PT710121E - Metodo para o tratamento da esclerose multipla - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA O TRATAMENTO DA ESCLEROSEMÚLTIPLA"

Fundamento A esclerose múltipla (EM) é, uma doença desmielinizante auto-imune do sistema nervoso central, que surge usualmente sob a forma de ataques recorrentes de disfunção neurológica focal ou multifocal. Os ataques ocorrem, diminuem e recorrem, aparentemente ao acaso ao longo de muitos anos. A remissão é ffequentemente incompleta e à medida que um ataque sucede outro, segue-se uma progressão em escada decrescente com um défice permanente crescente. A doença clínica está associada a uma disfunção da barreira hematoencefálica; infiltração de células mononucleares no sistema nervoso central, principalmente macrófagos e linfócitos T, e produtos do soro; e desmielinização (Harris J.O., et al., Ann. Neurol. 29:548 (1991); Kermonde A.G., et al., Brain 113:1477 (1990)).

Presentemente, a natureza dos auto-antigenes responsáveis pela esclerose múltipla não é conhecida, nem o é a acção que provoca a resposta auto-imune. Uma teoria popular envolve a semelhança de uma proteína virai com um antigene próprio, o que resulta em células T ou células B auto-reactivas que reconhecem o próprio antigene. Enquanto que os linfócitos-B produzem anticorpos, as células derivadas do timo ou as "células-T" estão associadas a funções imunes mediadas por células. As células-T reconhecem os antigenes presentes na superfície das células e desempenham a sua função em conjunto com células " exibidoras de antigene".

Selmaj et al. em Annals of Neurology, 30(5), 1991, 694-700 descreve o efeito de um anticorpo anti-FNT sobre uma encefalomielite auto-imunc experimental (EAE) em ratos. Ele conclui que os anticorpos anti-FNT podem inibir o desenvolvimento de EAE.

Ruddle et al. em J. Exp. Med., 172(4), 1990, 1193-1200 descreve o efeito de um anticorpo sobre a linfotoxina (factor de necrose tumoral β) e o factor de necrose tumoral

a na prevenção de EAE em ratos. Ele conclui que o anticorpo previne a transferê dos sintomas de EAE, consequentemente prevenindo o inicio da doença. A EP-A-0 512 528 descreve proteínas que ligam FNT, as quais estão relacionadas com formas solúveis de receptores de FNT do tipo I e tipo II. Propõe que as proteínas que ligam FNT sejam utilizadas para o tratamento de doenças auto-imunes e de reacções enxerto-veríMs-hospedeiro.

Actualmente, não existe nenhum tratamento prático e eficaz para a esclerose múltipla. Assim, o desenvolvimento de um método, para o tratamento de esclerose múltipla teria imensos benefícios. A DE-A-42 02 665 refere o uso de anticorpos monoclonais dirigidos para FNT, no tratamento de esclerose múltipla, mas prefere derivados de prostaciclina e carbaiclina para este propósito.

Resumo da invenção A presente invenção diz respeito à utilização de um anticorpo anti-factor de necrose tumoral, para a produção de um medicamento para o tratamento de esclerose múltipla , humana, após õ inicio das manifestações clínicas. A invenção baseia-se na descoberta de que o factor de necrose tumoral (FNT) tem um papel na patogénese da esclerose múltipla e da encefalomielite alérgica experimental (EAE). O medicamento que é administrado contém uma quantidade eficaz a nível terapêutico de um anticorpo anti-factor de necrose tumoral (anti-FNT), que melhora os efeitos da esclerose múltipla. Uma quantidade eficaz a nível terapêutico pode ser administrada na forma de uma única dose ou na forma de uma série de doses separadas por um intervalo de dias, semanas ou meses. O anticorpo anti-FNT pode ser administrado cm combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. A administração do referido anticorpo ou do receptor solúvel ocorre directamente no sistema nervoso central de um ser humano. A injecção directamente no sistema nervoso central pode ocorrer por injecção directa no fluido cerebrospinal lombar (intratecalmente). Numa outra forma de realização, a / administração do referido anticorpo é intravenosa. f O benefício da presente invenção consiste em fornecer um tratamento eficaz para a esclerose múltipla.

Breve descrição das figuras A figura 1 representa um histograma e um gráfico ilustrando a cinética de variações de peso e sinais clínicos durante a fase aguda de encefalomielite alérgica experimental de recaída crónica'(EAERC), induzida em ratos Biozzi AB/H. A figura 2 representa um histograma ilustrando a permeabilidade da barreira hematoencefálica às células e proteínas durante a fase aguda de EAERC. A figura 3 constitui um par de fotografias que representa a imunodetecção de FNTa em lesões da medula espinhal durante EAERC. A figura 4 consiste num conjunto de fotografias que representa a detecção de imunofluorescência de FNTa em linfócitos CD4+ T, astrócitos e macrófagos em lesões da medula espinhal durante EAERC. A figura 5 é um gráfico que ilustra o efeito na EAE de uma única injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT. A figura 6 constitui um par de gráficos ilustrando a inibição do desenvolvimento da doença clínica a seguir a uma injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT. A figura 7 é um par de gráficos que mostra que o anti-FNT, ao contrário de anti-CD4, não é imunossupressivo e não reduz a resposta proliferativa ao sensibilizador de contacto oxazolono. A figura 8 é um gráfico que ilustra a inibição dependente da dose da progressão de EAE clínica, a seguir a uma injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT directamente no sistema nervoso central. A figura 9 é um gráfico que ilustra a inibição do desenvolvimento da doença clínica após a injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT directamente no sistema nervoso central. A figura 10 constitui um conjunto de três histogramas ilustrando os graus clínicos individuais de 5 animais diferentes (em cada grupo), após a injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT directamente no sistema nervoso central e intraperitonealmente. A figura 11 é um gráfico que ilustra uma maior inibição de EAE por injecção intracerebral de anticorpo monoclonal específico para FNT ou de um receptor-FNT p55 humano, do que por injecção intraperitoneal. A figura 12 é um gráfico que ilustra a inibição da EAE por injecção sistémica de um receptor-FNT p55 humano.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção diz respeito a um tratamento para a esclerose múltipla através da administração de um anticorpo anti-FNT. A esclerose múltipla é uma doença auto-imune do sistema nervoso central. A doença está associada a uma disfunção da barreira hematoencefálica, infiltração de células mononucleraes (principalmente macrófagos e linfócitos T, e produtos do soro) no sistema nervoso central e desmielinização (Harris, J.O., et al, Ann. Neurol. 29:548 (1991); Kermonde, A.G., et al, Brain 113:1477 (1990)). Embora os linfócitos CD4+ T estejam envolvidos na indução da doença (Mokhtarian, F., et al, Nature 309:356-358 (1984); Waldor, M.K., et al., Science 227:415 (1985)), o mecanismo efector que medeia a patogénese de EM é desconhecido. O factor de necrose tumoral (FNT) tem estado implicado como uma importante molécula efectora na patogénese de várias doenças humanas e modelos animais, tais corno sépsis gram-negativa c artrite reumática (Tracey, K.J., et al, Nature 330:662 (1987); Brennan, F.M., et al, Lancet 2:244 (1989); Williams, R.O., et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 89:9784 (1992)). < : 5 · Ο FNTa é uma proteína segregada primeiramente por monócitos e macrófagos em resposta à endotoxina ou outros estímulos, tal como homotrímeros solúveis de subunidades proteicas de 17 kD (Smith, R.A., et al., J. Biol. Chem. 262:6951-6954 (1987)). Foi igualmente descrita uma forma precursora de 26 kD do FNT ligada à membrana (Kriegler, M., et ai, Cell 53:45-53 (1998)). A expressão do gene que codifica o FNTa não é restringida às células da família dos monócitos/macrófagos : FNT também é produzido por linfócitos T do sangue periférico CD4+ e CD8+ e por várias linhas de células T e B em cultura (Cuturi, M.C., et ai, J. Exp. Med. 165:1581 (1987); Sung, S.-S.J., et ai, J. Exp. Med. 168:1539 (1998); Tumer, M., et ai, Eur. J, Immunol. 17:1807-1814 (1987))/' O termo anticorpo engloba anticorpos policlonais e monoclonais. O termo anticorpo pretende também englobar misturas de mais do que um anticorpo reactivo com FNT (por exemplo, um cocktail de diferentes tipos de anticorpos monoclonais reactivos com FNT). O termo anticorpo pretende ainda incluir anticorpos completos, seus fragmentos biologicamente funcionais e anticorpos quiméricos contendo porções de mais do que uma espécie, anticorpos bifúncionais, etc. Fragmentos de anticorpo biologicamente funcionais, que podem ser utilizados, são aqueles que são suficientes para a ligação do fragmento de anticorpo ao FNT.

