CN113388044B - 一种蜗牛糖胺聚糖化合物、其药学上可接受的盐、制备方法及应用 - Google Patents

一种蜗牛糖胺聚糖化合物、其药学上可接受的盐、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蜗牛糖胺聚糖化合物、其药学上可接受的盐、制备方法及应用，所述蜗牛糖胺聚糖化合物包括原型蜗牛糖胺聚糖、解聚蜗牛聚糖胺聚糖及衍生物，具有式(I)所示结构，式(I)所含取代基同说明书定义。所述原型蜗牛糖胺聚糖、解聚蜗牛聚糖胺聚糖及衍生物及其药物组合物具有强效结合趋化因子活性，阻断过度炎症反应，促进包括糖尿病足在内的糖尿病皮肤伤口溃疡的愈合，可用于治疗如糖尿病足等皮肤溃疡药物的制备。

Description

一种蜗牛糖胺聚糖化合物、其药学上可接受的盐、制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种蜗牛糖胺聚糖化合物、其药学上可接受的盐、制备方法及应用。
背景技术
糖尿病足溃疡(Diabetic Foot Ulcers,DFU)，简称糖尿病足，是糖尿病患者中一种常见的高危并发症。糖尿病足给糖尿病患者带来严重的健康威胁，造成了沉重的社会经济负担。统计显示，约20％～35％的糖尿病患者受到不同程度的足部溃疡影响(Armstronget al.,N Engl J Med,2017,376(24):2367-2375)，严重时可导致患者截肢，而罹患糖尿病足的患者的5年死亡率是普通糖尿病患者的2.5倍(Walsh et al.,Diabet Med,2016,33(11):1493-1498)。糖尿病治疗费中高达三分之一的支出用于下肢溃疡的治疗上。
一般认为，糖尿病导致的神经病变和外周动脉栓塞是引发溃疡的关键因素之一，而创伤是主要的诱因。然而，糖尿病足的发病机制非常复杂，除了上述因素之外，感染和不引起临床感染的表面微生物、白细胞和再生组织功能改变、细胞信号异常及患者相关的因素等也是重要的致病因素(Jeffcoate et al.,Diabetes Care 2018,41(4):645-652)。上述因素导致糖尿病足的愈合远比普通伤口愈合更加困难，并且容易复发。目前，临床及在研的糖尿病足的治疗药物，依据其作用机制的不同主要包括：抗生素类、炎症控制药物、神经性药物、皮肤替代品类、生长因子类以及敷料等其他类型的药物(Karri et al.,Curr MedRes Opin,2016,32(3):519-542)。然而，由于其病理机制的复杂性，临床上尚迫切需要安全有效的治疗药物(Game et al.,Diabetes Metab Res Rev,2016,32Suppl 1:154-168)，而新靶点新机制候选药物发现相关的基础研究尚需推进。
蜗牛是一类传统中药，也是日常生活中的一种食材。作为传统中药的蜗牛又名：蠡牛、山蜗、蜗螺等。其入药历史悠久，早在《名医别录》和《本草纲目》中就有对蜗牛药方的记载，蜗牛通常作为一种清热药来使用。1996年，Kim等采用碱性蛋白酶酶解法提取褐云玛瑙螺(Achatina fulica)肌肉组织中多糖，应用盐析醇沉法进一步纯化获得一种新型糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)，该GAG是一个具有规则的二糖结构单元组成的新型糖胺聚糖，其化学结构由等摩尔的L-艾杜糖醛酸硫酸酯(2-sulfated L-Iduronic acid,IdoA2S)和D-2-乙酰氨基-葡萄糖(D-N-acetyl glucosamine,GlcNAc)组成(Kim et al.,J BiolChem,1996,271:11750-11755)。刘杰等人于2018年从该种中也提取纯化获得了蜗牛糖胺聚糖，并证实该糖胺聚糖的化学结构与1996年报道的结构类似(Liu et al.,CarbohydratePolymers,2018,181:433-441)。药理学活性研究发现，蜗牛糖胺聚糖不同于肝素无抗凝血活性(Wu et al.,Thromb Res,1998,92:273-281；Liu et al.,Carbohydr Polym,2018,181:433-441)，而具有抗炎(Ghosh et al.,Bri J Pharmacol,2002,137(4):441-448)、抑制成纤维细胞生长因子FGF-2活性(Wang et al.,Biochem Bioph Res Co,1997,235(2):369-373)、抑制血管生成(Raman et al.,ACS Med Chem Lett,2014,5(6):644-646)和抑制肿瘤生长(Lee et al.,Eur J Pharmacol,2003,465(1-2):191-198)等显著的药理学活性。作为结构规则的新型糖胺聚糖类多糖物质，因其具有上述广泛的药理学活性，使其具备潜在的应用研究价值。
本发明人惊奇地发现，新颖的蜗牛GAG(GAG from snail,SGAG)及其解聚衍生物可以高亲和力结合趋化因子，促进糖尿病皮肤组织伤口的愈合，因此，本发明所述新颖的蜗牛GAG及其解聚衍生物具有用于治疗和/或预防糖尿病并发症足或其他皮肤组织伤口溃疡或难愈合的新用途。本发明提供的一种结构新颖的SGAG及其解聚衍生物是指不同于已公开报道的首次发现的新型SGAG、其衍生物及其解聚产物和其衍生物，其药用蜗牛糖胺聚糖化合物及其制备方法及在制备治疗和/或预防如糖尿病足溃疡的糖尿病皮肤组织伤口愈合药物中的应用，均未见有公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜗牛糖胺聚糖化合物、其药学上可接受的盐、制备方法及应用，治疗或预防糖尿病并发症足或其他皮肤组织伤口溃疡或难愈合的问题。
为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐，包括化学式(I)所示结构，
Figure BDA0002408110770000021
化学式(I)中，R4是化学式(II)或化学式(III)所示结构：
Figure BDA0002408110770000022
R5是化学式(IV)、化学式(V)或化学式(VI)所示结构：
Figure BDA0002408110770000031
其中，
R1为相互独立的-H或-COCH3或-SO3 -；
R2为相互独立的–OH或-OSO3 -；
R3为-COO-或-CH2OH或–COOR6，其R6为相互独立的支链或支链的取代或未取代的C1-C6烷基、C7-C12的芳烷基；
R7为羟基、氨基、C1-C6烷基氨基或C7-C12芳基氨基；
R8为羰基中的双键氧(＝O)、双羟基、羟基、氨基、C1-C6烷基氨基或C7-C12芳基氨基；
n为2～150的整数。
A为α-D-2-氨基-2-脱氧-葡萄糖基(α-D-GlcN)；A'为取代的D-2-氨基-2-脱氧-葡萄糖-4-基的醛基还原产物：其糖醇、糖胺或N-取代的糖胺，A"为取代的2,5-脱水甘露糖基(anMan)或其糖醇、糖胺及N-取代糖胺；B为取代的α-L-艾杜糖醛酸基或其羧基还原产物α-L-艾杜糖基(α-D-IdoA或α-L-Ido)；B'为分别4-脱氧-4-烯吡喃糖醛酸基(ΔIdoA)。
本发明所述蜗牛糖胺聚糖化合物重均分子量(Mw)范围是2.5～200kDa，且其多分散系数(PDI)值小于或等于3.0。
