KR20010030803A - 신규 글리코사미노글리칸 및 이를 함유하는 의약 조성물 - Google Patents

신규 글리코사미노글리칸 및 이를 함유하는 의약 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20010030803A
KR20010030803A KR1020007003403A KR20007003403A KR20010030803A KR 20010030803 A KR20010030803 A KR 20010030803A KR 1020007003403 A KR1020007003403 A KR 1020007003403A KR 20007003403 A KR20007003403 A KR 20007003403A KR 20010030803 A KR20010030803 A KR 20010030803A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
deoxy
glycosaminoglycan
glycosaminoglycans
disaccharide
sulfo
Prior art date
Application number
KR1020007003403A
Other languages
English (en)
Inventor
가리야유따까
다까노료
가메이가에꼬
하라사부로
오나야준이찌
호리유수께
Original Assignee
야마야 와따루
세이가가쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 야마야 와따루, 세이가가쿠 고교 가부시키가이샤 filed Critical 야마야 와따루
Publication of KR20010030803A publication Critical patent/KR20010030803A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

본 발명은 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸에 있어서, 글리코사미노글리칸을 아질산으로 분해하고 p-니트로페닐히드라진과 반응시켜 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 화학적 이당 분석법에 의해 측정할 때 골격 구조에서 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않으며, 2-위치에 황산기를 갖는 유론산 잔기의 몰%(몰%는 글리코사미노글리칸을 글리코사미노글리칸 분해 효소로 소화하여 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 효소적 이당 분석법에 의해 얻은 이당 조성으로부터 계산함)가 총 유론산 잔기에 대하여 45% 이상인 글리코사미노글리칸을 제공한다. 본 글리코사미노글리칸은 의약품의 활성 성분으로서 사용할 수 있다.

Description

신규 글리코사미노글리칸 및 이를 함유하는 의약 조성물{NOVEL GLYCOSAMINOGLYCAN AND DRUG COMPOSITIONS CONTAINING THE SAME}
헤파린은 유론산(이듀론산(IdoA) 또는 글루쿠론산(GlcA)) 잔기 및 글루코사민(GlcN) 잔기로 구성된 이당 단위의 반복 구조로 된 골격 구조를 갖는 글리코사미노글리칸 중 하나이다. 헤파린은 유론산 잔기의 2-위치의 히드록시기와 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기기 및 2-위치의 아미노기가 각각 어느 정도 황산화된 글리코사미노글리칸 중 하나이다. 헤파린이 항트롬빈III(이후 ATIII라 함) 결합 부위(FEBS Lett.(1980) 117, 203-206)를 가지며, ATIII와 결합하여 트롬빈의 작용을 억제하여 항응혈 작용을 나타내기 때문에, 헤파린은 투석 처리 등의 결과를 향상시키기 위하여 항응혈제 등의 약제로서 오랫동안 널리 사용되었다. 최근, 헤파린이 각종 생리 활성 인자와 상호작용함이 밝혀졌다. 예를 들면, 헤파린은 리포단백질 리파아제와 상호작용하며(J.Biol.Chem.(1981) 256, 12893-12898), 염기성 섬유아세포 성장 인자에 대하여 친화성을 갖는다(J.Cell Biol.(1990) 111, 1651-1659).
이러한 상황하에서, 헤파린과 특정 세포 성장 인자 또는 시토킨 사이의 결합에 관여하는 헤파린 내의 도메인 구조가 관심의 초점으로 되었다. 또한, ATIII 결합 부위의 존재에 의한 항응혈 작용을 감소시켜 생리 활성 인자와의 상호작용을 증가시킬 목적으로 헤파린의 탈황산화에 의한 화학적 변성에 대한 많은 연구가 진행되고 있다(J.Carbohydr.Chem.(1993) 12, 507-521; Carbohydr.Res.(1989) 193, 165-172; Carbohydr.Res.(1976) 46, 87-95; WO95/30424, 등).
상술한 헤파린의 탈황산화에 있어서, 최근의 초점은 헤파린에서 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기를 제거하는데 있다(6-탈황산화). 탈황산화 방법으로서는, 가용매 분해를 사용하는 방법(WO95/30424) 및 실릴화제를 사용하는 방법(WO96/01278)을 들 수 있다.
전자의 방법에서는 헤파린 분자에서 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기(6-O-황산기)가 제거됨과 함께, 유론산 잔기의 2-위치의 히드록시기에 결합된 황산기(2-O-황산기)와 글루코사민 잔기의 2-위치의 아미노기에 결합된 황산기(N-황산기)도 제거된다. 따라서, 6-O-황산기를 실질적으로 모두 제거하는 전자의 방법을 사용하는 과정에서, 글루코사민 잔기의 N-황산기와 유론산 잔기의 2-O-황산기도 실질적으로 모두 제거된다. 이렇게 변성된 헤파린의 글루코사민 잔기의 2-위치의 아미노기는 재황산화될 수 있지만, 글루코사민 잔기의 6-위치를 황산화하지 않고 유론산 잔기의 2-위치의 재황산화는 어렵다.
후자의 방법은 글루코사민 잔기의 6-O-황산기를 더욱 특이적으로 제거할 수 있다는 점에서 전자의 방법보다 우수하다. 그러나, 후자의 방법으로 얻은 변성된 헤파린에서는 효소적 이당 분석법에 의해 측정된 유효 이당 수율이 낮으며, 따라서 이는 의약용으로 사용하기에는 구조 동정이 충분하지 않다는 점에서 여전히 방법상에 문제가 있음을 의미한다. 또한, 변성 헤파린의 항응혈 작용이 크게 감소는 되지만, 없지는 아니하여, 항응혈 작용이 완전히 제거된 변성 헤파린을 얻을 수는 없었다.
헤파린 또는 그 단편은 각종 생리 활성 물질에 대한 친화성을 가지며, 이 친화성은 상기 생리 활성 물질의 기능과 밀접하게 연관되어 있기 때문에, 헤파린 또는 변성 헤파린을 이용한 의약품의 조사 및 개발에 대한 집중적인 연구가 행해지고 있다. 그러나, 이러한 노력에도 불구하고, 의료용으로는 항응혈제로서만 효과적으로 사용되고 있다.
즉, 헤파린을 항응혈제 이외의 용도로 사용하는데 중점을 둘 때, 항응혈 및 출혈 작용을 충분히 제거하는 것이 중요하며, 의약품으로 사용하는 경우 물질로서의 구조 동정(structural identification as a substance)이 가능해야 한다. 이들 문제점에 대해서는 더 많은 개선이 있어야 하며, 이들 남아 있는 문제점을 해결하고 생리 활성 물질에 대한 헤파린의 친화성을 이용한 안전하고 유용한 의약품의 제공이 요구되고 있다.
본 발명은 글리코사미노글리칸을 구성하는 글루코사민 잔기의 6-위치에 결합된 황산기는 실질적으로 모두 제거되고 다른 황산기의 제거는 최소화된, 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸; 및 활성 성분으로서 상기 글리코사미노글리칸을 포함하는 의약; 뿐만 아니라 상기 글리코사미노글리칸의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 글리코사미노글리칸의 제조시13C-NMR 스펙트럼의 변화의 타임 코스(time course)를 나타낸다(발명 2). 도 1(1)은 표준 헤파린(표준 H)의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 1(2), (3), (4) 및 (5)는 110℃에서의 반응 시간을 각각 15, 30, 60 및 120분으로 변화시켜 얻은 글리코사미노글리칸의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다(대조 3, 대조 4, 대조 5 및 발명 2). 도면에서 6S는 6-O-황산기를 갖는 글루코사민 잔기의 6-위치 탄소 원자의 시그널이며, 6은 6-O-황산기가 없는 글루코사민 잔기의 6-위치 탄소 원자의 시그널이다.
도 2는 본 발명의 글리코사미노글리칸의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다(발명 1).
도 3은 본 발명의 글리코사미노글리칸의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다(발명 3).
도 4는 본 발명의 글리코사미노글리칸의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다(발명 4).
도 5는 대조 글리코사미노글리칸의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다(대조 1).
도 6은 대조 글리코사미노글리칸의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다(대조 2).
도 7은 건강한 피부 상처에 대한 본 발명의 글리코사미노글리칸의 치료-촉진 활성을 나타낸다(발명 2).
도 8은 당뇨성 피부 궤양에 대한 본 발명의 글리코사미노글리칸의 치료-촉진 활성을 나타낸다(발명 2).
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
이후, 하기 실시예를 참고하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
먼저, 검사 방법을 설명한다.
검사 방법 1
[화학적 이당 분석법을 사용한 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기의 검출 및 6-탈황산화율의 계산]
Kariya 등의 방법(Kariya 등, J.Biochem.(1998) 123, 240-246)에 따라 검사 물질의 6-탈황산화율을 측정하였다. 즉, 100μl의 아질산 용액(pH1.5)을 1mg의 샘플에 첨가하고 실온에서 10분 동안 두었다. 이 혼합물을 1N 탄산 나트륨으로 pH7.5로 조정하고, 불활성 기체를 취입하여 건조하였다. 건조 생성물에 200μl의 증류수 및 1% PNP-히드라진을 함유하는 200μl의 아세토니트릴을 첨가하고 이 혼합물을 37℃에서 30분 동안 유지하여 글리코사미노글리칸과 PNP의 커플링 반응을 실시하였다. 그 후, SepPak C-18 카트리지 컬럼(Waters)을 사용하여 부분적으로 정제하였다. 이 부분 정제된 생성물을 IPRP-HPLC(ion-pairing reversed-phase HPLC)로 분석하여 ISMS(IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP)의 피크의 존재 여부를 확인하였다. 또한, ISM(IdoA(2S)-AnMan-PNP)과 ISMS(IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP)의 피크 면적을 계산하고 얻어진 값은 하기 식에 따라 6-탈황산율의 계산하는데 사용하였다:
6-탈황산화율=(B0×A1-A0×B1)/(B0(A1+B1))×100(%)
식 중, A0는 하기 표준 헤파린을 샘플로서 사용할 때 ISM의 피크 면적이며, B0는 하기 표준 헤파린을 샘플로서 사용할 때 ISMS의 피크 면적이고, A1은 검사 물질(표준 헤파린, 본 발명의 글리코사미노글리칸 등과 같이 측정할 물질에 대한 일반명으로 사용됨)을 샘플로서 사용할 때 ISM의 피크 면적이며, B1은 검사 물질을 샘플로서 사용할 때 ISMS의 피크 면적이다.
검사 방법 2
[글리코사미노글리칸 분해 효소의 소화와 고속 액체 크로마토그래피의 조합을 사용한 효소적 이당 분석법]
(1) 글리코사미노글리칸 분해 효소를 사용한 소화
1.0mg의 검사 물질을 2mM 아세트산칼슘을 함유하는 220μl의 20mM 아세트산나트륨(pH7.0)에 용해하였다. 여기에 글리코사미노글리칸 분해 효소(헤파리나아제, 헤파리티나아제 I 및 II 각각 20mU)를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
(2) HPLC 분석
상기 (1)에서 얻은 용액 중의 효소 소화물(20μl)을 하기 조건하에서 HPLC(Shimadzu Corp., 모델 LC6AD)를 사용하여 분석하였다. 이온 교환 컬럼(Dionex, CarboPac PA-1 컬럼, φ4.0×250mm)을 공지된 방법(Kariya 등, Comp.Biochem.Physiol. (1992) 103B, 473-479)에 따라 사용하여, 염화리튬 구배(50mM→2.5M)를 사용하여 분 당 1ml의 유속으로 용출을 실시하고, 232nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(3) 이당 조성, 모든 유론산 잔기에서 2-O-황산화된 유론산 잔기의 몰% 및 유효 이당 수율의 계산
각각의 동정가능한 불포화 이당[ΔDiHS-OS, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S 및 ΔDiHS-tri(U,6,N)S]의 양을 상기 (2)에서 HPLC에 의해 검출한 피크 면적으로부터 측정하고, 각 불포화 이당(몰%)의 비율을 계산하여 이당 조성을 얻었다. 모든 유론산 잔기에서 2-O-황산화된 유론산 잔기의 몰%는 HPLC에 의해 동정가능한 불포화 이당류의 총량[ΔDiHS-OS, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S 및 ΔDiHS-tri(U,6,N)S의 총 피크 면적]을 100%로 하여, 유론산 잔기의 2-위치에 황산기를 갖는 불포화 이당[ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S 및 ΔDiHS-tri(U,6,N)S의 총 피크 면적]의 비율로서 계산하였다.
유효 이당 수율은 상기 이당 분석법에서 HPLC에 의해 검출된 모든 피크의 총 면적에서 동정가능한 불포화 이당류[ΔDiHS-OS, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S 및 ΔDiHS-tri(U,6,N)S]의 총 피크 면적의 비율에 하기 검사 방법 4에 따라 측정한 효소적 소화율을 곱하여 퍼센트로서 표시한다.
검사 방법 3
[분자량의 측정]
3%(w/w)의 검사 물질을 함유하는 10μl의 용액을 HPLC 겔여과에 의해 분석하였다. 사용된 컬럼은 TSKgel-(G4000+G3000+G2500)PWXL(Tosoh Corp., φ7.8×300mm)이었다. 용출액으로서 0.2M 염화나트륨을 사용하여 유속 0.6ml/분에서 검사 물질을 용출시켰다. 시차 굴절계(Shimadzu Corp., 모델 AID-2A)를 사용하여 검사 물질을 검출하였다. 분자량은 대조로서 소정의 분자량(중량 평균분자량)을 갖는 헤파린을 사용하여 계산하였다(Kaneda 등, Biochem.Biophys.Res.Comm.(1996) 220, 108-112).
검사 방법 4
[효소적 소화율의 측정 방법]
(1) 글리코사미노글리칸 분해 효소를 사용한 소화
1.0mg의 검사 물질을 2mM 아세트산칼슘을 함유하는 220μl의 20mM 아세트산나트륨(pH7.0)에 용해하였다. 여기에 글리코사미노글리칸 분해 효소(헤파리나아제, 헤파리티나아제 I 및 II 각각 20mU)를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
(2) 겔여과에 의한 분석
상기 (1)에 따라 효소적 소화한 후에 얻은 20μl의 용액을 HPLC를 사용한 겔여과에 의해 분석하였다. 사용된 컬럼은 TSKgel-(G4000+G3000+G2500)PWXL(Tosoh Corp., φ7.8×300mm)이었다. 용출액으로서 0.2M 염화나트륨을 사용하여 유속 0.6ml/분에서 검사 물질을 용출시켰다. 시차 굴절계(Shimadzu Corp., 모델 AID-2A)를 사용하여 검사 물질을 검출하였다. 효소적 소화율은 40분(불포화 사당), 41.5분(트리황산화 불포화 이당), 42분(디황산화 불포화 이당), 43분(모노황산화 불포화 이당) 및 45분(황산기가 없는 불포화 이당)의 보유 시간에서 총 피크 면적에 대하여, 41.5분(트리황산화 불포화 이당), 42분(디황산화 불포화 이당), 43분(모노황산화 불포화 이당) 및 45분(황산기가 없는 불포화 이당)의 보유 시간에서 총 피크 면적의 퍼센트로서 계산하였다.