Os anticorpos quiméricos podem compreender porções derivadas de duas espécies diferentes (por exemplo, região constante humana e região variável ou de ligação de murino). As porções derivadas de duas espécies diferentes podem ser ligadas quimicamente por meio de técnicas convencionais ou podem ser preparadas como proteínas contíguas individuais usando técnicas da engenharia genética. O DNA que codifica as proteínas de ambas as porções, a cadeia leve e a cadeia pesada, do anticorpo quimérico pode ser expresso como proteínas contíguas.

Anticorpos monoclonais reactivos com o FNT podem ser produzidos utilizando técnicas de hibridação de células somáticas (Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)) ou outras técnicas. Num procedimento de hibridação típico, uma proteína em bruto ou purificada ou um péptido contendo pelo menos uma porção de FNT pode ser usado como imunogénio. Um animal é vacinado com o imunogénio para obter células do baço produtoras de anticorpos anli-FNT. A espécie do animal imunizado variará dc acordo 6 ' \ '· ’ com a espécie de anticorpo monoclonal desejada. A célula produtora do anticorpo é fundida com uma célula imortalizante (por exemplo, célula de mieloma), para originar um hibridoma capaz de segregar anticorpos anti-FNT. As células produtoras de anticorpos residuais não utilizadas e as células imortalizantes são eliminadas. Os hibridomas produtores dos anticorpos desejados são seleccionados usando técnicas convencionais e os hibridomas seleccionados são clonados e colocados em cultura.

Anticorpos policlonais podem ser preparados por imunização de um animal com uma proteína em bruto ou purificada ou um péptido contendo pelo menos uma porção de FNT. O animal é mantido sob condições em que são produzidos anticorpos.reactivos com FNT. O sangue é colhido do animal após ter sido alcançado o título de anticorpos desejado. O soro contendo os anticorpos policlonais (anti-soro) é separado dos outros componentes do sangue. O soro contendo os anticorpos policlonais pode ainda ser, opcionalmente, separado em fracções de tipos particulares de anticorpos (por exemplo, IgG, IgM).

Hibridomas de murino que produzem anticorpos monoclonais específicos para o FNT são produzidos por fusão de células de mieloma de rato e células de baço de ratos imunizados contra células T FNT positivas, FNT purificado ou outras preparações biológicas contendo FNT. Para imunizar os ratos pode ser seguida uma variedade de protocolos diferentes. Por exemplo, os ratos podem receber imunizações primárias e reforçadoras de FNT. As fusões são realizadas por meio de procedimentos padrão, bem conhecidos daqueles especializados na área da imunologia. Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975) e Kennet, Monoclonal Antibodies (Kennet, et al., Eds pp. 365, Plenum Press, N.I., 1980).

Os clones co-transfectados resultantes são subsequentemente sujeitos a uma triagem para a produção de anticorpos reactivos com o FNT ou preparações biológicas contendo FNT. Aqueles que segregam anticorpos com uma reactividade e especificidade apropriadas são clonados para originar linhas celulares homogéneas secretoras de anticorpo anti-FNT.

Hibridomas humanos que produzem anticorpos anti-FNT monoclonais são preparados a partir da fusão de células B de um indivíduo produtor de anticorpos anti-FNT e uma linha celular humana linfoblastóide B. Altemativamente, o par de fusão para a célula de mieloma pode ser um linfócito do sangue periférico produtor de anti-FNT. A fusão e as técnicas de triagem são essencialmente as mesmas que as usadas para a produção e selecção de hibridomas de murino geradores de anti-FNT.

Também hibridomas de rato e humanos, que produzem anticorpo anti-FNT humano podem ser preparados por fusão de uma célula produtora de anticorpo humano e uma célula de plasmacitoma de murino ou uma célula que por si só é um híbrido possuindo as propriedades adequadas, tais como a capacidade de se fundir com linfócitos humanos a uma elevada frequência; permitam a síntese ê secreção de níveis elevados de anticorpo; permitam a secreção de anticorpo por períodos de tempo prolongados em cultura.

Outra maneira de preparar a linha celular produtora de anti-FNT é através da transformação das células produtoras de anticorpo. Por exemplo, um linfócito B produtor de anti-FNT pode ser infectado e transformado com um vírus, tal como o vírus de Epstein-Barr no caso dos linfócitos B, para originar uma célula produtora de anti-FNT imortal. Vide, por exemplo, Kozbor e Roder, Immunology Today, 4(3):72 (1983). Em alternativa, o linfócito B pode ser transformado por um gene transformante ou um produto de gene transformante.

Os anticorpos monoclonais específicos para FNT são produzidos em grandes quantidades por meio da injecção de hibridomas produtores de anticorpo anti-FNT na cavidade peritoneal de ratos ou outros animais hospedeiros apropriados e, após um tempo adequado, por recolha do fluido de ascites resultante, o qual contém um elevado título de anticorpo e por isolamento do anticorpo anti-FNT monoclonal a partir daí. Hibridomas alogénicos ou xenogénicos devem ser injectados em ratos carecas imunossuprimidos, irradiados ou atímicos. Alternativamente, os anticorpos podem ser produzidos por meio da cultura in vitro de células produtoras de anti-FNT e isolamento dos anticorpos anti-FNT monoclonais segregados pelo meio de cultura celular.

Anticorpos anti-FNT quiméricos são produzidos por meio da clonagem de segmentos de DNA que codificam as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de um anticorpo não humano específico para FNT e da conjugação destes segmentos de DNA a segmentos de DNA que codificam as regiões constantes de cadeia pesada e leve humanas, para produção de genes que codificam imunoglobolinas quiméricas. As construções de genes fundidos, que codificam as cadeias leves e pesadas, são reunidas em ou inseridas em vectores de expressão. Os genes são co-transfectados para uma célula linfóide receptora (por exemplo, uma célula de mieloma), onde a proteína imunoglobulina pode ser sintetizada, construída e segregada. As células receptoras transfectadas são colocadas em cultura e as imonuglobolinas expressas recolhida.

Uma descrição mais detalhada dos anticorpos anti-FNT e a sua utilização no tratamento de doenças está‘contida'nas seguintes referências; Rubin, et al, Publicação de patente EPO 0218868, Abril 22, 1987; Yone, et al., Publicação EPO 0288088, Outubro 26, 1988, Liang, C. -M, et al, Biochem., Biophys. Res. Comm. 137:847 (1986); Meager, A., et al., Hybridoma 6:305 (1987); Fendly, et al., Hybridoma 6:359 (1987); Bringman, T. S., et al., Hybridoma 6:489 (1987); Hirai, M., et al., J. Immunol. Meth. 96:57 (1987); Moller, A., et al, Cytokine 2:162 (1990); Mathison, J. C., et al, J. Clin. Invest. 81:1925 (1988); Beutler, B., et al., Science 229:869 (1985), Tracey, K. J., et al, Nature 330:662 (1987); Shimamoto, Y., et al., Immunol. Lett. 17:311 (1988); Silva, A. T., et al, L Infect. Pis. 162:421 (1990); Opal, S. M., et al., J. Infect. Pis, 161:1148 (1990); Hinshaw, L. B., et al., Circ. Shock 30:279 (1990).

