat-Oxidation oder durch Entfernen der Antithrombin bindenden Fraktion eines mittels anderer Verfahren hergestellten Heparins mit niedrigem Molekulargewicht, wobei immobilisiertes Antithrombin zur Adsorption verwendet wird, hergestellt werden.
Fragmin^® ist ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, dessen durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 4000-6000 Dalton liegt und das durch gesteuerte Depolymerisation von Natrium-Heparin aus Schweine-Darmschleimhaut mit salpetriger Säure hergestellt wird. Es wird von Kabi Pharmacia, Schweden, unter dem Namen Fragmin^® zur Verwendung als Antithrombotikum in Form von physiologischen Kochsalzlösungen zur Injektion in Spritzen mit Einzeldosen von 2500 IE/0,2 ml und 5000 IE/0,2 ml, was etwa 16 mg bzw. 32 mg entspricht, hergestellt.
Fraxiparin^® und Fraxiparine^® sind ein niedriges Molekulargewicht aufweisende Heparine mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 4500 Dalton, die aus Calcium-Heparin aus Schweine-Darmschleimhaut durch Fraktionierung bzw. gesteuerte Depolymerisation mit salpetriger Säure hergestellt werden. Diese Heparine mit niedrigem Molekulargewicht werden von Sanofi (Choay Laboratories) zur Verwendung als Antithrombotikum in Einzeldosen, die etwa 36 mg umfassen, was 3075 IE/0,3 ml Wasser entspricht, hergestellt.
Lovenox^® (Enoxaprain/e), ein Heparin-Fragment mit niedrigem Molekulargewicht, das durch Depolymerisation von Natrium-Heparin aus der Darmschleimhaut des Schweines unter Verwendung von wbw-Eliminierung hergestellt wird, wird von Pharmuka SF, Frankreich unter den Namen Clexane^® und Lovenox^® zur Verwendung als Antithrombotikum in Einzeldosis-Spritzen, die 20 mg/0,2 ml Wasser und 40 mg/0,4 ml Wasser umfassen, hergestellt und von Rhone-Poulenc vertrieben.
Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, die durch Fraktionierung oder gesteuerte Depolymerisation von Heparinen hergestellt werden, zeigen im Vergleich zu Heparin verbesserte antithrombotische Wirksamkeit, aber auch unterschiedliche pharmakokinetische Eigenschaften. Die Halbwertszeit ist verdoppelt und die biologische Verfügbarkeit ist in Bezug auf ihre Antikoagulans-Wirkung nach subkutaner Injektion höher (Bratt et al., 1985; Bone et al., 1987).
Die Eigenschaften der vorstehend beschriebenen Heparine mit niedrigem Molekulargewicht sind allen Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht gemeinsam, ungeachtet des Herstellungsverfahrens, der strukturellen Unterschiede (der durch Depolymerisation erzeugten oder derjenigen, die von einer Variation des als Rohmaterial verwendeten Heparins abhängen) oder der Antikoagulans-Aktivität, vorausgesetzt, dass das verwendete Heparin mit niedrigem Molekulargewicht in der Lage ist, die TNF-Sekretion durch in Ruhephase befindliche T-Zellen und/oder Makrophagen als Reaktion auf die Aktivierung durch einen Kontakt mit spezifischen Antigenen, Mitogenen, aufgeschlossener extrazellulärer Matrix oder deren Proteinbestandteilen wie Fibronectin oder Laminin in vitro zu hemmen.
Um die Wirksamkeit der Hemmung der TNF-Aktivität zu testen (vgl. Beispiele 1 und 2) wurden WISH-Zellen in 100 μl Medium in einer Konzentration von 30 000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. 16 Stunden später, wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 90% erreicht hatten, wurden den Vertiefungen TNF, Rezeptoren, Heparin oder Clexane^® zugegeben. Die den entsprechenden Vertiefungen zugegebenen Endkonzentrationen waren wie folgt:

TNF 0,5 ng/ml

Heparin 1 Einheit/ml

Clexane^® 1 Einheit/ml

TBPI (p55 TNF-Rezeptor) 5 ng/ml

TBPII (p75 TNF-Rezeptor) 10 ng/ml
Die unterschiedlichen Kombinationen wurden in Eppendorf-Teströhrchen gemischt, wobei ein Endvolumen von 300 μl erreicht wurde. Dann wurden der entsprechenden Vertiefung 50 μl zugegeben. Wenn eine Inkubation erforderlich war, wurde diese in einem Eppendorf-Teströhrchen 30 Minuten bei 37°C in einem Gemisch oder separat durchgeführt. Nach Zugabe jeder der unterschiedlichen Kombinationen wurden jeder Vertiefung 50 μl Cycloheximid zugegeben. 16 Stunden später wurden die Zellüberstände verworfen und der Farbstoff Neutralrot wurde 1 Stunde bei 37°C zugegeben. Der Farbstoff wurde aus überlebenden Zellen mit einer Sorensen- Lösung extrahiert und die Ergebnisse wurden in einer ELISA-Ablesevorrichtung abgelesen.