검사 방법 5
[활성화 부분 트롬보플라스틴 타임(APTT)의 측정 방법]
3.2% 구연산나트륨 수용액을 함유하는 주사기를 사용하여 쥐의 복부 대정맥으로부터 상기 구연산나트륨 수용액의 9배 용적의 혈액을 채집하였다. 이 혼합물을 4℃, 1,000×g에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 얻었다. 100μl의 혈장 및 소정의 농도로 검사 물질을 함유하는 100μl의 생리 식염수를 계량컵에 분배하고 37℃에서 1분 동안 배양하였다. 그 후, 미리 37℃에서 5분 동안 보존한 100μl의 Actin(Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd.의 상표명)을 여기에 첨가하고 37℃에서 2분 더 배양하였다. 이어, 미리 37℃에서 보존한 100μl의 0.02M 염화칼슘 용액을 첨가하여 응고를 시작하도록 하였다. 응고 시간은 자동 혈액 응고 측정장치(Baxter, 모델 AMELUNG KC10A)를 사용하여 측정하였다.
검사 방법 6
[트롬빈 타임(TT)의 측정 방법]
상기 APTT 측정 방법에서 설명한 방법에 따라 준비한 100μl의 혈장 및 소정의 농도로 검사 물질을 함유하는 100μl의 생리 식염수를 계량컵에 분배하고 37℃에서 1분 동안 배양하였다. 그 후, 미리 37℃에서 5분 동안 보존한 100μl의 트롬빈(10U/ml, Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd.)을 첨가하여 응고를 시작하도록 하였다. 응고 시간은 응혈측정기(Baxter, 모델 AMELUNG KC10A)를 사용하여 측정하였다.
검사 방법 7
[항트롬빈 활성의 측정 방법]
150mM 염화나트륨, 10mM 염화칼슘 및 0.1% 소 혈청 알부민을 함유하는 350μl의 20mM Tris 완충액(pH7.4), 100μl의 소 ATIII 용액(상기와 동일한 완충액 중 1U/ml) 및 100μl의 2배 연속 희석된 검사 물질의 수용액(샘플)의 3개의 용액을 냉각 상태에서 혼합하고, 37℃에서 2분 동안 배양하였다. 이 용액에, 50μl의 소 트롬빈 용액(증류수 중 50mU/ml)을 첨가하고, 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 그 후, 이 혼합물에 100μl의 기질 용액[Boc-Val-Pro-Arg-MCA(Peptide Laboratory, Boc는 t-부틸옥시카르보닐을 의미하며 MCA는 7-아미노-4-메틸쿠마린을 의미함), 70μM 수용액]을 첨가하고, 이 혼합물을 교반하고 37℃에서 3분 동안 배양하였다. 이어, 300μl의 30% 아세트산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응 혼합물의 형광 강도는 350nm의 여기 파장 및 444nm의 형광 파장에서 측정하였다. 상기 반응 혼합 조성물에서 샘플 대신 증류수를 사용한 블랭크 1 및 단지 기질과 완충액으로 된 반응 혼합물로 구성된 블랭크 2를 동일한 방법으로 처리하여 형광 강도를 측정하였다.
트롬빈 활성 억제율은 하기 식에 따라 계산하였으며, 검사 물질의 농도에 대한 억제율을 세미로그 그래프에 기입하여 50% 억제(IC50)를 나타내는 농도를 얻었다.
트롬빈 활성 억제율=(1-(ΔFs/ΔFb))×100(%)
식 중, ΔFs는 (샘플의 형광 강도-블랭크 1의 형광 강도)를 나타내며, ΔFb는 (블랭크 2의 형광 강도-블랭크 1의 형광 강도)를 나타낸다.
검사 방법 8
[출혈 활성에 대한 측정 방법]
쥐를 에테르로 마취시킨 후, 투여 부위마다 각 검사 물질을 0.2mg, 0.4mg 또는 0.8mg 함유하는 생리 식염수 0.4ml를 쥐의 등에 피하 투여하였다. 음성 대조군으로서, 0.4ml의 생리 식염수를 각 부위마다 피하 투여하였다. 24시간 후에 이 쥐를 출혈 치사시켰다. 각 주사 위치 주변의 피부를 제거하고 피하 반상 출혈의 장경과 단경을 버니어 캘리퍼를 사용하여 측정하여 면적을 계산하였다. 음성 대조군과의 차이는 Dunnett의 다중 비교 검사에 의해 측정하였다.
검사 방법 9
[bFGF 활성-촉진 효과의 측정 1(NaClO3첨가)]
10%의 소 혈청을 함유하는 DMEM(Asahi Techno Glass)에서 계대배양한 A31 세포(BALB/c 마우스 3T3 세포)를 20mM NaClO3및 2ng/ml의 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(hrbFGF, Promega)를 함유하는 DMEM-ITS 배지(GIBCO BRL에서 제조한 ITS, 10mg/l의 인슐린, 5.5mg/l의 트랜스페린 및 6.7μg/l의 셀렌산)에 5×104세포/ml의 밀도로 현탁하였다. 각 검사 물질을 상기 세포 현탁액에 최종 농도 1μg/ml로 첨가하였다. 100μl의 세포 현탁액을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 시딩(seed)하고 배양하였다. 3일 동안 배양한 후, 20μl의 Celltiter 96AQ 비방사성 세포증식 분석용액(Promega)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포 증식은 흡광 광도계를 사용하여 파장 492nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 각 검사 물질의 존재하에서의 세포 증식율은 표준 헤파린의 존재하에서의 세포 증식율을 100%로 하고 음성 대조군(검사 물질을 첨가하지 않음, 단지 용매로서 인산염-완충 생리 식염수(PBS)를 첨가함)의 세포 증식율을 0%로 하여 계산하였다.
[bFGF 활성-촉진 효과의 측정 2(NaClO3무첨가)]
10%의 소 혈청을 함유하는 DMEM(Asahi Techno Glass)에서 계대배양한 A31 세포(BALB/c 마우스 3T3 세포)를 2ng/ml의 hrbFGF(Promega)를 함유하는 DMEM-ITS 배지(GIBCO BRL에서 제조한 ITS, 10mg/l의 인슐린, 5.5mg/l의 트랜스페린 및 6.7μg/l의 셀렌산)에 5×104세포/ml의 밀도로 현탁하였다. 각 검사 물질을 상기 세포 현탁액에 최종 농도 20μg/ml로 첨가하였다. 100μl의 세포 현탁액을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 시딩하고 배양하였다. 3일 동안 배양한 후, 20μl의 Celltiter 96AQ 비방사성 세포증식 분석용액(Promega)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포 증식은 흡광 광도계를 사용하여 파장 492nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 각 검사 물질의 존재하에서의 세포 증식율은 표준 헤파린의 존재하에서의 세포 증식율을 100%로 하고 음성 대조군(검사 물질을 첨가하지 않음, 단지 용매로서 인산염-완충 생리 식염수(PBS)를 첨가함)의 세포 증식율을 0%로 하여 계산하였다.
[bFGF 활성-촉진 효과의 측정 3(NaClO3무첨가/초대 배양 세포)]
에테르 마취하에서, C57BL/6마우스(9주생, 암컷, Charles River)의 등의 털을 깎고 미리 멸균한 면봉을 피하에 집어넣었다(2위치/마우스). 10일 후 이 면봉을 육아 조직과 함께 제거하였다. 면봉을 페니실린/스트렙토마이신 용액(페니실린: 200U/ml, 스트렙토마이신: 200μg/ml)으로 2회 세척하고 PBS로 1회 세척하였다. 그 후, 면봉을 덮고 있는 멤브레인을 제거하였다. 0.1% 콜라게나아제 및 0.25% 트립신을 함유하는 용액이 든 관으로 면봉을 옮기고, 자동 온도 조절기(thermostat)에서 37℃, 1시간 동안 교반하였다. 이 처리된 용액을 세포 여과기(cell strainer, φ=70μm)로 걸렀다. 여기에 10% 소 혈청을 함유하는 RPMI1640 배지(Iwaki)를 첨가하고, 이 혼합물을 약하게 교반하고 2,000×g에서 3분 동안 원심분리하였다. 얻어진 세포를 동일 배지로 3회 세척하고, 1×105세포/ml의 밀도로 동일 배지에 재현탁하고, 10cm 페트리디쉬에 시딩하였다. 다음 날, 부착되지 않은 세포는 제거하고 아융합(subconfluent) 상태가 얻어질 때까지 37℃, CO2배양기에서 세포를 배양하였다.
0.25% 트립신과 0.05% EDTA 용액을 사용하여 아융합 상태의 세포를 페트리디쉬로부터 분리하였다. 세포를 원심분리에 의해 세척하고 투석된 0.1% 소 혈청을 함유하는 Basal ME/S-MEM 배지(Gibco)에 5×104세포/ml로 현탁하였다. 100μl의 세포 현탁액을 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 또한, 4μg/ml의 hrbFGF(Promega)를 함유하는 50μl의 Basal ME/S-MEM 배지 및 발명 2를 함유하는 50μl의 Basal ME/S-MEM 배지를 각 웰에 분배하고, 37℃, CO2배양기에서 3일 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 15μl의 세포 카운팅 용액(Dojin)을 각 웰에 첨가하여 3시간 더 배양하였다. 그 후, 배지의 흡광도를 450nm에서 측정하였다. 음성 대조로서는, 발명 2 없이 용매로서 단지 Basal ME/S-MEM 배지만 첨가된 샘플을 사용하였다. 양성 대조로서는, 발명 2 대신 표준 헤파린을 용해한 Basal ME/S-MEM 배지가 첨가된 샘플을 사용하였다.
참고예 1
[실시예에서 대조로서 사용된 표준 헤파린]
표준 헤파린으로서는, 돼지 소장 유래의 헤파린(SPL로부터 구입)을 사용하였다. 이 헤파린은 하기 물리화학적 특성을 갖는다.
(1) 상기 검사 방법 2에 따라 이당 분석법에 의해 얻은 하기 이당 조성물(몰%)(유효 이당 수율: 85.5%)
ΔdiHS-
OS NS 6S US di(6,N)S di(U,N)S di(U,6)S tri(U,6,N)S
3.9 2.3 3.8 1.8 11.4 6.4 1.5 68.9
(2) 항응혈 활성: 160IU/mg
(3) 상기 검사 방법 3에 의해 측정한 평균 분자량 분포: 13,000~15,000Da
(4) 상기 검사 방법 4에 의해 측정한 효소적 소화율: 89.8%
(5) 3μg/ml의 표준 헤파린 용액을 사용할 때, 상기 검사 방법 5의 APTT-측정 방법에 의해 측정한 APTT: 200초 이상
(6) 1μg/ml의 표준 헤파린을 함유하는 용액을 사용할 때, 상기 검사 방법 6의 TT-측정 방법에 의해 측정한 TT: 600초 이상
이후, 상기 표준 헤파린을 단지 표준 H라 한다.
참고예 2
대조 글리코사미노글리칸 1의 제조(공지 물질 1)
WO96/01278의 실시예에 기술한 방법에 따라 대조 글리코사미노글리칸 1(이후 간단히 대조 1이라 함)을 제조하였다. 즉, 통상의 방법으로 표준 H로부터 피리디늄염으로서 제조된 200mg의 헤파린 피리디늄염(이후, HepP)을 20ml의 탈수 피리딘에 첨가하여 용해하였다. 이 용액에 4ml(약 4g, HepP의 20배 중량)의 MTSTFA를 첨가하고 이 혼합물을 95℃에서 2시간 동안 교반하였다. 그 후, 이 혼합물에 20ml의 물을 첨가하고 이 혼합물을 Millipore 한외여과 멤브레인(Millipore)을 사용하여 투석하였다. 이 투석 용액을 백색 탁도가 사라질 때까지 100℃에서 가열하였다. 이어, 이 용액에 NaOH(1N)를 첨가하여 pH9로 조정하고, 유수에서 18시간 동안 투석하고 증류수에서 2시간 동안 투석하였다. 이 투석 용액을 동결건조하여 대조 1(나트륨염)의 분말 130mg을 얻었다.
참고예 3
대조 글리코사미노글리칸 2의 제조(공지 물질 2, 가용매 분해+N-재황산화)
WO95/30424의 실시예 1에 기술한 방법에 따라 대조 글리코사미노글리칸 2(이후 간단히 대조 2라 함)를 제조하였다. 즉, 50mg의 HepP을 10ml의 물에 첨가하여 용해하였다. 이 용액을 90ml의 디메틸 술폭시드로 희석하고, 이 혼합물을 100℃ 열수조에서 72시간 동안 교반하였다. 여기에 50ml의 5% 탄산수소나트륨을 첨가하고 이 혼합물을 냉각시켰다. 그 후, 이 용액을 1ℓ의 0.1M 아세트산나트륨 용액으로 각각 12시간 동안 2회 투석하고 증류수로 완전히 투석하였다.
이 투석 용액에, 0.1M 농도의 탄산나트륨 수용액 및 5몰 당량의 피리딘/SO3을 첨가하고, 이 혼합물을 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 24시간 동안 5몰 당량의 피리딘/SO3을 8시간마다 2회 첨가하였다. 그 후, 이 용액을 유수에서 18시간 동안 투석하고 증류수에서 2시간 동안 투석하였다. 이 투석 용액을 여과하고 동결건조하여 대조 2(나트륨염)의 분말 47.5mg을 얻었다.