Anticorpos particularmente preferidos são os anticorpos específicos para FNT com uma elevada afinidade de ligação, isto é, com uma constante de associação K de pelo menos 10® litros por mole. A constante de associação K pode ser determinada por diálise de equilíbrio como descrito por Kuby, J., Immunology, W. H. Freeman & Co., Nova Iorque, 1992, pp. 122-124.

Uma descrição mais detalhada da afinidade do anticorpo e da constante de associação K está contida nas seguintes referências: Kuby, J., Immunology, W. H. Freeman & Co, Nova Iorque, 1992, pp 122-124; Hood, L. E., et al., Immunology, segunda edição, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, CA, 1984, pp. 58-60; Abbas, A. K., et al., Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., Filadélfia, 1991, pp. 53-54. 9

Os anticorpos anti-FNT são úteis se, após a administração ao hospedeiro numa quantidade eficaz, eles melhoram os sintomas clínicos ou as causas da esclerose múltipla. Os sintomas ou causas são melhorados se forem significativamente reduzidos ou eliminados.

Os anticorpos anti-FNT utilizados no âmbito da invenção são administrados directamente ao sistema nervoso central. A existência da barreira hematoencefálica restringe a livre passagem de muitos tipos de moléculas do sangue para as células do sistema nervoso central (por exemplo, agentes potencialmente úteis e terapêuticos, tais como anticorpos anti-FNT e receptores FNT solúveis).. Durante a fase activa das doenças inflamatórias, tais como EM e EAE, verifica-se a ocorrência de uma fúga de sangue para o cérebro que permitirá a entrada de anticorpo anti-FNT para o sistema nervoso central.

Contudo, existem várias técnicas que penetram fisicamente a barreira hematoencefálica ou levam-na a libertar agentes terapêuticos. Exemplos destas técnicas incluem injecções intratecais, implantes cirúrgicos e técnicas osmóticas. Além disso, a permeabilidade da barreira hematoencefálica aos anticorpos anti-FNT, receptores FNT solúveis e compostos anti-FNT, pode ser aumentada por administração de um agonista da o permeabilidade hematoencefálica de bradiquinina (por exemplo, N-acetil [Phe (CH2-NH)Arg9]bradiquinina). Uma descrição mais detalhada destas técnicas que tanto penetram fisicamente a barreira hematoencefálica como a enganam encontra-se contida em Malffoy-Camine, Patente dos Estados Unidos No. 5 112 596,12 de Maio, 1992.

Uma forma preferida de concretização da administração de anticorpos é por injecção intratecal, isto é, directamente no fluido cerebrospinal, através da punctura das membranas que circundam 0 sistema nervoso central. A punctura das membranas que circundam os sistema nervoso central ocorre usualmente por punctura lombar. Dosagens sustidas do agente directamente no fluido cerebrospinal podem ser conseguidas através da utilização de bombas de infusão que são implantadas cirurgicamente. A administração de anticorpos anti-FNT pode ocorrer por injecção directa no fluido cerebrospinal lombar (intratecalmente), como descrito anteriormente. Noutra forma de 10 realização, a administração pode ocorrer por injecção intravenosa. Outros métodos e modos de administração podem igualmente ser empregues. A forma farmaceuticamente aceitável na qual o anticorpo anti.FNT é administrado dependerá, pelo menos parcialmente, da via pela qual é administrado. Por exemplo, no caso da administração por injecção, o anticorpo anti-FNT pode ser formulado em composições farmacêuticas com veículos farmaceuticamente aceitáveis convencionais, de forma usual para essa via de administração. Tais veículos são inerentemente não-tóxicos e não-terapêuticos.

Uma quantidade de anticorpo anti-FNT eficaz a nível terapêutico corresponde à quantidade necessária para reduzir significativamente ou eliminar os sintomas associados à esclerose múltipla. Uma quantidade de anticorpo anti-FNT eficaz para ratos situa-se no intervalo de 150 pg - 1 mg/injecção. Por conseguinte, uma quantidade razoável de anticorpo anti-FNT, eficaz a nível terapêutico e preferida para humanos situa-se no intervalo de 0,1 - 50 mg/kg/dose. A quantidade eficaz a nível terapêutico será determinada com base indivudual e será baseada, pelo menos em parte, tendo em consideração o tamanho do indivíduo, a severidade dos sintomas a tratar, o resultado pretendido, etc. Assim, a quantidade eficaz em termos terapêuticos pode ser • - determinada por qualquer especialista nesta área que empregue tais. factores e que não utilize mais do que a experimentação de rotina. A quantidade eficaz em termos terapêuticos pode ser administrada na forma de uma única dose, ou de uma série de doses separadas por intervalos de dias, semanas ou meses. Uma vez administrada a quantidade eficaz em termos terapêuticos, uma quantidade de manutenção de anticorpo anti-FNT pode ser administrada. Uma quantidade de manutenção corresponde a uma quantidade de anticorpo anti-FNT necessária para manter a redução ou a eliminação de sintomas alcançada pela dose eficaz em termos terapêuticos. A quantidade de manutenção pode ser administrada na forma de uma única dose ou de uma serie de doses separadas por intervalos de dias, semanas ou meses. Tal como a quantidade eficaz em termos terapêuticos, a quantidade de manutenção será determinada numa base individual. 11

Outras drogas anti-inflamatórias ou anti-imunes, tais como metotrexato ou ciclosporina A, ou anticorpos, tais como anticorpos anti-CD4, podem ser administradas em conjunto com o anticorpo anti-FNT. O objectivo da presente invenção está definido pelas reivindicações anexas, mas o que se encontra aqui descrito é trabalho que ilustra o efeito do anticorpo anti-FNT e da proteína de fusão solúvel R-FNT IgG na EAE, os resultados que indicam que o bloqueio da actividade biológica do FNT ou outros efeitos do FNT, ou o bloqueio da transdução de sinal do receptor do FNT é útil para o tratamento da EM.

Os ensaios descritos na presente utilizam a EAE como um modelo experimental da doença desmielinizante humana, esclerose múltipla. A EAE de recaída crónica é uma doença desmielinizante auto-imune do sistema nervoso central usada como um modelo experimental da EM.

Este modelo em rato de EAE induzida apresenta similaridades com a EM humana, no que respeita aos seus sinais clínicos. Em ambas, EAE e EM, a doença clínica está associada a uma disfunção da barreira hematoencefálica (BHE), infiltração de células mononucleares (principalmente macrófagos e linfócitos T e produtos séricos) no sistema nervoso central e desmielinização (Baker, D., et al., J. Neuroimmunol. 28:261 (1990); Butter, C., et al., J, Neurol. Sei. 104:9 (1991); Harris J. O., et ai, Ann. Neurol. 29:548 (1991); Kermonde A. G., et al., Brain 113:1477 (1990)). Assim, o modelo do rato serve como uma boa aproximação à doença humana.

Para facilitar a determinação da importância do FNT na patogénese de doenças neuroimunológicas, tais como a EAE e EM, um anticorpo monoclonal específico para FNT (TN3.19.12) foi administrado como descrito nos exemplos 5, 6 e 7, durante a EAE activamente induzida (exemplo 1), pouco antes (1-2 dias) da perda de peso pré-clínica, quando a disfunção da BHE e a infiltração no sistema nervoso central se tomou aparente (exemplo 2) (Butler, C., et al., J. Neurol. Sei. 104:9 (1991)), c durante a doença clinicamente activa, quando os sinais neurológicos se manifestaram (exemplo 1), e um, receptor humano do FNT solúvel (R-FNT p55 humano) foi administrado como descrito nos exemplos 8 e 9, durante a EAE activamente induzida, pouco depois do surgimento dos sinais clínicos. Como descrito nos exemplos 5, 6, 7, 8 e 9, verificou-se que a 12 imunoterapia FNT inibe a progressão da EAE de recaída crónica e, por conseguinte, tem implicações nas estratégias terapêuticas da doença de esclerose múltipla humana.