本发明所述蜗牛糖胺聚糖化合物包括原型蜗牛糖胺聚糖和/或其解聚糖胺聚糖混合物，所述原型蜗牛糖胺聚糖是指从蜗牛中提取纯化的糖胺聚糖，未经解聚处理的原型蜗牛糖胺聚糖化合物。
本发明中的蜗牛糖胺聚糖化合物包括但不限于具有化学式(VII)、(VIII)、(IX)、(X)或(XI)所示结构的同系糖胺聚糖化合物。
Figure BDA0002408110770000032
Figure BDA0002408110770000041
式(VII)、(VIII)、(IX)、(X)或(XI)中：
R1、R2、R3、R7和R8均同前文所述定义；
n为2～150的整数，优选的可为10～80。
所述制备方法中：化学式(VII)和或(VIII)所示解聚蜗牛糖胺聚糖混合物可以但不限于用过氧化氢解聚法制备；化学式(IX)所示解聚蜗牛糖胺聚糖混合物可以但不限于用脱酰脱氨基解聚法制备；化学式(X)和或(XI)所示解聚蜗牛糖胺聚糖混合物可以但不限于用β-消除解聚法制备。
本发明人发现，式(IX)蜗牛糖胺聚糖化合物还原端为2,5-脱水甘露糖(AnMan)时，所述AnMan的C1位羰基易于结合一分子水形成二醇(AnMan-diol)式水合物结构，显然这种水合物或二醇式蜗牛糖胺聚糖化合物也在本发明的范围之内。
一种蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，由去壳的褐云玛瑙螺或其亚种白玉蜗牛中提取蜗牛糖胺聚糖并纯化获得所述的蜗牛糖胺聚糖化合物。
本发明中，所述蜗牛糖胺聚糖是将蜗牛去外壳、切碎、粉碎或匀浆后，用水作为提取溶剂，任选采用蛋白酶酶解处理和/或无机碱处理法获得含蜗牛糖胺聚糖的提取液；对提取液进行纯化，所述纯化步骤任选采用季铵盐沉淀法、醇(如乙醇或甲醇)和/或酮(如丙酮)沉淀法、阴离子树脂交换层析法、凝胶过滤层析法、透析法和/或超滤法获得纯化的或部分纯化的蜗牛糖胺聚糖多糖组分。
本发明所述含蜗牛糖胺聚糖的多糖组分是指，多糖组分在分析型凝胶色谱柱上呈单一的多糖色谱峰，具有均一性分子量，且多分散系数在1～3之间。
目前仅发现褐云玛瑙螺Achatina fulica或人工养殖的白玉蜗牛含有本发明定义的类肝素蜗牛糖胺聚糖，但是全球约有数万种腹足纲动物，其中陆生蜗牛所属的柄眼目(Stylommatophora)就有如石磺科(Onchididae)、玛瑙螺科(Achatinidae)、肋齿螺科(Pleurodontidae)、蛞蝓科(Limacidae)、嗜黏液蛞蝓科(Phiolomycidae)和巴蜗牛科(Bradybaenidae)等6科数十种蜗牛类动物入药。尽管已开展SGAG分离纯化的蜗牛品种尚少，但是含有符合本发明定义上的蜗牛糖胺聚糖SGAG的腹足纲动物品种并不限于褐云玛瑙螺和白玉蜗牛。本领域技术人员可以理解，对于符合本发明定义的蜗牛糖胺聚糖，即使来源于其他软体腹足纲动物品种，也可用于制备本发明所述解聚糖胺聚糖混合物及其要学上可接受的盐。
进一步的，所述蜗牛糖胺聚糖单糖组成包括摩尔比为1:(1±0.3)的D-2-乙酰氨基-葡萄糖和L-艾杜糖醛酸；其单糖连接方式是D-2-乙酰氨基-葡萄糖和L-艾杜糖醛酸以α(1→4)糖苷键糖苷键交替链接；单糖的羟基有被硫酸酯基取代。
本领域技术人员能够理解，本发明所述蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐由一系列聚合度不同的式(I)所示蜗牛糖胺聚糖化合物组成。由式(I)所示结构可见，本发明蜗牛糖胺聚糖化合物具有特征性的重复结构单元，其为式(I)结构式的括号内部分，即，
-{→4)-D-GlcN-α(1→4)–L-IdoA-α(1→}n-
本发明所述解聚糖胺聚糖混合物及其药学上可接受的盐，一般由蜗牛来源的糖胺聚糖直接或经化学解聚法解聚制备。其中所述蜗牛来源的糖胺聚糖具有如下特征：
(1)所述糖胺聚糖是从一些特定物种蜗牛中提取获得，其化学属性是类肝素糖胺聚糖衍生物，其结构与肝素相似但有本质区别，其结构比肝素更加规则，暂未发现其含有肝素五糖核心活性片段；
(2)所述糖胺聚糖中，其单糖组成包括摩尔比在1:(1±0.3)范围内的D-乙酰氨基-葡萄糖和L-艾杜糖醛酸；
(3)所述糖胺聚糖的单糖连接方式是，D-乙酰氨基-葡萄糖和L-艾杜糖醛酸以α(1→4)糖苷键交替链接形成多糖链。
一种蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括：
步骤A：将蜗牛糖胺聚糖采用解聚方法解聚至重均分子量4.0kDa～100kDa。
进一步地，还可以对解聚蜗牛糖胺聚糖进行步骤B：对所述解聚产物进行羧基还原反应和/或末端还原处理，得到蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐；
其中，所述羧基还原反应是将己糖醛酸还原成相应的己糖；所述末端还原处理是将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-葡萄糖基和/或2,5-脱水甘露糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。
进一步的，将蜗牛糖胺聚糖解聚中所述解聚方法为过氧化氢解聚法、脱酰脱氨基解聚法或β-消除解聚法中的一种，其中，
过氧化氢解聚法：在铜离子存在下，采用终浓度1％～10％的H2O2处理含所述蜗牛糖胺聚糖的原料；
脱酰脱氨基解聚法：肼处理含所述蜗牛糖胺聚糖的原料，使其所含蜗牛糖胺聚糖中的2％～75％的D-乙酰氨基葡萄糖发生脱乙酰化反应，在冰浴至室温条件下，将反应产物加入pH 2～5的亚硝酸溶液中反应5min～60min，使反应产物发生脱氨基反应并解聚，调溶液至碱性终止反应；
β-消除解聚法：通过季铵盐化和酯化反应将含所述蜗牛糖胺聚糖的原料中，糖胺聚糖中2％～75％己糖醛酸转化为己糖醛酸羧酸酯；然后在有机溶剂或水溶剂中，碱处理所得糖胺聚糖羧酸酯发生β-消除反应；所述有机溶剂为乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH2Cl2、CHCl3中的一种或几种的混合物，所述碱性试剂为NaOH、KOH、C1-C4醇钠、乙二胺、三正丁胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或几种的混合物。
1、过氧化氢解聚法对大多数多糖糖苷键均能实现解聚，鉴于蜗牛糖胺聚糖原料一般为含蜗牛糖胺聚糖的多糖组分，其中除SGAG外可能还含有分子量分布近似的葡聚糖类多糖成分。尽管过氧化解聚法对SGAG和葡聚糖的解聚效率存在差异，但均有解聚作用，因此，通过解聚产物的分子量差异有效去除中性多糖存在一定的困难。一般来说，其产物的纯化仍需进一步进行阴离子交换树脂层析等纯化技术处理。显然，为了得到更均一更纯的蜗牛糖胺聚糖解聚产物，也可以蜗牛糖胺聚糖原料进行阴离子交换树脂层析先除去中性多糖，再进行自由基解聚。
所得解聚蜗牛糖胺聚糖还可任选进行还原性末端的还原处理，将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-葡萄糖基或L-艾杜糖醛酸转化为相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。将多糖和/或寡糖的末端还原糖转化为对应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺是本领域技术人员已知方法，例如，碱性条件下的硼氢化钠或氰基硼氢化钠处理可以容易地将还原糖还原为糖醇；碳酸氢铵和氰基硼氢化钠处理可以将还原糖转化为相应的糖胺；而在有机胺存在下可以将还原性末端还原氨基化，其反应是有机胺与末端糖基的C1位醛基反应生成席夫碱，后者在还原剂存在下被还原成次级胺，即形成N取代的糖胺。
