JP2002534375A

JP2002534375A - 活性阻害

Info

Publication number: JP2002534375A
Application number: JP2000591982A
Authority: JP
Inventors: アデルカ、ダン; エシュド（イングレンダー）、タルマ
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2002-10-15
Also published as: IL127851A0; EP1058544B1; AU780203B2; WO2000040225A2; IL138024A; ES2237959T3; DK1058544T3; CA2322229A1; EP1058544A1; US6608044B1; PT1058544E; DE69923832D1; WO2000040225A3; AU1796100A; CA2322229C; ATE289506T1; DE69923832T2

Abstract

(57)【要約】ＴＮＦの生物学的活性は、可溶性ＴＮＦレセプターと共にヘパリンまたはその派生物を投与することにより阻害される。ヘパリンまたはその派生物は、可溶性ＴＮＦレセプターと同時に、別々の組成物として、またはヘパリンもしくはその派生物と可溶性ＴＮＦレセプターとの両方を含む組成物としてのどちらかで投与されることができる。ヘパリンまたはその派生物はまた、可溶性ＴＮＦレセプターなしで、ＴＮＦ生物学的活性の阻害にさらに効果的な量を投与されることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の活性を阻害する方法および医薬組成物に関
する。

【０００２】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、細胞の広範囲のスペクトル（spectrum）によって
生成される多機能前炎症（pro-inflammatory）サイトカインである。宿主細胞の
防御、また異なるおよび対照となる性質の複雑な細胞応答の仲介において重要な
役割を有する（Aggarwal et al., 1996）。過剰で、ＴＮＦは有害な全身効果を
有する可能性がある。２つの高度に親和的な細胞表面レセプター、ｐ５５ＴＮ
Ｆ−レセプター（ｐ５５ＴＮＦ−Ｒ）およびｐ７５ＴＮＦ−レセプター（ｐ
７５ＴＮＦ−Ｒ）は、ＴＮＦへの細胞内シグナルを提供するトランスデューシ
ング要素として機能する。ＴＮＦ−Ｒｓの細胞外部分は可溶性レセプターとして
知られ、以前はそれぞれＴＢＰ−ＩおよびＴＢＰ−IIと言われていた（Wallach,
US patent 5359037 and Tartaglia et al., 1992; Loetscher et al., 1991参
照）。

【０００３】ＴＮＦの生物学的効果は、その濃度および産生部位に依存する。低濃度では、
ＴＮＦは望ましい恒常性および防御機能を生み出す。たとえば、これらの効果は
腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を破壊し、顆粒球の抗菌活性を増大させる。こ
の点において、ＴＮＦは感染性媒介物（infectious agents）に対する生物の防
御に寄与し、傷からの回復に寄与する。しかしながら、高濃度で、全身的にまた
は特定の組織で、ＴＮＦは他のサイトカイン特にインターロイキンと、炎症応答
を悪化させるために相乗的に作用することができる。そのうえ、主として血管上
において、ＴＮＦ−αの効果が敗血症性ショックの症状の主要な原因であること
が知られている（Tracey et al., 1986）。いくつかの疾病において、ＴＮＦは
含脂肪細胞の活性を抑制すること、および拒食症を引き起こすことで体重の過度
の減少（悪液質(cachexia)）を引き起こす。

【０００４】ＴＮＦは（インターロイキン−２とともに）以下の活性を誘導することがわか
っている。すなわち発熱、低波睡眠、血行力学ショック、急性期タンパク質産生
の増加、アルブミン産生の減少、血管内皮細胞の活性化、主要組織適合複合体分
子の発現の減少、リポプロテインリパーゼの減少、シトクロームＰ４５０の減少
、血漿亜鉛および鉄の現象、繊維芽細胞増殖、滑膜細胞コラーゲナーゼの増加、
シクロ−オキシゲナーゼ活性の増加、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化およびサイト
カイン、ＴＮＦそれ自身、インターロイキン−１ならびにインターロイキン−６
の分泌の誘導。

【０００５】その多面性効果のために、ＴＮＦは体内のたくさんの異なる臓器で様々な病理
学状態と関係する。血管において、ＴＮＦは出血性ショックを促進し、上皮細胞
トロンボモジュリンをダウンレギュレートしおよび凝血促進効果を増強する。血
管壁への白血球、そしておそらく血小板の凝集をおこし、また血管炎と同様にア
テローム性動脈硬化症を引き起こす過程を促進する可能性がある。

【０００６】ＴＮＦは血液細胞を活性化し、好中球、好酸球、単球／マクロファージおよび
ＴならびにＢリンパ管の接着を引き起こす。インターロイキン−６およびインタ
ーロイキン−８を誘導することで、ＴＮＦは炎症細胞の走化性とそれらの組織へ
の浸潤を増加させる。したがって、ＴＮＦは自己免疫疾患、アレルギーおよび移
植片拒絶の組織傷害に役割を持つ。

【０００７】ＴＮＦはまた、含脂肪細胞の代謝活性を調節し、癌、慢性感染、慢性心不全お
よび慢性炎症を伴う消耗、悪液質の原因となるため、カテクチンとも呼ばれる。
ＴＮＦはまた自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶の組織傷害で役割を果
たす。

【０００８】ＴＮＦはまた骨格筋および心筋における代謝効果を有する。これはまた肝臓に
おける著しい効果をもつ。これはアルブミンおよびシトクロームＰ４５０代謝を
低下させ、フィブリノーゲン、α−酸糖タンパク質（ＡＧＰ）および他の急性期
タンパク質の産出を増加させる。これはまた腸の壊死を引き起こすことができる
。

【０００９】中枢神経系において、ＴＮＦは血管脳関門を通過し、発熱、睡眠増加、拒食症
を誘導する。ＴＮＦ濃度の増加はまた多重硬化に関連する。副腎出血の原因とな
り、ステロイドホルモン産出に影響し、皮膚でのコラゲナーゼおよびＰＧＥ−２
を増加させ、破骨細胞の活性化による骨と軟骨の衰弱の原因となる。

【００１０】したがって、ＴＮＦは、自己免疫疾患、移植片拒絶、血管炎およびアテローム
性動脈硬化症での多くの好ましくない炎症状態の病原に関連する。これは心不全
、癌への応答および拒食症での役割を有することが明らかである。これらの理由
により、多種の疾病を制御するための方法としてＴＮＦの活性を阻害する方法が
求められた。

【００１１】特定の臨床状態におけるＴＮＦの有害な潜在力を阻害することについて調査す
る間、調査員は天然のＴＮＦ阻害剤を探した（Engelmann et al, 1989；Engelma
nn et al, 1990；Seckinger et al, 1989；Olsson et al, 1989）。最初に尿で
検出されたこのような物質は、ＴＮＦ−Ｒｓに関連した２つの膜の細胞外サイト
カイン結合ドメインに構造的に同一であった（Nophar et al, 1990）。これらの
流動可溶性ＴＮＦ−Ｒｓ（ｓＴＮＦ−ＲＳ）は細胞表面レセプターでＴＮＦと競
合でき、したがってサイトカイン活性を阻止できる。

【００１２】しかしながら、ＴＮＦ−Ｒｓとそれらのリガンドの間の相互作用は当初考えら
れていたものよりも複雑であった。生理学的な濃度において、三量体の生物学的
活性ＴＮＦ分子は不活性化単量体の形に解離しながら崩壊する（Petersen et al
, 1989；Aderka et al, 1992）。ｓＴＮＦ−ＲｓのＴＮＦ三量体への付加は、そ
れらの間の複合体の形成を促進し、このことはＴＮＦの活性三量体の形の崩壊を
維持し保護することができる（Aderka et al, 1991；De Groote et al, 1993）
。この生物学的活性ＴＮＦは、崩壊したフリーのＴＮＦを置換するためにこの複
合体から解離する可能性があり、したがってフリーの生体活性三量体サイトカイ
ンの一定濃度を保っている。この可溶性レセプターおよびそのリガンド間の可逆
的相互作用は、ＴＮＦレセプターに帰することができる機能を拡張する。これら
の可溶型において、ＴＮＦ−Ｒｓは以下のものとしての役割をする可能性がある
。

【００１３】（ａ）ＴＮＦアンタゴニスト（ＴＮＦに対して過剰に存在する時）（ｂ）ＴＮＦ担体タンパク質（体区画間）（ｃ）生物学的活性ＴＮＦに対する徐放貯蔵庫（ｄ）ＴＮＦの生体活性型の安定剤（ＴＮＦの半減期を引き延ばす可能性もあ
る）、および（ｅ）高ＴＮＦ濃度の効果を抑制し、細胞に対して低いそしてよく制御された
レベルでＴＮＦを提示することでの、ＴＮＦ「緩衝液」（Aderka et al, 1992）