Como descrito no exemplo 2, os episódios da doença de EAE de recaída crónica estão associados a uma disfunção da BHE (figura 2) e a uma acentuada infiltração celular no sistema nervoso central (Baker, D., et ai, J. Neuroimmunol. 28:261(1990); Butter, C., et ai, J. Neurol- Sei. 104:9 (1991)). Como descrito nos exemplos 1, 2 e 3, estes parâmetros que são modulados pelo anticorpo anti-FNT (tabela 2), correlacionam-se com uma perda de peso progressiva, a qual ocorre pouco antes da detecção do déficit neurológico clínico (figura 1). A capacidade do FNT em aumentar a doença clínica (Kuroda, Y., et ai, J. Neuroimmunol. 34:159-164 (1991)) e induzir a produção de outras citoquinas proinflamatórias (Beutler, B., et al., Science 229:869 (1985); Brennan, F. M., et ai, Lancet 2:244 (1989)), e a inibição da EAE após a neutralização do FNT, como descrito na presente, revela um papel proinflamatório importante do FNT na patogénese da EAE. Como descrito nos exemplos 5, 6 e 7, a EAE clínica desenvolvida após a cessão da terapia de anticorpo, indica que a imunoterapia de FNT não exerce um efeito através de uma imunossupressão generalizada.

Como descrito no exemplo 4, em contraste com a acção imunossupressiva do anticorpo monoclonal específico para CD4 na EAE e a proliferação de células T, a inibição da actividade do FNT exibiu efeitos mínimos nas respostas proliferativas de T (figura 7), indicando que a imunoterapia dirigida para o FNT atinge a função celular efectora em vez da indução da doença, o que está de acordo com a incapacidade do tratamento in vitro de células encefalitogénicas para inibir a transferência adoptiva da doença (Selmaj, K. et ai, Ann, Neurol. 30:694 (1991)). Consequentemente, o momento relativo da administração do anticorpo é importante para que seja observado um efeito inibitório. Por exemplo, em contraste com o efeito inibitório de múltiplas doses, observado quando o tratamento cra administrado durante o desenvolvimento antecipado da doença (tabela 1), o tratamento semelhante (3 x 250 pg de TN3.19.12 injectados intraperitonealmente) terminado antes do desenvolvimento da doença clínica antecipada falhou na prevenção do desenvolvimento da EAE clínica (8 dos 8 afectados com uma pontuação de grupo média de 3,3 ± 0,5).

Como descrito nos exemplos 5, 6 e 7, apesar da administração sistémica de anticorpos FNT neutralizantes inibisse a EAE (figuras 6, 9 e 10), foi observada uma melhoria significativamente aumentada quando o FNT era administrado directamente no sistema nervoso central (figuras 9 e 10), indicando que a maioria da actividade do FNT é gerada no sistema nervoso central. Os anticorpos possuem um potencial limitado para atravessar a barreira hematoencefálica intacta (Hafler, D. A., et al., Ann. Neurol. 21:89 (1987)). No entanto, caso o anticorpo monoclonal específico para FNT seja administrado sistemicamente a doentes com esclerose múltipla, ocorrerá um maior direccionamento do anticorpo para o sistema nervoso central quando está presente uma disfunção da barreira hematoencefálica, o que ffequentemente acontece em EM clinicamente silenciosa (Harris, J. O., et al., Ann. Neurol. 29:548 (1991); Kermonde, A. G., et al., Brain 113:1477 (1990)), assim como durante episódios clínicos.

Os exemplos descritos na presente demonstram o importante papel do FNT na doença desmielinizante EAE, um modelo experimental da EM, por conseguinte, indicando que o FNT é um alvo adequado para a intervenção imune e indicando um método para o tratamento de esclerose múltipla. Além disso, o trabalho aqui descrito apresenta as vantagens da administração de anticorpos FNT ou receptores de FNT solúveis directamente no sistema nervoso central.

Adicionalmente, ao contrário de estudos prévios usando anti-FNT em EAE, em que o efeito sobre a EAE era limitado apenas se o anticorpo fosse dado antes do inicio das manifestações clínicas, isto é, profilacticamente (Selmaj, K., et al., Ann. Neurol. 30:694 (1991); Ruddle, N., J. Exp. Med. 172:1193 (1990)), o trabalho descrito na presente demonstra a terapia após o inicio das manifestações clínicas, uma situação que é relevante para o tratamento da esclerose múltipla em seres humanos. A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, os quais em caso algum devem ser limitativos.

Exemplo 1: Indução de encefalomielite alérgica experimental

Ratos Biozzi AB/H (H-2dql) inatos foram injectados com 1 mg de homogenato de medula espinhal (ME) emulsionado com adjuvante de Freund incompleto, suplementado com 60 pg de micobactéria {Mycobacteria tuberculosis H37Ra e M.

butyricum numa proporção de 8 para 1) nos dias 0 e 7 como descrito anteriormente (Baker, D., et al., J. Neuroimmunol. 28:261 (1990)). A partir do dia 11 (Dl 1) pós-inoculação (p.i.), os ratos foram pesados e examinados para detecção de sinais clínicos (figura I). Estes sinais foram classificados como se segue: 0 = normal, 1 = traseira totalmente coxeante, 2 = reflexo de endireitar desemparelhado, 3 = paralisia parcial dos membros traseiros e 4 = paralisia total dos membros traseiros. Os sinais neurológicos de menor severidade que os tipicamente observados foram pontuados 0,5 abaixo do grau indicado (Baker, D., et al., J. Neuroimmunol. 28:261 (1990)).

As fases clínicas da EAE aguda já foram anteriormente descritas (Allen, S. J., et al., Cell Immunol. 146:335 (1993)). Resumidamente, ocorreu inicialmente uma perda de peso (PP) de mais de 1,5 gramas/dia, geralmente nos dias 13-15 p.i. Esta foi seguida pelo aparecimento dos sinais (AS), manifestados por uma traseira flácida, nos dias 15-17 p.i. e nos dias 17-19 p.i. os animais experimentavam uma fase aguda de paralisia (AP), grau 3-4. Os animais paralisados (grau 3-4) exibiram, eventualmente, um ganho de peso (GP) e os sinais clínicos começaram a diminuir durante o período pós-agudo (PA), apresentando os animais, geralmente nos dias 21-23 p.i., um grau de doença de 2-1 (figura 1). Tipicamente, no dia 24 p.i. os animais entram num período de remissão clínica e histológica (Baker, D., et ai, J. Neuroimmunol. 28:261 (1990)), quando o sistema nervoso central está de novo relativamente impermeável à entrada de linfócitos e proteínas séricas (Butter, Cet al., J. Neurol. Sei. 104:9 (1991)). A figura 1 ilustra a cinética das variações de peso e sinais clínicos durante a fase aguda da encefalomielite alérgica experimental de recaída crónica (EAERC), induzida em ratos Biozzi AB/H. Os dados apresentados mostram que a doença clínica activa está correlacionada com progressivas variações de peso. Cada barra no histograma representa a percentagem média da perda de peso corporal relativamente ao apresentado 3 dias antes do inicio da doença clínica, e cada círculo no gráfico representa a pontuação clínica média relativamente ao dia do inicio da doença clínica no dia 0. Os dados representam a média ± SEM de 13 ratos individuais. Os tempos relativos das diferentes fases da doença encontram-se indicados. As abreviaturas correspondem às seguintes fases: PP = perda de peso; AS = aparecimento dos sinais; AP = paralisação aguda; GP = ganho de peso; e PA = pós-aguda. 15'

Exemplo 2: Função da barreira hematoencefálica

Em várias alturas, após a indução da EAE (exemplo 1), os ratos foram injectados intravenosamente com 2,5 x 107 de células de nodos linfáticos marcadas com 51 Cr e 5 pCi de l25I-albumina, como descrito anteriormente (Butter, C., et al, J. Neurol. Sei. 104:9 (1991)). Passadas dezoito horas os animais anestesiados foram sujeitos a uma perfusão com meio RPMI-1640 via o ventrículo esquerdo após a recolha de uma amostra de sangue de 20 μΐ. Os cérebros e medulas espinhais de 4 - 14 animais por grupo foram recolhidos e efectuadas as estimativas das concentrações de radioisótopo com um espectrómetro-γ. Os resultados são expressos como o número de células dadoras por grama de tecido alvo e equivalentes de sangue extravascular (ESEV), em que 100 ESEV correspondem à concentração de proteína plasmática I-albumina no sangue, na altura da recolha da amostra, como descrito anteriormente (Butter, C., et al, J. Neurol. Sei. 104:9 (1991)). A figura 2 ilustra a permeabilidade da barreira hematoencefálica durante a fase aguda da EAE de recaída crónica. As barras não preenchidas representam a permeabilidade da medula espinhal às células e as barras preenchidas com riscos representam a permeabilidade da medula espinhal às proteínas do plasma. Os resultados representam a média ± SEM de entre 4-14 animais por grupo.