2、脱氨基解聚法包括在有或无硫酸肼存在下，采用肼处理含有蜗牛糖胺聚糖的原料，蜗牛糖胺聚糖中约5％-35％的D-乙酰氨基葡萄糖基脱除乙酰基，接着经亚硝酸或亚硝酸盐处理脱氨反应而发生糖苷键断裂，从而获得还原性末端为2,5-脱水甘露糖基的解聚糖胺聚糖混合物。
所述部分脱乙酰化反应是将含有蜗牛糖胺聚糖的原料溶解于无水或含水肼中，在硫酸肼或盐酸肼或硫酸或盐酸等催化剂下，加热60℃～110℃搅拌下反应，使多糖组分中的蜗牛糖胺聚糖的脱乙酰化程度达到约5％～50％。所述蜗牛糖胺聚糖的脱乙酰化程度通过1H NMR波谱检测分析。
脱乙酰化产物的脱氨基解聚反应一般在冰浴至室温条件下进行，将蜗牛糖胺聚糖脱乙酰化产物水溶后，加入亚硝酸溶液使溶液pH至约2～5，或者直接将蜗牛糖胺聚糖脱乙酰化产物溶解于pH约2～5的亚硝酸溶液中。蜗牛糖胺聚糖脱乙酰化产物的脱氨基解聚反应较为迅速而彻底，反应时间为5min～60min即可使反应完全。
采用脱氨基解聚法解聚蜗牛糖胺聚糖的多糖组分时，对于不含氨基己糖的中性多糖，在脱氨基解聚法所述处理步骤中基本不发生解聚反应。按脱氨基解聚法所述步骤处理后，即使蜗牛糖胺聚糖原料中可能含有中性多糖，因其不会发生脱氨基解聚反应其分子量基本不变，由此基于分子量分布的显著差异，可以通过凝胶层析、超滤和/或透析法将残留于多糖组分中的中性多糖成分除去。
类似地，解聚糖胺聚糖可以任选进行羧基还原处理，将L-艾杜糖醛酸基还原成L-艾杜糖基；还可任选进行还原性末端的还原处理，将其还原性末端的2,5-脱水甘露糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。
3、β-消除解聚法包括通过季铵盐化和酯化反应将含蜗牛糖胺聚糖原料中所含己糖醛酸上的游离羧基部分地转化为羧酸酯基，获得羧酸酯化程度约2％～75％的所述多糖的羧酸酯化物，并利用该步骤除去原多糖组分中残存非酸性多糖类杂质成分；继而在水或有机溶剂中，在碱性试剂存在下，使所得羧酸酯化物发生β-消除反应并获得目标分子量范围的解聚产物。
本发明人在基础化学理论指导下，创造性地应用β-消除反应原理，实现了新型蜗牛糖胺聚糖的易操作高效髙得率解聚制备。在β-消除解聚法中，将蜗牛糖胺聚糖原料中含有的蜗牛糖胺聚糖中的己糖醛酸之游离羧基部分地转化为羧酸酯基的过程中，需将所述多糖组分进行季铵盐转化，即是该步骤可以向蜗牛糖胺聚糖原料的水溶液中缓慢加入如苄索氯铵等季铵盐，作为酸性多糖的蜗牛糖胺聚糖可以形成季铵盐化的多糖沉淀。
蜗牛多糖组分中除SGAG外，还可能含有不带电荷中性多糖葡聚糖(neutralpolysaccharide)。该中性多糖具有近似SGAG的分子量分布范围，因此，蜗牛SGAG提取纯化过程中，采用醇沉分级沉淀法很难完全除去其中所含的葡聚糖。本发明β-消除解聚法中，在含有的蜗牛糖胺聚糖原料的季铵盐化处理过程中，由于中性多糖类成分不被季铵盐沉淀，季铵盐沉淀经过离心和纯水洗涤处理，可以非常有效地去除可能存在的分子量分布近似于所述蜗牛糖胺聚糖的葡聚糖。
所得季铵盐化的酸性多糖沉淀经洗涤、干燥后，将其溶解于非质子化溶剂如二甲基甲酰胺中与化学计量的卤代烃反应，可获得季铵盐的羧酸酯衍生物。所述卤代烃中烃基包括但不限于C1-C6直链或支链、饱和或不饱和、取代或未取代的脂族烃基；取代或未取代的C7-C12芳族烃基等。本发明优选的卤代烃为溴化苄或氯化苄。
本发明所述目标产物的重均分子量在4.0～100kDa范围内，所述SGAG羧酸酯衍生物的酯化程度以摩尔比计选择在2％～75％的范围内。所述羧酸酯衍生物的酯化程度可通过1H NMR谱图计算，或者通过对酯化产物完全碱水解后，采用高效液相色谱法测定相应苄醇的含量，从而计算酯化程度。本发明所述羧酸酯衍生物在碱性试剂存在下的有机溶剂或水溶媒中进行，由此获得解聚产物。其非水有机溶剂任选自乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH2Cl2、CHCl3或者它们的混合溶剂，所述碱性试剂任选自NaOH、KOH、C1-C4醇钠、乙二胺、三正丁胺、4-二甲氨基吡啶或者它们的混合物。优选的非水溶剂是二甲基甲酰胺(DMF)，碱性试剂为NaOH。
按照上述方法所述非水溶剂发生解聚时，其部分艾杜糖糖醛酸仍以羧酸酯形式存在，所述羧酸酯的酯基部分为C1-C6烷基、C7-C12的芳烷基。这种含羧酸酯基的解聚中间产物可以任选在碱性条件下的纯水和含水溶剂中水解酯基，获得不含羧酸酯的解聚糖胺聚糖混合物。
解聚蜗牛糖胺聚糖混合物所含艾杜糖糖醛酸基上的羧基可进一步在碳化二亚胺类化合物存在下被还原剂如硼氢化钠还原成相应的己糖基，即L-艾杜糖基。
类似地，解聚糖胺聚糖可以任选进行羧基还原处理，将L-艾杜糖醛酸基还原成L-艾杜糖基；还可任选进行还原性末端的还原处理，将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-葡萄糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺。
进一步地，本申请中所述药学上可接受的盐为钠盐、钾盐或钙盐。
包括糖尿病足溃疡(简称糖尿病足)在内的糖尿病皮肤组织溃疡，是糖尿病患者中一种常见的高危并发症。例如，糖尿病足给糖尿病患者带来严重的健康威胁，造成了沉重的社会经济负担。糖尿病患者受到不同程度的足部溃疡影响，严重时可导致患者截肢。目前，临床及在研的糖尿病足的治疗药物，依据其作用机制的不同主要包括：抗生素类、炎症控制药物、神经性药物、皮肤替代品类和生长因子类等其他类型的药物。然而，由于其病理机制的复杂性，临床上尚迫切需要安全有效的治疗药物。
为此，本发明所述蜗牛糖胺聚糖化合物包括原型蜗牛糖胺聚糖、解聚蜗牛糖胺聚糖混合物及其衍生物，具有促进包括糖尿病足在内的糖尿病皮肤组织伤口难以愈合和/或溃疡的药理活性，具有临床预防和治疗糖尿病皮肤组织伤口难以愈合性疾病的应用价值，因此，本发明提供一种治疗和/或预防糖尿病皮肤组织伤口难以愈合性疾病的药物，含有有效剂量的所述蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐以及药用赋形剂，所述糖尿病皮肤组织伤口难以愈合性疾病包括但不限于糖尿病足以及其他皮肤组织创面难以愈合。
可选的，所述药物的剂型为注射用水溶液或注射用冻干粉针剂或凝胶剂。
可选的，所述药物剂型为水凝胶剂，其药用辅料可为海藻酸盐、明胶、果胶、纤维素衍生物、淀粉及其衍生物、聚维酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸类如卡波姆、聚丙烯酸等水凝胶成型辅料。
本发明所述药物中所含生物活性成分为本发明所定义的原型蜗牛糖胺聚糖或蜗牛糖胺聚糖的解聚产物及其衍生物，由于包括糖尿病足在内的糖尿病皮肤组织伤口或创面或溃疡面等在皮肤面局部，一般而言，其合适的系统用药的给药途径适宜选择皮肤伤口面外用途径，例如伤口组织部位注射给药、涂抹伤口创面部位等。
与局部给药的给药途径相对应的制剂形式可包括注射用水溶液、可临用前配制成水溶液冻干粉针剂等。因此，本发明优选的药物蜗牛糖胺聚糖化合物为注射用水溶液或注射用冻干粉针剂。
本发明所述原型蜗牛糖胺聚糖、解聚蜗牛糖胺聚糖混合物及其衍生物一般具有良好的水溶性，其水溶液制备过程中，优选不含助溶剂和/或表面活性剂；可选择的药用赋形剂可包括调节溶液渗透压和/或pH值的无机盐如氯化钠、缓冲盐如磷酸盐等。