Es stellte sich heraus, dass die Zugabe von 1 Einheit Heparin/ml zu 0,5 ng TNF/ml zu einer biologischen TNF-Aktivität von etwa 25% führte (d.h. einer Verminderung der Cytotoxizität von 49% auf 27%), wie in 1A gezeigt. Clexane^® übte eine ähnliche Wirkung aus, wie in 1B gezeigt. Daher hemmten sowohl Heparin als auch Clexane^®, ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, die Toxizität von TNF.
Man nimmt an, dass Heparin die zelluläre Bindung von TNF stört. Wie in Beispiel 3 genauer ausgeführt, wurden WISH-Zellen 0 bis 30 Minuten vor TNF-Zugabe mit Heparin vorbehandelt. Durch diese Vorbehandlung wurde die TNF-Cytotoxizität erheblich gehemmt, wie in 2 gezeigt. Die Hemmwirkung von Heparin äußerte sich sofort (zum Zeitpunkt 0), was vermuten ließ, dass sie nicht auf eine metabolische Wirkung, durch die eine Resistenz der Zellen gegen TNF induziert wird, zurückzuführen ist.
Mögliche Erklärungen für dieses Phänomen sind:

(1) Heparin kann an TNF-Rezeptoren (Zelloberflächen- oder lösliche Rezeptoren) binden, wodurch die Bindung von TNF an dessen Rezeptoren gestört wird.
(2) Heparin beeinträchtigt nicht TNF-Rezeptoren. Es kann mit TNF in dem Moment seiner Anwendung Komplexe bilden und/oder es kann die Bindung von Liganden an zellassoziierte Rezeptoren stören und TNF daran hindern, die Rezeptor-Trimerisierung zu induzieren, was eine Voraussetzung für die Signalübertragung darstellt.

Wie aus Beispiel 4 ersichtlich, führt die Entfernung von Heparin oder eines Heparins mit niedrigem Molekulargewicht aus dem Überstand zu einer sofortigen Beseitigung seiner Schutzwirkung gegen die TNF-Cytotoxizität. Die Gegenwart von Heparin oder eines Heparins mit niedrigem Molekulargewicht ist daher für die Hemmung der TNF-Aktivität erforderlich. Die Polysaccharide induzieren in den Zellen, die mit diesen Polysacchariden vorbehandelt wurden, keinen metabolischen Resistenzzustand. Zwischen Heparin oder einem Heparin mit niedrigem Molekulargewicht und Zellmembran-Elementen wie TNF-Rezeptoren gibt es keine Affinität, da es durch einfaches mechanisches Waschen praktisch entfernt wird und die TNF-Hemmwirkungen aufgehoben werden.
Da die „zelluläre Wirkung" von Heparin entfernt werden kann, kann daher angenommen werden, dass die TNF-Hemmwirkung von Heparin wahrscheinlich auf sein Anhaften an TNF zurückzuführen ist, was dessen Assoziation mit den TNF-Rs der Zellmembran verhindert oder diese stört.
Wie in Beispiel 5 genauer ausgeführt, zeigte eine Untersuchung der Bindung von Heparin oder Clexane^® an die löslichen Rezeptoren oder den TNF/TNF-R-Komplex unter Bezugnahme auf die 4 und 5 das Folgende:

(1) Eine 30-minütige Vorinkubation von TNF mit Heparin oder Clexane^® und deren Anwendung auf die WISH-Zellen führte im Vergleich zu deren Anwendung ohne Vorinkubation zu einer weiteren Verstärkung ihrer TNF-Hemmwirkung (vgl. Säulen 3 und 6 in den 4A, 4B, 5A und 5B). Es scheint ein Störungs-Phänomen vorzuliegen. Nach Vorinkubation mit Heparin oder einem Heparin mit niedrigem Molekulargewicht wird mehr TNF an das Polysaccharid gebunden, was die Bindung von TNF an dessen zellassoziierte Rezeptoren stören kann. Eine andere Erklärung ist, dass Heparin die Dissoziation des aktiven Trimers zu inaktiven Monomeren fördern kann.
(2) Während p55 TNF-R oder p75 TNF-R allein etwa 8-15% der biologischen TNF-Aktivität hemmen konnten, wurde durch die Zugabe von entweder Heparin oder Clexane^® zu TNF und jedem Rezeptor die Hemmung durch die Rezeptoren um das 3-4-fache (60%ige Hemmung) verstärkt. Vgl. Säulen 2,4 und 5 in den 4 und 5.

Heparin und ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht können daher die Bindung von löslichem TNF-R an TNF steigern, wodurch die neutralisierende Wirkung sowohl von p55 TNF-R als auch p75 TNF-R um das 3- bis 4-fache verstärkt wird. Es scheint, dass das Polysaccharid TNF mit dessen Rezeptoren vernetzt. Obwohl die Schlussfolgerung, dass Heparin die Bindung von TNF an dessen zellassoziierte Rezeptoren verhindert, und die Schlussfolgerung, dass Heparin diese Bindung an die löslichen Rezeptoren steigert, widersprüchlich und paradox zu sein scheinen, führen beide Konstellationen zu einer Hemmung der biologischen TNF-Aktivität und können nebeneinander bestehen.

(3) Eine einfache Vorinkubation von TNF mit p55 sTNF-R führte im Gegensatz zu seiner Vorinkubation mit p75 sTNF-R zu einer stärkeren TNF-Hemmung, wie sich bei einem Vergleich der Säulen 4 und 7 in den 4A und 5A sowie 4B und 5B zeigt. Dies kann mit der „Ligandendurchlauf ("ligand passing")"-Wirkun von p75 sTNF-R im Zusammenhang stehen.