Em animais normais (N) e até ao dia 11 pós-inoculação, após a indução da EAE, o sistema nervoso central era relativamente permeável às células de nodos linfáticos circulantes e a proteínas do plasma (figura 2). A extravasão das proteínas do plasma e a tráfico celular são factos, ambos correlacionados com o desenvolvimento da doença clínica. O colapso da BHE foi primeiramente detectável no cérebro (dados não apresentados), o qual não está relativamente envolvido durante a EAE em ratos AB/H (Baker, D., et al., J. Neuroimmunol. 28:261 (1990)); (Butter, C., et al., J. Neurol. Sei. 104:9 (1991), e na medula espinhal (figura 2), quando os animais sofrem um perda de peso. Λ permeabilidade da barreira hematoencefálica aumentou dramaticamente à medida que os sinais clínicos evoluíam e a perda de peso progrediu (um total de 25-35% do peso corporal comparado com o dia 12). Uma vez tomado aparente o aumento de peso em animais paralisados, a permeabilidade na BHE decresceu significativamente. Os sinais 16 clínicos diminuíram durante a fase pós-aguda e, como referido anteriormente (Butter, C., et al., J. Neurol. Sei. 104:9 (1991)), a integridade da BHE foi restituída em animais remissivos. Os resultados indicam que a disfunção da BHE está correlacionada com variações de peso progressivas.

Exemplo 3: Detecção da actividade do factor de necrose tumoral Fluidos tecidulares

Amostra de soro foram preparadas após a exsanguíneação +ara a cavidade torácica de animais terniiriáimente anestesiados, durante as várias fases da EAE. Amostras de fluido cerebrospinal (FCS) (1-3 μΐ/animal) foram recolhidas de foramen magnum para um tubo hematocrito. Após centifugação, para remoção das células, estas amostras foram armazenadas a -20°C antes do ensaio. A actividade de necrose tumoral foi ensaiada usando quer uma linha de células de fibroblastos de rato sensível ao FNT L929, como descrito anteriormente (Beutler B., Science 229-869 (1985)), quer diluições de soro de 1:2, e diluições de FCS de 1:50 foram ensaiadas utilizando o kit ELISA teste de factor FNTa de rato (Genzyme, UK), de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio de ELISA pôde detectar 50pg/ml - 3,2 ng/ml de FNTa.

Secções tecidulares

Secções criostáticas da medula espinhal cervical fixadas em acetona foram coradas por uma técnica indirecta de imunoperoxidase, no espaço de uma semana de preparação, essencialmente como descrito anteriormente (Baker, D., et al., J. Neuroimmunol. 28:261 (1990)), Resumidamente, a actividade de peroxidase endógena foi bloqueada. As secções foram incubadas com soro de rato 5% normal (SRN) durante 30 minutos, seguindo-se 1 hora de incubação com um anticorpo monoclonal primário reactivo com FNTa/β de rato, por exemplo com o anticorpo monoclonal TN3.19.12, um anticorpo monoclonal imunoglobulina G1 (IgGl) de hamster, que neutraliza o FNTa e ο ΡΝΤβ de rato (Sheehan, K. C. F., et al., J. Immunol. 142:3884 (1989)) (fornecido por Dr. R. Schreiber, Washington Universily Medicai Scliool, St Louis, USA cm conjunto com a Celltech, Slough, UK), ou com um anticorpo monoclonal primário reactivo com anti-FNTa de rato de ratazana, por exemplo com MP6-XT3 [HB10649] ou MX6-XT22 [HB10697], ambos anticorpos monoclonais IgGl de ratazana produzidos por culturas celulares dc hibridoma (obtido da ATCC, cortesia do Dr. J. Abrams, DNAX, USA). 17

Os anticorpos monoclonais primários foram detectados por incubações sequenciais de 30 minutos com anti-imunoglobulina de hamster de cabra biotinilado ou anti-imimoglobulina de ratazana de coelho, complexo de peroxidase avidina:biotina e anti-imunoglobulina de cabra de coelho conjugada com peroxidase ou anti-imunoglobulina de coelho de porco, repectivamente. O produto de reacção foi desenvolvido usando o cromogénio diaminobenzidina. As secções foram contra-coradas com hematoxilina. Em alguns casos, o anticorpo monoclonal primário foi diluído com excesso de FNTa de rato recombinante (200-500 μg/ml) antes de ser utilizado em imunocitoquímica. Este processo falhou no que respeita à inibição da coloração das secções com o anticorpo monoclonal específico para CD8.

Para a dupla-marcação, as secções foram incubadas com anti-FNTa de rato de ratazana, anti-imunoglobulina de ratazana de coelho, e com uma diluição de 1:100 (em tampão fosfato salino (PBS) contendo 5% de SRN) de anti-imunoglobulina de coelho de porco, a qual foi conjugada tanto com isotiocianato de tetra-rodamina (ITCTR) como com isotiocianato de fluoresceína (ITCF). O antigene relacionado com anti-factor VIII de coelho e a anti-proteína acídica fibrilhar glial de coelho (PAFG) foram conjugados com ITCF e extensamente dialisados. A coloração por imunofluorescência dupla foi depois realizada por incubação destas secções com diluições de 1:50-1:100 (em 5% de SRN) quer de: anti-factor VIII conjugado com ITCF, anti-PAFG, anticorpo monoclonal de . , rato específico para H-2A, ou de anticorpo monoclonal imunoglobulina de ratazana conjugado com ficoeritrina específico para B220 restringido com células B, antigenes CD4 ou CD8, durante 30 minutos. As secções foram observadas por microscopia de fluorescência.

Detecção de FNT

Os dados apresentados na figura 2 sugerem que a disfunção da barreira hematoencefálica está correlacionada com a perda de peso dos animais. Contudo, uma análise inicial do soro de animais com PP e AP, com a linha celular L929, não foi bem sucedida na demonstração da presença de FNT biologicamente activo. Alem disso, a análise de 5 amostras individuais de soro de animais PP, AS, AP e PA e amostras de FCS de 5 animais paralisados (AP) mostraram que o nível de FNT presente estava abaixo da sensibilidade do ensaio de ELISA FNTa utilizado, indicando que pelo menos nas amostras de soro existia menos dc 100 pg/ml de FNTa. No entanto, a figura 3 18 mostra que foi possível detectar o FNT no sistema nervoso central de animais com EAE de recaída crónica usando imunocitoquímica.

Embora alguns anticorpos monoclonais específicos para FNT (MX6-XT22 [HB10649] e TN3.19.12) não tenham tido sucesso na produção de uma coloração satisfatória através de uma gama de doses, sugerindo que a área de tecido que é reconhecida por estes anticorpos pode estar desnaturada, o anticorpo monoclonal específico para FNT MP6-XT3 (20 μΐ de 4-8 pg/ml) revelou a coloração (figura 3a) que estava bloqueada por co-incubação de anticorpo monoclonal com FNTa de rato recombinante (figura 3b). A imunocoloração demonstrou actividade de FNTa nas lesões presentes na medula espinhal cervical de animais paralisados (figura 3a) e sob algumas lesões de animais em fase pós-aguda, apesar da intensidade da coloração aparecer reduzida comparativamente à observada em animais paralisados (AP) FNTa estava presente em células mononucleares em lesões perivasculares e estava frequentemente concentrado no parenquima/orla da lesão, onde as células positivas aparecem como macrófagos/tipo glial. Embora alguma células positivas também pareçam possuir a morfologia de astrócitos, a resolução do tecido corado por imunoperoxidase não permitiu uma identificação precisa das células que expressam FNT.