실시예 1
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 제조 등]
HepP 및 MTSTFA를 피리딘에 첨가하고, 이 혼합물을 하기 표 3에 기술한 각 반응 조건하에서 일정 시간 동안 교반, 가열 및 배양하였다. 반응 혼합물을 함유하는 용기를 얼음 위에서 냉각하였다. 그 후, 이 혼합물을 감압하에서 회전식 증발기를 사용하여 10배 농축하고 나서, 2배 용적의 증류수를 첨가하였다. 또한, 백색 탁도가 사라질 때까지 회전식 증발기를 사용하여 상기 혼합물을 감압하에 두고, 유수에서 48시간 동안 투석하고 증류수에서 2시간 동안 투석하였다. 이 투석 용액을 증류수로 평형화된 Amberlite IR-120B(H+형) 수지(ORGANO CORP.)로 충전된 컬럼에 통과시켜, 수집된 분획물 중에서 산성 분획물만 모았다. 이 산성 분획물에 NaOH(1N)를 첨가하여 pH9로 조정하고, 유수에서 18시간 동안 투석하고 증류수에서 2시간 동안 투석하였다. 이 투석 용액을 동결건조하여 각 목적 제제를 분말로서 얻었다.
얻어진 제제[본 발명 1~4(발명 1~4)의 글리코사미노글리칸 및 대조 글리코사미노글리칸 3~6(대조 3~6)], 및 각 제조에 사용된 조건은 표 3에 나타낸다.
물질 HepP 사용량 MTSTFA 가열(오일조) 수율
사용량 HepP에 대한중량비 온도 보유 시간
발명 1 0.5g 5g 10배 110℃ 120분 385mg
발명 2 5g 50g 3.3g
대조 3 15분 3.9g
대조 4 30분 3.7g
대조 5 60분 3.4g
발명 3 50g 500g 120분 33.0g
발명 4* 500g 5000g 307.0g
대조 6 5g 100g 20배 95℃ 120분 3.5g
* 가열시 스팀 쟈켓 사용.
발명 1~4에 상이한 반응 스케일을 사용하였다. 대조 3~5에서는 발명 2와 동일한 반응 스케일을 사용하였지만, 반응 시간을 변경하여 대조군을 얻었다. 대조 6에서는 발명 2와 동일한 양의 HepP을 사용하였지만, 실릴화제로서 MTSTFA를 20배의 양으로 사용하고 반응 온도를 낮추어 대조군을 얻었다.
평균 분자량은 검사 방법 3에 따라 측정하였다. 그 결과, 모든 물질이 약 12,500Da로 밝혀졌으며, 이것은 분자량이 실질적으로 감소되지 않았음을 나타낸다.
실시예 2
(1) 효소적 소화율
표준 H, 발명 1~4 및 대조 1, 2 및 6의 효소적 소화율은 검사 방법 4에 기술한 방법에 따라 측정하였다. 6-탈황산화율도 검사 방법 1에 기술한 방법에 따라 표준 H를 제외한 다른 물질에 대하여 측정하였다(표 4). 표 4에 나타낸 대조 1의 6-탈황산화율은 WO96/01278에 나타낸 값을 인용하였다.
물질 효소적 소화성 6-탈황산화율
표준 H 89.8% -
발명 1 81.5% 100%
발명 2 81.0% 100%
발명 3 82.0% 100%
발명 4 73.0% 100%
대조 1 35.0% 81.2%
대조 2 81.0% 100%
대조 3 미측정 56.7%
대조 4 미측정 70.0%
대조 5 미측정 90.0%
대조 6 81.8% 80.3%
* WO96/01278에서 주어진 6-탈황산화율
본 발명(발명 1~4) 및 대조 2의 글리코사미노글리칸에서 높은 효소적 소화율과 6-탈황산화율이 얻어짐을 나타냈다.
(2) 이당 조성
검사 방법 2에서 기술한 효소적 이당 분석법에 따라 표준 H, 발명 1~4 및 대조 1, 2 및 6에 대한 이당 조성을 측정하였다(표 5).
물질 ΔDiHS- 유효이당수율
OS NS 6S US di(6,N)S di(U,N)S di(U,6)S tri(U,6,N)S
표준 H 3.9 2.3 3.8 1.8 11.4 6.4 1.5 68.9 85.5%
본 발명의글리코사미노글리칸 발명 1 11.8 25.2 1.0 6.0 1.3 54.7 0 0 81.5%
발명 2 9.3 25.9 0 6.7 4.7 53.4 0 0 82.0%
발명 3 11.5 30.4 2.5 4.9 2.3 48.0 0 0 81.8%
발명 4 11.8 22.6 2.4 4.5 1.6 57.1 0 0 65.3%
공지 물질(WO96/01278) 대조 1 6.8 10.2 0 2.6 5.7 73.0 0 1.7 32.4%
대조 6 9.2 12.2 1.1 5.0 4.7 54.9 0 8.2 81.5%
공지 물질(WO95/30424) 대조 2 13.3 65.2 0 0 0 21.5 0 0 81.0%
주석: 0은 검출 한계 이하의 값을 나타낸다. 단위: 몰%
그 결과, 가용매 분해를 사용한 탈황산화 방법에 의해 제조한 대조 2가 다른 물질과는 현저히 다른 이당 조성을 나타냈다. 또한, 본 발명의 글리코사미노글리칸이 표준 H, 대조 1 및 대조 6에 비하여 6-위치에 황산기를 적게 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 글리코사미노글리칸은 트리황산화 불포화 이당[ΔDiHS-(U,6,N)triS]이 검출되지 않은 것이 특징이었다.
실시예 3
내독소 농도의 측정
본 발명의 글리코사미노글리칸 제제에 오염된 내독소는 Toxicolor-LS-50M 세트(Seikagaku Corporation)를 사용한 비색 정량에 의해 측정하였다. Toxicolor-Et-2(Seikagaku Corporation)를 표준 내독소로 사용하였다.
즉, 실시예 1에서 기술한 발명 2를 제조하는데 사용된 방법에 따라 무내독소 기구, 피리딘 및 증류수를 사용하여 발명 5를 제조하였다. 그 후, (1) 발명 5를 2mg/ml의 농도로 희석한 수용액 및 (2) 내독소를 0.212EU/mL로 함유하는 (1)의 수용액을 각각 무내독소 마이크로티터 플레이트의 웰에 분배하였다. 마찬가지로, (3) 표준 용액으로서 Et-2를 0.424EU/ml로 함유하는 50μl의 수용액 및 (4) 블랭크로서 50μl의 증류수(무내독소)를 각각 무내독소 마이크로티터 플레이트의 웰에 분배하였다. Toxicolor-LS-50M 세트에 함유된 주요 시약 50μl를 상기 (1)~(4)가 분배된 각 웰에 첨가하고, 이 플레이트를 즉시 웰 리더 SK601(Seikagaku Corporation제)에 설치하였다. 37℃에서 30분 동안 반응시키면서 측정 파장 405nm 및 대조 파장 492nm에서 흡광도(mAbs/분)의 타임 코스를 측정하여 내독소 농도 계산에 사용되는 절대 보정(calibration) 곡선을 얻었다.
발명 5 자체가 LAL 시약에 대하여 억제 활성 또는 항진성을 가질 수 있기 때문에, 하기 식에 따라 첨가된 내독소 단위량에 상응하는 측정값으로부터 부가 수율을 얻고, 이 값을 곱함으로써 실제 측정값을 보정하였다.
{(첨가시 측정값)-(무첨가시 측정값)}/(첨가한 내독소 농도)
이렇게 얻은 발명 5의 수용액 10mg/ml 중 내독소 활성은 0.427EU/ml이었다. 즉, 발명 5의 오염된 내독소의 양은 0.0427EU/ml이었다. 따라서, 의약 제제로서 오염된 내독소량이 충분히 적은 본 발명의 글리코사미노글리칸 제제는 단지 본 발명의 제조 방법에 제조할 수 있음이 밝혀졌다.
실시예 4
피리딘 함량의 측정
본 발명의 글리코사미노글리칸에 남아있는 피리딘의 함량을 측정하였다. 즉, 발명 3(20mg)을 5N NaOH(1ml)에 첨가하고, 이 용액을 5분 동안 초음파 처리하였다. 이 용액에 1ml의 디메틸에테르를 첨가하고, 이 혼합물을 2분 동안 심하게 교반하였다. 그 후, 이 용액을 10분 동안 3,000×g에서 원심분리하여 상층(1)(유기층)과 하층(1)(수성층)으로 분리하였다. 하층(1)에 1ml의 디메틸에테르를 더 첨가하고, 이 혼합물을 심하게 교반하였다. 그 후, 이 용액을 상기와 같은 조건에서 원심분리하여 상층(2)(유기층)과 하층(2)(수성층)으로 분리하였다. 하층(2)은 버렸다. 상층(1)과 상층(2)을 합하여 2ml의 추출물(1)을 얻었다.
상기에서 얻은 추출물(1)에 400μl의 2N HCl을 첨가하고 이 혼합물을 2분 동안 심하게 교반하였다. 이 혼합물을 10분 동안 3,000×g에서 원심분리하여 상층(3)(유기층)과 하층(3)(수성층)으로 분리하였다. 상층은 버렸다. 하층(3)에 5N NaOH(800μl) 및 300μl의 디클로로메탄을 첨가한 후, 이 혼합물을 2분 동안 심하게 교반하였다. 이 혼합물을 10분 동안 3,000×g에서 원심분리하여 상층(4)(수성층)과 하층(4)(유기층)으로 분리하였다. 상층(4)은 버렸다. 하층(4) 1μl를 기체 크로마토그래피로 분석하였다.
GC-18APFSC(Shimadzu Corp.)를 기체 크로마토그래피로 사용하고, DB-5ms[φ0.25mm(I.D. 0.5μm)×30m: J＆W]를 컬럼으로 사용하였다. 헬륨을 이동상으로 사용하였다. 유속은 80℃에서 22cm/초로 설정하고 상기 컬럼을 80℃에서 1분 동안 두었다. 그 후, 컬럼 오븐의 온도를 120℃까지 분 당 10℃의 속도로 승온시키면서 용출하였다. FID(Flamed Ionized Detection)를 사용하여 300℃에서 검출을 실시하였다. 20, 40, 60, 80 및 100ppm 농도의 피리딘을 함유하는 1μl의 메탄올을 분석하여 보정 곡선을 만들었다. 보정을 위하여 발명 3의 수분 함량을 10%로 설정하였다. 발명 3에서 추출 및 잔류 피리딘 함량의 정량을 2회 실시하였다. 그 결과, 잔류 피리딘 함량의 2회 측정값은 73.1ppm, 70.3ppm이었다. 이 두 값은 의약품 중 잔류 피리딘 함량의 규정값인 200ppm보다 현저히 낮았다.
실시예 5
[13C-핵자기 공명 분광법에 의한 구조 분석]
표준 H, 발명 1~4 및 대조 3~5를13C-핵자기 공명 분광법(13C-NMR)에 의해 분석하였다[표준 H: 도 1(1), 발명 1: 도 2, 발명 2: 도 1(5), 발명 3: 도 3, 발명 4: 도 4, 대조 3: 도 1(2), 대조 4: 도 1(3), 대조 5: 도 1(4)].13C-NMR 분광분석에는 NMR 분광계 모델 QE300(GE)을 사용하였다. 각 검사 물질의 5%(w/v) 용액을 산화듀테륨 중에서 제조하였다. TSP(Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.)를 표준(0ppm)으로 사용할 때 51.66ppm의 화학적 쉬프트를 나타내는 메탄올을 내부 표준으로 사용하여 측정 온도 80℃, 펄스폭 60°, 적분수 90,000회로 측정하였다. 표준 H, 발명 1~4의 시그널의 화학적 쉬프트는 다음과 같다(표 6).
물질 글루코사민 잔기 유론산(이듀론산) 잔기
C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5
표준 H 99.4 60.5 72.4 79.1 72.2 69.1 101.9 78.7 71.8 78.8 72.0
발명 1 100.3 60.6 72.3 80.4 73.7 62.6 102.0 78.4 70.7 77.6 71.0
발명 2 100.3 60.8 72.4 80.4 73.8 62.6 102.0 77.7 70.7 78.6 71.0
발명 3 100.2 60.5 72.5 80.8 73.5 62.9 101.8 78.5 70.5 77.8 71.0
발명 4 100.2 60.7 72.3 80.8 73.4 63.0 101.7 78.5 70.6 77.9 71.2
단위: ppm
13C-NMR의 결과는 글루코사민 잔기의 C-6의 시그널은 69.1ppm(황산기를 갖는 6-위치의 탄소 원자의 시그널) 및 62.6~63.0ppm(황산기가 없는 6-위치의 탄소 원자의 시그널)에서 검출됨을 나타낸다. 하기(표 7)는 상기 시그널 강도와 시그널 강도의 비율을 사용하여 각 샘플(발명 1~4 및 대조 3~5)의 표준 H를 기준으로 6-위치가 황산화되지 않은 글루코사민 잔기의 비율(6-위치 비황산화 GlcN 비율) 및 글루코사민 잔기의 6-위치 탈황산화율(de-6S율)을 계산한 결과를 나타낸다.
검사 물질 69.1ppm에서의시그널 강도 62.6ppm에서의시그널 강도 6-위치 비황산화GlcN 비율(%) de-6S율(%)
표준 H 57.0 10.2 15.2 0(기준)
대조 3 34.5 59.6 63.3 56.7
대조 4 19.0 84.9 81.7 78.4
대조 5 7.1 80.1 91.9 90.5
발명 1 0* 94.3 100 100
발명 2 0* 93.2 100 100
발명 3 0* 90.8 100 100
발명 4 0* 62.9 100 100
주석: 0*은 측정 한계 이하의 값을 나타낸다.
이들 결과로부터 알 수 있듯이, 상기 탈황산화 조건으로 110℃에서 배양할 때 약 2시간 동안 반응시켜 거의 100%의 6-위치 탈황산화율을 얻었다.
상술한 바와 같이,13C-NMR 분광법을 사용하여 대조 1 및 대조 2를 분석하였다. 대조 1에서 각 탄소 원자의 피크 위치는 발명 1~4의 피크 위치 근처에서 검출되었지만, 발명 1~4와 표준 H에서는 관찰되지 않은 특징적인 피크가 67ppm 및 96.5~97.0ppm(연속적)에서 검출되었다(도 5). 이들 특징적인 피크가 대조 3, 대조 4 및 대조 5(발명 2의 제조에서 반응 시간을 변경하여 얻은 물질)에서는 관찰되지 않기 때문에, 대조 1은 본 발명의 글리코사미노글리칸 또는 6-위치 탈황산화 반응 시간을 변경하여 얻은 물질의 구조와는 다른 구조를 갖는 것으로 밝혀졌다.