(4) Eine 30-minütige Vorinkubation von TNF mit p55 sTNF-R/p75 sTNF-R und Heparin/Clexane^® führte zu fast der gleichen TNF-Hemmung wie die, die beobachtet wurde, wenn die drei Bestandteile ohne Vorinkubation bei Zellen angewendet wurden (vgl. Säulen 5 bis 8 in den 4 und 5). Daraus lässt sich die Schlussfolgerung ziehen, dass die Wechselwirkung zwischen TNF, löslichem Rezeptor und Heparin im Gegensatz zu der Wechselwirkung zwischen TNF und Heparin, die sich mit der Zeit steigert, sofort erfolgt, wie vorstehend gezeigt. Das lässt vermuten, dass sich der natürlichen Neigung von TNF zur sofortigen Bindung an seinen Rezeptor eine schnelle Vernetzung des gebildeten Komplexes durch Heparin/Clexane^® anschließt.
(5) TNF wurde 30 Minuten mit Heparin/Clexane^® vorinkubiert und unmittelbar vor der Anwendung auf Zellen wurde p55 sTNF-R bzw. p75 sTNF-R zugegeben. Die beobachtete TNF-Cytotoxizität war gegenüber der, die bei einer gleichzeitigen Vorinkubation der drei Bestandteile erhalten wurde, höher, wie sich bei einem Vergleich zwischen den Säulen 8 und 9 in den 4 und 5 zeigt. Eine Erklärung ist, dass während der Inkubation von TNF + Heparin/Clexane^® das Polysaccharid mit TNF einen Komplex bildet, was dessen Bindung an die löslichen Rezeptoren nach deren späterer Zugabe stört. Da sich freier TNF, Heparin und deren Komplex im Gleichgewicht befanden, führte die Entfernung von freiem TNF durch die Zugabe von löslichen Rezeptoren zu einer Dissoziation der TNF/Polysaccharid-Komplexe, sodass das Gleichgewicht wieder erhalten wurde, wobei freier TNF mit der gleichen Chance an lösliche Rezeptoren oder Zellrezeptoren binden und diese aktivieren konnte. Dass Heparin/Clexane^® die Bindung von TNF an dessen Rezeptor stört, wurde ferner durch einen Vergleich zwischen Säule 9 und Säule 5 in den 4 und 5 untermauert.
(6) Eine 30-minütige Vorinkubation von p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R mit Heparin oder Clexane^® und die Zugabe von TNF unmittelbar vor Anwendung auf die Zellen, wie in den 4A und 5A sowie 4B und 5B gezeigt, führte zu einer TNF-Hemmung, die mit denjenigen identisch war, die bei gleichzeitiger Zugabe der drei Bestandteile zu den Zellen (Säule 5) oder nach deren gemeinsamer 30-minütiger Vorinkubation (Säule 8) erhalten wurden. Daraus lässt sich die Schlussfolgerung ziehen, dass das Polysaccharid die Bindung der TNF-Rezeptoren an TNF nicht stört und keine Affinität zu dem „nackten" TNF-Rezeptor aufweist. Heparin/Clexane^® weist jedoch eine starke Affinität zu dem TNF/TNF-Rezeptor-Komplex auf, den es stark vernetzt. Da Heparin/Clexane^® keine Affinität zu den „nackten" löslichen TNF-Rezeptoren aufweist, lässt sich die Leichtigkeit, mit der die „zelluläre Wirkung" von Heparin/Clexane^® ausgewaschen werden kann, wie in 2 gezeigt, mit der Schlussfolgerung vereinbaren, dass Heparin/Clexane^® auch keine Affinität zu den „nackten" zellassoziierten Rezeptoren aufweist.
(7) Die Hemmung von TNF nach seiner Vorinkubation mit seinem p55 sTNF-R und der Zugabe von Heparin/Clexane^® unmittelbar vor Anwendung auf Zellen (4A und 4B, Säule 11) war besser als die Hemmung, die erhalten wurde, wenn TNF nur mit p55 sTNF-R vorinkubiert worden war, wie ein Vergleich zwischen den Säulen 7 und 11 in den 4A und 4B zeigt. Dies lässt vermuten, dass Heparin/Clexane^® die Hemmung von TNF durch p55 sTNF-R weiter erleichtert, wahrscheinlich indem diese vernetzt werden. Es ist erwähnenswert, dass nach Zugabe von Heparin/Clexane^® die Hemmung von TNF durch p75 sTNF-R besser war (20-25%) als die Hemmung durch p55 sTNF-R (15%). Dies ist durch einen Vergleich der Säulen 7 und 11 in den 4A und 4B mit den Säulen 7 und 11 in den 5A und 5B zu sehen. Heparin/Clexane^® verstärkt die Bindung von TNF an dessen p55 sTNF-R und p75 sTNF-R. Die größere Hemmung von TNF durch p75 sTNF-R in Gegenwart des Polysaccharids kann mit der Verhinderung des „Ligandendurchlaufs" durch p75 sTNF-R im Zusammenhang stehen, wenn Heparin/Clexane^® diesen mit TNF vernetzt.