【００１４】ＴＮＦレセプターの機能はしたがって、シグナル伝達に限定されず、しかしそ
の可溶性型で、局部のおよび全身の生物学的活性ＴＮＦ効果に影響する細胞外調
節の役割を含む。

【００１５】ＴＮＦおよび疾病髄膜炎菌血症による敗血症性ショックの患者の試験は、ＴＮＦ／ｓＴＮＦ−Ｒ
ｓの比が、回復した患者に比べて、致命的な結果の患者でより高いことを示し、
このことはリガンドとその阻害剤間の重大な不均衡を示唆している（Girardin e
t al, 1994）。過剰なＴＮＦの中和が好ましい次の段階であるように見えた。

【００１６】実際は、ｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒではなくｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒの二量体Ｆｃ融
合構築物が、もしＬＰＳ後１〜３時間以内に投与した場合（Peppel et al, 1991
；Mohler et al, 1993；Ashkenazi et al, 1991；Lesslauer et al, 1991）、Ｌ
ＰＳの致命的な投与量からマウスを保護することがわかった（Evans et al, 199
4）。これは、もしその短い時間の間、生成した初期高ＴＮＦ濃度が十分な可溶
性レセプター濃度によって緩衝されない場合に、敗血症性ショックの表出がおこ
ることを示唆する。

【００１７】さらに混乱を増加するように、敗血病または敗血症性ショックの患者でのＴＮ
Ｆの、モノクローナル抗ＴＮＦＡｂでの（Abraham et al, 1995；Kaul, et al
, 1996）、またはｐ５５ｓＴＮＦ−ＲＩｇＧ１での（Leighton et al,1996
）、中和は矛盾した結果を示した。１つの研究では、抗体が効果がないとわかり
（Abraham et al, 1995）、一方もう１つの実験では、抗体の投与はインターロ
イキン−６の基準レベルが１０００ｐｇ／ｍｌより高い患者にのみには役立つが
、しかしインターロイキン−６のレベルがより低い患者の死亡率を増加させた（
Kaul et al, 1995）。もう一つのランダム化試験では、ＩｇＧ１のｓＴＮＦ−Ｒ
／Ｆｃ部分を含んでいる組換え体二量体を与えた敗血性患者は、プラゼボ処置患
者（３０％）にくらべて高い死亡率であった（４８〜５３％）（Suffredini et
al, 1994；Fisher et al, 1996）。興味深いことに、投与したｓＴＮＦ−Ｒｓの
投与量が高ければ高いほど、患者の死亡率が高かった（Fisher et al, 1996）。
循環しているＴＮＦの効果的な除去が、結果として全身の感染の悪化となると思
われる（Fisher et al, 1996）。対照的に、最近の研究で、同様の可溶性Ｆｃレ
セプター構築物の投与は、その血清インターロイキン−６濃度に関係なく敗血性
患者に明らかに有用であり、プラセボ処置個体と比較して３６％の死亡率の減少
があった（Leighton et al, 1996）。これらの矛盾したデータは、ｓＴＮＦ−Ｒ
ｓの投与が、臨床での個性化が難しいであろう非常に狭い治療指針を有する可能
性があるという印象を与えた。過度のレセプターが全体的にＴＮＦを中和する可
能性があり、全身の感染を悪化させており、一方非常に少ないレセプターが十分
にＴＮＦを中和する可能性はなく、結果として敗血症性ショックおよび患者の死
亡となる。現実のチャレンジは、保護効果を示すための低ＴＮＦレベルとするた
めにｓＴＮＦ−Ｒの投与量が微調整される。したがって、逆に言えば、すでに用
いられたより低いｓＴＮＦ−Ｒｓの投与量は（Fisher et al, 1996）、高いもの
よりもむしろ敗血症性ショック患者に有益である可能性がある。

【００１８】ＴＮＦ中和は完全に行なうべきではなく、しかし好ましい有益な効果を示すた
めに、低量の生物学的活性ＴＮＦを取り去ることを目指すべきであるので、天然
可溶性ＴＮＦレセプターを本目的に理想的に適応してもよい。

【００１９】ＴＮＦはまたクローン病、腸の慢性身体障害疾患の病因の中枢サイトカインで
もあり、したがって、特異的免疫治療の最初の標的である（Braegger et al, 19
92；MacDonald et al, 1990；Breese et al, 1994）。実際、クーロン病患者の
キメラ抗ＴＮＦモノクローナル抗体での処置は、従来の治療に非応答性の患者で
の華々しい鎮静を誘導した（van Dullemen et al, 1995）。ｓＴＮＦ−Ｒｓの徐
放剤（Eliaz et al, 1966）がこの疾病経過において同一の効果を有するかどう
かは決定されたままである。

【００２０】もう１つの自己免疫傷害であるリウマチ関節炎において、血清ｓＴＮＦ−Ｒｓ
が疾病活性をモニターすることに有用であることが例示された（Cope et al, 19
92；Roux-Lombard et al, 1993）。リウマチ関節炎がおこっている関節での高レ
ベルＴＮＦ阻害剤の存在にも関わらず、これらの阻害剤がＴＮＦ活性を中和する
のに不十分であったことが示された（Cope et al, 1992）。キメラ抗ＴＮＦモノ
クローナル抗体のリウマチ関節炎の患者への投与と比較したランダマイズした２
重ブラインド試験は、結果として目立った臨床的な鎮静となった（Levine et al
, 1994）。最近、ｓＴＮＦ−Ｒｓの、エチレン−ビニル酢酸共重合体またはポリ
ラクチック−グリコリル酸などの重合体系への組み込みとそれらの皮下注射が、
引き延ばされた期間（１ヶ月以上）一定の率で、高い濃度での全身の天然ｐ５５
ｓＴＮＦ−Ｒｓを提供することができることが例示された（Eliaz et al, 196
6）。したがって、ｓＴＮＦ−Ｒｓは同様にリウマチ関節炎を処置するのに治療
的に効果的であることを証明することが可能である。

【００２１】ＴＮＦ．ＴＮＦ−Ｒｓおよび心臓ＴＮＦとその可溶性レセプターの濃度の上昇が心不全患者の血清で検出された
（Levine et al, 1990）。ＴＮＦは、筋細胞短縮の明らかな低下を起こすことが
示されたように（Cunnion, 1990）、この状況下で心筋収縮障害の原因となる可
能性がある。さらに、１８〜２２時間早くＴＮＦで処理した動物からの血清で灌
流した全心臓は、コントロールと比較して、明らかな傷害と弛緩速度の減少とを
示した（DeMeules et al, 1992）。同様な心筋低下効果が、心不全患者において
循環している、ＴＮＦに心臓を連続的にさらすことによって与えられる可能性が
ある（Levine et al, 1990）。ｓＴＮＦ−Ｒｓによるサイトカインの中和が心不
全の処置において有用である可能性がある。

【００２２】ＴＮＦの阻害ヘパリンはＴＮＦに結合することが報告されている（Lantz et al, 1991）。
しかしながら、この観察の重要性はまだなにも試験されていない。ヘパリンの効
果がLantz et al.の表１に示されたように、ＴＮＦの効果の正確な逆効果である
ように思われた。

【００２３】［発明の要約］本発明は、ＴＮＦの生物学的活性を阻害する医薬組成物の製造におけるへパリ
ンおよび／またはその派生物の用途を提供する。

【００２４】本発明はまた、ＴＮＦの生物学的活性を阻害するための医薬組成物を提供する
。

【００２５】本発明はさらに、活性成分と共に薬学的に許容し得る担体とからなる、そのよ
うな組成物の同時または連続投与のためのキット、および使用説明書を提供する
。

【００２６】ヘパリンおよび低分子量ヘパリンはＴＮＦのサイトカイン生物学的活性を、と
くにほかのＴＮＦ結合タンパク質と作用するばあい阻害することがわかっている
。ヘパリンは天然ＴＮＦ結合タンパク質であり、おそらくＴＮＦをｐ５５ＴＮ
Ｆおよびｐ７５ＴＮＦ−レセプターに架橋する。これは、おそらくＴＮＦレセ
プターの三量体化を妨害することにより、ＴＮＦのサイトカイン生物学的活性を
阻害する。本発明者らは？？？前記理論を立てた。したがって、可溶性ＴＮＦレ
セプターと共にヘパリンまたはその派生物の投与によって、ＴＮＦの生物学的活
性は阻害され、過剰ＴＮＦによって起こる疾患を首尾よく治療することができる
。ヘパリンまたはその派生物をＴＮＦレセプターと同時に、別々の組成物または
ヘパリンもしくはその派生物と少なくとも1つの可溶性ＴＮＦレセプターとを含
有する組成物のいずれかで、投与することができる。