As figuras 4a a 4h mostram a detecção por imunofluorescência de FNTa em linfócitos T CD4+, astrócitos e macrófagos em lesões da medula espinhal durante a EAE de recaída crónica. Esta distribuição é semelhante à observada em lesões de esclerose múltipla (Hoffman, F. M., et al., J. Exp. Med. 170:607 (1989); Selmaj, K., et al, J. Clin. Invest. 87:949 (1991)). O factor de necrose tumoral (FNTa) foi detectado que pelo anticorpo conjugado com ITCF (figura 4a) quer com ITCTR (figuras 4c, 4e e 4g) em lesões da medula espinhal de animais paralisados por EAE. As secções foram incubadas quer com o anticorpo monoclonal específico para CD4 conjugado com ficoeritrina (figura 4b) quer com o antigene relacionado com o factor VIII conjugado com ITCF (figura 4d), PAFG (figura 4f) ou anticorpos espacíficos para H-2A (figura 4h).

Durante a fase aguda da EAE de recaída crónica, as células B e os linfócitos T CD8+ constituem uma componente menor do infiltrado celular e as células B, geralmente, não mostram qualquer evidência de actividade de FNTa por coloração de imunofluorescência dupla. Ocasionalmente, alguns linfócitos T CD4+ das lesões perivasculares expressam FNTa (figuras 4a e 4b). As setas pequenas na figura 4b indicam que alguns dos linfócitos T CD4+ não expressam a actividade FNTa detectável dos linfócitos T CD4+ apresentada na figura 4a, e as setas grandes nas figuras 4a e 4b indicam uma actividade FNTa que por vezes está co-localizada com as células que expressam o antigene CD4.

Apesar de ter sido detectada actividade FNT numa grande proximidade dos vasos sanguíneos, a coloração tipicamente falhou na co-localização com células endoteliais coradas com o antigene relacionado com anti-factor VIII (figuras 4c e 4d). A seta nas figuras 4c e 4d indica o vaso sanguíneo na lesão perivascular em células que não co-expressam FNTa.

Enquanto que alguns astrócitos PAFG+ expressavam FNTa (figuras 4e e 4f), particularmente nas áreas adjacentes às lesões perivasculares, a maior parte da actividade FNTa detectável estava co-localizou-se com macrófagos/células da microglia que expressam antigenes de classe II de MHC (figuras 4g e 4h).

As setas grandes nas figuras 4e e 4f indicam astrócitos que expressam FNTa e as setas pequenas indicam astrócitos que expressam FNTa localizados em parte dos processos astrocíticos que rodeiam as lesões. Este perfil de coloração astrocítica de FNTa também pode ser observado nas figuras 4a, 4c e 4g. As setas nas figuras 4g e 4h indicam a expressão de FNTa durante a EAE em lesões do sistema nervoso central.

Exemplo 4: Ensaio proliferativo de oxazolono

Os animais foram pintados numa das orelhas com 25 μΐ de oxazolono 2,5% (OX, Sigma, Poole, UK) dissolvido em acctona:azcitc (AAZ) na proporção dc 4:1 no dia 0 (ONeill, J. K., et al., J. Neuroimmunol. 35:53 (1992)). No dia 2 os animais (3-4 por grupo) foram injectados intraperitonealmente (i.p.) com 0,1 ml de anticorpos monoclonais específicos para FNT ou CD4 diluídos em PBS (500 pg de TN3.19.12, um anticorpo monoclonal específico para FNT, ou aproximadamente 250 pg de YTS 177.9, um anticorpo monoclonal IgG2a de ratazana, que é um anticorpo específico para CD4 de rato não-deplector (Qin, S., et al., Eur. J. Immunol. 20:2737 (1990)) produzidos no fluido de ascites.

Três dias após a aplicação tópica de oxazolono, as drenagens dos nodos linfáticos auriculares de cada 3-4 animais por grupo foram retiradas e reunidas, e a resposta proliferativa induzida avaliada como anteriormente descrito (0'Neill, J. K., et al., T Neuroimmunol. 35:53 (1992)). Brevemente, 5xl05 células/poço foram colocadas em cultura durante a noite (na ausência de oxazolono exógeno), a 37°C, numa atmosfera humedecida de 5% de CO2 em ar, com 2 pCi de [metil-3H] timidina (actividade específica 2 Ci/mmol). As culturas foram colhidas e a incorporação de [3H] timidina foi determinada por meio de um contador de cintilação-β. A figura 7 mostra os resultados do efeito da imunoterapia FNT numa resposta proliferativa de células T induzida in vivo de duas experiências individuais. Os dados apresentados mostram que, em contraste com a acção imunossupressiva do anticorpo específico para CD4, o anticorpo anti-FNT não inibiu a função proliferativa das células T sob as condições testadas, indicando que estes compostos imunomoduladores operam via diferentes mecanismos. Os resultados representam a média ± SD de um mínimo de 5 poços replicados. : ^

Exemplo 5: Imunoterapia anti-FNT sistémica

Para elucidar 0 potencial papel de FNT num modelo de EAE de recaída crónica, os animais foram injectados com TN3.19.12, um anticorpo monoclonal anti-FNT. O anticorpo monoclonal TN3.19.12 (fornecido pelo Dr. R. Schreiber, Washington University Medicai School, St. Louis, USA) tem tuna semi-vida sérica de aproximadamente 7 dias (Sheehan K. C. F., et al., J. Immunol. 142:3884 (1989)) e verificou-se que uma única injecção de 300 pg do anticorpo monoclonal TN3.19.12 inibe o desenvolvimento da EAE de recaída induzida pela transferência de células (Ruddle N. H., et al., J. Exp. Mcd. 172:1193 (1990)). Contudo, uma única injecção intraperitoneal de 250 pg do anticorpo monoclonal TN3.19.12 no dia 12 pós-inoculação a seguir à sensibilização activa, não foi capaz de proteger os animais (7 de 8) do desenvolvimento da EAE em comparação com aqueles (8 de 8) injectados com L2 3D9, um anticorpo monoclonal IgGl de hamster não-neutralizador de controlo reactivo com 21 interleuquina-2 de rato (fornecido pelo Dr. R. Schreiber em conjunto com a Celltech, Slough, UK). No entanto, ocorreram manifestações clínicas reduzidas (figura 5). A figura 5 ilustra o efeito na EAE, especificamente sobre os sinais clínicos, de uma única injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT. A seta indica o dia pós-inoculação em que o rato foi injectado intraperitonealmente; os triângulos representam o resultado obtido com ratos que foram injectados intraperitonealmente com 250 pg de TN3.19.12, um anticorpo monoclonal específico para FNT; e os triângulos invertidos representam o resultado obtido com ratos que foram injectados intraperitonealmente com 250 pg de L2 ‘3D9, um anticorpo monoclonal controlo, que é reactivo com interleuquina-2 de rato. Os resultados representam a pontuação clínica média dos animais em cada grupo ± SEM, a vários tempos de pós-inoculação.

Apesar de os dados obtidos não permitirem alcançar um significado estatístico, os resultados indicam, todavia, que os ratos injectados com anticorpo monoclonal TN3.19.12, comparados com os ratos injectados com o anticorpo monoclonal L2 3D9, parecem exibir um inicio da perda de peso retardado (dia 16,1 ± 2,5 vs. 14,0 ± 0,9) e dos sinais clínicos (dia 17,0 ± 2,0 vs. 15,4 ± 1,2) e uma inferior severidade dos sinais clínicos máximos (2,1 ± 1,1 vs. 3,1 ± 0,9) e perda de peso corporal (25,5 ± 4,6% vs. 29,0 ±4,8%).