Heparin/Clexane^® verstärkt die Bindung von TNF an dessen lösliche Rezeptoren und steigert so deren TNF-Hemmwirkung. Man würde jedoch erwarten, dass eine ähnliche erhöhte Bindung an zellassoziierte Rezeptoren, wie ein Vergleich zwischen Säule 2 und Säule 3 in den 4 und 5 zeigt, zu einer erhöhten TNF-Cytotoxizität führt. In der Praxis wurde die TNF-Cytotoxizität jedoch gehemmt.
Eine theoretische Erklärung für diesen offensichtlichen Widerspruch ist, dass Heparin/Clexane^® die Vernetzung des biologisch aktiven TNF-Trimers mit nur einem oder zwei TNF-Rezeptoren fördert, sodass die Bindung des dritten Rezeptors daran gestört wird. Durch die Förderung einer solchen Bindung an lösliche Rezeptoren wird die biologische TNF-Aktivität neutralisiert. Dass die Bindung von TNF an nur ein oder zwei Zelloberflächen-Rezeptoren verstärkt wird, während die letzte Rezeptoraggregation zu Trimeren gestört wird, erklärt eindeutig den vorstehenden Widerspruch, da eine Signalübertragung am besten nach Aggregation der drei Zelloberflächen-Rezeptoren ausgelöst wird. Nach Vernetzung eines Zelloberflächen-Rezeptors mit TNF durch Heparin/Clexane^® kann das Polysaccharid eine dazwischenliegende Position in einer Weise einnehmen, die eine weitere Trimerisierung der Zelloberflächen-TNF-Rezeptoren verhindert. Wenn TNF die Rezeptor-Trimerisierung bereits induziert hat, kann Heparin andererseits diesen Komplex nicht vernetzen oder dessen Funktion nicht stören. Dies könnte der Schlüssel für die TNF-Hemmung durch dieses Polysaccharid sein.
Zur Unterstützung für die vorstehende Erklärung wurde festgestellt, dass es bei den Experimenten eine widersprüchliche Wirkung gab. Bei den Experimenten, bei denen geringere Mengen an löslichen Rezeptoren verwendet wurden und die durch eine minimale Hemmung (TNF-Hemmung von weniger als 10%) charakterisiert waren, war die verstärkende Wirkung von Heparin/Clexane^® maximal (mehr als 60% Hemmung). Bei den Experimenten, bei denen die Rezeptoren eine 50%-ige Hemmung ausübten, hatte Heparin/Clexane^® eine geringfügige verstärkende Wirkung.
Es scheint, dass bei sehr geringen Mengen an löslichen Rezeptoren die meisten TNF-Trimere Komplexe mit nur einem löslichen Rezeptor erzeugen können. Diese Komplexe stellen wahrscheinliche Ziele für die Vernetzung durch Heparin/Clexane^® dar, was zu einer außergewöhnlichen TNF-Hemmung führt. Wenn die Menge an den löslichen Rezeptoren höher ist, können zwei oder mehr lösliche Rezeptoren an TNF binden, was die wirksame Vernetzung solcher Komplexe durch das Polysaccharid verhindert. Es muss noch nachgewiesen werden, dass diese Komplexe nicht im gleichen Maße durch Heparin/Clexane^® stabilisiert werden wie Komplexe von TNF und monomerem löslichem Rezeptor.
Ein starker Beweis, der erhärtet, dass die Vernetzung durch Heparin/Clexane^® auf Komplexe von TNF mit einem oder höchstens zwei Rezeptoren beschränkt sein könnte, ergibt sich aus einem Vergleich zwischen den Säulen 5 bis 11 der 4 und 5. Wenn bei der Bildung von TNF-Komplexen mit einem, zwei oder drei Rezeptoren zwischen TNF + p55 sTNF-R ein Gleichgewicht erreicht und danach Heparin/Clexane^® zugegeben wurde (Säule 11), wurde die TNF-Cytotoxizität gegenüber einer gleichzeitigen Zugabe von TNF, dessen Rezeptoren und Heparin zu Zellen (Säule 5) erhöht. Eine mögliche Erklärung ist, dass im letzteren Fall TNF anfangs einen einzigen Rezeptor binden kann. Dieser Komplex würde durch Heparin/Clexane^® sofort vernetzt, wodurch TNF gehindert wird, einen zweiten oder dritten Rezeptor zu binden.
Ein weiterer erhärtender Beweis ist in dem Experiment zu finden, mit dem bestimmt wurde, ob Heparin/Clexane^® die biologische Aktivität von TNF hemmen kann, wenn Heparin/Clexane^® nach TNF-Anwendung zugegeben wird. Wenn Heparin/Clexane^® zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach TNF-Anwendung angewandt wurde, war seine Hemmaktivität nach 15 Minuten noch signifikant und nach einer Stunde geringfügig weiter vorhanden. Überraschenderweise betrug die Hemmaktivität von Heparin/Clexane^® bei zwei Experimenten zum Zeitpunkt 0 etwa 7-15%, erhöhte sich auf 25%, wenn es 5-15 Minuten nach TNF angewandt wurde, und verminderte sich nach einer Stunde auf 10% (6).