【００２７】［発明の詳細な説明］ヘパリンまたは低分子量ヘパリンが、単に追加的なというよりもあきらかに相
乗的な様式で、ＴＮＦ−Ｒｓの効果を増強させることができるということが発見
された。

【００２８】ヘパリンは、Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸の、グルコサミンへの１
，４−グルコシド結合からなる反復二糖単位の異種系からなる高度スルホン化ム
コポリサッカライドであるグリコサミノグリカンである。それぞれの反復単位は
２つの硫酸エステルおよび１つのＮ−硫酸基を含む。ヘパリンは生存生物学的系
（living biological system）から今まで単離された中でもっとも強い、陰イオ
ン性荷電有機酸物質である。ヘパリンは多くの異なる体組織に存在するが、肺、
腸管、肝臓および肥満細胞はヘパリンがとりわけ豊富である。ヘパリンは鎖長お
よび分子量が異なる直鎖ポリマーのファミリーであり、その正確で完全な組成は
明らかでない。

【００２９】商業上、ヘパリンは動物組織、もっとも一般的にはウシの肺およびウシ、ヒツ
ジ、ブタ、ヤギ種の腸粘膜から抽出する。治療で使用されている任意のバイアル
中、２，０００から２５，０００ダルトンまでの、広い範囲の分子種であるヘパ
リンが存在する。ヘパリンの効力はユニットで定義し、ここで１ユニットはカル
シウム再沈着工程によるヒツジ血漿の凝集を防ぐようなヘパリンの量である。ヘ
パリンの様々な抽出物は効力に幅があってよく、すなわち体重あたり１ｍｇは８
０〜１７０ユニット効力の範囲でよい。世界保健機関はヘパリンの参照標準物を
保持している。

【００３０】ヘパリンは、少なくとも２つの異なったメカニズムによって、血液凝集カスケ
ード系においてその阻害的効果を示す。まず、ヘパリンが１：１化学量論様式で
高い親和性でアンチトロンビンIIIのリジン残基と複合化する時に、アンチトロ
ンビンIIIのセリンプロテアーゼ抑制効果が数倍促進される。第二にその高度な
ポリ陰イオン性荷電密度のために、ヘパリンは正電荷活性化糖タンパク質凝集剤
セリンプロテアーゼの効果を中和することができる。ヘパリンはまた、リポタン
パク質リパーゼおよびヒスタミンのヒスタミナーゼ分解を誘導し、また同様に抗
自己炎症特性を有する。

【００３１】ヘパリンはまず深血管血栓症、肺塞栓症、および心筋不全のような血栓性疾病
の予防的防止と処置のために１９４０年代中頃より広く使用されてきた。ヘパリ
ンのもう一つの主要な用途は体外系において、したがって腎透析、心筋バイパス
手術、心臓、肺、肝臓ならびに腎臓の移植、体外肺バイパス酸化および体外循環
膜限外濾過を可能にするように、血液凝集を防ぐことである。低投与量の低分子
量ヘパリンを、血管内血栓形成の予防的防止のために使用する。ヘパリン断片、
ペプチド、および合成的に製造したペプチドもまた使用される。

【００３２】動物モデルにおいて、ヘパリンはその標的臓器にたどり着くために、自己免疫
Ｔリンパ球の能力を減少させることが示された（Lider et al, 1990）。ヘパリ
ンはまた、１日１回の注射で、マウスへは約５マイクログラム、ラットへは約２
０マイクログラムの低投与量で使用した時に、ラットにおける実験的な自己免疫
疾患を抑制し、マウスでの皮膚移植のモデルにおいて同種移植片の生存を引き延
ばすことも示された（Lider et al, 1989）。

【００３３】ヘパリンの観察された効果の背後のメカニズムは、血管壁浸透に必要な酵素、
主として、血管をならべる（line blood ressels）内皮下の細胞外マトリクスの
グルコサミノグリカン部分に特異的に作用する酵素ヘパラナーゼのＴリンパ球に
よる放出の阻害を含んでいると信じられている（Naparstek et al, 1984）。ヘ
パラナーゼ酵素の発現は自己免疫Ｔリンパ球の血管壁に浸透する能力、および実
験的自己免疫脳脊髄炎モデル疾病において脳を攻撃する能力に関連する。

【００３４】たとえば欧州特許第ＥＰ００１４１８４号に開示された低分子量ヘパリンのよ
うな、平均分子量３０００〜６０００である低分子量ヘパリンが、ヘパリンより
誘導される。いくつかの低分子量ヘパリンは、米国特許第４，３０３，６５１号
を参照のFragmin（登録商標）、米国特許第４，４８６，４２０号、および第４
，６９２，４３５号を参照のFraxiparin（登録商標）、Flaxiparine（登録商標
）、欧州特許第４０１４４号のLovenox（登録商標）、米国特許第３，９４８，
９１７号のClexane（登録商標）などの異なった商品名で商業的に入手可能であ
る。

【００３５】低分子量ヘパリンは、いくつかの異なった方法、エタノールおよび／またはた
とえば標準ヘパリンに存在する低分子量ヘパリンのゲル濾過もしくは膜濾過など
の分子ふるいによる分手による濃縮、および制御した化学的（亜硝酸、ｗｂｗ−
除去あるいは過ヨウ素酸酸化による）、もしく酵素的（へパリナーぜによる）解
重合、にて産出することができる。解重合の条件は所望の分子量の産物を産出す
るように慎重に制御できる。亜硝酸解重合が一般的に使用される。また、ヘパリ
ンのベンジルエステルをｗｂｗ−除去によって解重合でき、これはヘパリナーゼ
を用いた酵素的解重合化と同様の型の断片を産出する。ヘパリンの基礎的化学構
造は保っていて低抗凝集活性を持つ低分子量ヘパリンは、過ヨウ素酸酸化を用い
る解重合によって、あるいは、吸着のための固定化アンチトロンビンを用いる他
の方法で製造される、低分子量ヘパリンのアンチトロンビン−結合画分を取り除
くことによって製造できる。

【００３６】 Fragmin（登録商標）は平均分子量が４０００〜６０００ダルトンの範囲内で
ある低分子ヘパリンであり、ブタの腸粘膜からのナトリウムヘパリンの制御した
亜硝酸解重合によって産出された。それぞれ１６ｍｇおよび３２ｍｇに相当する
２５００ＩＵ／０．２ｍｌおよび５０００ＩＵ／０．２ｍｌの１回の投与量シリ
ンジでの注射のための塩類溶液としてのアンチトロンビン剤として使用するため
に、Fragmin（登録商標）という名前でKabi Pharmacia社、スウェーデンで製造
される。

【００３７】 Fraxiparin（登録商標）およびFraxiparine（登録商標）は平均分子量が約４
５００ダルトンの低分子量ヘパリンであり、ブタ腸粘膜からのカルシウムヘパリ
ンの、それぞれ分手または制御した亜硝酸解重合によって産出された。これらの
低分子量ヘパリンは、３０７５ＩＵ／０．３ｍｌ水に相当する、約３６ｍｇから
なる１回の投与量でのアンチトロンビン剤として使用するために、Sanofi社（Ch
oay Laboratories）より製造される。

【００３８】ｗｂｗ−除去を用いたブタ腸粘膜からのナトリウムヘパリンの解重合によって
産出される低分子量ヘパリン断片である、Lovenox（登録商標）（Enoxaprain/e
）は、Pharmuka SF社、フランスで製造され、２０ｍｇ／０．２ｍｌおよび４０
ｍｇ／０．４ｍｌ水からなる１回投与量シリンジでのアンチトロンビン剤として
の使用のためにClexane（登録商標）およびLovenox（登録商標）の名前で、Rhon
e-Poulenc社によって流通される。

【００３９】ヘパリンの分別化、あるいは制御した解重合によって産出される低分子量ヘパ
リンは、ヘパリンと比較して改善されたアンチトロンビン性能を示し、また異な
った薬物動態学的特性を示す。半減期は２倍となり、生物学的利用能（bioavail
ability）は皮下注射に続くそれらの抗凝集効果に関してより高くなる（Bratt e
t al, 1985；Bone et al, 1987）。