Além disso, embora os animais que desenvolveram a doença clínica após tratamento com anticorpo monoclonal TN3.19.12 tenham subsequentemente recaído, 6 de 7 animais sofreram recaída (dia do inicio 38,3 ± 7,5), os animais controlo recaíram de modo semelhante, 5 de 6 animais recaíram, no dia 39,6 ± 5,3, quando observados até ao dia 55 pós-inoculação.

Assim, o anticorpo monoclonal TN3.19.12 administrado imediatamente antes do inicio das manifestações clínicas pode inibir parcialmente o despoletar da EAE por 2-3 dias. Consequentemente, múltiplas doses de anticorpo (250 pg) foram dadas aos animais, intraperitonealmente com um intervalo de três dias (dias 14, 17 e 20), com inicio antes de e durante o desenvolvimento antecipado da doença clínica (por exemplo, perda de peso) (tabela 1). Em comparação com os controlos tratados com PBS e L2 3D9, múltiplas doses de anticorpo monoclonal específico para FNT, inibiram 22 significativamente o desenvolvimento da EAE, quando avaliada até 3 dias após a cessão do tratamento. Nos poucos casos em que os animais foram injectados quando a perda de peso foi primeiramente detectada, o tratamento com TN3.19.12 pareceu estabilizar a perda de peso. Contudo, como apresentado na tabela I, apesar de apenas 4 de 16 animais contraírem EAE clínica durante este período, num intervalo de 10 dias de tratamento com anticorpo monoclonal, a maior parte (13 de 16) dos animais desenvolveram subsequentemente sinais clínicos, embora isto represente um atraso significativo no aparecimento dos sinais clínicos. Embora não significativamente diferente dos animais injectados com PBS, o tratamento com L2 3D9 parece reduzir a •severidade dos sinais clínicos expressos (tabela 1).

Tabela 1

Múltiplas doses de mAb específico para FNT administradas sistemicamente inibem o desenvolvimento de EAE

Resultado até dia 23 p.i. Resultados até ao dia 30 p.i. TRATAMENT O N° EAE/Total Pontuação clinica No. EAE/Total Pontuação clinica Dia do despoletar PBS 13/15 2,6 ± 0,4 15/15 2,7 ± 0,4 17,7 ± 0, 7 Ig Hamster (L2 3D9) 11/16 1,7 ±0,44 14/16 1,8 ±0,4 18,4 ±1,4 Φ Anti-TNF TN3,19,12 4/16* 0,7 ±0,3** 13/16 1,1 ±0,3* 22,5 ± 0,7 ** *P<0,01, ** P<0,002 COMPARADO COM O GRUPO TRATADO COM PBS Φ PO,05 COMPARADO COM O GRUPO TRATADO COM TNF-i.p.

Exemplo 6: Imunoterapia anti-FNT sistémica após o despoletar da doença clínica Animais EAE ME-imunizados foram injectados com anticorpo monoclonal específico para FNT quando os sinais clínicos se manifestaram primeiramente (dia 0), isto é, quando os animais exibiam uma traseira flácida (grau 1). Os ratos foram injectados i.p. com 0,1 ml de PBS, ou 250 pg ou 1 mg de TN3.19.12, um anticorpo monoclonal específico para FNT diluído em PBS, ou 250 pg de L2 3D9, um anticorpo monoclonal de imonoglobulina de hamster diluído em PBS, nos dias 0, 1 e 2 após o aparecimento dos sinais clínicos (figura 6), ou uma única injecção de 250 pg i.p. de YTS 177.9, um anticorpo monoclonal específico para CD4 diluído cm PBS, no dia 0. A figura 6 mostra a inibição do desenvolvimento da doença clínica após a injecção de um anticorpo monoclonal específico para FNT. As setas indicam os dias nos quais os ratos foram injectados i.p.; os circulos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.p. com 0,1 ml de PBS; os triângulos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.p. com anticorpo monoclonal específico para FNT; os triângulos invertidos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.p. com 250 pg de anticorpo monoclonal L2 3D9; e os losangos representam os resultados obtidos com ratos injectados i.p. com 250 pg do anticorpo monoclonal YTS 177.9 no dia 0. A figura 6a mostra os resultados obtidos após a injecção i.p. de 250 pg de um anticorpo específico para FNT. A figura 6b mostra os resultados obtidos após a injecção i.p. de 1 mg de um anticorpo específico para FNT. Os resultados representam a pontuação clinica do grupo média ± SEM (n=5-7) após o aparecimento dos sinais.

Após a primeira injecção de anticorpo monoclonal TN3.19.12, os sinais clínicos progrediram (Figura 6). O tratamento com anticorpo foi, por isso, continuado diariamente durante mais dois dias. No intervalo de 2 dias, após o inicio da administração de 250 pg de anticorpo monoclonal TN3.19.12, os .sinais clínicos diminuíram e foram significativamente diferentes dos sinais clínicos observados em animais tratados com L2 3D9, cuja doença se tomou mais severa. Contudo, animais tratados com L2 3D9 pareceram recuperar a uma maior velocidade que os animais tratados com PBS, indicando que este anticorpo específico para IL-2 não-neutralizante pode exibir algum efeito biológico inibitório (figura 6a). O aumento da dose de anticorpo monoclonal TN3.19.12 administrada para 1 mg, não provocou o aumento do efeito inibitório observado com a administração de 250 pg de anticorpo monoclonal TN3.19.12 (figura 6b), embora reduzisse significativamente a severidade da doença clínica comparativamente aos animais tratados com PBS.

Por outro lado, o anticorpo monoclonal específico para CD4 não-deplector pôde rapidamente estabilizar e reverter a progressão clínica (figura 6b). Apesar dos mecanismos pelos quais actuem estes anticorpos ainda não estejam estabelecidos, a observação dc que a imunoterapia específica para FNT- não teve sucesso na inibição de uma resposta proliferativa induzida in vivo, enquanto o tratamento com anti-CD4 foi extremamente imunossupressivo (figura 7), indicou que estes mecanismos são diferentes.

Exemplo 7: Imunoterapia FNT dirigida para o sistema nervoso central Após o aparecimento dos sinais clínicos, isto é, quando os animais exibiam uma traseira flácida (dia 0), ratos EAE ME-imunizados foram injectados intra-cerebralmente (i.c.) no córtex do lóbulo frontal direito, como descrito anteriormente (0'Neill. J. K., et ai, L Neuroimmunol. 35:53 (1992)), com doses variáveis de anticorpo monoclonal TN3.19.12 (figura 8): 150 pg, 15 pg, 1,5 pg e 0 pg. Embora 1,5 pg de anticorpo monoclonal TN.3.19.12 não tenham conseguido alterar o curso clínico da doença, 150 pg de anticorpo monoclonal estabilizaram a doença clínica (figura 8).

Assim, a figura 8 mostra a inibição dependente da dose da progressão da EAE clínica após a injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT directamente no sistema nervoso central. As setas indicam o aparecimento dos sinais clínicos, quando os animais exibiam uma traseira flácida (dia 0); os círculos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados intratecalmente com 30 pl de PBS; os triângulos invertidos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados intracerebralmente com 150 pg de anticorpo monoclonal TN3.19.12; os triângulos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados intracerebralmente com 15 pg de anticorpo monoclonal TN3.19.12; e os losangos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados intracerebralmente com 1,5 pg de anticorpo monoclonal específico para FNT TN3.19.12. Os resultados representam a pontuação do grupo média ± SEM de 5 animais por grupo.