Eine Erklärung für diese widersprüchliche Erhöhung bei Zugabe von Heparin/Clexane^® 5-15 Minuten nach TNF ist, dass Heparin/Clexane^® nur einen monomeren Rezeptor stark an ein TNF-Trimer bindet. Diese Bindung stört die weitere Rezeptor-Trimerisierung, der sich bekanntlich die Signalübertragung anschließt.
Man kann sich die Bindung von TNF an seine Rezeptoren als Prozess vorstellen, während dem zu Beginn TNF an einen Rezeptor gebunden und mit der Zeit an den zweiten Rezeptor und im weiteren Zeitverlauf an den dritten Rezeptor gebunden wird. Die Tatsache, dass Heparin/Clexane^® selbst eine Stunde nach seiner Anwendung TNF noch hemmen kann, lässt vermuten, dass es in diesem späten Stadium die Trimerisierung der wenigen letzten Rezeptoren stören kann. TNF-Moleküle können in diesem späteren Stadium mit ein oder zwei Rezeptoren kombiniert werden und Heparin/Clexane^® stört die Bindung des dritten, der ansonsten die Signalübertragung induzieren würde.
Dieser Mechanismus kann den Widerspruch erklären, dass die Zugabe von Heparin/Clexane^® 15 Minuten nach TNF-Anwendung zu einer Hemmung von TNF führt, die besser als die ist, die bei gleichzeitiger Anwendung auftritt. Zum Zeitpunkt 0 bindet Heparin/Clexane^® einen Teil von TNF und kann dessen Bindung an die Zellrezeptoren geringfügig stören, wie vorstehend erwähnt. Wenn geringe Konzentrationen von TNF einige Minuten vor Heparin/Clexane^® angewendet werden, hat TNF die Gelegenheit, ungestört an seine Rezeptoren zu binden und durch die Anwendung von Heparin wird der an Rezeptor-Monomere gebundene TNF gegebenenfalls vernetzt.
Es ist daher ersichtlich, dass die Behandlung eines Patienten mit Heparin und/oder einem Heparin mit niedrigem Molekulargewicht die biologische Aktivität von TNF hemmen kann. Die Wirkung von Heparin oder Derivaten davon kann durch Verabreichung von p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R in Kombination mit Heparin oder einem Derivat davon verstärkt werden. Heparin und die löslichen Rezeptoren können gleichzeitig oder im Abstand von etwa 15-30 Minuten verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform wird Heparin oder ein Derivat verabreicht und etwa 15-60 Minuten später wird p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R verabreicht.
Obwohl Heparin per se verabreicht werden kann, weist ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, das mittels Fraktionierung oder gesteuerter Depolymerisation von Heparinen hergestellt wurde, im Vergleich zu Heparin sowohl eine verbesserte antithrombotische Wirksamkeit als auch unterschiedliche pharmakokinetische Eigenschaften auf. Die Halbwertszeit von Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht ist verdoppelt. Obwohl Bratt et al. (1985) festgestellt haben, dass deren biologische Verfügbarkeit in Bezug auf ihre Antikoagulans-Wirkung nach subkutaner Injektion höher ist, sollte aufgrund der 4 und 5 dennoch beachtet werden, dass Heparin und Clexane^® mit p55 sTNF-R, p75 sTNF-R und TNF etwa die gleichen Wechselwirkungen zeigen. Für die erfindungsgemäßen Zwecke kann daher jedes Heparin mit niedrigem Molekulargewicht anstelle von Heparin verwendet werden.
Die Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, die erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden können, umfassen sowohl Clexane, wie vorstehend beschrieben, als auch Fragmin^®, ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, dessen durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 4000-6000 Dalton liegt und das mittels gesteuerter Depolymerisation von Natrium-Heparin aus Schweine-Darmschleimhaut mit salpetriger Säure von Kabi Pharmacia, Schweden, hergestellt wird. Auch Fraxiparin^® und Fraxiparine^®, Heparine mit niedrigem Molekulargewicht, deren durchschnittliches Molekulargewicht etwa 4500 Dalton beträgt und die von Sanofi (Choay Laboratories) aus Calcium-Heparin aus Schweine-Darmschleimhaut mittels Fraktionierung bzw. gesteuerter Depolymerisation mit salpetriger Säure hergestellt werden, lassen sich verwenden.
Für die erfindungsgemäßen Zwecke kann Heparin per se verwendet werden, entweder allein oder in Kombination mit einem Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, ungeachtet des Herstellungsprozesses, der strukturellen Unterschiede (der durch Depolymerisation erzeugten oder derjenigen, die von einer Variation des als Ausgangsmaterial verwendeten Heparins abhängen) oder der Antikoagulans-Aktivität. In einer anderen Ausführungsform kann ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht allein verwendet werden.
Zu den Störungen, die erfindungsgemäß durch Hemmung der TNF-Aktivität behandelt werden können, gehören alle Störungen, die mit der Gegenwart von TNF im Zusammenhang stehen und die auf eine Hemmung der biologischen Aktivität von TNF ansprechen. Zu diesen Störungen gehören Atherosklerose und Vaskulitis und damit im Zusammenhang stehende pathologische Prozesse, Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis, Diabetes mellitus Typ I, Allergien, Transplantatabstoßung, akute und chronische Entzündungserkrankungen wie Uveitis und Darmentzündung, Anorexia nervosa, durch Septikämie verursachter hämorrhagischer Schock und opportunistische Infektionen bei AIDS-geschädigten Individuen.