【００４０】前述した低分子量ヘパリンの特性は、もし、使用する低分子量ヘパリンが、特
異的な抗原、有糸分裂促進剤、崩壊細胞外マトリクスまたはフィブロネクチンも
しくはラミニンのようなそのタンパク質成分と接触することによる活性化に応答
して、静止（resting）Ｔ細胞および／またはマクロファージによるインビトロ
でのＴＮＦ分泌作用を阻害する能力があるならば、製造工程、構造の違い（解重
合化もしくは原料物質として使用したヘパリンのバリエーションに依存する違い
によって作られる）、または抗凝集活性には関わらずすべての低分子量ヘパリン
について共通の特徴である。

【００４１】ＴＮＦの活性の阻害の効果を調べるために（実施例１および２を参照のこと）
、ＷＩＳＨ細胞を１００μｌ培地中１ウェルあたり３０，０００細胞の濃度で播
いた。１６時間後、細胞が約９０％密集に達した時、ＴＮＦ、レセプター、ヘパ
リン、またはClexane（登録商標）をウェルに加えた。それぞれのウェルに加え
た最終濃度は以下のようである。

【００４２】ＴＮＦ０．５ｎｇ／ｍｌヘパリン１ユニット／ｍｌ Clexane（登録商標）１ユニット／ｍｌＴＢＰＩ（ｐ５５ＴＮＦ−レセプター）５ｎｇ／ｍｌＴＢＰII（ｐ７５ＴＮＦ−レセプター）１０ｎｇ／ｍｌ

【００４３】最終容量が３００μｌに達するまでエッペンドルフ（Eppendorf）チューブ内
で異なる組み合わせを混合した。ついで５０μｌをそれぞれのウェルに加えた。
インキュベーションが必要な場合、混合液でまたは別々で、３７℃で３０分間エ
ッペンドルフチューブ内で実施した。それぞれの異なる組み合わせを加えた後、
５０μｌのシクロヘキシミドをそれぞれのウェルに加えた。１６時間後、細胞上
清を除き、ニュートラルレッド色素を３７℃で１時間加えた。色素をSorensen's
溶液を用いて生存している細胞より抽出し、結果をELISAリーダーで読んだ。

【００４４】図１Ａで示したように、ＴＮＦ０．５ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン１ユニット／ｍ
ｌの付加は、ＴＮＦの生物学的活性の約２５％（すなわち４９％から３７％まで
の細胞傷害性の減少）を有することがわかった。図１Ｂに示したように、Clexan
e（登録商標）は非常に同様の効果を有する。したがってヘパリンおよび低分子
ヘパリンであるClexane（登録商標）は両方ともＴＮＦの毒性を阻害する。

【００４５】ヘパリンはＴＮＦの細胞結合を干渉すると信じられている。実施例３に詳述の
ように、ＷＩＳＨ細胞をＴＮＦに先立ち０分から３０分の間ヘパリンで前処理し
た。図２で示したように、この前処理は本質的にＴＮＦの細胞傷害性を阻害する
。ヘパリンの阻害効果はすぐに（０時間に）表われ、これがＴＮＦに対する細胞
抵抗性を誘導する代謝効果によるのではないことを示唆している。

【００４６】この現象のなし得る説明は以下のようなものである。

【００４７】（１）ヘパリンはＴＮＦレセプター（細胞表面または可溶性レセプター）に結
合する可能性があり、そのレセプターへのＴＮＦの結合を干渉する。

【００４８】（２）ヘパリンはＴＮＦレセプターに影響を及ぼさない。適用した瞬間ＴＮＦ
と複合化し、および／または細胞関連レセプターへのリガンド結合を干渉し、Ｔ
ＮＦをシグナル伝達に必要であるレセプターの三量体化を誘導することから防ぐ
可能性がある。

【００４９】実施例４で見られるように、上清からのヘパリンまたは低分子量ヘパリンの除
去は、すぐにそのＴＮＦ細胞傷害性に対する保護的効果を除去する。したがって
、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの存在はＴＮＦ活性の阻害に必要である。ポ
リサッカライドはこれらのポリサッカライドで前処理した細胞における抵抗性の
代謝的状態を誘導しない。簡単な機械的な洗浄でそれが実際に取り除かれ、ＴＮ
Ｆ阻害効果をなくすので、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンと、ＴＮＦレセプタ
ーなどの細胞膜成分との間に親和性はない。

【００５０】したがって、ヘパリンの「細胞効果」は取り除くことができるので、おそらく
ヘパリンのＴＮＦ−抑制効果はそのＴＮＦへの接着により、その細胞膜ＴＮＦ−
Ｒｓとの相互作用を防ぎ、それを干渉しているのであると見なしてよい。

【００５１】実施例５に詳記したように、ヘパリンまたはClexane（登録商標）の可溶性Ｔ
ＮＦレセプターまたはＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒ複合体への結合実験は、図４および５
に関連して、以下を明らかにした。

【００５２】（１）ＴＮＦのヘパリンまたはClexane（登録商標）との３０分間の前インキ
ュベーションと、そのＷＩＳＨ細胞への適用は、前インキュベーションのなしで
のこれらの適用と比較して、それらのＴＮＦ阻害効果をさらに強力にした（図４
Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂのカラム３と６の比較）。干渉現象であることが明らかで
ある。ヘパリンまたは低分子量ヘパリンとの前インキュベーションに続き、さら
なるＴＮＦが、レセプターに関連するその細胞へ結合するＴＮＦを干渉する可能
性のあるポリサッカライドへ結合する。代わりの説明としては、ヘパリンが活性
三量体の不活性単量体への解離を促進する可能性があるということである。

【００５３】（２）ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒのみは、ＴＮＦ生物
学的活性の約８〜１５％を阻害できた一方、ヘパリンまたはClexane（登録商標
）どちらかの、ＴＮＦおよび各レセプターへの添加は、レセプターによる阻害を
３〜４倍（６０％阻害）強力にした。図４と５のカラム２、４および５を比較の
こと。

【００５４】したがって、ヘパリンまたは低分子量ヘパリンは、ＴＮＦに結合する可溶性Ｔ
ＮＦ−Ｒを増加する可能性があり、ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒおよびｐ７５ｓＴＮ
Ｆ−Ｒ両方の中和効果を３から４倍強力にする。ポリサッカライドは、そのレセ
プターへＴＮＦを架橋することが明らかである。ヘパリンがＴＮＦのその細胞関
連レセプターへの結合を防ぐという結論と、ヘパリンがこの可溶性レセプターへ
のこの結合を増加させるという結論とは、矛盾し、逆説的に見え、両方の結論は
結果ＴＮＦ生物学的活性の阻害となり、共存する可能性がある。

【００５５】（３）ｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒとの前インキュベーションと違って、ｐ５５ｓ
ＴＮＦ−ＲのＴＮＦとの簡単な前インキュベーションは結果として、カラム４と
７を比較して図４Ａ、５Ａ、４Ｂ、５Ｂで示したように、よりすぐれたＴＮＦ阻
害となった。これはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒの「リガンド通過」効果に関連する可
能性がある。

【００５６】（４）ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒ／ｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒおよびヘパリン／Clexan
e（登録商標）とのＴＮＦの３０分間前インキュベーションは、結果として、３
つの内容物を前インキュベーションなしに細胞全体に適用したときに観察された
のとほとんど同じＴＮＦ阻害となった（図４および５、カラム５から８の比較を
参照のこと）。このことから、上述したように時間とともに増加したＴＮＦ−ヘ
パリンの相互作用とは違って、ＴＮＦ、可溶性レセプターおよびヘパリン間の相
互作用が瞬間的であると結論づけることができる。このことは、ＴＮＦのそのレ
セプターへの瞬間的な結合の本来の傾向が、ヘパリン／Clexane（登録商標）に
よって形成された複合体のすばやい架橋によって引き続く可能性がある。

【００５７】（５）ＴＮＦを３０分間、ヘパリン／Clexane（登録商標）と前インキュベー
ションし、細胞へ適用の直前にｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５ｓＴＮＦ−
Ｒそれぞれを加えた。観察されたＴＮＦ細胞傷害性は、カラム８と９を比較した
図４および５で示したように、３つの成分の同時の前インキュベーションと比較
してより高かった。１つの説明は、ＴＮＦ＋ヘパリン／Clexane（登録商標）イ
ンキュベーションの間で、ポリサッカライドはＴＮＦと複合体化し、その後の添
加において可溶性レセプターへの結合を干渉するというものである。フリーのＴ
ＮＦ、ヘパリン、およびそれらの複合体が平衡であったので、可溶性レセプター
の添加によるフリーのＴＮＦの減少が、結果として、平衡を取り戻すためにＴＮ
Ｆ／ポリサッカライド複合体の解離となり、フリーのＴＮＦは細胞レセプターの
可溶性レセプターに結合し、それらを活性化する等しい機会を得た。そのレセプ
ターへ結合するＴＮＦのヘパリン／Clexane（登録商標）の干渉に対するさらな
る支持を、図４および５のカラム９を比較するときに得ることができた。