对于临用前配制注射液的冻干粉针剂而言，除调节渗透压和pH值的药学上可接受的无机盐和/或缓冲盐外，还可以选择采用甘露糖等有助于制剂成型的药学上可接受的赋形剂。
与局部给药途径相对应的制剂形式还包括凝胶剂和软膏，优选水凝胶剂，包括但不限于采用海藻酸盐、明胶、果胶、纤维素衍生物、淀粉及其衍生物、聚维酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸类如卡波姆、聚丙烯酸等为凝胶辅料成型的水凝胶剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次公开了包括化学式(I)所示结构的蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐，所述蜗牛糖胺聚糖化合物包括新颖结构的蜗牛糖胺聚糖及其衍生物、解聚产物等，其能髙亲和力的结合趋化因子和炎症因子等，有效阻断皮肤组织处的炎症过度反应，促进糖尿病足等皮肤伤口和/或创面和/或溃疡的愈合，具有重要的预防和治疗糖尿病皮肤组织溃疡的应用潜力。
附图说明
图1化学式(I)所述结构
图2.蜗牛糖胺聚糖AFG-2过氧化氢解聚产物的HPGPC谱图
图3.过氧化氢解聚法制备的解聚蜗牛糖胺聚糖dAFG-2-3的1H(A)和13C(B)NMR谱图
图4.β-消除解聚法制备的解聚蜗牛糖胺聚糖dAFG-2-5的1H(A)和13C(B)NMR谱图
图5.蜗牛糖胺聚糖促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合实验照片(空白组：生理盐水；AFG-2：蜗牛糖胺聚糖原型；阳性对照：重组人表皮生长因子凝胶，临床药物)
图6.蜗牛糖胺聚糖AFG-2促进糖尿病小鼠伤口愈合面积随时间变化情况(*表示药品组与空白对照组比较；*表示P<0.05，**表示P<0.01)
图7.糖尿病小鼠各组HE染色病理评分比较(图A为表皮和真皮的再生，图B为肉芽组织厚度，图C为新生血管形成和图D为成纤维细胞浸润。*表示AFG-2组与模型对照组比较；*表示P<0.05)
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：蜗牛糖胺聚糖的提取与纯化
1.1实验材料
原料：褐云玛瑙螺(Achatina fulica)和白玉蜗牛(Achatina fulica"white")，均为市售途径购买。
试剂：强阴离子交换树脂FPA98(Cl-)，美国陶氏化学公司；琼脂糖凝胶，法国BIOWEST公司；3000Da透析袋，美国Spectrum Laboratories；100-500Da透析袋，美国Spectrum Laboratories公司；D-2-乙酰氨基-葡萄糖(D-GlcNAc)为Alfa Aesar产品；L-艾杜糖醛酸(L-IdoA)，英国Carbosynth产品；葡萄糖(Glc)为中国药检产品；3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(PMP)，为阿拉丁产品；右旋糖酐标准品D1(2500Da)、D2(4600Da)、D3(7100Da)、D4(10000Da)、D5(21400Da)、D6(41100Da)、D7(84400Da)、D8(133800Da)和D2000(2000000Da)中国药品生物制品鉴定所；碱性蛋白酶、NaCl、NaOH、H2O2、乙醇、苄索氯胺、三氯乙酸等试剂均为市售分析纯试剂。
1.2提取纯化
脱脂去壳：新鲜活蜗牛褐云玛瑙螺或白玉蜗牛，加95％乙醇淹没浸泡约3-7天脱脂，去除外壳，螺肉与内脏分离(也可不分离)，螺肉干燥后，粉碎成约5-100目的细粉。
酶解反应：称取200g干燥蜗牛肉粉加入到5L玻璃多功能反应釜中，加1.6L去离子水。称取4.0g碱性蛋白酶，加入到上述反应釜中，120rpm搅拌均匀。6M NaOH调节溶液pH≈9，60℃水浴连续搅拌条件下，酶解反应提取36h，然后冷却至室温，4℃静置过夜，4000rpm×15min离心得上清。上清中加入三氯乙酸使其浓度为5％，溶液4℃静置30min，4000rpm×15min离心，弃沉淀得上清，上清调节pH至中性。
盐析醇沉：向所得上清中加入116g乙酸钾，再缓慢加入95％乙醇使其终浓度75％醇沉，静置过夜，4000rpm×15min离心，得沉淀。所得沉淀用无水乙醇洗3次。将沉淀溶于1450mL 0.2M NaCl溶液，4000rpm×15min离心，得上清。
季铵盐沉淀：所得上清中缓慢滴入150mL 4％苄索氯铵溶液，有白色沉淀生成，静置，4000rpm×15min离心，得沉淀。
盐交换：所得沉淀用去离子水反复洗涤3次后，加入200mL饱和食盐水搅拌溶解，加无水乙醇至终浓度80％(v/v)，4000rpm×15min离心得沉淀。该盐交换步骤重复操作三次。将沉淀用适量水溶解，3000Da透析袋对水透析，用0.1M硝酸银检测至透析水中无Cl-为止，浓缩后，液体冻干，称重计算得率，并对两个蜗牛糖胺聚糖进行分析检测。
按照上述提取纯化方法，制备的来自于褐云玛瑙螺和白玉蜗牛的蜗牛糖胺聚糖分别记为AFG-1和AFG-2。
1.3检测分析
茚三酮显色法：采用茚三酮显色法定性检测AFG-1和AFG-2是否含有蛋白质类成分。
紫外吸收光谱分析：取AFG-1和AFG-2样品各5mg，加水溶解稀释至0.1mg/mL，采用紫外分光光度计在190-400nm范围内检测样品的紫外吸收。
-OSO3 -/-COO-摩尔比分析：采用电导率滴定法(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江大学出版社，1999)分析AFG-1和AFG-2中所含硫酸酯基与羧酸基的摩尔比和硫酸酯基的含量。
单糖组成分析：按照柱前PMP衍生化法(Liu et al.,Int J Biol Macromol,2017,98:786-792)进行AFG-1和AFG-2的单糖组成分析，蜗牛糖胺聚糖先用三氟乙酸完全水解后，在碱性条件下与PMP反应，萃取后，经高效液相色谱仪C18柱分析，色谱条件为ZORBAX SB-C18(4.6mm×150mm×5μm)色谱柱，流动相为0.1M乙酸铵(pH5.5)缓冲液-乙腈(83:17)，柱温25℃，流速1mL/min。
高效凝胶色谱法：取样品AFG-1和AFG-2各约5mg，加流动相溶解至10mg/mL，使用0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤液进行色谱分析。
色谱条件为：Agilent Technologies 1260series高效液相色谱仪；Shodex OHpakSB-804 HQ色谱柱；柱温：35℃；流动相：0.1M氯化钠溶液；流速为0.5mL/min；进样量：50μL；示差检测器分析；记录色谱图。
分子量及其分布测定：取约10mg样品加流动相配制为10mg/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜，滤过液进行液相分析；准确称取已知分子量的右旋糖酐类对照品，配制成10mg/mL的溶液；色谱条件同上文，数据采用GPC软件处理，绘制标准曲线，应用此曲线对AFG-1和AFG-2进行分子量标定。
核磁共振波谱法：取样品约5mg，加D2O溶解至约10mg/mL，800MHz核磁仪检测1H、13C和二维相关NMR谱。
1.4实验结果