Heparin oder ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht oder Gemische davon werden beispielsweise in Form von wässrigen Lösungen, die möglicherweise Natriumchlorid, Stabilisatoren und andere geeignete nicht-aktive Inhaltsstoffe umfassen, in Arzneimittel eingearbeitet. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise mittels subkutaner oder intravenöser Injektion, wobei die vorliegende Erfindung jedoch jede andere geeignete Darreichungsform umfasst.
Die löslichen TNF-Rezeptoren p55 sTNF-R und p75 sTNF-R werden ebenso in Arzneimittel eingearbeitet, entweder allein oder in Kombination mit Heparin und Derivaten davon. Die verabreichten Mengen an Heparin oder Derivaten davon hängen von der Darreichungsform ab. Wenn ein Präparat mit langsamer Freisetzung verabreicht wird, sind die verabreichten Mengen viel geringer als bei intramuskulärer oder intravenöser Verabreichung.
Erfindungsgemäße Arzneimittel zur Verabreichung können mindestens ein Heparin oder Derivat davon und mindestens einen löslichen TNF-Rezeptor zusammen in pharmazeutisch verträglicher Form, gegebenenfalls kombiniert mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, umfassen. Diese Zusammensetzungen können mittels jedes Mittels, mit dem ihre angestrebten Zwecke erreicht werden können, verabreicht werden. Mengen und Therapieschemata zur Verabreichung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung können vom Fachmann zur Behandlung von Störungen, die mit einer übermäßigen biologischen Aktivität von TNF im Zusammenhang stehen, ohne weiteres bestimmt werden.
Beispielsweise kann die Verabreichung über einen parenteralen Weg wie den subkutanen, intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen, transdermalen oder bukkalen Weg erfolgen. In einer anderen Ausführungsform oder gleichzeitig kann die Verabreichung über den oralen Weg erfolgen. Die verabreichte Dosierung hängt vom Alter, dem Gesundheitszustand und dem Gewicht des Empfängers, dem Typ einer früheren oder gleichzeitigen Behandlung, sofern durchgeführt, der Häufigkeit der Behandlung und der Natur der gewünschten Wirkung ab.
Zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung gehörende Zusammensetzungen umfassen alle Zusammensetzungen, die mindestens ein Heparin oder Derivat umfassen, das in Kombination mit mindestens einem löslichen TNF-Rezeptor in einer Menge verabreicht wird, die zur Erzielung des beabsichtigtes Zwecks ausreicht. Wenngleich der individuelle Bedarf schwankt, gehört die Bestimmung optimaler Bereiche wirksamer Mengen von jedem Bestandteil zum allgemeinen Fachwissen. Typische Dosierungen umfassen etwa 0,1 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht.
Die folgenden Beispiele helfen, die vorliegende Erfindung zu erläutern.
BEISPIEL 1: Hemmung der TNF-Aktivität durch Heparin
WISH-Zellen wurden in 100 μl Medium in einer Konzentration von 30 000 Zellen/Vertiefung ausgesät. 16 Stunden später wurde entweder Medium (Kontrolle), Heparin, TNF oder eine Kombination von TNF plus Heparin zugegeben. Die Endkonzentrationen jedes Bestandteils in den entsprechenden Vertiefungen waren wie folgt: 0,5 ng/ml TNF und 1 Einheit/ml Heparin. Nach den verschiedenen Zugaben wurde jeder Vertiefung Cycloheximid zugegeben (50 μl), wobei die Endkonzentration in der Vertiefung 25 μg/ml betrug. 16 Stunden später wurden die Zellüberstände verworfen und der Farbstoff Neutralrot wurde 1 Stunde zugegeben. Nach einer 1-stündigen Inkubation wurde der Farbstoff mit einer Sorensen-Lösung extrahiert und die Ergebnisse wurden in einer ELISA-Ablesevorrichtung abgelesen. Die Ergebnisse korrelieren direkt mit dem Prozentsatz der abgetöteten Zellen. Die Ergebnisse sind in 1A gezeigt. Es ist ersichtlich, dass die Zugabe von TNF eine Hemmung der biologischen TNF-Aktivität von etwa 25% bewirkte (Verminderung der Cytotoxizität von 49% auf 37%).
BEISPIEL 2: Hemmung der TNF-Aktivität durch Clexane^®
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei allerdings Heparin durch Clexane^® ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in 1B gezeigt. Es ist ersichtlich, dass im Wesentlichen ähnliche Hemmwirkungen erhalten wurden.
BEISPIEL 3: Wirkung einer Vorbehandlung mit Heparin auf die TNF-Cytotoxizität
Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei die WISH-Zellen 0 bis 30 Minuten vor Zugabe von TNF mit Heparin behandelt wurden. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Es ist ersichtlich, dass über den ganzen Zeitverlauf hinweg im Wesentlichen identische Hemmwirkungen erhalten wurden.