표준 H 및 발명 1~4에서는 유론산의 3-위치의 탄소 원자의 피크가 70.0~71.0ppm의 범위에서 관찰되었지만, 대조 2에서는 관찰되지 않았다(도 6). 또한, 헤파린 구조에서 관찰되는 98.3ppm, 100ppm 및 102ppm 근처의 피크를 비교하면, 98.3ppm 근처의 피크가 가장 높았으며, 이는 차트 특성을 형성한다. 또한 이들 결과는 대조 2가 본 발명의 글리코사미노글리칸의 구조와는 다른 구조를 가짐을 나타낸다.
실시예 6
[항응혈 활성의 측정]
(1) 활성화 부분 트롬보플라스틴 타임(APTT)의 측정
검사 방법 5에 기술한 방법에 따라 표준 H, 발명 2, 대조 4 및 대조 5의 APTT를 측정하였다(표 8). 그 결과, 표준 H, 대조 4 및 대조 5에서는 APTT가 연장된 반면, 발명 2는 APTT를 연장하는데 거의 작용하지 않음이 밝혀졌다. 대조 1 및 대조 6에 대한 6-위치 탈황산화율이 대조 4와 대조 5 사이이므로, 대조 4와 대조 5 사이의 중간 항응혈 활성을 나타내는 것으로 예견되었다.
농도(μg/ml) 표준 H 대조 4 대조 5 발명 2
0.01 25 25 26 24
0.03 26 24 23 26
0.1 27 25 24 25
0.3 36 27 26 24
1 98 26 25 24
3 〉600 34 26 27
10 - 48 35 25
30 - 96 52 36
100 - 〉600 102 51
주석: -는 무측정을 나타낸다. 단위: 초
(2) 트롬빈 타임(TT)의 측정
검사 방법 6에 기술한 방법에 따라 표준 H, 발명 2, 대조 4 및 대조 5의 TT를 측정하였다(표 9). 그 결과, 표준 H, 대조 4 및 대조 5에서는 TT가 연장된 반면, 발명 2는 TT를 연장하는데 작용하지 않음이 밝혀졌다. 대조 1 및 대조 6의 6-위치 탈황산화율이 대조 4와 대조 5 사이이므로, 대조 4와 대조 5 사이의 중간 항응혈 활성을 나타내는 것으로 예견되었다.
농도(μg/ml) 표준 H 대조 4 대조 5 발명 2
0.01 17 15 15 14
0.03 34 16 15 16
0.1 37 13 16 15
0.3 75 16 16 17
1 〉600 18 17 16
3 - 23 16 16
10 - 35 17 18
30 - 385 53 16
100 - 〉600 96 17
주석: -는 무측정을 나타낸다. 단위: 초
(3) 항트롬빈 활성의 측정
검사 방법 7에 기술한 방법에 따라 표준 H, 발명 2 및 대조 1의 항트롬빈 활성을 측정하였다(표 10). 하기 결과는 발명 2의 항트롬빈 활성이 표준 H와 대조 1에 비하여 실질적으로 감소되었음을 나타낸다.
검사 물질 항트롬빈 활성(IC50, ng/ml)
표준 H 8.75
발명 2 1.22×105
대조 1 8.84×103
실시예 7
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 출혈 활성]
검사 방법 8에 기술한 방법에 따라 표준 H 및 발명 2의 출혈 활성을 측정하였다(표 11). 하기 결과는 발명 2의 출혈 활성이 완전히 상실되었음을 나타낸다.
검사 물질 반상 출혈 면적 mm2(출혈 빈도)
상처 당 0.0mg 상처 당 0.2mg 상처 당 0.4mg 상처 당 0.8mg
생리 식염수 0±0(0/7) - - -
표준 H - 179±82(7/7) 209±35(7/7) 193±56(7/7)
발명 2 - 0±0(0/7) 0±0(0/7) 0±0(0/7)
주석: -는 무측정을 나타낸다.
실시예 8
[건강한 피부의 상처에 대한 본 발명의 글리코사미노글리칸의 상처 치료 촉진 활성]
건강한 피부의 상처에 대한 본 발명의 글리코사미노글리칸의 상처 치료 촉진 활성은 건강한 쥐를 사용하여 측정하였다. 즉, 건강한 쥐의 등의 털을 깎고 φ8mm의 안과 관상톱을 사용하여 피부의 피하 영역까지 절개하였다. 안과 가위와 핀셋을 사용하여 상기 피부를 제거하여 등에 두 개의 상처를 만들었다. 그 후, 표준 H, 발명 2 또는 대조 4를 각각 0.5중량% 함유하는 오일 연고를 제조하고, 각 연고를 0.1g씩 매일 도포하여, 치료된 면적을 바탕으로 상처 치료 정도를 비교하였다. 쥐를 에테르로 마취하여 정치한 후, 일정한 초점 거리에서 상처 부위의 사진을 촬영하였다. 화상 분석 시스템을 사용하여 사진 프린트물 상에서 피부 상처 부위를 측정하였다. 각각의 치료된 면적은 상처 부위가 형성된 직후의 면적에서 각 측정시의 면적을 감하여 얻었다. Tukey의 다중 비교 검사에 의해 통계 분석을 실시하였다. 그 결과, 발명 2를 사용하여 제조된 연고를 도포한 동물군에서 현저한 피부 상처 치료-촉진 활성이 관찰되었다(도 7).
실시예 9
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 당뇨성 피부 궤양 치료-촉진 활성]
유전성 당뇨병이 있는 쥐[db/db 마우스(암컷): Japan Clare]를 사용하여 본 발명의 글리코사미노글리칸의 당뇨성 피부 궤양 치료-촉진 활성을 검사하였다. 즉, 유전성 당뇨병이 있는 마우스의 등의 털을 깎고 φ8mm의 안과 관상톱을 사용하여 피부의 피하 영역까지 절개하였다. 안과 가위와 핀셋을 사용하여 상기 피부를 제거하여 등에 두 개의 상처를 만들었다. 그 후, 1%(w/w)의 표준 H, 발명 2 또는 대조 4가 용해된 50μl의 생리 식염수를 매일 적하하여, 상처 치료 정도를 비교하였다. 쥐를 에테르로 마취하여 정치한 후, 일정한 초점 거리에서 상처 부위의 사진을 촬영하였다. 화상 분석 시스템을 사용하여 사진 프린트물 상에서 피부 상처 부위를 측정하였다. 각각의 치료된 면적은 상처 부위가 형성된 직후의 면적에서 각 측정시의 면적을 감하여 얻었다. Tukey의 다중 비교 검사에 의해 통계 분석을 실시하였다. 그 결과, 최초 7일 동안은 어떤 검사 물질에서도 현저한 차이가 관찰되지 않았지만, 발명 2는 투여 개시일로부터 11일 후에 통계학적으로 유의하게 치료를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 10
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 bFGF에 대한 친화성 측정]
세포 증식 인자에 대한 본 발명의 글리코사미노글리칸의 친화성을 측정하였다. 즉, 0.2mg의 발명 2를 100μl의 50mM 탄산수소나트륨 완충액(pH8.5)에 용해하였다. 여기에 74μg의 NHS-LC-바이오틴[숙신이미딜-6-(바이오틴아미드)-헥사노에이트, Pierce]을 함유하는 수용액을 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이어, 이 용액에 2.5배 용적의 에탄올을 첨가하고, 침전된 바이오티닐화 발명 2를 원심분리에 의해 채집하였다. 이 바이오티닐화 발명 2를 아비디닐화 센서칩(BIAcore AB, SA)에 고정하였다. 액상에 용해된 bFGF를 센서칩 표면과 접촉시킨 후, 표면 플라스몬 효과를 사용하는 두 가지 방법, 즉 친화성 및 동역학 분석 방법 및 정상 상태 분석 방법으로 발명 2와 bFGF의 상호작용을 분석하였다.
그 결과, 전자의 분석 방법에서 얻은 대조로 사용된 표준 H 및 발명 2의 회합 속도 상수(Ka)는 각각 1.3(M-1S-110-6), 1.0(M-1S-110-6)이었다. 전자의 분석 방법에서 얻은 표준 H 및 발명 2의 해리 속도 상수(Kd)는 각각 4.8(S-1103), 5.3(S-1103)이었다. 이들 결과로부터 계산된 표준 H와 발명 2의 해리 상수(KD)는 각각 4.1nM, 4.3nM이었다.
상기 후자의 분석 방법에 의해 얻은 해리 상수(KD)는 표준 H와 발명 2에 대하여 각각 23nM, 24nM이었다.
이들 결과로부터 알 수 있듯이, bFGF에 대한 발명 2의 친화도는 표준 H와 실질적으로 동일하였다.
실시예 11
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 bFGF 활성-촉진 효과의 측정(NaClO3첨가)]
검사 방법 9에 기술한 [bFGF 활성-촉진 효과의 측정 1]에 따라 발명 2의 bFGF 활성-촉진 효과를 측정하였다. 또한, 동일한 방법으로 대조 1 및 대조 2의 bFGF 활성-촉진 효과도 측정하였다. 그 결과, 발명 2는 표준 H와 동일한 정도의 bFGF 활성-촉진 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(표 12). 또한, 대조 1은 표준 H에 비하여 약 26%(즉, 발명 2의 1/4 이하)의 bFGF 활성-촉진 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이것은13C-NMR에 의해 나타난 구조 차이가 bFGF 활성-촉진 효과의 차이를 야기한다는 것을 시사한다.
물질 bFGF 활성-촉진 효과
표준 H 100
발명 2 108
대조 1 26
대조 2 61
실시예 12
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 bFGF 활성-촉진 효과의 측정 2(NaClO3무첨가)]
검사 방법 9에 기술한 [bFGF 활성-촉진 효과의 측정 2]에 따라 본 발명(발명 2)의 글리코사미노글리칸의 bFGF 활성-촉진 효과를 측정하였다. 대조 2를 비교 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 발명 2는 표준 H와 동일한 정도의 bFGF 활성-촉진 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(표 13). 또한, 대조 2의 bFGF 활성-촉진 효과는 발명 2의 절반 이하인 것으로 밝혀졌다.
물질 bFGF 활성-촉진 효과
표준 H 100
발명 2 89.9
대조 2 31.2
실시예 13
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 bFGF 활성-촉진 효과의 측정 3(NaClO3무첨가/초대 배양 세포)]
초대 배양 세포에 대한 본 발명(발명 2)의 글리코사미노글리칸의 bFGF 활성-촉진 효과를 검사 방법 9에 기술한 [bFGF 활성-촉진 효과의 측정 3]에 따라 측정하였다. 표준 H를 비교 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 발명 2는 초대 배양 세포에 대하여 표준 H의 75% bFGF 활성-촉진 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(표 14).
물질 bFGF 활성-촉진 효과
표준 H 100
발명 2 75
실시예 14
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제에 대한 친화성 측정]
호흡에서 글리콜리시스 경로의 주요 효소인 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제(이후 FPA라 함)와 본 발명의 글리코사미노글리칸 사이의 친화성은 Sasaki 등의 방법[J.Chromatogr. (1987) 400, 123-132]에 따라 제조한 친화성 겔 담체로 충전된 FPLC용 컬럼을 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 친화성 겔 담체는 다음과 같이 제조하였다. 200mg의 발명 2를 5ml의 2M 인산염 완충액(pH7.2)에 용해하고, 5g의 아미노아가로오스 겔 분말을 상기 용액에 현탁하였다. 15mg의 NaB(CN)H3을 상기 혼합물에 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 충분히 교반하여 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 커플링 생성물을 함유하는 겔을 여과시키고 물로 3회 세척하여 완전히 탈염하였다. 탈염된 겔을 5ml의 0.2M CH3COONa 용액에 현탁하고, 여기에 2.5ml의 무수 아세트산을 첨가하여 0℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 생성된 겔을 세척하여 완전히 탈염하였다.
본 발명의 글리코사미노글리칸을 고정하고 1mM EDTA와 0.5mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 10mM Tris-HCl(pH7.5)로 평형화시킨 겔 담체가 충전된 컬럼에 A4알돌라아제, C4알돌라아제 및 이들의 하이브리드형 알돌라아제의 혼합물을 로딩하였다. 두 종류의 용액[1mM EDTA와 0.5mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 15ml의 10mM Tris-HCl(pH7.5) 및 1.0M NaCl, 1mM EDTA 및 0.5mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 15ml의 10mM Tris-HCl(pH7.5)]으로 형성된 NaCl 선형 농도 구배(0~1.0M)를 사용하여 흡착된 분획물을 용출하였다. 220nm에서의 흡광도를 측정함으로써 검출을 실시하였으며, 최고의 용출 피크에 상응하는 NaCl 농도를 측정하였다.
또한, 발명 2 대신, (1) 표준 H, (2) Jaseja 등의 방법[Can. J. Chem. (1989) 67, 1449-1456]에 의해 표준 H를 부분 변성 처리하여 표준 H의 골격 구조를 구성하는 유론산 잔기의 2-위치에서 에스테르 결합을 통하여 히드록시기에 결합된 황산기를 제거하여 얻은 헤파린 유도체(이후 2ODSH라 함), 및 (3) Inoue ＆ Nagasawa의 방법[Carbohydr. Res. (1976) 46, 87-95]에 따라 표준 H를 처리하여 표준 H의 골격 구조를 구성하는 글루코사민 잔기의 2-위치에서 에스테르 결합을 통하여 아미노기에 결합된 황산기를 제거하고 이 탈황산화된 생성물을 N-아세틸화하여 얻은 헤파린 유도체(이후 NDSH라 함)를 사용하여 제조한 담체로 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 최고의 용출 피크가 얻어지는 NaCl 농도를 측정하여 친화성 정도를 비교하였다.
그 결과, FPA-활성 분획물이 표준 H가 고정된 겔 담체로부터는 약 0.37M에서 용출되었지만, 발명 2, 2ODSH 또는 NDSH가 고정된 겔 담체로부터는 0.31~0.33M에서 용출되는 것으로 밝혀졌다. 즉, 이들 물질은 표준 H와 거의 동일한 수준의 FPA 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 15
[본 발명의 글리코사미노글리칸의 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제 억제 활성의 측정]
본 발명의 글리코사미노글리칸의 FPA 억제 활성을 측정하였다. 상기 효소가 기질인 프락토오스-1,6-비스포스페이트(이후 F-1,6-P2라 함)에 작용하면, 기질을 디히드록시아세톤 포스페이트(이후 DHAP라 함)와 글리세르알데히드 3-포스페이트(GAL-3-P)로 분해한다. 상기 효소가 기질인 프락토오스-1-포스페이트(이후 F-1-P라 함)에 작용하면, 기질을 DHAP와 글리세르알데히드(GAL)로 분해한다. 따라서, F-1,6-P2와 F-1-P를 기질로 사용하고 340nm에서의 흡광도의 변화를 측정하여 NADH(환원된 니코인아미드 아데닌 디뉴클레오티드)의 양의 변화를 측정하였으며, 트리오스 포스페이트 아이소머라아제의 존재하에서 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나아제계가 커플링될 때 상기 생성된 DHAP는 글리세롤-3-포스페이트로 환원된다.