按照本实施例所述提取纯化步骤，从褐云玛瑙螺和白玉蜗牛中提取的蜗牛糖胺聚糖冻干后的质量分别为：来自褐云玛瑙螺的AFG-1为3.03g，以干重计得率为1.52％；白玉蜗牛的AFG-2为3.28g，以干重计得率为1.64％。所述两个蜗牛糖胺聚糖的为无味、无色或类白色的蓬松海绵状固体，两个多糖均易溶于水，难溶于乙醇、二氯甲烷等有机溶剂，有引湿性。
茚三酮显色法检测显示，2个蜗牛糖胺聚糖AFG-1和AFG-2均不含蛋白质或氨基酸类物质。而紫外吸收光谱分析显示，AFG-1和AFG-2在260nm和280nm处均无显著吸收峰，说明两者中均不含核酸和蛋白质类杂质。
电导率滴定法测定AFG-1和AFG-2的-OSO3 -/-COO-摩尔比均约为1:1，两者的-OSO3 -含量分别为14.22％和15.21％。凝胶排阻色谱法分析显示，AFG-1和AFG-2的重均分子量(Mw)分别为230kDa和130kDa，多分散系数分别为2.07和1.98。
AFG-1和AFG-2的单糖组成分析结果显示，其组成单糖为L-艾杜糖醛酸(L-IdoA)和D-2-乙酰氨基-葡萄糖基(D-GlcNAc)，AFG-1中两者的摩尔比为1.23:1.00，而AFG-2中两者的摩尔比为1.09:1.00。
进一步的NMR检测分析显示，质子化学位移5.170和5.101ppm分别为L-2-SO3 --艾杜糖醛酸(L-IdoA2S)和D-2-乙酰氨基-葡萄糖基(D-GlcNAc)异头1H质子信号，艾杜糖醛酸的2位质子信号为4.331ppm和相应的C-2的化学位移为76.12ppm，说明该位置有硫酸酯基取代；D-2-乙酰氨基-葡萄糖基(D-GlcNAc)的C-2的化学位移为56.68ppm，说明其C-2为氨基取代，其与CH3CO-成酰胺。
综合分析，AFG-1和AFG-2的结构特征为：(1)所述糖胺聚糖是从一些特定物种蜗牛中提取获得，其化学属性是硫酸化糖胺聚糖衍生物；(2)所述糖胺聚糖中，其单糖组成包括摩尔比在1:(1±0.3)范围内的D-乙酰氨基-葡萄糖和L-艾杜糖醛酸；(3)所述糖胺聚糖的单糖连接方式是，D-乙酰氨基-葡萄糖和L-艾杜糖醛酸以α(1→4)糖苷键交替链接形成多糖链。这2个蜗牛糖胺聚糖的化学结构式为-{→4)-D-GlcN-α(1→4)–L-IdoA-α(1→}n-，其中，硫酸酯基(-SO3 -)或乙酰基(CH3CO-)取代可以独立地在D-2-氨基-葡萄糖基(D-GlcN)中的N-位置取代，硫酸酯基(-SO3 -)取代在艾杜糖醛酸(L-IdoA)的2-位羟基。
实施例2：过氧化氢解聚法解聚蜗牛糖胺聚糖制备解聚蜗牛糖胺聚糖
2.1实验材料
AFG-2：按照实施例1方法，提取纯化的人工养殖的鲜品白玉蜗牛来源的蜗牛糖胺聚糖的多糖组分，其重均分子量(Mw)约为130kDa，多分散系数约为1.98。
试剂：H2O2、Cu(CH3COO)2、NaOH、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙醇等化学试剂均为市售分析纯试剂。
2.2制备过程
称取1.0g AFG-2样品，加36.5mL去离子水溶解，35℃水浴下，加入3.125mg乙酸铜，溶解后，缓慢加入1.4mL 30％H2O2，每次取样9mL，取样时间0.5h、2h、5h和7.5h，对应4个解聚产物(分别编号为dAFG-2-1,dAFG-2-2,dAFG-2-3,dAFG-2-4)。各加无水乙醇36mL，4000rpm×10min离心得沉淀，再用80％乙醇洗沉淀三次。沉淀加25mL水溶解，按照铜离子和EDTA摩尔比1:1加入EDTA后，用1000Da的透析袋对水透析，冻干，称重计算得率。
各个冻干样品的分子量，按照本发明实施例1所述高效凝胶排阻色谱法进行分析(HPGPC)。按照中国药典(2015版)二部附录VI-E法测定解聚样品的旋光度。按照实施例1所述单糖组成分析方法，分析解聚产物的单糖组成摩尔比。
2.3实验结果
实验结果显示(表1)，四个解聚产物dAFG-2-1,dAFG-2-2,dAFG-2-3和dAFG-2-4的得率范围为90％～65％，均符合图1所述化学式(I)的结构，解聚时间越短得率越高，而分子量越大。四个解聚蜗牛糖胺聚糖的HPGPC峰形为单一色谱峰，如图2所示，峰形对称，而多分散系数靠近于1，其均一性较好。
表1.AFG-2及其解聚产物的分子量和单糖组成等理化性质
Figure BDA0002408110770000141
以dAFG-2-3为例做NMR全谱归属，见表2和图3所示，进一步对本发明所述过氧化氢解聚法制备的解聚蜗牛糖胺聚糖的化学结构进行了确证，其化学结构具有本发明前文所述化学式(VII)或(VIII)的结构特征。
表2.dAFG-2-3的NMR信号归属
Figure BDA0002408110770000142
实施例3：脱氨基解聚法解聚蜗牛糖胺聚糖制备含2,5-脱水甘露糖的解聚蜗牛糖胺聚糖
3.1实验材料
AFG-1：按照实施例1方法，提取纯化的鲜品褐云玛瑙螺来源的蜗牛糖胺聚糖的多糖组分，其重均分子量(Mw)约为230kDa，多分散系数约为2.07。
试剂：水合肼、硫酸肼、无水乙醇、硼氢化钠、乙酸等均为市售分析纯试剂。
3.2制备过程
(1)部分脱乙酰化中间体的制备：称取100mg AFG-1置于反应烧瓶，加入20.0mg催化剂硫酸肼和2.5mL水合肼，氮气保护200rpm转速下搅拌，90℃下加热反应4h。向反应液中加入乙醇到80％(v/v)，4000rpm×15min离心得沉淀。8mL 95％乙醇洗涤沉淀3遍后，去离子水溶解后用1kDa透析袋于纯水中透析，透析截留液冻干，得部分脱乙酰化产物86.0mg。1HNMR检测所得产物的脱乙酰化程度约56％。该脱氨基中间产物，还可以进一步与三氧化硫三甲胺复合物(SO3·NMe3)在DMF溶剂中50℃反应，游离的氨基可以被磺化为磺酰氨基。
(2)脱氨基解聚产物的制备：称取步骤(1)制备的部分脱乙酰化产物50mg于反应烧瓶中，加3mL水溶解，加入5M亚硝酸溶液调节至pH 3.5，电磁搅拌反应解聚20min，然后加0.5M NaOH溶液调pH 9终止反应。上述整个过程在冰浴中反应完成。
(3)端基还原与产物纯化：步骤(2)所述反应溶液中加入含0.5mol/L硼氢化钠的0.1M氢氧化钠溶液2mL，50℃下加热搅拌反应60min，冷却至室温，滴加2M乙酸除去过量的硼氢化钠，0.5M NaOH溶液中和反应溶液，1.0kDa透析袋透析于纯水透析1天后，透析截留液上G50凝胶色谱柱，分段收集并合并含酸性糖胺聚糖的洗脱液，将洗脱溶液冷冻干燥，获得脱氨基解聚产物dAFG-1-1约45.1mg。
dAFG-1-1的理化性质检测及波谱分析方法检同本发明实施例1中所述部分检测方法。
3.3实验结果
高效凝胶排阻色谱法(HPGPC)对脱氨基解聚过程的检测结果显示，脱氨基解聚后，所得产物中仍含有少量约250kDa的多糖组分没有被解聚，该高分子量多糖组分经后续的凝胶色谱层析去除，并收集经化学鉴定为中性葡聚糖。凝胶色谱纯化后的脱氨基解聚产物dAFG-1的重均分子量约18.5kDa，其多分散系数(PDI)为约1.45。此解聚结果证实，非氨基取代的中性糖不会发生脱氨基解聚，可在后续凝胶层析或超滤法纯化过程中除去。这个恰恰说明了本发明所述解聚方法的优势特征之一。
单糖组成结果显示，解聚产物dAFG-1单糖艾杜糖醛酸(IdoA)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的摩尔比为1.08:1.00。