BEISPIEL 4: Wirkung der Entfernung von Heparin mittels Waschen
WISH-Zellen wurden in 100 μl Medium in einer Konzentration von 30 000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. 16 Stunden nach dem Aussäen der Zellen wurde den entsprechenden Vertiefungen entweder Heparin oder Clexane^® zugegeben, während den als Kontrolle dienenden Vertiefungen nur Medium zugegeben wurde. Heparin oder Clexane^® wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 Einheit/ml zugegeben. 6 Stunden später wurde ein Teil der Vertiefungen, der entweder mit Heparin oder Clexane^® oder nur mit Medium vorbehandelt worden war, dreimal mit frischem Medium gewaschen und TNF wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ng/ml zugegeben. Die Ergebnisse für Heparin sind in 3A und die für Clexane^® in 3B gezeigt. Es ist ersichtlich, dass durch die Vorbehandlung mit Heparin/Clexane^® die TNF-Cytotoxizität erwartungsgemäß um 33% (von 60% auf 40%) vermindert wurde (vgl. Säulen 2 bis 4 in 3A und 3B). Ein einfaches Waschen der Zellen, die mit Medium vorbehandelt worden waren, führte jedoch auch zu einer 25%-igen Verminderung der Empfänglichkeit der Zellen für TNF. Zellen, die mit Heparin oder Clexane^® vorbehandelt und deren Überstände vor TNF-Zugabe gewaschen worden waren, wurden in identischer Weise durch TNF abgetötet (vgl. Säulen 3 bis 5 in 3A und 3B). Die Entfernung von Heparin oder Clexane^® aus den Überständen führt daher zu einer sofortigen Beseitigung ihrer Schutzwirkung vor TNF-Cytotoxizität.
Durch die Entfernung der Überstände, das Waschen der Zellen und die Zugabe von neuem Medium erhöht sich die Resistenz der Zellen gegen TNF um 20%. Es ist möglich, dass die entfernten Überstände einen Faktor enthalten, der die TNF-Cytotoxizität ermöglicht, und dass dessen Entfernung die Wirkung von TNF vermindert. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die Zelloberflächen-TNF-Rezeptoren nach Entfernung der Überstände schnell abgestoßen werden, wie bereits festgestellt wurde (Aderka, im Druck), was eine gewisse vorübergehende Desensibilisierung gegenüber TNF induzieren könnte.
BEISPIEL 5: Wirkung von Heparin/Clexane^® auf TNF-Rezeptoren
WISH-Zellen wurden in 100 μl Medium in einer Konzentration von 30 000 Zellen/Vertiefung ausgesät. 16 Stunden später wurden entweder Medium (Kontrolle) oder ein sTNF-R (entweder p55 sTNF-R (4A und 4B) oder p75 sTNF-R (5A und 5B)) und entweder Heparin (4A und 5A) oder Clexane^® (4B und 5B) zugegeben. Die Endkonzentrationen jedes Bestandteils in den entsprechenden Vertiefungen waren wie folgt: 0,5 ng/ml TNF, 1 Einheit/ml Heparin, 1 Einheit/ml Clexane^®, 5 ng/ml TBP-I (p55 TNF-Rezeptor) und 10 ng/ml TBP-II (p75 TNF-Rezeptor).
Unterschiedliche Kombinationen der Bestandteile wurden in einem Eppendorf-Teströhrchen gemischt, wobei ein Endvolumen von 300 μl erhalten wurde. Jeder entsprechenden Vertiefung wurden dann 50 μl zugegeben. Falls eine Inkubation erforderlich war, erfolgte diese in einem Eppendorf-Teströhrchen als Gemisch oder separat 30 Minuten bei 37°C.
Nach Zugabe der verschiedenen Kombinationen wurde jeder Vertiefung Cycloheximid (50 μl) bis zu einer Endkonzentration von 25 μg/ml zugegeben. 16 Stunden später wurden die Zellüberstände verworfen und der Farbstoff Neutralrot wurde 1 Stunde zugegeben. Nach der 1-stündigen Inkubation wurde der Farbstoff mit einer Sorensen-Lösung extrahiert und die Ergebnisse wurden in einer ELISA-Ablesevorrichtung abgelesen.
Die Ergebnisse sind in den 4A, 4B, 5A und 5B gezeigt. In jeder der Figuren stellt der erste Balken des Diagramms eine Kontrolle dar, bei der das Eppendorf-Teströhrchen nur 300 μl Medium umfasste. Bei dem zweiten Balken jeder Figur umfasste das Eppendorf-Teströhrchen 2,1 μl TNF in einer Konzentration von 2 ng/ml plus 20 μl Medium.
Bei Balken 3 jeder Figur wurden dem Eppendorf-Teströhrchen 1,8 Einheiten Heparin oder Clexane^® (10 μl) und 10 μl Medium zusammen mit 280 μl TNF in einer Konzentration von 2,1 ng/ml zugegeben. Das Gemisch wurde dann sofort den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen zugegeben.
Bei dem vierten Balken wurden 6 ng p55 sTNF-R (10 μl) zu 10 μl Medium und der gleichen Menge an TNF, wie vorstehend diskutiert, unmittelbar vor Zugabe zu den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen gegeben. In den 5A und 5B wurde anstelle von p55 sTNF-R die doppelte Menge an p75 sTNF-R (12 ng/10 μl) verwendet.
Bei Balken 5 wurden dem Eppendorf-Teströhrchen 6 ng p55 sTNF-R oder 12 μg p75 sTNF-R, 1,2 Einheiten Heparin oder Clexane^® (10 μl) und 280 μl TNF in einer Konzentration von 2,1 ng/ml zugegeben. Das Gemisch wurde dann sofort den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen zugegeben.