Blostein ＆ Rutter의 방법[J. Biol. Chem. (1963) 238, 3280-3285]에 따라 측정하였다. 즉, 50mM F-1,6-P2 나트륨염, 0.1M F-1-P 모노시클로헥실암모늄염, 4mg NADH 및 500μg 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나아제/트리오스포스페이트 아이소머라아제 복합 용액을 함유하는 20ml의 0.1M 글리실글리신 완충액(pH7.5)에 발명 2를 최종 농도 0.4~4μg/ml([I])로 첨가하였다. 이 반응 혼합물에 5~50μl의 FPA[소 뇌로부터 유래된 FPA의 5종의 아이소폼(isoform) 중 A4알돌라아제(A4아이소폼) 및 C4알돌라아제(C4아이소폼), 0.005~0.02유닛]를 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응 속도(v)는 25℃의 온도 조건하에서 340nm에서의 단위 시간 당 흡광도 감소로부터 계산하였다. 이 결과로부터, [I]에 대하여 l/v를 기입하고(Dixon plot), [I]의 인터셉트값으로부터 각 경우의 Ki값을 계산하였다.
FPA의 유닛(활성: 유닛)에서, 1유닛이란 25℃의 상기 반응계에서 분 당 기질 1μ몰을 절단하는 효소의 양을 뜻한다. 비활성이란 단백질 1 mg당 유닛수를 뜻한다.
상기 억제 활성 측정의 음성 대조군으로서는, 발명 2 대신 상기 실시예 14에서 기술한 2ODSH 및 NDSH, 콘드로이틴 술페이트A(Seikagaku Corporation) 및 콘드로이틴 술페이트C(Seikagaku Corporation)를 사용하여 억제 활성을 측정하였다.
그 결과, 발명 2가 FPA 억제 활성을 나타냈다(표 15). 또한, 발명 2의 억제 양상은 경합 억제인 것으로 밝혀졌다.
이들 결과는 발명 2를 강력한 FPA 활성 억제제로서 사용할 수 있으며, 예컨대 글리콜리시스 경로에서 대사항진을 억제하는 작용 때문에 말라리아 기생충의 감염을 방지하는 약제 등의 의약품으로 사용할 수 있음을 시사한다.
A4아이소폼(Ki값) C4아이소폼(Ki값)
발명 2 0.33μg/ml 2.32μg/ml
2ODSH 0.40μg/ml 2.66μg/ml
NDSH 0.54μg/ml 10.80μg/ml
콘드로이틴 술페이트A 547.3μg/ml -
콘드로이틴 술페이트C 275.8μg/ml -
주석: -는 무측정을 나타낸다.
실시예 16
[의약 조성물의 예]
(1) 주사제(용액)
발명 2(나트륨염)의 동결건조 생성물(30mg/ml)을 최종 농도 5mg/ml로 5% 만니톨 수용액에 용해하였다. 이 용액을 멸균 여과하고, 각 앰풀에 2ml의 양으로 넣어 주사제(용액)을 제조하였다.
(2) 연고
발명 2(나트륨염)의 동결건조 생성물 100mg, 미네랄 오일 4g, 바셀린 8g, 메틸파라벤/프로필파라벤 혼합물 60mg, 비이온성 계면활성제 1g 및 정제수 30g을 균일하게 혼합하고 용기에 충전하여 연고를 제조하였다.
상기 문제점을 해결하기 위하여 열심히 연구한 결과, 본 발명자들은 황산기를 갖는 헤파린과 같은 글리코사미노글리칸을 탈황산화시키는 특정 방법을 사용하여, 항응혈 및 출혈 활성은 실질적으로 제거된 반면 생리 활성 물질에 대한 친화성과 같은 생체에 생물학적으로 이로운 효능은 유지하는 신규 글리코사미노글리칸을 제조하는데 성공하였으며, 의약용의 관점에서 중요한 물질로서의 구조 동정을 쉽게 달성할 수 있을 정도로 미동정 구조가 크게 감소하였다. 이로써, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸을 피리딘 중 100℃ 이상에서 실릴화제인 N-메틸-N-(트리메틸실릴)-트리플루오로아세트아미드(이후 MTSTFA라 함)의 존재하에서 열처리하여 글루코사민 잔기로부터 6-O-황산기를 실질적으로 모두 제거한 후, 반응 혼합물로부터 피리딘을 증발시키고, 물을 가하고 감압하에서 농축하여 얻은 글리코사미노글리칸은 피부 상처의 치료 및 당뇨성 피부 궤양의 치료를 촉진시키는데 매우 효과적이며, 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제 억제 활성을 가지며, 항응혈 및 출혈 활성이 없음을 밝혀냈다.
또한, 글리코사미노글리칸 분해 효소를 이용한 글리코사미노글리칸의 우수한 소화성(digestibility) 때문에, 글리코사미노글리칸 분해 효소를 이용한 효소적 이당 분석법을 사용함으로써 상기 방법에 의해 제조된 글리코사미노글리칸의 구조를 정확히 쉽게 동정할 수 있음이 밝혀졌다. 이것은 각종 형태의 화학적 처리에 의해 변성된 변성 헤파린의 구조를 동정하는데 있어서의 종래의 어려움과는 대조적이다. 이렇게 구조가 동정된 글리코사미노글리칸을 의약품으로 사용하면 매우 안전하고 유용한 의약을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 또한 글리코사미노글리칸이 글리콜리시스(glycolysis) 경로에서 중요한 효소인 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제에 대하여 높은 친화성을 가지며, 상기 효소의 강한 억제제로서 사용될 수 있음을 밝혔다. 따라서, 신규 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제 억제제를 제공할 수 있게 되었다.
즉, 본 발명은 다음을 제공한다.
1. 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸에 있어서, 글리코사미노글리칸을 아질산으로 분해하고 p-니트로페닐히드라진과 반응시켜 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 화학적 이당 분석법에 의해 측정할 때 골격 구조에서 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않으며, 2-위치에 황산기를 갖는 유론산 잔기의 몰%(몰%는 글리코사미노글리칸을 글리코사미노글리칸 분해 효소로 소화(digest)하여 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 효소적 이당 분석법에 의해 얻은 이당 조성으로부터 계산함)가 총 유론산 잔기에 대하여 45% 이상인 글리코사미노글리칸.
2. 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며, 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸에 있어서, 글리코사미노글리칸을 글리코사미노글리칸 분해 효소로 소화하여 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 효소적 이당 분석법에 의해 얻은 글리코사미노글리칸의 이당 조성에서 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스, 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스, 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스 및 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스의 총량이 10몰% 이하이고, 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스가 1.5몰% 이하이며, 유효 이당 수율이 60% 이상인 글리코사미노글리칸.
3. 상기 2에서, 효소적 이당 분석법에 의해 얻은 이당 조성에서 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-D-글루코오스, 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-D-글루코오스, 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스 및 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스의 총량이 45몰% 이상인 글리코사미노글리칸.
4. 상기 1~3 중 어느 하나에서, 3-(트리메틸실릴)프로피온산 나트륨을 기준으로 하여, 산화듀테륨 중 5%의 글리코사미노글리칸 용액을 사용한 글리코사미노글리칸의13C-핵자기 공명 분광분석에서 66.5~67.5ppm에서 피크가 실질적으로 검출되지 않으며 100ppm과 102ppm 근처의 시그널 강도가 98.3ppm 근처의 시그널 강도보다 높은 글리코사미노글리칸.
5. 상기 1~4 중 어느 하나에서 기재된 글리코사미노글리칸(이후 본 발명의 글리코사미노글리칸이라 함)을 활성 성분으로 포함하는 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제 억제제.
6. 본 발명의 글리코사미노글리칸을 활성 성분으로 포함하는 의약 조성물.
7. 상기 6에서, 조직 상처 및 궤양에 대한 치료제인 의약 조성물.
8. 상기 6에서, 피부병에 대한 치료제인 의약 조성물.
9. 상기 8에서, 상기 피부병에 대한 치료제가 피부 상처에 대한 치료 촉진제이거나 또는 피부 궤양에 대한 치료제인 의약 조성물.
10. 하기 단계를 포함하는 본 발명의 글리코사미노글리칸의 제조 방법:
(a) 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸의 피리딘-가용성 염을 피리딘 중에서 MTSTFA의 존재하 100℃ 이상의 온도에서 가열하여, 글리코사미노글리칸을 아질산으로 분해하고 p-니트로페닐히드라진과 반응시켜 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 화학적 이당 분석법에 의해 측정할 때 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않을 정도의 충분히 오랜 시간 동안 가열하는 단계,
(b) 상기 단계(a)에서 얻은 반응 혼합물로부터 피리딘을 증발시키는 단계 및
(c) 상기 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 물을 첨가한 후, 이 혼합물을 감압하 상온에 두는 단계.
본 발명의 실시 형태를 이하 설명한다.
본 발명에서, 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸은 유론산 잔기와 글루코사민 잔기의 반복 구조의 헤파린 구조를 갖는 글리코사미노글리칸 중에서 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸이며, 헤파린, 헤파란 술페이트 및 황산화 히알루론산을 들 수 있다. 글루코사민 잔기는 또한 아세틸화 아미노기 및 황산화 아미노기를 갖는 것을 포함한다.
1. 본 발명의 글리코사미노글리칸
본 발명의 하나의 태양에 따라서, 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸에 있어서, 글리코사미노글리칸을 아질산으로 분해하고 p-니트로페닐히드라진(이후 PNP-히드라진이라 함)과 반응시켜 고속 액체 크로마토그래피(이후 HPLC라 함)로 분석하는 화학적 이당 분석법에 의해 측정할 때 골격 구조에서 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않으며, 2-위치에 황산기를 갖는 유론산 잔기의 몰%(몰%는 글리코사미노글리칸을 글리코사미노글리칸 분해 효소로 소화하여 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 효소적 이당 분석법에 의해 얻은 이당 조성으로부터 계산함)가 총 유론산 잔기에 대하여 45% 이상인 글리코사미노글리칸을 제공한다. 이 글리코사미노글리칸은 더욱 바람직하게는 하기한 바와 같이 유효 이당 수율이 60% 이상이다.
검사 방법 1에 따라 후술하는 바와 같이, 상술한 화학적 이당 분석법은 측정할 물질을 아질산으로 분해하고, 생성물을 p-니트로페닐히드라진과 반응시키고, 생성물을 HPLC로 분석하는 것을 포함하는 방법을 말한다.
글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않는다는 것은 일반적으로 상술한 화학적 이당 분석법에서 통상적인 HPLC에 의한 상기 화학적 처리로 제조된 ISMS[IdoA(2S)α1→AnMan(6S)-PNP, 식 중 AnMan(6S)-PNP는 AnMan(6S)-CH=N-NH-PNP를 의미하며 AnMan(6S)는 2,5-안히드로만노오스-6-O-술페이트를 의미함]에 대한 피크를 검출할 수 없음을 의미한다. 구체적으로, ISM[IdoA(2S)α1→4AnMan-PNP, 식 중 AnMan-PNP는 AnMan-CH=N-NH-PNP를 의미하며 AnMan은 2,5-안히드로만노오스를 의미함] 피크의 면적과 ISMS 피크의 면적으로부터 계산되는 본 발명의 글리코사미노글리칸에서 총 글루코사민 잔기에 대한 6-O-황산기를 갖지 않는 모든 글루코사민 잔기의 퍼센트를 지표로 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 95% 이상은 실질적으로 검출되지 않음을 의미하는 것으로 간주할 수 있으며, 100%가 가장 바람직하다. 항응혈 작용을 감소시키기 위하여는, 본 발명의 글리코사미노글리칸의 구조에서 6-O-황산기를 갖는 글루코사민 잔기가 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 편의상, 이후 글루코사민 잔기의 6-위치의 탈황산화율을 6-탈황산화율이라 한다.
6-탈황산화율은 실시예에서 기술한 핵자기 공명 분광법에서 얻은 시그널 강도로부터 계산할 수도 있다. 이 방법으로 얻은 결과는 상술한 화학적 이당 분석법으로 얻은 6-탈황산화율과 실질적으로 일치한다.
본 발명의 글리코사미노글리칸의 헤파린 구조에서 구성 당 잔기에 결합된 황산기의 위치와 양은 글리코사미노글리칸을 글리코사미노글리칸 분해 효소로 소화하여 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 효소적 이당 분석법(글리코사미노글리칸 분해 효소의 소화와 HPLC의 조합을 사용한 효소적 이당 분석법)에 의해 검출되는 불포화 이당류 조성(이당 조성)으로부터 계산할 수 있다.
총 유론산 잔기에 대한 2-위치에 황산기를 갖는 유론산 잔기의 몰%는 하기 일반식[2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-D-글루코오스(이후 ΔDiHS-OS라 함), 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-D-글루코오스(이후 ΔDiHS-NS라 함), 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스(이후 ΔDiHS-6S라 함), 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-D-글루코오스(이후 ΔDiHS-US라 함), 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스(이후 ΔDiHS-di(6,N)S라 함), 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-D-글루코오스(이후 ΔDiHS-di(U,N)S라 함), 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스(이후 ΔDiHS-di(U,6) S라 함) 및 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스(이후 ΔDiHS-tri(U,6,N)S라 함)의 합계(몰수)]으로 표시되는 불포화 이당류의 총량을 100%로 하여, 글리코사미노글리칸 분해 효소에 의한 소화와 HPLC의 조합을 사용한 효소적 이당 분석법에 의한 분석에서 측정한 퍼센트로 표시되는 유론산 잔기의 2-위치에 황산기를 갖는 상술한 각 불포화 이당류[ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S 및 ΔDiHS-tri(U,6,N)S의 총 (몰수)]의 비율을 의미한다. 피부병 치료를 위하여 본 발명의 글리코사미노글리칸의 높은 활성을 유지하기 위한, 상기 값은 통상 45% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상이다. 효소적 소화와 HPLC의 조합을 사용하는 상기 이당 분석법은 후술하는 검사 방법 2에 기재한 효소적 소화와 HPLC의 조합을 사용하는 효소적 이당 분석법을 의미한다.