【００５８】（６）図４Ａおよび５Ａならびに４Ｂおよび５Ｂで示したように、ｐ５５ｓ
ＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒの、ヘパリン／Clexane（登録商標）い
ずれかとの３０分間の前インキュベーションと細胞への適用直前でのＴＮＦの添
加によって、結果として３つの内容物を細胞に同時に加えたとき（カラム５）
または、それら一緒での３０分間の前インキュベーションの後（カラム８）に得
られたものと同一のＴＮＦの阻害が示された。このことから、ポリサッカライド
はＴＮＦ−レセプターのＴＮＦへの結合を干渉はせず、「裸の」ＴＮＦレセプタ
ーに何の親和性もないと結論づけることができる。しかしながら、ヘパリン／Cl
exane（登録商標）はＴＮＦ／ＴＮＦ−レセプター複合体に対して強い親和性が
あり、強く架橋する。したがって、ヘパリン／Cleane（登録商標）は「裸の」可
溶体ＴＮＦレセプターには親和性がないので、図２に示した、ヘパリン／Clexan
e（登録商標）の「細胞効果」の洗浄が容易であることは、ヘパリン／Clexane（
登録商標）は同様にレセプターと関連する「裸の」細胞に対して親和性がないと
いう結論と矛盾する。

【００５９】（７）そのｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒとの前インキュベーションと細胞への適用直
前のヘパリン／Clexane（登録商標）の添加の後のＴＮＦの阻害は、図４Ａおよ
び４Ｂ、カラム７と１１とを比較することで明らかなように、ｐ５５ｓＴＮＦ
−ＲのみとのＴＮＦ前インキュベーションの後で得られた阻害よりも大きかった
（図４Ａおよび４Ｂ、カラム１１）。このことは、ヘパリン／Clexane（登録商
標）がさらにｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒによる、好ましくはそれらの架橋によるＴＮ
Ｆの阻害を促進することを示唆する。ヘパリン／Clexane（登録商標）添加に続
いて、ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒによる阻害（１５％）に比べて、ｐ７５ｓＴＮＦ
−ＲによるＴＮＦ阻害は大きい（２０〜２５％）ことに注意すべきである。これ
は図４Ａおよび４Ｂ、カラム７および１１と図５Ａおよび５Ｂ、カラム７および
１１を比較することで明らかにできる。ヘパリン／Clexane（登録商標）はＴＮ
Ｆのそのｐ５５ａＴＮＦ−Ｒｒとｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒへの結合を可能にする
。ポリサッカライドの存在下におけるｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒによるより大きいＴ
ＮＦの阻害は、ヘパリン／Clexane（登録商標）がそれとＴＮＦを架橋する時の
ｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒによる「リガンド通過（ligand passing）」の防止に関連
する可能性がある。

【００６０】ヘパリン／Clexane（登録商標）は、ＴＮＦのその可溶性レセプターへの結合
を可能にし、したがって、そのＴＮＦ阻害効果を増加させている。しかしながら
、図４および５でカラム２と３とを比較して明らかなように、細胞関連レセプタ
ーへの同様に促進された結合が結果として促進されたＴＮＦ細胞傷害性を導くと
予想するであろう。実際、それでも、ＴＮＦの細胞障害性は阻害された。

【００６１】この明らかな矛盾に対する１つの理論的な説明は、ヘパリン／Clexane（登録
商標）が生物学的活性ＴＮＦ三量体のただ１つかまたは２つのＴＮＦレセプター
への架橋を促進し、したがって、それと第３のレセプターとの結合を干渉するの
であるというものである。そのような可溶体ＴＮＦレセプターの結合の促進はＴ
ＮＦ生物学的活性を中和する。シグナル伝達が３つの細胞表面レセプターの凝集
において最も誘導されることから、明らかに、ＴＮＦのただ１つまたは２つの細
胞表面レセプターへの結合を可能にすること、一方、三量体への最後のレセプタ
ーの凝集を干渉することは、前記矛盾を説明する。ヘパリン／Clexane（登録商
標）による１つの細胞表面レセプターのＴＮＦへの架橋に引き続き、ポリサッカ
ライドは、さらなる細胞表面ＴＮＦ−レセプター三量体化を防ぐ可能性のある方
法で干渉するようになる可能性がある。一方、もしＴＮＦがすでにレセプター三
量体を誘導した場合、ヘパリンはこの複合体へ架橋できず、またはその機能を干
渉できない。このことは、このポリサッカライドによるＴＮＦ阻害の鍵である可
能性がある。

【００６２】前記説明の支持で、実験で矛盾した効果があることに注意した。低量の可溶性
レセプターが使用され、最小値（１０％以下のＴＮＦ阻害）によって特性化した
実験において、ヘパリン／Clexane（登録商標）の可能な効果は最大であった（
６０％以上の阻害）。レセプターが５０％の阻害を発揮した実験において、ヘパ
リン／Clexane（登録商標）は最低限の可能効果を有した。

【００６３】非常に少量の可溶性レセプターで、ほとんどのＴＮＦ三量体がたった１つの可
溶性レセプターとの複合体を産出できたことがあきらかである。これらの複合体
はおそらくヘパリン／Clexane（登録商標）架橋の標的であり、結果、顕著なＴ
ＮＦ阻害となる。可溶性レセプターの量がより多い場合、２つまたはそれ以上の
可溶性レセプターがＴＮＦに結合する可能性があり、ポリサッカライドによるそ
のような複合体へのそれらの効果的な架橋を防いでいる。これらの複合体は、Ｔ
ＮＦと単量体可溶性レセプターの複合体であるものと同量まで、ヘパリン／Clex
ane（登録商標）によって安定化されないことを明示することが残っている。

【００６４】ヘパリン／Clexane（登録商標）架橋がＴＮＦの、１つ、ほとんどが２つのレ
セプターとの複合体に制限されている可能性があることを強く支持する証拠は、
図４および５のカラム５から１１までの比較から得られる。もし平衡が、１つ、
２つまたは３つのレセプターとのＴＮＦ複合体の形を有するＴＮＦ＋ｐ５５ｓ
ＴＮＦ−Ｒ間に達し、およびそこでヘパリン／Clexane（登録商標）が加えられ
た場合（カラム１１）、ＴＮＦ細胞傷害性は、細胞全体へのＴＮＦ、そのレセプ
ターおよびヘパリンの同時の添加（カラム５）と比較して増加した。可能な説明
は、後者の状況で、ＴＮＦは始め１つの単レセプターに結合できたということで
ある。この複合体はすぐにヘパリン／Clexane（登録商標）によって架橋され、
ＴＮＦを第２または第３のレセプターの結合から守るであろう。

【００６５】さらに支持する結果が、ヘパリン／Clexane（登録商標）をＴＮＦ適用の後に
加えた場合、ヘパリン／Clexane（登録商標）がＴＮＦの生物学的活性を阻害で
きるか決定するための実験によって明らかにされた。ヘパリン／Clexane（登録
商標）をＴＮＦ適用後の異なる時点で適用した場合、その阻害活性は１５分後は
まだ明らかであり、１時間後わずかに残っていた。驚くことに、２つの実験で、
ヘパリン／Clexane（登録商標）の阻害活性は０時で約７〜１５％であり、ＴＮ
Ｆ後５〜１５分後に適用した場合２５％まで増加し、１時間の時には１０％まで
減少していた（図６）。

【００６６】ヘパリン／Clexane（登録商標）をＴＮＦ後５〜１５分後に加えた場合のこの
矛盾した増加の１つの説明は、ヘパリン／Clexane（登録商標）が強くたった１
つの単量体−レセプターを三量体ＴＮＦへ結合させたということである。この結
合は、シグナル伝達がその後に続くと知られているさらなるレセプターの三量体
化を干渉する。

【００６７】ＴＮＦのそのレセプターへの結合を、開始時、ＴＮＦが１つのレセプターに結
合する、第２のレセプターに結合したとき、そして第３のレセプターまでのさら
なる時間の工程として視覚化できる。ヘパリン／Clexane（登録商標）がその適
用の１時間後にまだＴＮＦを阻害きる事実は、これがこの後の段階でいくつかの
最後のレセプターの三量体化を干渉する可能性があることを示唆する。ＴＮＦ分
子はこのより遅い段階で、１つのレセプターまたは２つと連結する可能性があり
、ヘパリン／Clexane（登録商標）はさもなければシグナル伝達を誘導するだろ
う第３の結合を干渉する。