1H、13C NMR及其2D NMR相关谱显示，脱氨基解聚获得的解聚蜗牛糖胺聚糖dAFG-1的主要1H、13C信号峰及其2D相关谱显示的主要相关峰均相同或类似于过氧化氢解聚法制备的dAFG-2-3。但是，dAFG-1显示出不同于dAFG-2-3的归属于2,5-脱水甘露糖醇基(AnMannol)的碳和氢信号。
根据1H-1H COSY谱可以容易地归属AnMannol的糖环氢，其C-1上的两个H信号分别位于约3.77(H-1)和3.70ppm(H-1’)，C-2至C-5位上的H信号分别位于约3.95(H-2)、4.19(H-3)、4.15(H-4)和4.11ppm(H-5)，而C-6上的两个H信号分别位于约3.80(H-6)和3.76ppm(H-6’)。1H-13C HSQC谱图可以归属AnMannol所属碳信号，C-1至C-6信号分别位于约60.94、82.61、75.23、84.68、81.49和61.34ppm。
本发明平行制备的还原端2,5-脱水甘露糖(AnMan)未还原的脱酰脱氨基解聚产物的NMR谱图检测发现，其末端2,5-脱水甘露糖的C-1位羰基易于结合一分子水形成二醇式水合物结构。
综上所述，按照本实施例制备的dAFG-1-1的化学结构式具有如本发明所述的化学式(IX)所述的结构特征。
实施例4：β-消除解聚法解聚蜗牛糖胺聚糖混合物制备
4.1实验材料
AFG-2：按照实施例1方法，提取纯化的人工养殖的鲜品白玉蜗牛来源的蜗牛糖胺聚糖的多糖组分，其重均分子量(Mw)约为130kDa，多分散系数约为1.98。
试剂：苄索氯铵、氯化苄、无水乙醇、硫酸、氢氧化钠等均为市售分析纯试剂。
4.2制备过程
(1)季铵盐的制备：取AFG-2样品500mg，溶于16mL去离子水中，取苄索氯铵1254mg，溶于20mL去离子水中，连续搅拌条件下，于室温下将苄索氯铵溶液滴到AFG-2溶液中，溶液出现白色沉淀，4000rpm×15min离心取沉淀。沉淀用100mL去离子水洗涤3次。所得沉淀于减压干燥至恒重，得到AFG-2季铵盐产物1161mg。
(2)部分苄酯化中间体的制备：取步骤(1)所得600mg AFG-2季铵盐置于圆底烧瓶中，加入5mL二甲基甲酰胺(DMF)。待样品溶解后，加入0.32mL氯化苄，35℃下、500r/min搅拌中密闭反应8h。反应结束后加等体积饱和NaCl，加无水乙醇至80％，4000rpm×15min离心得沉淀，重复以上步骤三次，所得沉淀用80％乙醇洗一次，无水乙醇洗一次。所得沉淀用15mL去离子水溶解，用截留分子量为3kDa的透析袋进行透析。减压浓缩透析截留液至5mL，取少量冻干，检测其1H NMR谱图。1H NMR谱图检测结果显示其羧基酯化程度为68％。
(3)β-消除法解聚：将步骤(2)所得878mg羧基苄酯化产物置于50mL圆底烧瓶中，溶于15mL去离子水中，加入新配制的6M NaOH使终浓度0.18M，在62℃和氮气保护下，以200rpm转速搅拌反应1.5h。反应结束后，将反应溶液冷却至室温，用0.1M盐酸调节pH至中性，加入等体积饱和NaCl溶液、无水乙醇至80％，4000rpm×15min离心得沉淀，所得沉淀溶于水后，用1kDa的透析袋对水透析，截留液冷冻干燥，即为AFG-2的β消除解聚产物(dAFG-2-5)。产物的得率约为65％。
dAFG-2-5的理化性质检测及波谱分析方法检同本发明实施例1中所述部分检测方法。
4.3实验结果
HPGPC检测结果显示，与AFG-2相比，β消除解聚产物dAFG-2-5的分子量显著降低(Mw～9.0kDa)。单糖组成检测结果显示，解聚产物dAFG-2-5单糖艾杜糖醛酸(IdoA)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的摩尔比为0.94:1.00，与AFG-2比，解聚产物的GlcNAc组成比例有所提高(相对于IdoA的摩尔比计)，前者与部分IdoA发生β-消除反应相关。
在190nm～400nm波长范围内扫描结果显示，dAFG-2-5存在最大紫外吸收λmax235nm，这说明产物中有β-消除后的不饱和键存在。
NMR谱图检测结果显示见图4A，与过氧化氢法制备的dAFG-2-3谱图相比，消除解聚法制备的dAFG-2-5的1H NMR的谱图中在约5.96ppm出现了新的信号峰，根据其1H NMR相关谱将这些信号归属为IdoA的β-消除产物4-脱氧-4-烯吡喃糖醛酸-1-基(ΔIdoA)的4位H特征信号。
13C-NMR谱见图4B(DMSO内标)，IdoA与GlcNAc的C-1峰出现在约94～107ppm，而4-脱氧-4-烯吡喃糖醛酸-1-基(ΔIdoA)的C-1峰出现在约106.5ppm，其C-5的化学位移约为145.3ppm。
综合1H、13C谱及二维相关谱，dAFG-2-5的主要组成单糖中，L-IdoA与D-GlcNAc通过α(1→4)糖苷键交互连接组成聚糖链，而且dAFG-2-5中，非还原端的己糖醛酸主要为4,5-不饱和的糖醛酸。因此，按照本实施例所述发明制备的解聚蜗牛糖胺聚糖的化学结构式具有如本发明所述的化学式(X)所述的化学结构特征。
实施例5：蜗牛糖胺聚糖的羧基还原与末端羰基的还原氨基化
5.1材料
AFG-2：按照本发明实施例1方法，提取纯化的人工养殖的鲜品白玉蜗牛来源的蜗牛糖胺聚糖的多糖组分，其重均分子量约为130kDa，多分散系数约为1.98。
dAFG-2-2：本发明实施例2所得过氧化氢解聚产物解聚蜗牛糖胺聚糖。
dAFG-1-1：本发明实施例3所得脱氨基解聚产物解聚蜗牛糖胺聚糖。
dAFG-2-5：本发明实施例4所得β消除解聚产物解聚蜗牛糖胺聚糖。
试剂：硼氢化钠、氰基硼氢化钠、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、盐酸酪胺、HCl、NaCl、乙酸等均为市售分析纯试剂。
5.2制备
(1)羧基还原衍生物制备：取50mg AFG-2溶解于6mL纯水，0.1M HCl调pH至4.75。缓慢加入90mg EDC后，0.1M HCl调pH保持4.75。连续搅拌下缓慢加入400mg NaBH4，在50℃下水浴反应2h。反应结束后，滴加乙酸除去过量NaBH4，3kDa透析袋透析去离子水中，透析截留液经冷冻干燥到羧基还原的蜗牛糖胺聚糖(AFG-2a)约39.2mg，得率78.4％。
取50mg dAFG-2-2，按照上述方法对其羧基进行还原反应，获得羧基还原的解聚蜗牛糖胺聚糖(dAFG-2-2a)约41.2mg，得率82.4％。
取50mg dAFG-1-1，按照上述方法对其羧基进行还原反应，获得羧基还原的解聚蜗牛糖胺聚糖(dAFG-1-1a)约38.4mg，得率76.8％。
取50mg dAFG-2-5，按照上述方法对其羧基进行还原反应，获得羧基还原的解聚蜗牛糖胺聚糖(dAFG-2-5a)约37.6mg，得率75.2％。
(2)末端还原氨基化衍生物制备：取50mg AFG-2溶解于5mL 0.2mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，搅拌中依次加入30mg盐酸酪胺和10mg氰基硼氢化钠，35℃恒温水浴孵育4天后，加12.5mL 95％乙醇，4000rpm×15min离心得沉淀，沉淀用5mL 95％乙醇洗涤两遍。沉淀用4mL去离子水复溶，3000rpm×15min离心去不溶物，上清液转移至3kDa透析袋对离子水透析24h，透析截留液经冷冻干燥到末端还原氨基化的蜗牛糖胺聚糖(AFG-2b)约41.8mg，得率83.6％。
取50mg dAFG-2-2，按照上述方法对其末端进行还原氨基化反应，获得羧基还原的解聚蜗牛糖胺聚糖(dAFG-2-2b)约42.4mg，得率84.8％。
取50mg dAFG-1-1，按照上述方法对其末端进行还原氨基化反应，获得羧基还原的解聚蜗牛糖胺聚糖(dAFG-1-1b)约41.5mg，得率83.0％。
取50mg dAFG-2-5，按照上述方法对其末端进行还原氨基化反应，获得还原氨基化的解聚蜗牛糖胺聚糖(dAFG-2-5b)约39.8mg，得率79.6％。
上述所得产物的理化性质检测及波谱分析方法检同本发明实施例1中所述部分检测方法。
5.3实验结果
(1)羧基还原衍生物：电导率滴定法检测4个羧基还原衍生物得-OSO3 -/-COO-摩尔比(张惟杰，糖复合物生化研究技术(第二版)，浙江大学出版社，1999)得结果显示，电导率滴定曲线只有一个滴定拐点，此拐点为硫酸酯基，而未见羧基所致电导率变化的曲线拐点，说明4个羧基还原衍生物中L-IdoA上的羧基已被还原。
(2)末端还原氨基化衍生物：检测4个末端还原氨基化衍生物的单糖组成及核磁波谱，结果显示，单糖组成中L-IdoA:D-GlcNAc的摩尔比为约1:(1±0.3)，此与相应的起始非末端还原氨基化衍生物得结构单元的理论计算结果基本一致；1H NMR(D2O,δ[ppm])显示的7.26(2’,6’H)和6.94(3’,5’H)为特征性酪胺的苯环质子信号，这些数据证实了4个末端还原氨基化衍生物均为在相应的起始原料的还原端实现了还原氨基化，相应蜗牛糖胺聚糖的还原端半缩醛已被还原。
实施例6：不同解聚方法所得解聚蜗牛糖胺聚糖的结合趋化因子活性比较
6.1材料
(1)蜗牛糖胺聚糖样品：AFG-2，本发明实施例1所得样品，dAFG-2-2,本发明实施例2所得样品，过氧化氢解聚法制备；dAFG-2-5b，本发明实施例4和5所得样品，β-消除解聚法制备(末端氨基化)。
(2)生物材料及仪器：人白介素8(Human Interleukin-8,IL-8)，Abcam，100μg；大分子相互作用仪，Biacore T200，GE Healthcare公司；CM5芯片，GE Healthcare公司。
6.2方法
将IL-8蛋白按照标准操作流程偶联到CM5芯片上，对蛋白偶联通道进行封闭。使用HBS-EP作为运行缓冲液，不同浓度的蜗牛糖胺聚糖样品进行检测，并对结果进行分析，获得KD值。
6.3结果
原型蜗牛糖胺聚糖及其解聚产物结合趋化因子IL-8的亲和力结果显示，AFG-2、dAFG-2-2和dAFG-2-5b的KD(M)数据分别为3.38×10-6、9.23×10-6和4.79×10-7，说明蜗牛糖胺聚糖样品均具有结合趋化因子IL-8的活性。
实施例7：蜗牛糖胺聚糖对糖尿病小鼠全层皮肤缺损溃疡创面愈合的影响
7.1仪器
快速组织病理形态切片染色系统(包括石蜡包埋机、切片机和烤片机等)，美国Thermo Scientific公司；AE41型光学显微镜，美国Motic公司。
7.2主要试剂与对照药物
主要试剂：链脲佐菌素(STZ)，Sigma公司；苏木素-伊红染色液、中性树胶和防脱载玻片等，Auragene公司；异氟烷、碘伏、水合氯醛、二甲苯、无水乙醇等试剂为市售生物级或医用级试剂。
阳性对照：重组人表皮生长因子凝胶(hEGF)，国药准字号产品，某药业有限公司。
蜗牛糖胺聚糖：按照本发明实施例1制备的蜗牛糖胺聚糖AFG-2。
7.3动物实验
(1)动物状况
动物实验的全部过程遵守中华人民共和国公共卫生部动物实验委员会以及国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关监督管理规定，选用SPF级成年雄性小鼠34只，重约25～30g，鼠龄约6-8周。所有小鼠饲养于恒温条件下，每12h光暗循环，自由饮水、采食，并每天更换垫料。在实验开始之前，所有小鼠进入研究室条件下经过为期7天的适应性喂养后，称重标记。
(2)糖尿病小鼠造模
所有实验动物空腹称量并记录体重，按50mg/kg的剂量计算每只实验小鼠所需STZ(浓度为10mg/mL)剂量并进行腹腔注射，连续注射5天。注射完成一周后，所有造模小鼠经尾静脉采血并用血糖仪检测血糖。若随机血糖≥16.7mmol/L，则视为糖尿病模型造模成功。
(3)实验分组及方法
造模成功的糖尿病小鼠，按照体重大小均衡随机分为4组，每组8只。另设2只正常动物以观察行为学上的差异。
空白对照：生理盐水组，每孔50μL；阳性对照：重组人表皮生长因子凝胶，100mg/cm2；受试药物组：蜗牛糖胺聚糖AFG-2，高剂量组0.8mg/cm2，低剂量组0.2mg/cm2，每孔50μL，称取8mg(低剂量为2mg)AFG-2，生理盐水配制成1mL溶液。每日给药一次，给药方式均为创口部位涂抹。
(4)糖尿病溃疡造模
异氟醚吸入麻醉，背部毛发剔除，用动物皮肤打孔器造两个对称的直径为6mm的圆形创口(距小鼠耳朵后缘3cm处)，打孔部位进行碘伏消毒，再用手术缝合线将硅胶垫圈(直径8mm)缝合在伤口处固定伤口，在创口上加上50μL的药物，给药后拍照记录，各组按每创口每天50μL给药，持续给药5d；伤模小鼠单笼饲养，自由饮水、取食。
(5)数据记录
①自糖尿病溃疡模型建立之日起，每天观察1次，观察动物的行为相比正常动物是否有异常；
②给药后，每天观察并记录小鼠伤口愈合及周围炎症情况，利用Image J软件计算测定溃疡创面面积以分析创面愈合率：
愈合率(％)＝(初始伤口面积-治疗n天伤口面积)/初始伤口面积×100％
③治疗后第1、3、7和15天，腹腔注射5％水合氯醛(6mL/kg)麻醉，留取右侧伤口肉芽组织标本经4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，然后在光镜下观察表皮和真皮的再生、肉芽组织厚度、新生血管形成、成纤维细胞浸润情况，依据下表进行组织病理盲态评价。
(6)统计分析
创面愈合率：数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS17.0软件对统计数据进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
组织病理评分：用均数士标准差表示，采用K-W秩和非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
7.4实验结果
动物行为变化：自糖尿病溃疡模型建立之日起，经每日观察，与正常动物相比较，未发现糖尿病溃疡小鼠有明显的行为异常。
创面周围炎症情况及创面愈合率：实验各组小鼠创面周围炎症均于第3天明显减轻。于第0、2、7、13天对伤口皮肤拍照，如图5所示，利用Image J软件计算创面面积以分析创面愈合率。图6显示各组的创面愈合情况，AFG-2低剂量组在第五天以前促进愈合效果比较明显，与空白对照组相比有显著差异；而高浓度AFG-2处理组在第五天以后促伤口愈合效果显著，与阳性对照组效果接近。上述结果说明，蜗牛糖胺聚糖AFG-2具有显著的促进糖尿病创面愈合的药效。
HE染色分析：HE染色分析显示，表皮组织学结果与在糖尿病伤口的光学图像中观察到的伤口收缩一致，AFG-2处理组在3d内显示较少的免疫细胞。与生理盐水组相比，AFG-2高剂量组可以持续促进再上皮化，肉芽组织增厚，血管生成并导致伤口早期愈合，与hEGF的治疗效果相似。第15天，AFG-2高剂量和阳性对照组(hEG组)的皮肤组织高度重建，观察到更多的毛囊和皮脂腺。
对实验各组小鼠第七天的创面及周围组织行HE染色，光镜下观察并从表皮和真皮的再生、肉芽组织厚度、新生血管形成、成纤维细胞浸润等四个方面进行组织病理盲态评分。评分统计结果如图7所示，图7A表皮和真皮再生，高浓度的AFG-2处理组与模型对照组比较有显著性差异，低浓度AFG-2处理组与阳性对照组及模型对照组比较均无明显差异；肉芽组织厚度与新生血管形成(图7B和C)各组间比较均无明显差异；图7D为成纤维细胞浸润，高浓度AFG-2处理组与模型对照组比较差异有统计学意义，与其它组别比较无明显差异。
结果表明，蜗牛糖胺聚糖AFG-2能显著加快表皮和真皮的再生和成纤维细胞浸润，从而促进糖尿病创面的愈合以及毛囊和皮脂腺等皮肤组织的重建和再生。
实施例8：解聚蜗牛糖胺聚糖冻干粉针的制备
8.1材料
同实施例4方法所得dAFG-2-5。
8.2处方
原辅料名称 用量
dAFG-2-5 30g
注射用水 300mL
共制成 1000支
8.3制备工艺
称取处方量的解聚蜗牛糖胺聚糖钠盐(dAFG-2-5)加注射用水至全量，搅拌使溶解完全，间歇式热压法灭菌。加入0.3％的药用活性炭，搅拌20min；使用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜脱炭过滤除去热源。含量合格后用0.22μm的微孔滤膜过滤；分装于管制西林瓶中，每瓶0.5mL，半压塞，置冷冻干燥箱内，按设定的冻干曲线进行冻干，压塞，出箱，轧盖，目检合格，包装得成品。
冻干过程：将样品进箱，降隔板温至-40℃，保持4h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至300μbar。开始升华：1h匀速升温至-25℃，保持3h；2h匀速升温至-15℃，保持8h，真空保持100～250μbar；再进行干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持150～200μbar；0.5h升温至10℃，保持2h，真空保持80～100μbar；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。
实施例9：蜗牛糖胺聚糖水凝胶剂的制备
9.1材料
同实施例1方法所得AFG-2。
9.2处方
原辅料名称 用量
AFG-2 30g
卡波姆941 10g
聚山梨酯80 2g
氢氧化钠 4g
乙醇 50g
甘油 50g
蒸馏水 1000g
共制成 1000支
9.3制备工艺
称取10g卡波姆941和2g聚山梨酯80，加40℃蒸馏水400mL，连续搅拌直至完全溶胀；称取4g氢氧化钠，用200mL蒸馏水完全溶解后，在连续搅拌条件下滴加到卡波姆溶胀液中，然后依次加入50g乙醇和50g甘油，连续搅拌，分散均匀，是为卡波姆凝胶基质液。称取30g AFG-2，加蒸馏水400mL搅拌溶解完全。将制得的AFG-2水溶液，在连续搅拌下，滴加到上述卡波姆凝胶基质液中，充分的搅拌混匀，即得。
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (8)

1.一种解聚蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：具有化学式（I）所示结构，
Figure 584739DEST_PATH_IMAGE001
化学式(I)中，R4是化学式(II)所示结构：
Figure 155355DEST_PATH_IMAGE002
R5是化学式(V)或化学式(VI)所示结构：
Figure 144039DEST_PATH_IMAGE003
其中，
R1为相互独立的-H或-COCH3或 -SO3 -；
R2为相互独立的–OH或-OSO3 -；
R3为-COO-或-CH2OH或–COOR6，其R6为相互独立的支链或支链的取代或未取代的C1-C6烷基、C7-C12的芳烷基；
R7为羟基、氨基、C1-C6烷基氨基或C7-C12芳基氨基；
R8为羰基中的双键氧、双羟基、羟基、氨基、C1-C6烷基氨基或C7-C12芳基氨基；
n为2 ~150的整数。
2.根据权利要求1所述的解聚蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述解聚蜗牛糖胺聚糖单糖组成包括摩尔比为1 :(1±0.3)的D-2-乙酰氨基-葡萄糖和L-艾杜糖醛酸；其单糖连接方式是D-2-乙酰氨基-葡萄糖和L-艾杜糖醛酸以α(1→4)糖苷键交替链接；单糖的羟基有被硫酸酯基取代。
3.一种权利要求1所述的解聚蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括：
步骤A：将蜗牛糖胺聚糖采用解聚方法解聚至重均分子量4.0 kDa ~ 100 kDa；
步骤B：对所述解聚产物进行羧基还原反应和/或末端还原处理，得到蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐；
其中，所述羧基还原反应是将己糖醛酸还原成相应的己糖；所述末端还原处理是将其还原性末端的D-2-乙酰氨基-2-脱氧-葡萄糖基和/或2,5-脱水甘露糖基转化为其相应的糖醇、糖胺或N取代的糖胺；
所述解聚方法为过氧化氢解聚法、脱酰脱氨基解聚法或β-消除解聚法中的一种。
4.根据权利要求3所述的解聚蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述解聚方法为：
过氧化氢解聚法：在铜离子存在下，采用终浓度1%~10%的H2O2处理含所述蜗牛糖胺聚糖的原料；
脱酰脱氨基解聚法：肼处理含所述蜗牛糖胺聚糖的原料，使其所含蜗牛糖胺聚糖中的2%~75%的D-乙酰氨基葡萄糖发生脱乙酰化反应，在冰浴至室温条件下，将反应产物加入pH2~5的亚硝酸溶液中反应5 min~60 min，使反应产物发生脱氨基反应并解聚，调溶液至碱性终止反应；
β-消除解聚法：通过季铵盐化和酯化反应将含所述蜗牛糖胺聚糖的原料中，糖胺聚糖中2%~75%己糖醛酸转化为己糖醛酸羧酸酯；然后在有机溶剂或水溶剂中，碱处理所得糖胺聚糖羧酸酯发生β-消除反应；所述有机溶剂为乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、CH2Cl2、CHCl3中的一种或几种的混合物，所述碱性试剂为NaOH、KOH、C1-C4醇钠、乙二胺、三正丁胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求3所述的解聚蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述药学上可接受的盐为钠盐、钾盐或钙盐。
6.一种治疗和/或预防糖尿病皮肤组织伤口难以愈合性疾病的药物，其特征在于，含有有效剂量的权利要求1-5任意一项所述解聚蜗牛糖胺聚糖化合物或其药学上可接受的盐以及药用赋形剂。
7.根据权利要求6所述的治疗和/或预防糖尿病皮肤组织伤口难以愈合性疾病的药物，其特征在于，剂型为注射用水溶液或注射用冻干粉针剂或凝胶剂。
8.根据权利要求6所述的治疗和/或预防糖尿病皮肤组织伤口难以愈合性疾病的药物，其特征在于，剂型为水凝胶剂，其药用辅料为海藻酸盐、明胶、果胶、纤维素衍生物、淀粉及其衍生物、聚维酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸类水凝胶成型辅料。
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