불포화 이당 구조식에서의 치환기
R1 R2 R3
ΔDiHS-OS H COCH3 H
ΔDiHS-NS H SO3 - H
ΔDiHS-6S SO3 - COCH3 H
ΔDiHS-US H COCH3 SO3 -
ΔDiHS-di(6,N)S SO3 - SO3 - H
ΔDiHS-di(U,N)S H SO3 - SO3 -
ΔDiHS-di(U,6)S SO3 - COCH3 SO3 -
ΔDiHS-di(U,6,N)S SO3 - SO3 - SO3 -
상기 약어로 표시되는 구조는 하기와 같이 표시할 수도 있다:
ΔDiHS-OS: ΔHexA1→4GlcNAc; ΔDiHS-NS: ΔHexA1→4GlcNS;
ΔDiHS-6S: ΔHexA1→4GlcNAc(6S); ΔDiHS-US: ΔHexA(2S)1→4GlcNAc;
ΔDiHS-di(6,N)S: ΔHexA1→4GlcNS(6S);
ΔDiHS-di(U,N)S: ΔHexA(2S)1→4GlcNS;
ΔDiHS-di(U,6)S: ΔHexA(2S)1→4GlcNAc(6S);
ΔDiHS-tri(U,6,N)S: ΔHexA(2S)1→4GlcNS(6S);
상기 식에서, ΔHexA는 불포화 헥스유론산을 나타내며, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 나타내고, GlcNS는 N-황산화 글루코사민을 나타내며, 황산기의 결합 위치는 괄호 안에 나타냈다.
효소적 이당 분석법에 의해 얻은 수치는 효소적 소화 전의 글리코사미노글리칸의 황산기의 위치와 수를 반영한다. 더욱 정확한 반영을 위하여, 효소적 소화는 더욱 균일해야 하며 소화율[효소적 소화율(후술하는 검사 방법 4)]은 가능한 한 높아야 하는데, 통상 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상이어야 한다.
또한, 효소적 이당 분석법에 의해 계산되는 유효 이당 수율은 분석 대상인 글리코사미노글리칸 내에서 상기 방법으로 동정 가능한 이당 단위의 비율을 나타낸다. 구조 동정의 용이성에 대한 지표인 유효 이당 수율은 통상 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상이다.
상기 유효 이당 수율은 퍼센트로 표시되는 값이며, 상술한 이당 분석법에서 사용된 HPLC에 의해 검출된 불포화 이당류 피크의 총 면적에 대한 동정 가능한 불포화 이당류[ΔDiHS-OS, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S 및 ΔDiHS-tri(U,6,N)S] 피크의 총 면적의 비율과 효소 소화율을 곱하여 얻는다.
본 발명의 글리코사미노글리칸의 경우, 6-위치에 황산기를 갖는 글루코사민 잔기를 함유하는 불포화 이당류[ΔDiHS-6S, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S 및 ΔDiHS-tri(U,6,N)S의 합계]는 효소적 이당 분석법(이당 조성물에서)으로 분석할 때 10몰% 이하, 바람직하게는 5몰% 이하이며, ΔDiHS-tri(U,6,N)S는 1.5몰% 이하, 바람직하게는 1몰% 이하이며, 검출되지 않는 것이 더욱 바람직하다.
후술하는 표준 헤파린을 기준으로 사용하여 계산한 본 발명의 글리코사미노글리칸의 6-탈황산화율은 효소적 이당 분석법으로 분석할 때 통상 90% 이상이다.
헤파린은 각종 시토킨(예를 들면, 섬유아세포 성장인자, 간세포 성장인자, 도관 내피세포 성장인자, 형질전환 성장인자, 상피 성장인자, 미드킨, 인터루킨8, 비트로넥틴, 헤파린-결합성 뇌세포 유사분열 인자 및 헤파린-결합성 축삭돌기 과성장 촉진인자 등)과 상호작용(친화성)을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 헤파린 구조에 결합된 황산기가 이러한 상호작용에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 글리코사미노글리칸은 글루코사민 잔기의 6-O-황산기가 실질적으로 없기 때문에, 항응혈 작용, 항응혈 작용에서 주요한 역할을 하는 ATIII에 대한 친화성 및 출혈 작용이 사라지더라도, 상술한 시토킨과 헤파린의 상호작용(친화성)은 유지된다. 따라서, 본 발명의 글리코사미노글리칸에서 친화성을 유지하기 위하여, 2-위치에 아미노기에 결합된 황산기를 갖는 글루코사민 잔기를 갖는 불포화 이당류[ΔDiHS-NS, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S 및 ΔDiHS-tri(U,6,N)S의 합계]의 몰%는 상술한 효소적 이당 분석법을 사용하여 얻은 불포화 이당류의 조성물(이당 조성물)에서 65몰% 이상, 더욱 바람직하게는 75몰% 이상이다. 상술한 바와 같이, 총 유론산 잔기에 대한 2-O-황산기를 갖는 유론산 잔기의 몰%는 통상 45% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 60% 이상이다.
또한, 시토킨에 대한 친화성을 유지하기 위하여, 산화듀테륨 용액을 사용한13C-핵자기 공명(NMR) 분광법에 의한 구조 분석(하기 실시예 3에서 기술함)에서 3-(트리메틸실릴)프로피온산 나트륨(이후 TSP로 약칭함)이 기준(0ppm)으로 사용될 때, 70.0~71.0ppm에서 피크가 관찰되지만 66.5~67.5ppm에서는 피크가 실질적으로 관찰되지 않은 것이 바람직하며, 98.3ppm, 100ppm 및 102ppm 근처의 시그널 강도를 비교할 때 100ppm과 102ppm 근처의 두 시그널 강도가 98.3ppm 근처의 시그널 강도보다 높은 것이 더욱 바람직하다. 본 발명의 글리코사미노글리칸의 가장 바람직한 실시 형태 중 하나는 상술한 특징 이외에 96.5~97.0ppm 영역에서 연속적인 피크가 관찰되지 않는 것이다.
본 발명의 글리코사미노글리칸은 상술한 시토킨의 촉진 활성, 특히 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 활성(세포 증식-촉진 활성)에 대하여 높은 활성을 갖는 것이 바람직하며, NaClO3을 사용하여 세포 증식이 억제된 배양 세포에 대하여 bFGF 활성-촉진 활성을 측정하는 bFGF 활성-촉진 활성 측정법(실시예에서 검사 방법 9의 bFGF 활성-촉진 활성에 대한 측정 1 참조)으로 측정할 때 표준 헤파린 또는 시판중인 헤파린의 bFGF 활성-촉진 활성의 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상에 상당하는 bFGF 활성을 촉진시키는 활성을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 글리코사미노글리칸은 NaClO3을 사용하지 않고 배양된 배양 세포에 대하여 bFGF 활성-촉진 활성을 측정하는 bFGF 활성-촉진 활성 측정법(실시예에서 검사 방법 9의 bFGF 활성-촉진 활성에 대한 측정 2 참조)으로 측정할 때 표준 헤파린 또는 시판중인 헤파린의 bFGF 활성-촉진 활성의 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상에 상당하는 bFGF 활성을 촉진시키는 활성을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 글리코사미노글리칸에서 항응혈 활성과 출혈 활성과 크게 관련있는 헤파린 골격 구조의 고황산화 영역(황산화 클러스터)은 상술한 이당 분석법에 의해 ΔDiHS-tri(U,6,N)S로서 검출되므로, 상술한 효소적 이당 분석법에 의해 측정할 때 불포화 이당류의 조성물(이당 조성물)에서 ΔDiHS-tri(U,6,N)S는 1.5몰% 이하, 바람직하게는 1몰%, 가장 바람직하게는 검출되지 않아야 한다. 본 발명의 글리코사미노글리칸은 항응혈 활성과 출혈 활성을 실질적으로 상실하였다.
본 발명의 글리코사미노글리칸은 평균 분자량이 겔여과를 사용하여 측정할 때 바람직하게는 3,000~30,000, 더욱 바람직하게는 5,000~20,000, 가장 바람직하게는 7,000~16,000이지만, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 글리코사미노글리칸은 항응혈 활성과 출혈 활성을 실질적으로 상실하였다. 즉, 활성화 부분 트롬보플라스틴 타임(activated partial thromboplastin time, 이후 APTT로 약칭함)과 트롬빈 타임(thrombin time, 이후 TT로 약칭함)을 APTT와 TT 측정법(검사 방법 5 및 6)으로 본 발명의 글리코사미노글리칸을 반응 혼합물에 최종 농도 30μg/ml로 첨가하여 측정하면, APTT는 50초를 초과하지 않으며, 최종 농도 100μg/ml로 첨가하여 측정하면 TT는 50초를 초과하지 않는다.
또한, 소 ATIII를 사용한 항트롬빈 활성의 측정에서(예를 들면, 하기 검사 방법(검사 방법 7) 등에서 [항트롬빈 활성의 측정 방법]에서 기술하는 방법), 50% 억제(IC50)를 제공하는 농도는 바람직하게는 50μg/ml, 더욱 바람직하게는 100μg/ml이다.
본 발명의 글리코사미노글리칸은 상술한 바와 같이, 항응혈 활성과 출혈 활성을 실질적으로 상실하였고, 후술하는 실시예에서 알 수 있는 바와 같이 우수한 상처 치료 촉진 활성 및 피부 궤양 치료 활성을 갖기 때문에, 의약품의 활성 성분으로서 유용하다.
본 발명의 글리코사미노글리칸은 유리 형태로 사용할 수도 있지만, 의약적으로 허용가능한 염으로서 얻는 것이 바람직하다. 이러한 염의 예로는 나트륨염 및 칼륨염과 같은 알칼리 금속염, 마그네슘염 및 칼슘염과 같은 알칼리 토금속염, 암모늄염, 트리부틸아민염과 같은 아민염 등으로부터 선택된 의약적으로 허용가능한 염을 들 수 있지만, 알칼리 금속염 특히 나트륨염이 바람직하다.
2. 본 발명의 억제제
본 발명의 억제제는 활성 성분으로서 본 발명의 글리코사미노글리칸을 함유하는 것을 특징으로 하는 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제 억제제이다.
본 발명의 억제제의 활성 성분으로서 사용할 수 있는 상술한 본 발명의 글리코사미노글리칸은 글리콜리시스 효소의 반응 속도를 조절하는 효소로서 알려진 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제(이후 FPA로 약칭함)에 대하여 높은 친화성을 나타내며, 상기 효소의 반응을 억제하는 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 글리코사미노글리칸은 전체 글리콜리시스 경로를 억제할 수 있으며, 따라서 글리콜리시스 억제제, 특히 FPA 억제제의 활성 성분으로서 사용할 수 있다.
하기 실시예에서 나타낸 바와 같이, (1) 본 발명의 임의의 글리코사미노글리칸, (2) 에스테르 결합을 통하여 헤파린의 유론산 잔기의 2-위치의 히드록시기에 결합된 황산기(2ODSH)만이 제거된 헤파린에 상당하는 유도체, 및 (3) 아미드 결합을 거쳐 헤파린의 글루코사민 잔기의 2-위치의 아미노기에 결합된 황산기(NDSH)만이 제거된 헤파린에 상당하는 유도체는 FPA에 대한 친화성을 나타냈으며 FPA의 활성을 억제한다. 이들 결과는 헤파린이 FPA를 억제하는데 최고의 활성을 나타낸다는 것을 나타내지만, (1), (2) 및 (3)의 물질 중에서 본 발명의 글리코사미노글리칸이 가장 높은 FPA 억제 활성을 나타내며, 유도체(2)가 두번째로 높은 억제 활성을 나타내고, 유도체(3)가 가장 약한 억제 활성을 나타냈다. 따라서, 이들 실험 결과는 헤파린 구조에서 글루코사민 잔기의 2-위치의 아미노기에 황산기를 갖는 것이 가장 중요하며, FPA 활성을 위하여 헤파린 구조에서 유론산 잔기의 2-위치의 히드록시기에 결합된 황산기를 갖는 것이 두번째로 중요하고, 가장 관련이 적은 황산기는 에스테르 결합을 거쳐 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기임을 나타낸다. 본 발명은 이러한 결과를 바탕으로 완성하였으며, 본 발명의 억제제는 헤파린에 비하여 높은 FPA 억제 활성을 가지며 출혈 활성 등의 헤파린에 의해 나타나는 부작용이 감소된 본 발명의 글리코사미노글리칸을 활성 성분으로서 함유하는 FPA 억제제이다.
FPA 억제제의 활성 성분으로서 사용되는 본 발명의 글리코사미노글리칸은 2-위치의 아미노기가 황산화된 글루코사민 잔기를 글리코사미노글리칸의 골격 구조를 구성하는 글루코사민 잔기의 총량에 대하여 40몰% 이상 함유하는 것이 바람직하다. 더욱 구체적으로는, 상술한 효소적 이당 분석법에서(이당 조성물), 2-위치에 황산기를 갖는 글루코사민 잔기를 함유하는 불포화 이당류[ΔDiHS-NS, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-tri(U,6,N)S]의 몰%는 바람직하게는 40몰% 이상, 더욱 바람직하게는 50몰% 이상이다. 또한, FPA 억제제의 활성 성분으로서 사용되는 본 발명의 글리코사미노글리칸은 2-위치의 히드록시기가 황산화된 유론산 잔기를 글리코사미노글리칸의 골격 구조를 구성하는 유론산 잔기의 총량에 대하여 45몰% 이상 함유하는 것이 바람직하다. 더욱 구체적으로는, 상술한 효소적 이당 분석법에서(이당 조성물), 2-위치에 황산기를 갖는[ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(U,6)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-tri(U,6,N)S] 유론산 잔기의 몰%는 통상 45몰% 이상, 바람직하게는 50몰% 이상이다.
FPA 억제제의 활성 성분으로서 사용되는 본 발명의 글리코사미노글리칸은 소 뇌 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제의 이소 효소(isozyme) A4와 C4에 대하여 각각 0.4μg/ml 이하, 2.5μg/ml 이하의 Ki값(하기 실시예 15에서 기술한 조건하에서 측정함)을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 억제제는 글리콜리시스 경로의 대사항진(hypermetabolism)에 수반하는 질병 또는 질환의 예방 및 치료제로서 사용할 수 있다. 글리콜리시스 경로의 대사항진에 수반하는 상기 질병 또는 질환의 예로는 말라리아 기생충의 감염 등을 들 수 있으며, 본 발명의 억제제를 함유하는 의약품은 이러한 질병 또는 질환에 대한 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는 것으로 생각된다.