【００６８】このメカニズムは、ＴＮＦ添加の後１５分にヘパリン／Clexane（登録商標）
を添加したことが同時に適用したときよりもＴＮＦの阻害が大きくなったという
矛盾を説明する。０時に、ヘパリン／Clexane（登録商標）はＴＮＦの一部分に
結合し、前記のようにわずかにその細胞レセプターへの結合を干渉する可能性が
ある。もしＴＮＦを低濃度で、ヘパリン／Clexane（登録商標）の数分前に添加
した場合、ＴＮＦは影響を受けていないそのレセプターに結合する機会を得、ヘ
パリンの適用はここで架橋し、任意にＴＮＦはレセプター単量体へ結合する。

【００６９】したがって、ヘパリンおよび／または低分子量ヘパリンで患者を処置すること
で、ＴＮＦの生物学的活性を阻害することができると考えることができる。ヘパ
リンまたはその派生物は、ヘパリンまたはその派生物と組み合わせてｐ５５ｓ
ＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒを投与することにより強力とされること
ができる。ヘパリンおよび可溶性レセプターは同時にまたは約１５〜３０分の間
隔をあけて投与することができる。あるいは、ヘパリンまたは派生物が投与され
、約１５〜６０分後にｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒが投与
される。

【００７０】ヘパリン自身を投与できる一方、ヘパリンの分手または制御された解重合によ
って産出した低分子量ヘパリンは、ヘパリンと比較した時、異なる薬物動態学的
特性と同様に、改善されたアンチトロンビン能力を有する。低分子量ヘパリンの
半減期は２倍である。しかしながら、Bratt et al(1985)がその生物学的利用能
が、その皮下注射後の抗凝集効果に関してより高いことを発見したにもかかわら
ず、図４、および５から、ヘパリンおよびClexane（登録商標）がｐ５５ｓＴ
ＮＦ−Ｒ、ｐ７５ｓＴＮＦ−ＲおよびＴＮＦとほとんど同様に相互作用するこ
とに注意すべきである。したがって、任意の低分子量ヘパリンを本発明の目的の
ためにヘパリンの代わりに使用できる。

【００７１】前述のようにClexane（登録商標）を含む本発明でのこのましく使用できる低
分子量ヘパリンは、ブタ腸粘膜からのナトリウムヘパリンの制御された亜硝酸解
重合にて産出され、４０００〜６０００ダルトンの範囲内の平均分子量を有する
低分子量ヘパリンである、Fragmin（登録商標）と同様に、Kabi Pharmacia社、S
wedenより製造される。それぞれ分手または制御した亜硝酸解重合、またはSanof
i社（Choay Laboratories）によって製造されたブタ腸粘膜からのカルシウムヘ
パリンによって産出された、およそ４５００ダルトンの平均分子量を有する低分
子量ヘパリンであるFraxiparin（登録商標）およびFraxiparine（登録商標）も
有用である。

【００７２】本発明の目的のために、ヘパリンそれ自身が使用でき、製造工程、構造の違い
（解重合化または原料物質として使用したヘパリンのバリエーションに依存する
違いによって作られる）、あるい抗凝集活性には関わらず、それだけまたは低分
子量ヘパリンとの組み合わせのいずれかで使用できる。または、低分子量ヘパリ
ンはそれだけで使用できる。

【００７３】本発明によるＴＮＦ活性の阻害によって処置できる疾患はすべてＴＮＦの存在
に関連し、ＴＮＦの生物学的活性の阻害に応答する疾病である。これらの疾病の
間では、アテローム性動脈硬化症、および血管炎症、および以下の、リウマチ関
節炎やＩ型糖尿病などの自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、ブドウ膜炎お
よび腸炎症などの急性および慢性炎症疾病、拒食症、敗血症による出血性ショッ
ク、およびＡＩＤＳ感染個体の日和見感染に関連する病理学的工程である。

【００７４】ヘパリンまたは低分子量ヘパリン、またはそれらの混合物は、たとえば水溶液
、このましくは塩化ナトリウム、安定剤、および他の適切な不活性成分を含んで
いるものとして医薬組成物に組み込まれる。投与の好ましい方法は、注射、皮下
または静脈注射によってであり、しかし他の適切な投与方法も本発明に含まれる
。

【００７５】可溶性ＴＮＦレセプターである、ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒおよびｐ７５ｓＴＮ
Ｆ−Ｒも、それのみでまたはヘパリンおよびその派生物との組み合わせで、医薬
組成物に組み込まれる。投与したヘパリンとその派生物の量は投与の様式に依存
する。もし徐放製剤で投与する場合、投与量は筋肉内または静脈内での投与の場
合よりもかなり低い。

【００７６】本発明による投与のための医薬組成物は、薬理学的に許容し得る担体と任意に
結合した薬理学的に許容し得る形状で、少なくとも１つのヘパリンまたはその派
生物と、少なくとも１つの可溶性ＴＮＦレセプターとを別々にまたは一緒に含む
。これらの組成物はその意図する目的をなし遂げる任意の方法で投与できる。本
発明による組成物の投与の量および投与計画はＴＮＦの過度の生物学的活性に関
連している疾病を治療している当業者によってすぐに決定されうる。

【００７７】たとえば、投与は皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮または舌下経路などの
非経口的に行なうことができる。代わりに、または同時に、投与は経口経路によ
ってよい。投与量は患者の年齢、健康、および体重、以前または現在の治療の形
式、もしあるならば治療の頻度、および好ましい効果の性質に依存する。

【００７８】本発明内の組成物は、その意図する目的を成し遂げるのに効果的である量での
、少なくとも１つの可溶性ＴＮＦレセプターとの組み合わせで投与される、少な
くとも１つのヘパリンまたは派生物を含んでいるすべての組成物を含む。個々の
必要性はさまざまである一方、それぞれの組成物の効果的な量の最適な範囲の決
定は本技術分野内で行なう。典型的な投与量は、約０．１から約１００ｍｇ／ｋ
ｇ体重である。

【００７９】以下の限定はしていない実施例が本発明を説明する助けとなるであろう。

【００８０】実施例１ヘパリンによるＴＮＦ活性の阻害ＷＩＳＨ細胞を１００μｌ培地中、３０，０００細胞／ウェルの濃度で播いた
。１６時間後、培地（コントロール）、ヘパリン、ＴＮＦまたはＴＮＦとヘパリ
ンの組み合わせのいずれかを加えた。それぞれのウェルへのそれぞれの最終濃度
は以下のようであった。ＴＮＦ０．５ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン１ユニット／ｍｌ
。様々な添加の後、シクロヘキサミドを各ウェル（５０μｌ）に最終濃度１ウェ
ルにつき２５μｇ／ｍｌで加えた。１６時間後、細胞上清を捨て、ニュートラル
レッド色素を１時間加えた。１時間のインキュベーションの後、色素をSorensen
's溶液を用いて抽出し、結果をＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。結果は直接細胞殺
傷の割合と一致する。結果を図１Ａに示す。ＴＮＦの添加が約２５％のＴＮＦの
生物学的活性を阻害したことがわかる（細胞障害性の４９％から３７％への減少
）。

【００８１】実施例２ Clexane（登録商標）によるＴＮＦ活性の阻害実施例１と同様の手順を、ヘパリンの代用としてClexane（登録商標）を用い
ることを除いて繰り返した。結果を図１Ｂに示す。実質的に同様の阻害効果が得
られたことがわかる。

【００８２】実施例３ＴＮＦ細胞傷害性におけるヘパリンでの前処理の効果実施例１と同様の手順を、ＷＩＳＨ細胞をＴＮＦを添加する前０〜３０分間、
ヘパリンで処理することを除いて繰り返した。結果を図２に示す。スケジュール
の間中、実質的に同様の抑制効果が得られたことがわかる。

【００８３】実施例４洗浄によるヘパロン除去の効果ＷＩＳＨ細胞を１００μｌ培地中、３０，０００細胞／ウェルの濃度で播いた
。細胞を播いてから１６時間後、ヘパリンまたはClexane（登録商標）のいずれ
かをそれぞれのウェルに加え、一方培地のみをコントロールウェルに加えた。ヘ
パリンまたはClexane（登録商標）は最終濃度１ユニット／ｍｌで加えた。６時
間後ウェルの部分をヘパリンもしくはClexane（登録商標）のいずれかで、また
は培地のみで前処理し、新鮮な培地で３回洗浄し、ＴＮＦを最終濃度０．５ｎｇ
／ｍｌで加えた。結果をヘパリンに対して図３Ａに、Clexane（登録商標）に対
して図３Ｂに示す。ヘパリン／Clexane（登録商標）前処理が予想（６０％から
４０％）のように３３％までＴＮＦ細胞障害性を減少させたことがわかる（図３
Ａと３Ｂとのカラム２から４を比較する）。しかしながら、培地のみで処理した
細胞の簡単な洗浄も結果としてＴＮＦへの細胞感受性を２５％減少させた。その
上清をＴＮＦ添加前に洗浄したヘパリンまたはClexane（登録商標）で前処理し
た細胞はＴＮＦによって同一の殺傷を示した（図３Ａと３Ｂとのカラム３から５
を比較する）。したがって、ヘパリンまたはClexane（登録商標）の上清からの
除去はそれらのＴＮＦ細胞障害性に対する保護効果を即時に取り除く。

【００８４】上清の除去、細胞の洗浄および新しい培地の添加は細胞のＴＮＦへの抵抗性を
２０％まで増加させた。取り除いた上清はＴＮＦ細胞障害性を促進する因子を含
んでおり、その除去がＴＮＦの効果を減少させたのであろう。他の可能性として
は、上清の除去の後、すでにわかっているように（Aderka，印刷中）、ＴＮＦに
対するいくつかの一過性の脱感作が誘導される可能性がある細胞表面ＴＮＦレセ
プターの素早い減少がある。

【００８５】実施例５ＴＮＦレセプターにおけるヘパリン／Clexane（登録商標）の効果ＷＩＳＨ細胞を１００μｌ培地中、３０，０００細胞／ウェルの濃度で播いた
。１６時間後、培地のみ（コントロール）、またはｓＴＮＦ−Ｒ（ｐ５５ｓＴ
ＮＦ−Ｒ（図４Ａ、４Ｂ）もしくはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒ（図５Ａ、図５Ｂ）の
いずれか）のいずれか、およびヘパリン（図４Ａ、５Ａ）もしくはClexane（登
録商標）（図４Ｂ、図５Ｂ）のいずれかを加えた。それぞれのウェルのそれぞれ
の最終濃度は以下のようであった。ＴＮＦ０．５ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン１ユニ
ット／ｍｌ、Clexane（登録商標）１ユニット／ｍｌ、ＴＢＰ−Ｉ（ｐ５５Ｔ
ＮＦ−レセプター）５ｎｇ／ｍｌ、ＴＢＰ−II（ｐ７５ＴＮＦ−レセプター
）１０ｎｇ／ｍｌ。

【００８６】異なった成分の組み合わせをエッペンドルフ（Eppendorf）チューブ内で最終
容量が３００μｌに達するように混合した。ついで５０μｌをそれぞれのウェル
に加えた。インキュベーションが必要な場合、エッペンドルフチューブ内で、混
合物としてあるいは別々に３７℃で３０分間行なった。

【００８７】異なる組み合わせを添加した後、シクロヘキサミドをそれぞれのウェル（５０
μｌ）に最終濃度２５μｇ／ｍｌで加えた。１６時間後、細胞上清を取り除き、
ニュートラルレッド色素を１時間加えた。１時間のインキュベーションの後、色
素をSorensen's溶液を用いて抽出し、結果をＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。

【００８８】結果を図４Ａ、４Ｂ、５Ａおよび５Ｂに示す。これらの図のそれぞれにおいて
、グラフの最初の棒はエッペンドルフチューブ内に３００μｌの培地のみ含めた
コントロールを表す。それぞれの第２の棒は、エッペンドルフチューブ内に濃度
２ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ２．１μｌと２０μｌの培地を含めたものの結果である。

【００８９】図の棒３は、ヘパリンまたはClexane（登録商標）どちらかの１．８ユニット
（１０μｌ）と１０μｌの培地とを、濃度２．１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ２８０μｌ
の添加と一緒にエッペンドルフチューブに加えたものの結果である。ここで混合
物はすぐにＷＩＳＨ細胞ウェルに加えた。

【００９０】第４の棒に関しては、６ｎｇのｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒ（１０μｌ）を１０μｌ
の培地と同量の前述のＴＮＦへ、ＷＩＳＨ細胞ウェルに添加する直前に加えた。
図５Ａおよび５Ｂでは、ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒに換えて、２倍量（１２ｎｇ／１
０μｌ）のｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒを使用した。

【００９１】棒５に関しては、６ｎｇのｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒまたは１２ｎｇのｐ７５ｓ
ＴＮＦ−Ｒ（１０μｌ）、１．２ユニットのヘパリンまたはClexane（登録商標
）（１０μｌ）、および２．１ｎｇ／ｍｌの２８０μｌＴＮＦをエッペンドルフ
チューブに加えた。ついで混合物をすぐにＷＩＳＨ細胞ウェルに加えた。

【００９２】棒６は、ＴＮＦとヘパリンまたはClexane（登録商標）のいずれかとをエッペ
ンドルフに同時に加え、ＷＩＳＨ細胞ウェルに加える前３０分間一緒にインキュ
ベートしたことを除いて、前記棒３について記述したのと同様な物質を含む。同
様に棒７は、ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５ｓＴＮＦ−ＲのいずれかをＴＮ
Ｆと混合し、ＷＩＳＨ細胞ウェルに加える前に３７℃で３０分間一緒にインキュ
ベートすることを除いて、前記棒４について記述したのと同様である。棒８の実
験は、ＴＮＦ、ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒもしくはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒのいずれか
、およびヘパリンもしくはClexane（登録商標）のいずれかを一緒に混合し、Ｗ
ＩＳＨ細胞に加える前に３０分間インキュベートしたことを除いて、前記棒５に
ついて記述したのと同様である。

【００９３】棒９については、ＴＮＦとヘパリンまたはClexane（登録商標）とを、別々に
前インキュベートしたｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒのいず
れかの添加とそこでのすぐのＷＩＳＨ細胞ウェルへの添加の前に３０分間一緒に
前インキュベートした。棒１０については、ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒもしくはｐ７
５ｓＴＮＦ−Ｒのいずれかと、ヘパリンもしくはClexane（登録商標）のいずれ
かとを、前インキュベートＴＮＦの添加とそこでのすぐのＷＩＳＨ細胞への添加
の前に、一緒に３０分間前インキュベートした。棒１１については、ＴＮＦとｐ
５５ｓＴＮＦ−Ｒもしくはｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒのいずれかとを、前インキュ
ベートしたヘパリンまたはClexane（登録商標）のいずれかの添加およびそこで
のすぐのＷＩＳＨ細胞への添加の前に３０分間一緒にインキュベートした。

【００９４】図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂの様々な棒を比較することでわかるように、ＴＮＦ
のヘパリン／Clexane（登録商標）との３０分間の前インキュベーションおよび
そのＷＩＳＨ細胞への適用は、前インキュベーションなしのそれらの適用と比較
してそのＴＮＦ阻害効果をさらに強力にする（それぞれの３と６の棒を比較する
）。さらに、ｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒまたはｐ７５ｓＴＮＦ−ＲのみではＴＮＦ
生物学的活性の約８〜１５％を阻害できる一方、ヘパリンまたはClexane（登録
商標）いずれかの、ＴＮＦおよびいずれかのレセプターへの添加は３から４倍レ
セプターによる阻害を強力にした（６０％阻害）（それぞれの図の棒２、４、５
を比較する）。

【００９５】ヘパリンおよび／またはその派生物および可溶性ＴＮＦレセプターの同時のま
たは連続的な添加のためのキットが従来の様式で製造されている。一般的に、こ
のようなキットはたとえば、薬学的に許容し得る担体、シリンジ内のそれぞれの
活性成分のアンプル、同時または連続的な添加についての記述説明書を含んでい
るだろう。たとえば、同時添加が好ましい場合、アンプルの内容物は適切な容器
またはシリンジそれ自身どちらかに注入する前に混合してよい。

【００９６】特定の実施態様の先立つ解説は、他者が、最近の知識を適用することにより、
過度の実験なしに、本発明の一般的な意図を逸脱することなしに、特定の実施態
様のような様々な適用に対して容易に改良しおよび／または適合することができ
る本発明の一般的な特徴を完全に明らかにするだろう。したがって、このような
適合および改良は、本発明の開示された実施態様と同等な目的および範囲内であ
ることを意味する。

【００９７】本明細書の言葉づかいまたは用語は、説明の目的のためのものであり、限定の
目的ではないと理解されるものである。様々な開示された機能を実行するための
手段、材料および工程は、本発明から逸脱することなく、様々な択一的形式をと
ることが可能である。したがって、前記本願明細書および／または本願請求項に
みられ得るような表現「する手段（means to ...）」および「ための手段（mean
s for ...）」、または機能的状態にしたがう任意の方法工程（method step）用
語は、構造的、物理的、化学的または電気的な要素もしくは構造のどれでも、ま
たは列挙された機能を実行する、現在またはこれから存在する方法工程であれば
なんでも、明示し含む。実施態様または前記明細書に開示された実施態様に正確
に同等であってもなくても、つまり同様の機能を実行するためのほかの手段また
は工程を用いることができる。そして、このような表現がそれらの広い解釈を与
えられることを意図する。

【００９８】［参考文献］ Abraham et al, JAMA 273:934-941 (1995) Aderka et al, J. Exp. Med. 175:323-329 (1992) Aderka, J. Clin. Invest. (in press) Aggarwal et al, Eur. Cytokine Netw. 7:93-124 Ashkenazi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10535-10539 (1991) Bigda et al, J. Clin. Invest. 88:2026-2031 (1991) Bone et al, Thrombosis Research 46:845(1987) Braegger et al, Lancet 329:89-91 (1992) Bratt et al, Thrombosis and Haemostasis 52:208 (1985) Breese et al, Gastroenterology 106:1455-1466 (1994) Cope et al, Arthritis and Rheumatism 35:1160-1169 (1992) Cunnion, R.E., Ann. Intern. Med. 113:227-242 (1990) De Groote et al, Eur. Cytokine Netw. 4:359-362 (1993) De Meules et al, J. Trauma 32:686-692 (1992) Eliaz et al, Eur. Cytokine Netw. 7:291 (abstract) (1966) Elliot et al, Lancet 344:1105-1110 (1994) Engelmann et al, J. Biol. Chem. 264:119974-11980 (1989) Englemann et al, J. Biol. Chem. 265:1531-1536 (1990) Evans et al, J. Exp. Med. 180:2173-2179 (1994) Fisher et al, New Engl. J. Med. 334:1697-1702 (1996) Girardin et al, Immunol. 76:20-23 (1994) Kaul et al, Eur. Cytokine Netw. 7:283 (abstract) (1996) Lantz et al, J. Clin. Invest. 88:2026-2031 (1991) Leighton et al, Eur. Cytokine Netw. 7:282 (abstract) (1996) Lesslauer et al, Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991) Levine et al, New Engl. J. Med. 323:236-241 (1990) Lider et al, J. Clin. Invest. 83:752-757 (1989) Lider et al, Eur. J. Immunol. 20:493 (1990) Loetscher et al, Cancer Cells 3:221-226 (1991) MacDonald et al, Clin. Exp. Immunol. 81:301-305 (1990) Mohler et al, J. Immunol. 151:1548-1561 (1993) Naparstek et al, Nature 310:231-243 (1984) Nophar et al, The EMBO J. 9:3269-3278 (1990) Olsson et al, Eur. J. Haematol. 42:270-275 (1989) Peppel et al, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991) Peterson et al, Eur. J. Immunol. 19:1887-1891 (1989) Roux-Lombard et al, Arthr. Rheumat. 36:485-489 (1993) Seckinger et al, J. Biol. Chem., 264:11966-11973 (1989) Suffredini et al, Ann. Int. Med. 120:771-783 (1994) Tartaglia et al, Immunol. Today 13:151-153 (1992) Tracey et al, Science 234:470-474 (1986) van Dullemen et al, Gastroenterol. 109:129-135 (1995)

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａおよび図１Ｂはヘパリン（図１Ａ）およびClexane（登録商標）（図１
Ｂ）によるＴＮＦの阻害を示すグラフである。

【図２】図２は、細胞が、ヘパリンが添加された後のＴＮＦ添加の前にヘパリンにさら
された時間の関数として、ＴＮＦの細胞傷害性に及ぼすヘパリンによる細胞の前
処理の効果を示す図である。

【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ＴＮＦの細胞傷害性効果に及ぼす上清除去の影響を示
す図である。

【図４Ａ】図４Ａはヘパリンとｐ５５ｓＴＮＦ−ＲおよびＴＮＦとの相互作用を示す図で
ある。

【図４Ｂ】図４ＢはClexane（登録商標）とｐ５５ｓＴＮＦ−ＲおよびＴＮＦとの相互作
用を示す図である。

【図５Ａ】図５Ａはヘパリンとｐ７５ｓＴＮＦ−ＲおよびＴＮＦとの相互作用を示す図で
ある。

【図５Ｂ】図５ＢはClexane（登録商標）とｐ７５ｓＴＮＦ−ＲおよびＴＮＦとの相互作
用を示す図である。

【図６Ａ】図６ＡはＴＮＦ適用後、異なる時点で添加されたヘパリンの効果を示す図であ
る。

【図６Ｂ】図６ＢはＴＮＦ適用後、異なる時点で添加されたClexane（登録商標）の効果
を示す図である。

【図７】図７はＴＮＦ、可溶性ＴＮＦ−レセプター、およびヘパリンもしくは低分子量
ヘパリンとの間の相互作用の模式図である。

【図８】図８はＴＮＦおよびその可溶性レセプターとの間の平衡を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 19/02 19/02 25/00 １０１ 25/00 １０１ 29/00 29/00 １０１１０１ 31/04 31/04 31/12 31/12 31/18 31/18 37/02 37/02 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０８Ｂ 37/10 Ｃ０８Ｂ 37/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者エシュド（イングレンダー）、タルマイスラエル国、53316 ギバタイム、レチョフゲバ６Ｆターム(参考） 4C084 AA02 BA44 DA53 NA05 ZA02 ZA36 ZA45 ZA66 ZA96 ZB07 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB33 ZB35 ZC35 ZC55 4C086 AA01 AA02 EA27 MA01 MA02 MA04 NA05 NA14 ZA02 ZA36 ZA45 ZA66 ZA96 ZB07 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB33 ZB35 ZC35 ZC55 4C090 AA09 BA68 DA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＴＮＦの生物学的活性を阻害する医薬組成物の製造における
へパリンおよび／またはその派生物の用途。
【請求項２】少なくとも１つの可溶性ＴＮＦレセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ）
がへパリンおよび／またはその派生物と共に使用される、請求項１記載の用途。
【請求項３】可溶性ＴＮＦレセプター（ｓＴＮＦ−Ｒ）がｐ５５ｓＴＮＦ
−Ｒおよびｐ７５ｓＴＮＦ−Ｒからなる群から選択される、請求項２記載の用途
。
【請求項４】へパリン派生物が低分子量ヘパリンである、請求項１記載の
用途。
【請求項５】ヘパリン派生物が２５００から６５００ダルトンの間の分子
量を有する、請求項４記載の用途。
【請求項６】ヘパリンまたはその派生物がｓＴＮＦ−Ｒと同時に投与され
る、請求項２記載の用途。
【請求項７】ヘパリンまたはその派生物が、ｓＴＮＦ−Ｒが投与されてか
ら１時間後に投与される、請求項２記載の用途。
【請求項８】ヘパリンもしくはその派生物、またはヘパリンおよびその派
生物の混合物の有効量からなる、ＴＮＦの生物学的活性を阻害する組成物。
【請求項９】また、少なくとも１つのｓＴＮＦ−Ｒからなる請求項８記載
の組成物。
【請求項１０】さらに、薬学的に許容し得る担体からなる請求項８または
９記載の組成物。
【請求項１１】可溶性ＴＮＦレセプターがｐ５５ｓＴＮＦ−Ｒおよびｐ７
５ｓＴＮＦ−Ｒからなる群から選択される請求項９記載の組成物。
【請求項１２】へパリン派生物が低分子量ヘパリンである請求項８、９、
１０または１１記載の組成物。
【請求項１３】ヘパリン派生物が２５００から６５００ダルトンの間の分
子量を有する、請求項１２記載の組成物
【請求項１４】活性成分と共に薬学的に許容し得る担体からなる、請求項
８、９、１０、１１、１２または１３記載の組成物の同時または連続投与キット
および使用説明書。
【請求項１５】ヘパリンおよび／またはその派生物およびｓＴＮＦ−Ｒか
らなる組成物。
【請求項１６】患者でのＴＮＦ活性阻害のための方法であって、該患者を
請求項８、９、１０、１１、１２または１３記載の医薬組成物で処置することか
らなる方法。