Em ensaios adicionais, após o aparecimento dos sinais clínicos, isto é, quando os animais exibiam uma traseira flácida (dia 0), ratos EAE ME-imunizados não foram tratados, ou foram injectados com 30 pl de PBS i.c. e 150 pg de anticorpo monoclonal TN3.19.12 i.p., ou injectados com 150 pg dc anticorpo monoclonal TN3.19.12 i.c e 30 pl de PBS i.p. (figura 9). A injecção intracerebral foi realizada no córtex do lóbulo frontal direito, como anteriormente descrito (ONeill, J. K., et al., J. Neuroimmunol. 35:53 (1992)). 25 A figura 9 ilustra a inibição do desenvolvimento de uma doença clínica mais marcada, após a injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT directamente no sistema nervoso central. As setas indicam o tratamento no inicio do aparecimento dos sinais clínicos, quando os animais exibiam uma traseira flácida (dia 0); os círculos representam os resultados obtidos com ratos que não foram tratados; os triângulos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados com 30 μΐ de PBS i.c. e 150 pg de anticorpo monoclonal específico para FNT i.p.; e os triângulos invertidos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados com 150 pg de anticorpo monoclonal específico para FNT i.c. e 30 pl de PBS i.p (figura 9). A pontuação clínica do grupo média de 5-7 animais pôr grupo, após o aparecimento dos sinais clínicos é apresentada. A injecção i.p. sistémica de animais clinicamente afectados com 150 pg de anticorpo monoclonal TN3.19.12, falhou novamente no inicio em prevenir rapidamente a progressão da doença (figura 9). Contudo, foi observado um benefício significativo (asterisco duplo = P<0,002; asterisco simples = P<0,05) quando a imunoterapia FNT (150 pg de anticorpo monoclonal) foi administrada directamente no sistema nervoso central (figura 9), comparativamente à administrada sistemicamente.

Em contraste com os controlo e com os animais tratados sistemicamente com anticorpo. n v monoclonal TN3.19.12, em que os sinais clínicos se tomaram sempre mais severos após o inicio da doença, o tratamento directo do sistema nervoso central, geralmente, estabiliza a doença clínica antes da remissão, embora em alguns casos os animais experimentassem um aumento transitório da severidade dos sinais a seguir a um período de estabilização (figura 10).

Noutro ensaio, após o aparecimento dos sinais clínicos, ratos EAE ME-imunizados foram tratados como se segue: não tratados; injectados intraperitonealmente com 250 pg de YTS.177.9, um anticorpo monoclonal específico para CD4; injectados intraperitonealmente com 150 pg de TN3.19.12, um anticorpo monoclonal específico para FNT, e intracerebralmente com 30 pl de PBS; ou injectados intraperitonealmente com 30 pl de PBS e intracerebralmente com 150 pg de anticorpo monoclonal TN3.19.12. Como apresentado na tabela 2, os resultados deste ensaio indicam que a injecçSo inUacerebral do anticorpo monoclonal TN3.19.12 inibiu significativamente a .26 progressão da perda de peso, comparativamente com os animais não tratados e ratos injectados intraperitonealmente com o anticorpo específico para FNT. Além disso, embora a maioria dos animais tratados i.c. com anti-FNT (5 de 6) terem subsequentemente recaído no dia 35,6 ± 5,3 e a maior parte dos animais de controlo (5 de 6) também tenham recaído no dia 38,4 ± 3,4, os resultados indicam que este tratamento modula a severidade da doença clínica. Deste modo, os dados indicam que, apesar de as células CD4+ poderem ser alvejadas na circulação periférica antes da extravasão para o sistema nervoso central, a patogénese FNT/actividade/secreção ocorre principalmente no sistema nervoso central, e que a imunoterapia específica para FNT administrada apropriadamente no sistema nervoso central pode inibir a progressão da doença neuroimunológica.

Tabela 2 A Administração Directa do Anticorpo Anti-Tnf no Snc Inibe a Perda de Peso Progressivo Durante Episódios de EAE Clinica

Tratamento i.p. nenhum anti-CD4 anti-TNF PBS Tratamento i.c. nenhum nenhum PBS anti-TNF Número analisado 20 10 12 13 Peso médio no inicio do tratamento (g) 18,1 ± 1,3 18,1 ± 1,6 18,5 ± 2,5 18,1 ±2,9 Variação de peso relativo médio 24 horas após o tratamento (g) -1,37 ± 0,11 +0,82 ± 0,20 -1,00±0,18** ‘ * · 5 f -0,08 ± 0,21*, t *P<0,002, comparado com o grupo não tratado. Φ P<0,002 i.p. grupo anti-TNF comparado com o grupo de tratamento anti-TNF-i.c.

Exemplo 8: Imunoterapia com receptor do factor de necrose tumural dirigida para o sistema nervoso central

Após o aparecimento dos sinais clínicos, que ocorre quando os animais exibem uma traseira flácida (dia 0), ratos EAE ME-imunizados foram injectados i.c. com 15 pg de SF2 p55 humano solúvel, um receptor de FNT, ou doses variáveis (0 pg, 15 pg ou 150 pg) de TN3.19.12, um anticorpo monoclonal específico para FNT (figura 11). A figura 11 mostra a inibição do desenvolvimento da doença clínica após a injecção de anticorpo monoclonal específico para FNT e após a injecção de um receptor FNT, o p55 humano solúvel. As setas indicam o tratamento no inicio do aparecimento dos sinais clínicos, quando os animais exibiam uma traseira flácida (dia 0); os círculos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.c. com 30 μΐ de PBS; os triângulos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.c. com 15 pg de anticorpo monoclonal específico para FNT; os triângulos invertidos rpresentam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.c. com 150 pg de anticorpo monoclonal específico para FNT; e os losangos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.c. com 15 pg de R-FNT p55 humano solúvel. Os resultados representam a pontuação clínica média ± SEM de 5-6 animais por grupo. Os resultados observados quando se injecta i.c. com 15 pg de R-FNT SF2 p55 humano solúvel são semelhantes aos observados quando se injecta i.c. com 150 pg de anticorpo monoclonal anti-FNT, indicando, neste caso, a maior potência de R-FNT SF2.

Exemplo 9: Imunoterapia sistémica com o receptor do factor de necrose tumoral Após o aparecimento dos sinais clínicos, isto é, quando os animais exibem uma traseira flácida (dia 0), ratos EAE ME-imunizados foram injectados i.p. com doses variáveis de R-FNTs p55 humano solúvel (figura 12): 150 pg, 15 pg e 0 pg. A figura 12 mostra a inibição dependente da dose da progressão da EAE clínica após a injecção de R-FNTs p55 humano solúvel. A seta indica o tratamento no despoletar dos sinais clínicos, quando os animais exibiam uma traseira flácida (dia 0); os círculos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.p. com 30 pl de PBS; os losangos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.p com 15 pg de R-FNT SF2; e os triângulos representam os resultados obtidos com ratos que foram injectados i.p. com 150 pg de R-FNT SF2. Os resultados representam a pontuação clínica média ± SEM de 5-6 animais por grupo. Os resultados mostram que o efeito sistémico do receptor de FNT p55 humano solúvel situa-se entre 15 - 150 pg/injecção e é, consequentemente, mais eficaz que o efeito sistémico do anticorpo monoclonal FNT, TN3.19.12.

Lisboa, t J JAN. 2UU1

Dra. Maria Silvina Porreira

Agente Oíici.; de Prc?ri%!ade Industrio! R. Castilho, 201-3.° E - 1070-051 LISBOA Telets. 213 851 339 - 213 854 613

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de ura anticorpo anti-factor de necrose tumoral para a produção de um medicamento para o tratamento da esclerose múltipla humana, após o aparecimento das manifestações clínicas, em que no referido tratamento uma quantidade de anticorpo anti-factor de necrose tumoral eficaz em termos terapêuticos é administrada directamente no sistema nervosos central de seres humanos, por exemplo, intratecalmente.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o anticorpo anti-factor de necrose tumoral ser (a) um anticorpo policlonal; ou (b) um anticorpo monoclonal; ou (c) um fragmento de anticorpo. Lisboa, 1 1 JAN. 2001

   Dra. Maria Silvina Ffcrreira Agente Ofio;! íj Industriol R. Castiilio, 20MI.CE- 1070-051 LISBOA Telefs. 213 851 339 - 213 854 613