Bei Balken 6 wurden die gleichen Substanzen, wie vorstehend für Balken 3 diskutiert, verwendet, wobei allerdings TNF und entweder Heparin oder Clexane^® dem Eppendorf-Teströhrchen gleichzeitig zugegeben und dann 30 Minuten zusammen inkubiert wurden, bevor sie den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen zugegeben wurden. Ebenso entspricht Balken 7 dem vorstehend beschriebenen Balken 4, wobei allerdings entweder p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R mit TNF gemischt und damit zusammen 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde, bevor die Zugabe zu den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen erfolgte. Das Balken 8 zugrunde liegende Experiment ist das gleiche wie das vorstehend für Balken 5 beschriebene, wobei allerdings TNF, entweder p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R und entweder Heparin oder Clexane^® zusammen gemischt und 30 Minuten inkubiert inkubiert wurden, bevor die Zugabe zu den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen erfolgte.
Bei Balken 9 wurden TNF und entweder Heparin oder Clexane^® 30 Minuten zusammen vorinkubiert, bevor die Zugabe von entweder p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R, die separat vorinkubiert worden waren, und die sofortige Zugabe zu den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen erfolgten. Bei Balken 10 wurden entweder p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R und entweder Heparin oder Clexane^® zusammen 30 Minuten vorinkubiert, bevor die Zugabe von vorinkubiertem TNF und die sofortige Zugabe zu den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen erfolgten. Bei Balken 11 wurden TNF und entweder p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R zusammen 30 Minuten inkubiert, bevor die Zugabe von entweder vorinkubiertem Heparin oder vorinkubiertem Clexane^® und danach die sofortige Zugabe zu den WISH-Zellen enthaltenden Vertiefungen erfolgten.
Wie aus dem Vergleich der verschiedenen Balken der 4A, 4B, 5A und 5B ersichtlich ist, wurde durch eine 30-minütige Vorinkubation von TNF mit Heparin/Clexane^® und Anwendung bei den WISH-Zellen deren TNF-Hemmwirkung im Vergleich zu deren Anwendung ohne Vorinkubation weiter verstärkt (vgl. Balken 3 und 6 jeder Figur). Während p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R allein etwa 8-15% der biologischen TNF-Aktivität hemmen konnten, wurde die Hemmung durch die Rezeptoren darüber hinaus durch die Zugabe von Heparin oder Clexane^® zu TNF und jedem der Rezeptoren 3- bis 4-mal verstärkt (60%-ige Hemmung) (vgl. Säulen 2, 4 und 5 der verschiedenen Figuren).
Kits zur gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verabreichung von Heparin und/oder eines Derivats davon und eines löslichen TNF-Rezeptors werden in üblicher Weise hergestellt. Typischerweise umfasst ein solcher Kit beispielsweise eine Ampulle mit jedem der aktiven Inhaltsstoffe in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, eine Spritze und schriftliche Anweisungen für die gleichzeitige oder aufeinander folgende Verabreichung. Wenn beispielsweise eine gleichzeitige Verabreichung erwünscht ist, wird der Inhalt der Ampullen vor Injektion entweder in einem geeigneten Gefäß oder in der Spritze selbst gemischt.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Ausdrücke oder Begriffe dienen selbstverständlich nur zur Beschreibung, sollen jedoch die Erfindung nicht beschränken. Für die Mittel, Materialien und Schritte zur Durchführung der verschiedenen offenbarten Funktionen gibt es eine Vielzahl alternativer Ausführungsformen, ohne dass dadurch vom Schutzumfang der Erfindung abgewichen wird. Die Begriffe „Mittel zur ..." und „Mittel für ..." oder alle Bezeichnungen für einen Verfahrensschritt, die in der vorstehenden Beschreibung und/oder den nachstehenden Ansprüchen zu finden sind und denen eine funktionelle Aussage folgt, sollen daher jedwedes strukturelles, physikalisches, chemisches oder elektrisches Element oder jedwede strukturelle, physikalische, chemische oder elektrische Struktur oder jedweden Verfahrensschritt definieren und umfassen, das/die/der es jetzt oder zukünftig geben kann und mit dem/der die aufgeführte Funktion durchgeführt werden kann, ganz gleich, ob dies der Ausführungsform oder den Ausführungsformen, die in der vorstehenden Beschreibung offenbart ist/sind, genau entspricht oder nicht, d.h. zur Durchführung der gleichen Funktion können andere Mittel oder Schritte verwendet werden, wobei diese Begriffe so breit wie möglich ausgelegt werden sollen.
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Claims

Arzneimittel, umfassend eine wirksame Menge von Heparin und/oder einem Derivat davon in Kombination mit wenigstens einem löslichen TNF-Rezeptor (sTNF-R).
Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der lösliche TNF-Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus p55 sTNF-R oder p75 sTNF-R.
Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Heparinderivat ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Heparinderivat ein Molekulargewicht zwischen 2500 und 6500 Daltons hat.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verwendung von Heparin und/oder eines Derivates davon und eines löslichen TNF-Rezeptors gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Aktivität von TNF, wobei das Arzneimittel an ein Individuum verabreicht werden soll.
Kit zur gleichzeitigen oder aufeinander folgenden Verabreichung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die aktiven Inhaltsstoffe zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger sowie Anweisungen für die Verwendung.