3. 본 발명의 의약 조성물
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 글리코사미노글리칸을 활성 성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
상술한 본 발명의 글리코사미노글리칸은 부작용으로 문제를 야기하는 것으로 생각되는 항응혈 활성과 출혈 활성이 실질적으로 없기 때문에, 의약품으로서 생체에 투여할 수 있다.
본 발명의 글리코사미노글리칸이 갖는 생리 활성 중에는 조직 상처 또는 궤양 치료를 촉진시키는 활성이 특히 현저하며, 본 발명의 글리코사미노글리칸은 조직의 상처 및 궤양의 치료제(예방제)로서 사용할 수 있다. 상술한 조직으로는 피부와 같은 상피 조직, 각막 및 비강 점막 및 구강 점막을 포함하는 점막, 연골 및 뼈와 같은 결합 조직 및 신경 조직뿐 아니라, 소화관 및 혈관 조직 등을 들 수 있다. 상처로는 상술한 조직에서 발생하는 질환(예를 들면, 외부의 힘에 의한 부상, 화상 등)을 들 수 있다. 이 중에서, 본 발명의 의약 조성물의 바람직한 실시 형태는 특히 피부에 생긴 상처 또는 궤양의 치료 촉진제(피부 질병 치료제)이며, 본 발명의 의약 조성물의 가장 바람직한 실시 형태는 피부 상처의 치료 촉진제 및 피부 궤양의 치료제이다. 상술한 피부 궤양으로는 일반적인 궤양 이외에 예를 들면, 다리 궤양(lower extremity ulcer) 및 욕창과 같은 고질적인 피부 궤양(당뇨성 피부 궤양도 포함)을 들 수 있다.
본 발명의 글리코사미노글리칸은 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이 bFGF에 대하여 높은 친화성을 나타내고 그 활성을 촉진하는 활성이 높기 때문에, 본 발명의 의약 조성물은 상기 실시 형태 이외에 bFGF와 관련된 것으로 보이는 질환 및 질병의 치료에 적용하고자 하는 실시 형태에도 사용할 수 있으며, 공지된 변성 헤파린을 함유하는 의약품과 비교하여 더욱 우수한 효과를 나타낸다. 이러한 질환 및 질병의 예로는 치주 질환, 레스테노시스, 암, 신혈관 신생과 관련된 질병(증식성 망막염, 류마티스성 관절염, 건선 등), 허혈성 재관류 질환, 염증, 각종 순환기 질병 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 억제제에 대하여 설명한 바와 같이, 본 발명의 글리코사미노글리칸이 FPA 억제 활성을 갖기 때문에, 글리콜리시스 경로의 대사항진에 수반하는 질병의 치료 및 예방제로서 사용할 수 있다.
따라서, 피부 질병을 치료할 수 있으며 글리콜리시스 경로의 대사항진에 수반하는 질병도 본 발명에 따른 유효량의 글리코사미노글리칸을 피부 질병의 치료 또는 글리콜리시스 경로의 대사항진에 수반하는 질병의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에 투여함으로써 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물을 생체에 투여할 때 사용되는 투여 형태 및 투여 경로는 대상 질병의 특성 및 심각성에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 글리코사미노글리칸은 그대로 비경구 또는 경구 투여할 수 있으며, 또는 기타 의약적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 등을 함유하는 의약 조성물의 형태(예를 들면, 용액, 현탁액, 연고, 고약, 로션, 반죽, 도찰제 및 패치와 같은 제제, 주사액, 좌약, 정제, 캡슐 등)로 항온 동물(예를 들면, 인간, 마우스, 쥐, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 말 등)에 투여할 수 있다.
본 발명의 글리코사미노글리칸을 피부 질병에 대한 치료제로서 사용할 때는 비경구 투여가 특히 바람직하며, 상기 투여에 적합한 투여 형태는 상술한 외부 제제물을 들 수 있다. 투여 방법으로서는 적하, 도포, 플래스터링(plastering) 등을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
조성물 중 본 발명의 글리코사미노글리칸의 배합량 및 투여량은 제제의 투여 계획, 투여 형태, 환자의 상태, 환자의 체중 등에 따라 개별적으로 결정해야 하며, 특별히 한정할 수 없다. 그러나, 본 발명의 글리코사미노글리칸의 투여량은 예를 들면, 통상 약 100μg/kg/day~약 100mg/kg/day이다. 제제의 투여 회수는 1일 1회이거나, 1일 2~4회 이상이어도 좋다.
본 발명의 의약 조성물에 첨가하는 본 발명의 글리코사미노글리칸의 양은 조성물의 투여 형태에 따라 다르다. 예를 들면, 조성물 당 약 10μg~50mg이지만, 투여 형태, 환자의 상태 등에 따라 적절히 조절해야 한다.
마우스(암수)의 급성 독성 검사에서 측정한 정상 헤파린의 LD50(50% lethal dose)은 경구 투여인 경우 5,000mg/kg 이상, 피하 또는 복막내 투여인 경우 2,500mg/kg 이상, 정맥 주사인 경우 1,000mg/kg 이상인 것으로 공지되어 있으며, 현재 의약(항응혈제)으로서 일반적으로 사용되고 있다. 따라서, 그 안정성은 이미 확립되어 있다.
한편, 본 발명의 의약 조성물에 사용되는 본 발명의 글리코사미노글리칸은 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 유전성 당뇨가 있는 정상 쥐와 마우스에 투여하였을 때 사망하지 않았다. 또한, 본 발명의 글리코사미노글리칸은 헤파린을 원료로 제조한 물질이며, 헤파린에 비하여 매우 감소된 항응혈 활성과 출혈 활성을 나타내거나 이들 활성이 실질적으로 상실되었다. 따라서, 본 발명의 글리코사미노글리칸을 함유하는 본 발명의 의약 조성물은 항온 동물에 매우 안전하다고 할 수 있다.
4. 본 발명의 제조 방법
본 발명의 제조 방법은 상술한 본 발명의 글리코사미노글리칸을 제조하는 방법이며, 하기 단계를 포함한다:
(a) 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸의 피리딘-가용성 염을 피리딘 중에서 MTSTFA의 존재하에 100℃ 이상의 온도로 가열하여, 효소적 이당 분석법에 의해 측정할 때 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않을 정도의 충분히 오랜 시간 동안 가열하는 단계,
(b) 상기 단계(a)에서 얻은 반응 혼합물로부터 피리딘을 증발시키는 단계 및
(c) 상기 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 물을 첨가한 후, 이 혼합물을 감압하 상온에 두는 단계.
본 발명의 제조 방법의 실시예를 이하에서 설명한다.
(a) 피리딘 중에서 MTSTFA의 존재하 100℃ 이상의 온도로 헤파린의 피리딘-가용성 염의 가열 단계
본 발명의 제조 방법에서 사용된 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸의 피리딘-가용성 염은 헤파린의 피리디늄염이 바람직하며, 헤파린의 피리딘-가용성 염이라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 헤파린의 피리디늄염은 예를 들면, 헤파린의 나트륨염을 증류수로 평형화하여 유리형으로 전환된 양이온 교환 컬럼[예를 들면, Amberlite IR-120B(H+형) 수지(ORGANO CORP.제조)로 충전된 컬럼]에 통과시키고, 그 결과 얻어진 산성 분획물에 과량의 피리딘을 첨가하여 pH를 5~7, 바람직하게는 5.5~6.5로 조정하고, 상기 분획물을 동결건조하였다. 시판중인 헤파린 피리디늄염을 사용해도 좋다.
상술한 헤파린의 피리딘-가용성 염을 MTSTFA의 존재하 피리딘 중에서 반응시킨다. 이 반응에 사용하는 MTSTFA는 통상 헤파린의 피리딘-가용성 염의 6~12배 용적(w/w), 바람직하게는 8~11배 용적(w/w)의 양으로 첨가한다. 이 반응에 사용하는 피리딘의 양은 바람직하게는 헤파린의 피리딘-가용성 염의 5~150배 용적(v/w), 더욱 바람직하게는 10~120배 용적(v/w), 가장 바람직하게는 15~110배 용적(v/w)이지만, 이들 양에 한정되지는 않는다.
상기 반응의 반응 온도는 바람직하게는 100~115℃, 가장 바람직하게는 108~112℃이다. 화학적 이당 분석법에서 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않을 정도의 충분히 오랜 시간이란 상술한 바람직한 온도 범위로 온도가 유지될 때 바람직하게는 90~150분, 가장 바람직하게는 100~130분이다. 또한, 상술한 온도를 예를 들면, 10~20분, 25~35분, 또는 50~70분 동안 유지함으로써, 각각 약 50%, 약 70%, 또는 약 90%의 6-탈황산화율을 갖는 글리코사미노글리칸을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 제조 방법에서, 상술한 바와 같이 반응 시간을 조절함으로써 6-탈황산화율을 정확히 조절할 수 있다.
상기 반응의 완료 후, 상기 반응 혼합물을 냉각시킴으로써 반응을 중지시키는 것이 바람직하다. 상기 냉각은 예를 들면, 반응 혼합물을 함유하는 용기를 실온에 두거나, 유수 또는 얼음을 사용하여 실시할 수 있다. 냉각 방법에 특별히 제한은 없지만, 얼음 냉각이 바람직하다.
(b) 피리딘의 증발 단계
냉각된 반응 혼합물로부터 피리딘을 증발시킨다. 유기 용매를 증발시키는 임의의 공지된 방법으로 피리딘을 증발시킬 수 있지만, 조작이 용이하기 때문에 감압하 25~37℃에서 증발기를 사용하여 실시하는 것이 바람직하다. 증발에 의해 반응 혼합물이 농축된다. 반응 혼합물의 농축 정도는 바람직하게는 반응 혼합물의 7~25배, 가장 바람직하게는 8~20배이다.
감압이란 통상 10-2~10-4토르의 압력을 의미한다.
(c) 물의 첨가 및 감압하 상온에 두는 단계
피리딘의 증발을 통하여 농축된 반응 혼합물에 물을 첨가하여 히드록시기에 결합된 MTSTFA를 분해하여 MTSTFA를 유리시킨다. 첨가하는 물의 양은 바람직하게는 농축된 반응 혼합물의 1.5~3배, 가장 바람직하게는 1.8~2.5배이다. 상기와 같이 농축된 반응 혼합물에 물을 첨가하면, 반응 혼합물에 백색의 탁도가 발생한다. 이 백색 탁도를 제거하기 위하여, 물이 첨가된 농축 반응 혼합물을 감압하 상온에 둔다. 감압하 상온은 증발기를 사용하여 실현할 수 있으며, 감압 상태는 백색 탁도가 사라질 때까지 25~37℃로 유지하는 것이 바람직하다. 감압은 통상 5~10분 동안 유지한다. 감압은 상술한 감압과 같이 10-2~10-4토르의 압력이 바람직하며, 이것은 바람직하게는 감압에 의해 농축 반응 혼합물이 끓는 압력이다.
(d) 기타 단계
상기 단계(c)의 처리 후, MTSTFA의 분해 생성물과 유기 용매는 반응 혼합물로부터 제거하는 것이 바람직하다. 이를 위하여, 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 투석, 에탄올 침전, 양이온 교환 컬럼 등을 사용하는 방법을 들 수 있다.
투석을 사용할 때, 단지 유수 또는 유수와 증류수의 조합을 투석의 외부 액체로 사용할 수 있다. 유수를 사용하여 투석할 때, 투석은 통상 적어도 24시간, 바람직하게는 적어도 40시간, 가장 바람직하게는 48시간 동안 실시한다. 유수와 증류수의 조합을 사용하여 투석을 실시할 때는, 반응 혼합물을 유수에서 투석한 후, 증류수에서 투석할 수 있다. 상술한 바와 같이 유수에서 투석을 실시한 후, 증류수에서의 투석은 통상 적어도 1시간, 바람직하게는 1.5~2.5시간 동안 실시한다.
MTSTFA의 분해 생성물과 유기 용매가 제거된 반응 혼합물로부터 글리코사미노글리칸을 침전시키는 일반적인 방법으로 본 발명의 글리코사미노글리칸을 염의 형태로 얻을 수 있다.
본 발명의 글리코사미노글리칸을 염으로서 얻는 방법으로는 예를 들면, 증류수로 평형화된 양이온 교환 컬럼[예를 들면, Amberlite IR-120B(H+형) 수지(ORGANO CORP.제조)로 충전된 컬럼]을 사용하여 투석으로부터 얻은 내부 용액을 분획하여 산성 분획물을 수집하고, 알칼리 수용액(예를 들면, 수성 수산화나트륨, 수성 수산화칼륨, 수성 수산화마그네슘 및 수성 수산화칼슘과 같은 수성 수산화알칼리금속 또는 수산화알칼리토금속, 바람직한 농도 0.1~2N)을 첨가하여 상기 산성 분획물의 pH를 8~10, 바람직하게는 8.5~9.5로 조정하고, 이 분획물을 유수로 통상 적어도 15시간, 바람직하게는 약 18시간 동안 투석한 후, 증류수로 통상 1.5~2.5시간 동안 투석하고, 투석으로부터 얻은 내부 용액을 동결 건조시키는 것을 포함하는 방법을 들 수 있다. 이 방법에 의해, 본 발명의 글리코사미노글리칸의 동결 건조된 생성물을 얻을 수 있다.??
글루코사민 잔기의 2-위치와 유론산 잔기의 2-위치의 황산화 정도가 다른 본 발명의 글리코사미노글리칸의 변성물은 골격 구조를 구성하는 글루코사민 잔기의 2-위치의 아미노기 또는 유론산 잔기의 2-위치의 히드록시기를 황산화하는 방법 및 골격 구조를 구성하는 유론산 잔기의 2-위치에서 황산기를 제거하는 방법을 적절히 조합 사용하여 필요로 하는 본 발명의 글리코사미노글리칸의 황산화도를 변화시킴으로써 제조할 수 있다.
글루코사민 잔기의 2-위치의 아미노기를 황산화하는 방법으로서는 예를 들면, 변형된 Nagasawa 등의 방법[Carbohydr.Res.,(1989) 193, 165-172]을 들 수 있다. 즉, 본 발명의 글리코사미노글리칸 또는 그 염을 약 pH9~10의 알칼리 용액(예를 들면, 탄산나트륨 용액, 수산화나트륨 용액, 수산화칼륨 용액 등)에 용해하고, 고형 트리메틸암모늄 술포네이트 또는 트리에틸암모늄 술포네이트를 50~55℃에서 6~24시간 동안 부수적으로 첨가한다.
또한, 유론산 잔기의 2-위치의 히드록시기를 황산화하는 방법으로서는 예를 들면, 상술한 방법과 동일한 방법인 변형된 Nagasawa 등의 방법[Carbohydr.Res.,(1989) 193, 165-172]을 들 수 있다. 즉, 본 발명의 글리코사미노글리칸을 통상적인 방법으로 염 교환에 의해 트리부틸암모늄염으로 만들고, 얻어진 본 발명의 글리코사미노글리칸의 트리부틸암모늄염을 N,N-디메틸포름아미드에 완전히 용해시켜 5~20몰 당량/(유리 히드록시기 몰)의 황산화 피리딘과 -10~0℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 그러나, 이 방법에서, 유론산 잔기의 2-위치의 히드록시기의 황산화와 함께, 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기도 또한 황산화된다. 따라서, 이 방법을 사용할 때, 생성물을 다시 본 발명의 글리코사미노글리칸을 제조하는 방법으로 처리하여 글루코사민 잔기의 6-위치의 황산기를 제거시키는 것이 바람직하다.
유론산 잔기의 2-위치의 황산기를 제거시키는 방법으로서는 예를 들면, 부분적으로 변형된 Jaseja 등의 방법[Can.J.Chem. (1989) 67, 1449-1456]을 들 수 있다. 즉, 본 발명의 글리코사미노글리칸의 나트륨염을 NaOH 용액에 용해하고, 즉시 동결 건조시킨다. 여기서 얻어진 동결 건조된 분말을 증류수에 용해하고 아세트산을 첨가하여 pH6~8, 바람직하게는 pH6.5~7.5로 조정한다. 그 후, 이 용액을 투석 및 동결 건조시킨다.
본 발명의 글리코사미노글리칸의 제제는 오염된 내독소(endotoxin)를 적게 함유하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 글리코사미노글리칸의 제제 1mg에 함유된 상기 오염된 내독소(내독소 활성)의 양은 바람직하게는 0.2USP 내독소 단위(EU) 이하, 더욱 바람직하게는 0.1Eu 이하, 가장 바람직하게는 0.05Eu 이하이지만, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 글리코사미노글리칸의 제제는 본 발명의 글리코사미노글리칸의 제제가 의약품의 원료로 사용될 때 안전을 위하여 잔류 피리딘 함량이 바람직하게는 200ppm 이하, 더욱 바람직하게는 150ppm 이하, 가장 바람직하게는 100ppm 이하이다. 일본 약전에 따르면, 의약 제제 중 잔류 피리딘 함량을 200ppm 이하로 규정하고 있다.
본 발명은 종래의 변성 헤파린에 비하여 매우 용이하게 동정할 수 있는 구조를 가지며, 생체에 대한 활성이 우수하고, 항응혈 활성 및 출혈 활성이 없는 신규 글리코사미노글리칸을 제공한다. 또한, 본 발명은 생체에 대한 글리코사미노글리칸의 활성을 이용하는 의약품을 제공한다.

Claims (10)

  1. 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸에 있어서, 글리코사미노글리칸을 아질산으로 분해하고 p-니트로페닐히드라진과 반응시켜 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 화학적 이당 분석법에 의해 측정할 때 골격 구조에서 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않으며, 2-위치에 황산기를 갖는 유론산 잔기의 몰%(몰%는 글리코사미노글리칸을 글리코사미노글리칸 분해 효소로 소화하여 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 효소적 이당 분석법에 의해 얻은 이당 조성으로부터 계산함)가 총 유론산 잔기에 대하여 45% 이상인 글리코사미노글리칸.
  2. 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며, 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸에 있어서, 글리코사미노글리칸을 글리코사미노글리칸 분해 효소로 소화하여 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 효소적 이당 분석법에 의해 얻은 글리코사미노글리칸의 이당 조성에서 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스, 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스, 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스 및 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스의 총량이 10몰% 이하이고, 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포- α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스가 1.5몰% 이하이며, 유효 이당 수율이 60% 이상인 글리코사미노글리칸.
  3. 제2항에 있어서,
    효소적 이당 분석법에 의해 얻은 이당 조성에서 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-D-글루코오스, 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-D-글루코오스, 2-아세트아미도-2-데옥시-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스 및 2-데옥시-2-술파미노-4-O-(4-데옥시-2-O-술포-α-L-트레오-헥스-4-에노피라노실유론산)-6-O-술포-D-글루코오스의 총량이 45몰% 이상인 글리코사미노글리칸.
  4. 제1항~3항 중 어느 한 항에 있어서,
    3-(트리메틸실릴)프로피온산 나트륨을 기준으로 하여, 산화듀테륨 중 5%의 글리코사미노글리칸 용액을 사용한 글리코사미노글리칸의13C-핵자기 공명 분광분석에서 66.5~67.5ppm에서 피크가 실질적으로 검출되지 않으며 100ppm과 102ppm 근처의 시그널 강도가 98.3ppm 근처의 시그널 강도보다 높은 글리코사미노글리칸.
  5. 제1항~4항 중 어느 한 항 기재의 글리코사미노글리칸을 활성 성분으로 포함하는 프락토오스-1,6-비스포스페이트 알돌라아제 억제제.
  6. 제1항~4항 중 어느 한 항 기재의 글리코사미노글리칸을 활성 성분으로 포함하는 의약 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    조직 상처 및 궤양에 대한 치료제인 의약 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    피부병에 대한 치료제인 의약 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 피부병에 대한 치료제가 피부 상처에 대한 치료 촉진제이거나 또는 피부 궤양에 대한 치료제인 의약 조성물.
  10. 하기 단계를 포함하는, 제1항~4항 중 어느 한 항 기재의 글리코사미노글리칸의 제조 방법:
    (a) 유론산 잔기와 글루코사민 잔기를 갖는 반복 이당으로 된 골격 구조를 가지며 황산기를 갖는 글리코사미노글리칸의 피리딘-가용성 염을 피리딘 중에서 N-메틸-N-트리메틸실릴트리플루오로아세트아미드의 존재하 100℃ 이상의 온도에서 가열하여, 글리코사미노글리칸을 아질산으로 분해하고 p-니트로페닐히드라진과 반응시켜 고속 액체 크로마토그래피로 분석하는 화학적 이당 분석법에 의해 측정할 때 글루코사민 잔기의 6-위치의 히드록시기에 결합된 황산기가 실질적으로 검출되지 않을 정도의 충분히 오랜 시간 동안 가열하는 단계,
    (b) 상기 단계(a)에서 얻은 반응 혼합물로부터 피리딘을 증발시키는 단계 및
    (c) 상기 단계(b)에서 얻은 반응 혼합물에 물을 첨가한 후, 이 혼합물을 감압하 상온에 두는 단계.
KR1020007003403A 1998-07-31 1999-08-02 신규 글리코사미노글리칸 및 이를 함유하는 의약 조성물 KR20010030803A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP98-217051 1998-07-31
JP21705198 1998-07-31
JP24638798 1998-08-31
JP98-246387 1998-08-31
PCT/JP1999/004155 WO2000006608A1 (fr) 1998-07-31 1999-08-02 Nouveau glycosaminoglycan et compositions medicamenteuses le contenant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010030803A true KR20010030803A (ko) 2001-04-16

Family

ID=26521784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007003403A KR20010030803A (ko) 1998-07-31 1999-08-02 신규 글리코사미노글리칸 및 이를 함유하는 의약 조성물

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6492503B1 (ko)
EP (1) EP1022289B1 (ko)
JP (2) JP4575595B2 (ko)
KR (1) KR20010030803A (ko)
CN (1) CN1286699A (ko)
AT (1) ATE270677T1 (ko)
AU (1) AU4933099A (ko)
CA (1) CA2305619C (ko)
DE (1) DE69918523T2 (ko)
WO (1) WO2000006608A1 (ko)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2814463B1 (fr) 2000-09-22 2002-11-15 Sanofi Synthelabo Nouveaux polysaccharides a activite antithrombotique comprenant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un derive de la biotine
US7575886B2 (en) * 2002-03-11 2009-08-18 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Analysis of sulfated polysaccharides
DE10214507A1 (de) * 2002-04-02 2003-10-16 Beiersdorf Ag Verwendung von Acarbose und deren Derivaten zur Behandlung und Prophylaxe degenerativer Hautzustände
US8508508B2 (en) 2003-02-14 2013-08-13 Next Holdings Limited Touch screen signal processing with single-point calibration
US7629967B2 (en) 2003-02-14 2009-12-08 Next Holdings Limited Touch screen signal processing
US8456447B2 (en) 2003-02-14 2013-06-04 Next Holdings Limited Touch screen signal processing
EP2340856B2 (de) * 2003-05-24 2017-11-15 La Prairie Group AG Kosmetische oder dermatologische Zubereitung umfassend eine Nährmedienphase
DE602004027055D1 (de) 2003-09-12 2010-06-17 Seikagaku Kogyo Co Ltd Polysaccharid-pseudoschwamm
KR100577075B1 (ko) * 2004-06-16 2006-05-08 주식회사 티앤라이프시스템 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산정제방법
EP2287205A3 (en) 2004-09-15 2012-08-01 Seikagaku Corporation Photoreactive polysaccharide. photocrosslinked polysaccharide products, the method of making them and medical materials made therefrom
US7659260B2 (en) * 2005-01-14 2010-02-09 Eddie Francis Kadrmas Tamponade compositions and methods for retinal repair
US9139876B1 (en) 2007-05-03 2015-09-22 Momenta Pharmacueticals, Inc. Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin
US8432377B2 (en) 2007-08-30 2013-04-30 Next Holdings Limited Optical touchscreen with improved illumination
AU2009231634B2 (en) 2008-04-04 2014-05-15 University Of Utah Research Foundation Alkylated semi-synthetic glycosaminoglycosan ethers, and methods for making and using thereof
WO2011090948A1 (en) * 2010-01-19 2011-07-28 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating heparin preparations
WO2012115952A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluating heparin preparations
WO2012129461A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 University Of Utah Research Foundation Methods for treating or preventing urological inflammation
JP5263349B2 (ja) * 2011-08-08 2013-08-14 生化学工業株式会社 生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物
HUE036523T2 (hu) * 2011-12-19 2018-07-30 Dilafor Ab Nem anti-koagulatív glikózaminoglikánok ismétlõdõ diszacharid egységgel és ezek gyógyászati alkalmazása
WO2013095215A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-27 Dilaforette Ab Low anticoagulant heparins
RU2700877C2 (ru) * 2013-05-16 2019-09-23 Эдженси Фо Сайенс, Текнолоджи Энд Ресёрч Гепарансульфаты
CN103698425B (zh) * 2013-12-12 2015-08-26 中国海洋大学 一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法
CN105504097B (zh) * 2015-12-30 2018-07-03 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用
US11337994B2 (en) 2016-09-15 2022-05-24 University Of Utah Research Foundation In situ gelling compositions for the treatment or prevention of inflammation and tissue damage
CN113388044B (zh) * 2020-03-11 2023-03-31 中国科学院昆明植物研究所 一种蜗牛糖胺聚糖化合物、其药学上可接受的盐、制备方法及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS609043B2 (ja) * 1976-06-22 1985-03-07 生化学工業株式会社 脱硫酸化ムコ多糖体の製造法
CA2130295A1 (en) * 1993-08-26 1995-02-27 Richard A. Berg Ionically crosslinked glycosaminoglycan gels for soft tissue augmentation and drug delivery
JPH09512822A (ja) * 1994-05-06 1997-12-22 グリコメド・インコーポレイテッド Ｏ−脱硫酸化ヘパリン誘導体とその製造法および使用
US6140481A (en) * 1994-07-01 2000-10-31 Seikagaku Corporation Process for producing desulfated polysaccharide, and desulfated heparin

Also Published As

Publication number Publication date
JP2010235956A (ja) 2010-10-21
JP5189137B2 (ja) 2013-04-24
CA2305619C (en) 2008-05-20
DE69918523T2 (de) 2005-07-28
CA2305619A1 (en) 2000-02-10
EP1022289B1 (en) 2004-07-07
DE69918523D1 (de) 2004-08-12
JP4575595B2 (ja) 2010-11-04
CN1286699A (zh) 2001-03-07
US6492503B1 (en) 2002-12-10
EP1022289A1 (en) 2000-07-26
WO2000006608A1 (fr) 2000-02-10
ATE270677T1 (de) 2004-07-15
EP1022289A4 (en) 2001-10-17
AU4933099A (en) 2000-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20010030803A (ko) 신규 글리코사미노글리칸 및 이를 함유하는 의약 조성물
KR100591960B1 (ko) 황산화된올리고사카라이드의제조및그용도
US8912149B1 (en) Glycosaminoglycan mimetics
HUT59828A (en) Process for producing oligosaccharid-containing inhibitors of endothelial celle-multiplication and inhibitors of angiogenezis
EP0577756A1 (en) New non-anticoagulant heparin derivatives
AU1669592A (en) New non-anticoagulant heparin derivatives
EP0466315A2 (en) Compositions containing xylan sulphates for affecting growth factor function and for inhibiting fibroblast proliferation
SG188756A1 (en) Glycosaminoglycans
WO1996009828A1 (en) Highly sulfated maltooligosaccharides with heparin-like properties
KR20090109104A (ko) 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 포함하는 저분자량 헤파린, 이의 제조 방법 및 이의 용도
DE69531945T2 (de) Verfahren zur herstellung von desulfatiertem polysaccharid und desulfatiertem heparin
US20240041918A1 (en) Oligosaccharide Compound for Inhibiting Intrinsic Coagulation Factor X-Enzyme Complex, and Preparation Method Therefor and Uses Thereof
EP3398971A1 (en) Sulfated heparin oligosaccharide and preparation method and application thereof
US9012413B2 (en) FGF receptor-activating N-acyl octasaccharides, preparation thereof, and therapeutic use thereof
CA2171465A1 (en) Highly sulfated maltooligosaccharides with heparin-like properties
JP4051099B2 (ja) 低分子化ヘパリン、その製造法及び医薬組成物
JP2010518251A (ja) ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも１つの共有結合を含むヘパリン、これらの調製方法およびこれらの使用
JP4412756B2 (ja) 新規多糖誘導体、その製造法及びそれを有効成分とする医薬組成物
PL204419B1 (pl) Kompozycja farmaceutyczna, oligosacharyd, sposób wytwarzania oligosacharydu i zastosowanie oligosacharydu
JP2004210714A (ja) 骨疾患治療剤
JP2005089424A (ja) シグナル伝達物質産生抑制剤

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid