JP5189137B2 - グリコサミノグリカンの製造法 - Google Patents
グリコサミノグリカンの製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5189137B2 JP5189137B2 JP2010128387A JP2010128387A JP5189137B2 JP 5189137 B2 JP5189137 B2 JP 5189137B2 JP 2010128387 A JP2010128387 A JP 2010128387A JP 2010128387 A JP2010128387 A JP 2010128387A JP 5189137 B2 JP5189137 B2 JP 5189137B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycosaminoglycan
- deoxy
- sulfo
- present
- disaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/727—Heparin; Heparan
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Description
用されていない。
(1)ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p−ニトロフェニルヒドラジンと反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法において、上記基本骨格中のグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されず、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成から算出される、2位に硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル%が45%以上であり、かつ該グリコサミノグリカンをヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びIIで消化し、得られた酵素消化液をゲルろ過により分析する測定法で測定される、グリコサミノグリカンの酵素消化率が60%以上であることを特徴とするグリコサミノグリカンの製造法であって、
以下の工程
(a)ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩を、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p−ニトロフェニルヒドラジンと反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法においてグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間、N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド存在下においてピリジン中100℃以上で加熱する工程、
(b)工程(a)で得られた反応混液からピリジンを留去する工程、及び、
(c)工程(b)で得られた反応混液に水を添加してその後常温で減圧する工程、
を含む、グリコサミノグリカンの製造法。
(2)ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、2−アセトアミド−2−デオキシ−4−O−(4−デオキシ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコース、2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコース、2−アセトアミド−2−デオキシ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコース及び2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコースの合計が10モル%以下であり、かつ2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコースが1.5モル%以下であり、さらに有効二糖収率が60%以上であり、かつ該グリコサミノグリカンをヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びIIで消化し、得られた酵素消化液をゲルろ過により分析する測定法で測定される、グリコサミノグリカンの酵素消化率が60%以上であることを特徴とするグリコサミノグリカンの製造法であって、
以下の工程
(a)ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩を、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p−ニトロフェニルヒドラジンと反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法においてグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間、N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド存在下においてピリジン中100℃以上で加熱する工程、
(b)工程(a)で得られた反応混液からピリジンを留去する工程、及び、
(c)工程(b)で得られた反応混液に水を添加してその後常温で減圧する工程、
を含む、グリコサミノグリカンの製造法。
(3)製造されるグリコサミノグリカンは、前記酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、2−アセトアミド−2−デオキシ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−D−グルコース、2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−D−グルコース、2−アセトアミド−2−デオキシ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコース及び2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコースの合計が45モル%以上であることを特徴とする、(2)に記載のグリコサミノグリカンの製造法。
(4)製造されるグリコサミノグリカンは、5%濃度のグリコサミノグリカンの重水溶液を用い、3−(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウムを基準物質とした13C−核磁気共鳴分光法による分析において、66.5〜67.5ppmに実質的にピークが観察されず、且つ100ppm付近及び102ppm付近のシグナル強度がいずれも98.3ppm付近のシグナル強度よりも高いことを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載のグリコサミノグリカンの製造法。
本発明はさらに以下に関する。
1.ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p-ニトロフェニルヒドラジンを反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法において、上記基本骨格中のグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されず、かつ該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成から算出される、2位に硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル%が45%以上であることを特徴とするグリコサミノグリカン。
2.ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース、2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース及び2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースの合計が10モル%以下であり、かつ2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースが1.5モル%以下であり、さらに有効二糖収率が60%以上であることを特徴とするグリコサミノグリカン。
3.上記酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース、2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース及び2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースの合計が45モル%以上である2記載のグリコサミノグリカン。
4.5%濃度のグリコサミノグリカンの重水溶液を用い、3-(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウムを基準物質とした13C-核磁気共鳴分光法による分析において、66.5〜67.5
ppmに実質的にピークが検出されず、且つ98.3 ppm付近のシグナル強度よりも100 ppm付
近及び102 ppm付近のシグナル強度が高いことを特徴とする1〜3のいずれかに記載のグリコサミノグリカン。
5.1〜4のいずれかに記載のグリコサミノグリカン(以下、本発明グリコサミノグリカンともいう)を有効成分とするフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤。
6.本発明グリコサミノグリカンを有効成分とする医薬組成物。
7.組織創傷・潰瘍治療剤である6記載の医薬組成物。
8.皮膚疾患治療剤である6記載の医薬組成物。
9.皮膚疾患治療剤が皮膚創傷治癒促進剤又は皮膚潰瘍治療剤である8記載の医薬組成物。
本発明グリコサミノグリカンの一態様は、ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p-ニトロフェニルヒドラジン(paranitrophenyl hydrazine: PNP-ヒドラジンとも記載する)を反応させて高速液体クロマトグラフィー(以下「HPLC」とも記載する)により分析を行う化学的二糖分析法において、上記基本骨格中のグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されず、かつ該グ
リコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成から算出される、2位に硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル%が45%以上であることを特徴とし、さらに後述の有効二糖収率が60%以上であることが好ましい。
,6)S、及びΔDiHS-tri(U,6,N)Sの合計(モル数))の割合を百分率で示したものであり、特に本発明グリコサミノグリカンの皮膚疾患治療効果を高く保つためには、この値が、通常には45%以上であり、50%以上であることが好ましく、60%以上であることがより好ましい。なお、酵素消化とHPLCを組み合わせた酵素的二糖分析法とは後記の試験法2の酵素消化とHPLCとを組み合わせた酵素的二糖分析法を意味する。
ΔDiHS-0S:ΔHexA1→4GlcNAc、ΔDiHS-NS:ΔHexA1→4GlcNS、ΔDiHS-6S:ΔHexA1→4GlcNAc(6S)、ΔDiHS-US:ΔHexA(2S)1→4GlcNAc、ΔDiHS-di(6,N)S:ΔHexA1→4GlcNS(6S)、ΔDiHS-di(U,N)S:ΔHexA(2S)1→4GlcNS、ΔDiHS-di(U,6)S:ΔHexA(2S)1→4GlcNAc(6S)、ΔDiHS-tri(U,6,N)S:ΔHexA(2S)1→4GlcNS(6S)。
の容易さの指標となる有効二糖収率が、通常には60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上である。
GF活性促進効果の測定2参照)においても、標準ヘパリン又は市販のヘパリンと比較してbFGF活性促進効果が通常には70%以上、好ましくは80%以上であり、90%以上のbFGF活性促進効果も有していることが最も好ましい。
本発明阻害剤は、本発明グリコサミノグリカンを有効成分として含有することを特徴とするフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤である。
ii)ヘパリンのグルコサミン残基の2位アミノ基に結合した硫酸基のみを脱離させた誘導体(NDSH)が、いずれもFPAに対して親和性を有するとともに、FPAの活性を阻害することが明らかとなった。この結果から、ヘパリンが最も高いFPA阻害活性を有することが示されたが、(i)、(ii)、及び(iii)の物質の中では、特に本発明グリコサミノグリカンがFPAの阻害活性が高く、次に(ii)の誘導体の阻害活性が高く、そして(iii)の誘導体が最も阻害活性は弱いことが示された。したがって、ヘパリン骨格中にグルコサミン残基の2位アミノ基に結合した硫酸基を有することがFPA活性に対して最も重要であり、次にウロン酸残基の2位水酸基にエステル結合した硫酸基が重要であり、FPA活性に対して最も関与していない硫酸基はグルコサミン残基の6位水酸基にエステル結合した硫酸基であることを上記実験結果は示している。本発明はこれらの知見に基づく発明であり、FPA阻害活性においてヘパリンに匹敵する程度に高く、ヘパリンの有する出血活性などの副作用を軽減した本発明グリコサミノグリカンを有効成分とするFPA阻害剤である。
本発明医薬組成物は、本発明グリコサミノグリカンを有効成分として含有することを特徴とする。
として挙げられ、本発明医薬組成物の態様としては皮膚創傷治癒促進剤又は皮膚潰瘍治療剤が最も好ましい。前記皮膚潰瘍としては、一般的な潰瘍の他に、例えば下肢潰瘍及び褥創などの難治性の皮膚潰瘍(糖尿病性皮膚潰瘍も包含される)が挙げられる。
示すとおり、健常ラット及び遺伝的糖尿病マウスに投与した際に、死亡例が見られなかったこと、及び本発明グリコサミノグリカンは、ヘパリンを基に製造された物質であって、ヘパリンと比較して抗凝固活性及び出血活性がきわめて低いか、これらを実質的に失っているため、本発明グリコサミノグリカンを含む本発明医薬組成物は温血動物に対する安全性が高いと言える。
本発明製造方法は上記本発明グリコサミノグリカンの製造方法であって、以下の工程を含む。
(a)ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩をMTSTFA存在下においてピリジン中100℃以上で、化学的二糖分析法においてグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間、加熱する工程、
(b)工程(a)で得られた反応混液からピリジンを留去する工程、及び、
(c)工程(b)で得られた反応混液に水を添加してその後常温で減圧する工程。
本発明製造方法における「ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩」とは、ピリジンに可溶なヘパリンの塩であれば特に限定はされないが、特にヘパリンのピリジニウム塩が好ましい。ヘパリンのピリジニウム塩は、例えばヘパリンのナトリウム塩を蒸留水で平衡化した陽イオン交換カラム(例えばアンバーライト(Amberlite)IR-120B(H+型)樹脂(オルガノ社製)を充填したカラム等)に通塔して、遊離型とし、得られた酸性画分に過剰のピリジンを添加してpHを5〜7、好ましくは5.5〜6.5に調整し、凍結乾燥することにより得ることが可能であり、また市販のヘパリンピリジニウム塩を使用しても良い。
冷却した反応混液から、ピリジンの留去を行う。ピリジンの留去の方法としては、一般に知られた有機溶媒の留去方法を使用することができるが、25〜37℃において、減圧下でエバポレーターを使用して行うことが簡便なため好ましい。当該留去によって反応混液が濃縮されるが、反応混液に対する濃縮度は7〜25倍が好ましく、8〜20倍濃縮が最も好ましい。「減圧下」とは、通常には10-2〜10-4 Torrの圧力下を示す。
ピリジンを留去して濃縮した反応混液に対し、水酸基に結合したMTSTFA及び遊離のMTSTFAを分解するために水を添加する。添加する水の量は濃縮した反応混液の1.5〜3倍量が好ましく、1.8〜2.5倍量が最も好ましい。前記の濃縮した反応混液に上述の通り水を添加する場合、反応混液に白濁が生じるが、当該白濁を解消するために上記水を添加した濃縮反応混液を常温で減圧する。当該常温での減圧は、エバポレーターを用いて行うことが可能であり、通常は25〜37℃において上述の白濁を消失するまで継続することが好ましいが、通常5〜10分程度である。当該「減圧」は上述の「減圧下」と同様に通常には10-2〜10-4Torrの圧力下であることが好ましく、上記水を添加した濃縮反応混液が減圧により沸騰する圧力下であることが好ましい。
上記(c)の処理後、反応混液中のMTSTFAの分解物及び有機溶媒を除去することが好ましく、そのために行われる公知の方法を適用することが可能であり、その方法の例としては透析、エタノール沈殿、陽イオン交換カラムを用いる方法などが挙げられる。
先ず、試験法について説明する。
[化学的二糖分析法を用いたグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基の検出及び6位脱硫酸化率の算出]
苅谷らの方法(Kariya et al.(1998) J. Biochem., 123, 240-246)に従い、被検物質の6位脱硫酸化率の算出を行った。すなわち、1 mgの試料に100μlの亜硝酸溶液(pH 1.5)を添加し、10分間室温で保温した。1 Nの炭酸ナトリウムでpH 7.5に調整した後、不活化ガスを吹き付けて乾固した。この乾固物に、200μlの蒸留水と、1%PNP-ヒドラジンを含む200μlのアセトニトリルとを添加し、37℃で30分間保温することによりグリコサミノグリカンとPNPを反応させて結合(カップリング)させ、その後SepPak C-18 カートリッジカラム(Waters社製)で部分精製を行った。得られた部分精製物をIPRP-HPLC(ion-pai
ring reversed-phase HPLC)で分析することによりISMS(IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP)のピークの有無を確認した。さらに、ISM(IdoA(2S)-AnMan-PNP)とISMS(IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP)のピーク面積を算出し、これらの値より6位脱硫酸化率を次式により算出した。
但し、A0:下記標準ヘパリンを試料とした際のISMのピーク面積
B0:下記標準ヘパリンを試料とした際のISMSのピーク面積
A1:被検物質(標準ヘパリン、本発明グリコサミノグリカンなどの測定対象となる物質の総称として使用する)を試料とした際のISMのピーク面積
B1:被検物質を試料とした際のISMSのピーク面積
[グリコサミノグリカン分解酵素による消化と高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせた酵素的二糖分析法]
(1)グリコサミノグリカン分解酵素による消化
被検物質1.0 mgを、2 mM酢酸カルシウムを含む20 mM酢酸ナトリウム(pH 7.0)220μlに溶解して、グリコサミノグリカン分解酵素(各20 mUのヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びII)を加えて、37℃で2時間反応させた。
上記(1)による酵素消化を行った後の溶液20μlを、HPLC(島津製作所社製、LC6AD型)を用いて以下の条件で分析した。イオン交換カラム(Dionex社製、CarboPac PA-1カラムφ4.0×250 mm)を使用し、公知の方法(Kariya, et al.(1992) Comp. Biochem. Physiol., 103B, 473-479)に準拠し、流速1 ml/分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系(50 mM→2.5 M)で溶出し、232 nmでの吸光度を測定した。
上記(2)のHPLCにおいて検出されるピーク面積から、特定可能な不飽和二糖(ΔDiHS-0S、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、及びΔDiHS-tri(U,6,N)S)の各々の量を求め、各不飽和二糖の割合(モル%)を算出することにより二糖組成を得た。2-O-硫酸化ウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル%は、HPLCで特定可能な不飽和二糖の総量[ΔDiHS-0S、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、ΔDiHS-tri(U,6,N)Sのピーク面積の合計]を100%として、上記ウロン酸残基の2位に硫酸基を有する不飽和二糖(ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、及びΔDiHS-tri(U,6,N)Sのピーク面積の合計)の割合として算出した。
[分子量測定]
被検物質の3%(w/w)溶液10μlにつきHPLCによってゲル濾過分析した。カラムはTSKgel-(G4000+G3000+G2500)PWXL(東ソー社製:φ7.8×300 mm)を用い、溶出液に0.2 M塩化ナトリウムを使用して、0.6 ml/分の流速で溶出した。被検物質の検出には、示差屈折計(島津製作所社製:AID-2A型)を用いた。分子量は予め分子量(重量平均分子量)が特定
されているヘパリンを対照として算出した(Kaneda et al.(1996) Biochem. Biophys. Res. Comm., 220, 108-112)。
[酵素消化率の測定法]
(1)グリコサミノグリカン分解酵素による消化
被検物質1.0 mgを、2 mM酢酸カルシウムを含む20 mM酢酸ナトリウム(pH 7.0)220μlに溶解して、グリコサミノグリカン分解酵素(各20 mUのヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びII)を加えて、37℃で2時間反応させた。
上記(1)による酵素消化を行った後の溶液20μlを、HPLCによってゲル濾過分析した。カラムはTSKgel-(G4000+G3000+G2500)PWXL(東ソー社製:φ7.8×300 mm)を用い、溶出液に0.2 M塩化ナトリウムを使用し、0.6 ml/分の流速で溶出した。被検物質の検出には、示差屈折計(島津製作所社製:AID-2A型)を用いた。酵素消化率は保持時間40分のピーク(不飽和四糖)、41.5分のピーク(三硫酸化不飽和二糖)、42分のピーク(二硫酸化不飽和二糖)、43分のピーク(一硫酸化不飽和二糖)及び45分のピーク(硫酸基を有さない不飽和二糖)の面積の合計に対する、41.5分のピーク(三硫酸化不飽和二糖)、42分のピーク(二硫酸化不飽和二糖)、43分のピーク(一硫酸化不飽和二糖)及び45分のピーク(硫酸基を有さない不飽和二糖)の面積の合計の百分率で算出した。
[活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定法]
ラット下大動脈より3.2 wt%クエン酸ナトリウム水溶液を含む注射筒を用意し、該注射筒を用いて該クエン酸ナトリウム水溶液の9倍量の血液を採取した。該混合物を4℃、1,000×gで10分間遠心処理して血漿を得た。血漿100μlと既知濃度の被検物質を含む生理食塩水100μlを測定用カップへ分注し、37℃で1分間保温した。その後、予め37℃で5分間保温しておいたアクチン(商品名:吉富製薬社製)100μlを添加して37℃にて更に2分間保温した。次いで予め37℃に保温しておいた0.02M塩化カルシウム溶液100μlを添加して凝固を開始させ、凝固時間を血液凝固自動測定装置(バクスター社製、AMELUNG KC10A型)で測定した。
[トロンビン時間(TT)の測定法]
上記APTTの測定法で記載した方法により調製した血漿100μlと既知濃度の被検物質を含む生理食塩水100μlとを測定用カップへ分注し、37℃で1分間保温した。その後、予め37℃で5分間保温しておいたトロンビン(10 U/ml:吉富製薬社製)100μlを添加して凝固を開始させ、凝固時間を血液凝固自動測定装置(バクスター社製、AMELUNG KC10A型)で測定した。
[抗トロンビン活性の測定法]
150 mM 塩化ナトリウム、10 mM塩化カルシウム及び0.1%ウシ血清アルブミンを含む20 mMトリス緩衝液(pH7.4)350μl、ウシATIII溶液(1 U/ml同緩衝液)100μl及び被検物質の倍数希釈水溶液(試料)100μlの3液を冷却した状態で混合し、37℃で2分間保温した。この溶液にウシトロンビン溶液(50 mU/ml蒸留水)50μlを加え、37℃で5分間保温後、基質溶液(Boc-Val-Pro-Arg-MCA(ペプチド研究所製:Bocは第三ブチルオキシカルボニル、MCAは7-アミノ-4-メチルクマリンを示す)、70μM水溶液)100μlを加えて撹拌し、37℃で3分間保温し、30%酢酸300μlを加えて反応を停止した。反応液の蛍光強度を励起波長350 nm、蛍光波長444 nmにて測定した。上記反応液組成の試料の代わりに蒸留水を用いた
反応混液のブランク1と、基質及び緩衝液のみの反応混液のブランク2を同様に処理し、蛍光強度を測定した。
但し、ΔFs:試料の蛍光強度−ブランク1の蛍光強度
ΔFb:ブランク2の蛍光強度−ブランク1の蛍光強度
[出血活性の測定法]
ラットをエーテル麻酔後、背部に、一ヶ所あたり、各被検物質の0.2 mg、0.4 mg、0.8 mgを含む生理食塩水溶液0.4 mlを皮下投与した。陰性対照には生理食塩水を1箇所あたり0.4 mlで皮下投与した。24時間後にラットを失血死させ、投与部周囲の皮膚を剥離し、皮下出血斑の長短径をノギスで測定し、面積を算出した。陰性対照群との差の検定はDunnettの多重比較検定を用いた。
[bFGF活性促進効果の測定1(NaClO3添加)]
10%の牛血清を含んだDMEM培地(旭テクノグラス社製)で継代維持されたA31細胞(BALB/cマウス 3T3細胞)を、20 mMのNaClO3、2 ng/mlのヒト組換塩基性線維芽細胞増殖因子(hrbFGF:プロメガ社製)を含んだDMEM-ITS培地(ITS:GIBCO BRL社製、インスリン10 mg/l、トランスフェリン5.5 mg/l、亜セレン酸6.7μg/l)に、5×104個/mlになるように懸濁し、各被検物質を最終濃度1μg/mlになるように添加した後、100μlを96穴マイクロプレートに撒き、培養した。3日間の培養の後、20μlのセルタイター96AQノンラジオアクティブ細胞増殖アッセイ溶液(プロメガ社製)を各ウェルに添加し、37℃で2時間培養し、吸光光度計によって492 nmの波長の吸光度を測定することで、それぞれのウェルの細胞増殖を定量した。標準ヘパリンを添加した際の細胞増殖率を100とし、陰性対照(被検物質は添加せず、溶媒であるPBS(リン酸緩衝生理食塩水)のみを添加した)の細胞増殖率を0として、各被検物質を添加した際の細胞増殖率を算出した。
10%の牛血清を含んだDMEM培地(旭テクノグラス社製)で継代維持されたA31細胞(BALB/cマウス 3T3細胞)を、2 ng/mlのhrbFGF(プロメガ社製)を含んだDMEM-ITS培地(ITS:GIBCO BRL社製、インスリン10 mg/l、トランスフェリン5.5 mg/l、亜セレン酸6.7μg/l)に、5×104個/mlになるように懸濁し、各被検物質を最終濃度20μg/mlになるように添加した後、100μlを96穴マイクロプレートに撒き、培養した。3日間の培養の後、20μlのセルタイター96AQノンラジオアクティブ細胞増殖アッセイ溶液(プロメガ社製)を各ウェルに添加し、37℃で2時間培養し、吸光光度計によって492 nmの波長の吸光度を測定することで、それぞれのウェルの細胞増殖を定量した。標準ヘパリンを添加した際の細胞増殖率を100とし、陰性対照(被検物質は添加せず、溶媒であるPBSのみを添加した)の細胞増殖率を0として、各被検物質を添加した際の細胞増殖率を算出した。
エーテル麻酔下でC57BL/6マウス(9週齢:雌、チャールスリバー)の背部を剃毛し、予め滅菌した綿球を皮下に埋め込み(2箇所/匹)、10日後に肉芽組織ごと綿球を摘出した。ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(ペニシリン:200 U/ml、ストレプトマイシン:200μg/ml)で2回、PBSで1回洗浄した後、綿球を覆っている被膜を取り除き、0.1%コラゲナーゼ/0.25%トリプシン溶液の入ったチューブに移し、37℃の恒温槽中で1時間振盪
処理した。処理液をセルストレーナー(φ=70μm)に通し、牛血清を10%含むRPMI1640培地(イワキ社製)を加え、軽く攪拌した後に、2,000×gで3分間遠心した。得られた細胞は同培地で3回洗浄し、1×105 cells/mlになるように同培地で再懸濁後、10 cmシャーレに捲き込んだ。翌日、未接着細胞を取り除き、サブコンフルエントに達するまで、37℃のCO2インキュベーターで培養した。
[本実施例中の対照として用いた標準ヘパリン]
標準ヘパリンとしてブタ小腸由来のヘパリン(市販品:SPL社製)を使用した。このヘパリンは以下に示す物性を有していた。
対照グリコサミノグリカン1の調製(公知例1)
WO96/01278の実施例に記載された方法に基づいて対照グリコサミノグリカン1(以下、単に「対照1」と記載する)を調製した。すなわち標準Hから常法によりピリジニウム塩として調製したヘパリンピリジニウム塩(以下「HepP」と記載する)200 mgを、脱水した20 mlのピリジンに添加、溶解した。4 ml(約4 g)(HepPの20倍重量)のMTSTFAを加え、95℃で2時間攪拌した。その後、20 mlの水を加え、ミリポア限外濾過膜(ミリポア社製)を用いて透析した。この透析内液を100℃で白濁が消失するまで加熱した。その後、NaOH(1 N)を添加してpHを9に調整し、流水に対して18時間、蒸留水に対して2時間透析を行い、透析内液を凍結乾燥処理することにより対照1(ナトリウム塩)の粉末130 mgを調製した。
対照グリコサミノグリカン2の調製(公知例2;ソルボリシス+N-再硫酸化)
WO95/30424の実施例1の記載に基づいて対照グリコサミノグリカン2(以下単に「対照2」と記載する)を調製した。すなわちHepP 50 mgを10 mlの水に添加、溶解し、90 mlのジメチルスルフォキシドで希釈した。この溶液を100℃の湯浴中で72時間攪拌した。その後、50 mlの5%重炭酸ナトリウムを加えて冷却した後、0.1 Mの1リットルの酢酸ナトリウム溶液に対する12時間の透析を2回繰り返し、次いで蒸留水に対して徹底的に透析した。
[本発明グリコサミノグリカン等の調製]
下記表3記載の反応条件で、HepP及びMTSTFAをピリジンに添加、撹拌後、一定時間加熱・保持した。反応混液を含む容器を氷冷後、減圧下ロータリーエバポレーターを用いて10倍に濃縮し、2倍量の蒸留水を添加した。更に、白濁が消失するまでロータリーエバポレーターを使用して減圧した後、流水に対して48時間、蒸留水に対して2時間、透析を行った。透析内液を蒸留水で平衡化したアンバーライト IR-120B(H+型)樹脂(オルガノ社製)を充填したカラムに通塔し、回収した画分のうちの酸性画分のみをプールした。この酸性画分にNaOH(1 N)を添加してpHを9に調整し、流水に対して18時間、蒸留水に対して2時間透析を行い、透析内液を凍結乾燥処理することにより目的の調製物(ナトリウム塩)を粉末として調製した。
(1) 酵素消化率
標準H、本発明1、本発明2、本発明3、本発明4、対照1、対照2及び対照6について酵素消化率を試験法4に記載した方法により測定した。また、標準H以外の物質について、試験法1に記載した方法により6位脱硫酸化率を算出した(表4)。表4中の対照1の6位脱硫酸化率はWO96/01278に記載された6位脱硫酸化率を引用した。
標準H、本発明1、本発明2、本発明3、本発明4、対照1、対照2、及び対照6について、試験法2記載の酵素的二糖分析法に従って二糖組成値を算出した(表5)。
飽和二糖(ΔDiHS-(U,6,N)triS)が検出されない点で特徴づけられた。
エンドトキシン濃度の測定
本発明グリコサミノグリカンの調製物へ混入したエンドトキシンの測定はトキシカラ-LS-50Mセット(生化学工業(株)製)による比色定量で行った。標準エンドトキシンとしてはトキシカラーEt-2(生化学工業(株)製)を用いた。
{(添加時の測定値)-(無添加時の測定値)}/(添加エンドトキシン濃度)
ピリジン含量の測定
本発明グリコサミノグリカンに残留したピリジンの含量を測定した。すなわち、本発明3(20 mg)を5 NのNaOH(1 ml)に添加し、この溶液に5分間超音波処理を行った。この溶液に1 mlのジメチルエーテルを添加し、2分間、激しく撹拌を行った。その後、3,000×gで10分間遠心処理を行い、上層(i)(有機層)と下層(i)(水層)に分離した。1 mlのジメチルエーテルを下層(i)に添加し、再度激しく撹拌し、上記と同様の条件で遠心処理を行い、上層(ii)(有機層)と下層(ii)(水層)を分離した。下層(ii)は廃棄し、上層(i)及び上層(ii)を合わせて2 mlの抽出液(i)とした。
温度を上昇させて溶出を行った。検出はFID(Flamed Ionized Detection)を用い300℃で行った。検量線は20、40、60、80、及び100 ppm濃度のピリジンを含むメタノールを1μlずつ分析することにより作成した。本発明3の水分含量は10%で算出した。本発明3について2回、抽出及びピリジン含量の定量を行った。その結果、二回のピリジン含量の測定値はそれぞれ73.1 ppm及び70.3 ppmであった。いずれも、製剤中のピリジン含量の規制値である200 ppmを大きく下回る数値であった。
[13C-核磁気共鳴分光法による構造解析]
標準H、本発明1、本発明2、本発明3、本発明4、対照3、対照4、及び対照5について13C-核磁気共鳴分光法(13C-NMR法)により分析を行った(標準H:図1(1)、本発明1:図2、本発明2:図1(5)、本発明3:図3、本発明4:図4、対照3:図1(2)、対照4:図1(3)、対照5:図1(4))。13C-NMR法は、GE社製QE300型NMRスペクトロメーターを用い、被検物質につき5%濃度(w/v)の重水溶液を調製したうえ、TSP(和光純薬工業社製)を基準物質(0 ppm)としたときのケミカルシフトが51.66 ppmのメタノールを内部標準とし、測定温度80℃、パルス幅60°、積算回数90,000回の条件にて行った。標準H、本発明1、本発明2、本発明3及び本発明4のシグナルのケミカルシフトは以下の通りであった(表6)。
[抗凝固活性の測定]
(1)活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定
標準H、本発明2、対照4、及び対照5を使用して試験法5に記載の方法に従ってAPTTの測定を行った(表8)。その結果、標準H、対照4及び対照5においてはAPTTが延長する結果が得られたが、本発明2においてはAPTTを延長する作用がほとんど見られなかった。対照1及び対照6は6位脱硫酸化率がいずれも対照4と対照5の間の値となるため、対照4及び対照5の中間的な抗凝固活性を示すと予想される。
標準H、本発明2、対照4及び対照5を使用して試験法6に記載の方法に従ってTTの測定を行った(表9)。その結果、標準H、対照4及び対照5においてはTTが延長する結果が得られたが、本発明2はTTを延長する作用が全く見られなかった。対照1及び対照6はそれぞれ6位脱硫酸化率が対照4及び対照5の間の値となるため、対照4及び対照5の中間的な抗凝固活性を示すと予想される。
試験法7に記載の方法に従って、標準H、本発明2、および対照1の抗トロンビン活性の測定を行った(表10)。その結果、本発明2の抗トロンビン活性が標準Hおよび対照1と比較して大幅に低下していることが明らかとなった。
[本発明グリコサミノグリカンの出血活性]
標準H及び本発明2を使用して試験法8に記載の方法に従って出血活性の測定を行った(表11)。その結果、本発明2が出血活性を完全に失っていることが明らかとなった。
[健常皮膚創傷に対する本発明グリコサミノグリカンの治癒促進効果]
健常ラットを用いて、本発明グリコサミノグリカンの皮膚創傷促進効果を検討した。すなわち、健常ラットの背部を剃毛後、φ8 mmの眼科用トレパンで皮膚を皮下まで切開し、眼科用ハサミとピンセットを用いて剥離して皮膚欠損創を背部に2カ所作成した。そして標準H、本発明2又は対照4を0.5 wt%含む油性軟膏を調製して、該軟膏を、毎日0.1 gずつ塗布し、創傷の治癒の程度を治癒面積で比較した。測定は、ラットをエーテル麻酔下で静置した上、欠損部位につき常に焦点距離を一定として写真撮影し、皮膚欠損部位を画像解析装置を用いて、写真プリント上から測定した。治癒面積は、欠損部作成直後の面積から、各測定時点の面積を差し引いた値とした。統計処理はTukeyの多重比較検定により行った。その結果、本発明2を使用して製造した軟膏を塗布した動物群で顕著な皮膚創傷治癒促進活性が観察された(図7)。
[糖尿病性皮膚潰瘍に対する本発明グリコサミノグリカンの治癒促進効果]
遺伝的糖尿病マウス(db/dbマウス(雌):日本クレア社)を用いて、本発明グリコサミノグリカンの糖尿病性皮膚潰瘍治癒促進効果を検討した。すなわち、遺伝的糖尿病マウスの背部を剃毛後、φ8 mmの眼科用トレパンで皮膚を皮下まで切開し、眼科用ハサミとピンセットを用いて剥離して皮膚欠損創を作成した。そして標準H、本発明2又は対照4を1%濃度(w/w)で溶解した生理食塩水を、毎日50μlずつ滴下して、創傷の治癒の程度を比較した。測定は、マウスをエーテル麻酔下で静置した上、欠損部位につき常に焦点距離を一定として写真撮影し、皮膚欠損部位を、画像解析装置を用いて、写真プリント上から測定した。治癒面積は、欠損部作成直後の面積から、各測定時点の面積を差し引いた値とした。統計処理はTukey検定により行った。その結果、投与開始後7日間は各被検物質で顕著な差はみられなかったが、投与開始後11日目以降は本発明2が統計的に有意に治癒を促進することが明らかとなった(図8)。
[本発明グリコサミノグリカンのbFGFに対する親和性の測定]
本発明グリコサミノグリカンの細胞増殖因子との親和性を測定した。すなわち、本発明2 0.2 mgを100μlの50 mMの重炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)に溶解し、さらに74μgのNHS-LC-ビオチン(Succinimidyl-6-(biotineamide)-hexanoate:Pierce社製)を含む水溶液を添加した後、室温で30分間反応させた。次いで、2.5倍量のエタノールを添加し、沈殿した、ビオチン化された本発明2を遠心分離により回収した。このビオチン化された本発明2をアビジン化センサーチップ(BIAcore AB社製: SA)に固定化した。本発明2とbFGFとの相互作用は、液相中に可溶化したbFGFをセンサーチップ表面に接触させた後、表面
プラスモン効果を利用してAffinity and kinetics 分析法及びSteady-state分析法の2通りの手法にて解析した。
[本発明グリコサミノグリカンのbFGF活性促進効果の測定1(NaClO3添加)]
試験法9に記載した[bFGF活性促進効果の測定1]に基づき、本発明2のbFGF活性促進効果を測定した。同様に対照1及び対照2についても同様の方法に従ってbFGF活性促進効果を測定した。その結果、本発明2は標準Hと同等のbFGF活性促進効果を有していることが明らかとなった(表12)。対照1は、標準Hの26%程度すなわち本発明2の4分の1以下のbFGF活性促進効果を有していることが明らかとなった。このことは、13C-NMRによって明確となった構造的差異がbFGFの活性の促進効果の差異となっていることを示している。
[本発明グリコサミノグリカンのbFGF活性促進効果の測定2(NaClO3非添加)]
試験法9に記載した[bFGF活性促進効果の測定2]に基づき、本発明グリコサミノグリカン(本発明2)のbFGF活性促進効果を測定した。比較の対照として対照2を使用した。その結果、本発明2は標準Hと同等のbFGF活性促進効果を有していることが明らかとなった(表13)。対照2の、bFGF活性促進効果は本発明2と比較して半分以下であることが明らかとなった。
[本発明グリコサミノグリカンのbFGF活性促進効果の測定3(NaClO3非添加/初代培養細胞)]
試験法9に記載した[bFGF活性促進効果の測定3]に基づき、本発明グリコサミノグリカン(本発明2)の初代培養細胞に対するbFGF活性促進効果を測定した。比較の対照として標準Hを使用した。その結果、本発明2は標準Hの75%のbFGF活性促進効果を初代培養細胞に対して示すことが明らかとなった(表14)。
[本発明グリコサミノグリカンのフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ親和性の測定]
呼吸における解糖系のキーエンザイムであるフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(以下「FPA」と記載する)と本発明グリコサミノグリカンとの親和性の測定は、Sasakiらの方法(J. Chromatogr.(1987) 400, 123-132)に従って調製したアフィニティーゲル担体をFPLC用カラムに詰め、アフィニティークロマトグラフィーによって行った。アフィニティーゲル担体の調製は以下の様に行った。本発明2 200 mgを5 mlの2 Mリン酸緩衝液(pH 7.2)に溶解し、次いで5gのアミノアガロースゲル粉末を懸濁し、15 mgのNaB(CN)H3を添加して充分撹拌しながら室温にて24時間反応させ、反応終了後、カップリング産物を含有したゲルを濾過し、更に水洗処理を3回行い完全に脱塩した。脱塩後のゲルを5 mlの0.2 M CH3COONa溶液に懸濁させ、2.5 mlの無水酢酸を添加して0℃にて30分間、次いで室温にて30分間反応させ、反応終了後、生成したゲルを水洗して完全に脱塩した。
[本発明グリコサミノグリカンのフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ阻害活性の測定]
FPAに対する、本発明グリコサミノグリカンの阻害活性を測定した。前記酵素は、フルクトース1,6-ビスリン酸(以下「F-1,6-P2」と記載する)を基質として作用させた場合、ジヒドロキシアセトンリン酸(以下「DHAP」と記載する)とグリセルアルデヒド3ーリン酸(GAL-3-P)に分解する。また、フルクトース-1-リン酸(以下「F-1-P」と記載する)を基質として作用させた場合、DHAPとグリセルアルデヒド(GAL)に分解する。したがって、F-1,6-P2およびF-1-Pを基質として、トリオースリン酸イソメラーゼ存在下で、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ系を共役させ、生じたDHAPがグリセロール-3-リン酸に還元される際のNADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)量の変化を、340 nmの吸光度の変化により測定した。
[製剤例]
(1)注射剤(液剤)
本発明2(ナトリウム塩)の凍結乾燥物(30 mg/ml)を、終濃度5 mg/mlとなるように5%マンニトール水溶液に溶解し、これを無菌濾過した後、2 mlずつアンプルに分注して注射剤(液剤)を製造した。
本発明2(ナトリウム塩)の凍結乾燥物100 mg、鉱油4 g、石油ゼリー8 g、混合メチル/プロピルパラバン60 mg、非イオン性界面活性剤1 g及び精製水30 gを均一に混合し、この混合物を容器に充填して軟膏剤を製造した。
Claims (6)
- ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p−ニトロフェニルヒドラジンと反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法において、上記基本骨格中のグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されず、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成から算出される、2位に硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル%が45%以上であり、かつ該グリコサミノグリカンをヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びIIで消化し、得られた酵素消化液をゲルろ過により分析する測定法で測定される、グリコサミノグリカンの酵素消化率が60%以上であることを特徴とするグリコサミノグリカンの製造法であって、
以下の工程
(a)ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩を、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p−ニトロフェニルヒドラジンと反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法においてグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間、N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド存在下においてピリジン中100℃以上で加熱する工程、
(b)工程(a)で得られた反応混液からピリジンを留去する工程、及び、
(c)工程(b)で得られた反応混液に水を添加してその後常温で減圧する工程、
を含む、グリコサミノグリカンの製造法。 - ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、2−アセトアミド−2−デオキシ−4−O−(4−デオキシ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコース、2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコース、
2−アセトアミド−2−デオキシ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコース及び2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコースの合計が10モル%以下であり、かつ2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコースが1.5モル%以下であり、さらに有効二糖収率が60%以上であり、かつ該グリコサミノグリカンをヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びIIで消化し、得られた酵素消化液をゲルろ過により分析する測定法で測定される、グリコサミノグリカンの酵素消化率が60%以上であることを特徴とするグリコサミノグリカンの製造法であって、
以下の工程
(a)ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩を、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p−ニトロフェニルヒドラジンと反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法においてグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間、N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド存在下においてピリジン中100℃以上で加熱する工程、
(b)工程(a)で得られた反応混液からピリジンを留去する工程、及び、
(c)工程(b)で得られた反応混液に水を添加してその後常温で減圧する工程、
を含む、グリコサミノグリカンの製造法。 - 製造されるグリコサミノグリカンは、前記酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、2−アセトアミド−2−デオキシ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−D−グルコース、2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−D−グルコース、2−アセトアミド−2−デオキシ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコース及び2−デオキシ−2−スルファミノ−4−O−(4−デオキシ−2−O−スルホ−α−L−threo−hex−4−エノピラノシルウロン酸)−6−O−スルホ−D−グルコースの合計が45モル%以上であることを特徴とする、請求項2に記載のグリコサミノグリカンの製造法。
- 製造されるグリコサミノグリカンは、5%濃度のグリコサミノグリカンの重水溶液を用い、3−(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウムを基準物質とした13C−核磁気共鳴分光法による分析において、66.5〜67.5ppmに実質的にピークが観察されず、且つ100ppm付近及び102ppm付近のシグナル強度がいずれも98.3ppm付近のシグナル強度よりも高いことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載のグリコサミノグリカンの製造法。
- 工程(a)における、グリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩を、N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド存在下においてピリジン中加熱する工程を120分以上100℃以上で行うことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載のグリコサミノグリカンの製造法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の方法により製造されたグリコサミノグリカンを有効成分として含有させる工程を含む、フルクトース1,6−ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010128387A JP5189137B2 (ja) | 1998-07-31 | 2010-06-04 | グリコサミノグリカンの製造法 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1998217051 | 1998-07-31 | ||
JP21705198 | 1998-07-31 | ||
JP1998246387 | 1998-08-31 | ||
JP24638798 | 1998-08-31 | ||
JP2010128387A JP5189137B2 (ja) | 1998-07-31 | 2010-06-04 | グリコサミノグリカンの製造法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000562404A Division JP4575595B2 (ja) | 1998-07-31 | 1999-08-02 | 新規グリコサミノグリカン及び該物質を有効成分とする医薬組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010235956A JP2010235956A (ja) | 2010-10-21 |
JP5189137B2 true JP5189137B2 (ja) | 2013-04-24 |
Family
ID=26521784
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000562404A Expired - Fee Related JP4575595B2 (ja) | 1998-07-31 | 1999-08-02 | 新規グリコサミノグリカン及び該物質を有効成分とする医薬組成物 |
JP2010128387A Expired - Fee Related JP5189137B2 (ja) | 1998-07-31 | 2010-06-04 | グリコサミノグリカンの製造法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000562404A Expired - Fee Related JP4575595B2 (ja) | 1998-07-31 | 1999-08-02 | 新規グリコサミノグリカン及び該物質を有効成分とする医薬組成物 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6492503B1 (ja) |
EP (1) | EP1022289B1 (ja) |
JP (2) | JP4575595B2 (ja) |
KR (1) | KR20010030803A (ja) |
CN (1) | CN1286699A (ja) |
AT (1) | ATE270677T1 (ja) |
AU (1) | AU4933099A (ja) |
CA (1) | CA2305619C (ja) |
DE (1) | DE69918523T2 (ja) |
WO (1) | WO2000006608A1 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8432377B2 (en) | 2007-08-30 | 2013-04-30 | Next Holdings Limited | Optical touchscreen with improved illumination |
US8456447B2 (en) | 2003-02-14 | 2013-06-04 | Next Holdings Limited | Touch screen signal processing |
US8466885B2 (en) | 2003-02-14 | 2013-06-18 | Next Holdings Limited | Touch screen signal processing |
US8508508B2 (en) | 2003-02-14 | 2013-08-13 | Next Holdings Limited | Touch screen signal processing with single-point calibration |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2814463B1 (fr) | 2000-09-22 | 2002-11-15 | Sanofi Synthelabo | Nouveaux polysaccharides a activite antithrombotique comprenant au moins une liaison covalente avec la biotine ou un derive de la biotine |
JP4828795B2 (ja) | 2002-03-11 | 2011-11-30 | モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 硫酸化多糖類の分析 |
DE10214507A1 (de) * | 2002-04-02 | 2003-10-16 | Beiersdorf Ag | Verwendung von Acarbose und deren Derivaten zur Behandlung und Prophylaxe degenerativer Hautzustände |
EP1635782A1 (de) * | 2003-05-24 | 2006-03-22 | JUVENA (International) AG | Gewebekulturmedien als bestandteil von kosmetika |
WO2005026214A1 (ja) | 2003-09-12 | 2005-03-24 | Seikagaku Corporation | 多糖擬スポンジ |
KR100577075B1 (ko) * | 2004-06-16 | 2006-05-08 | 주식회사 티앤라이프시스템 | 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산정제방법 |
AU2005283282B2 (en) | 2004-09-15 | 2011-05-19 | Seikagaku Corporation | Photoreactive polysaccharide, photocrosslinked polysaccharide products, the method of making them and medical materials therefrom |
US7659260B2 (en) * | 2005-01-14 | 2010-02-09 | Eddie Francis Kadrmas | Tamponade compositions and methods for retinal repair |
US9139876B1 (en) | 2007-05-03 | 2015-09-22 | Momenta Pharmacueticals, Inc. | Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin |
EP2281008B1 (en) | 2008-04-04 | 2017-01-04 | University of Utah Research Foundation | Alkylated and sulfated hyaluronan compounds, methods for their preparation and use thereof |
EP2526122B1 (en) * | 2010-01-19 | 2020-06-10 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
US9068957B2 (en) | 2011-02-21 | 2015-06-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
EP2688402B1 (en) | 2011-03-23 | 2018-10-24 | University of Utah Research Foundation | Means for treating or preventing urological inflammation |
JP5263349B2 (ja) * | 2011-08-08 | 2013-08-14 | 生化学工業株式会社 | 生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物 |
ME02994B (me) * | 2011-12-19 | 2018-10-20 | Dilafor Ab | Glikozaminoglikani koji nisu anтikoagulanтi koji sadrže ponavljajuću jedinicu disaharida i njihova medicinska upotreba |
WO2013095215A1 (en) * | 2011-12-19 | 2013-06-27 | Dilaforette Ab | Low anticoagulant heparins |
CN105408361B (zh) * | 2013-05-16 | 2019-09-06 | 新加坡科技研究局 | 硫酸乙酰肝素 |
CN103698425B (zh) * | 2013-12-12 | 2015-08-26 | 中国海洋大学 | 一种化学降解法获得及检测生物来源糖胺聚糖二糖的方法 |
CN105504097B (zh) * | 2015-12-30 | 2018-07-03 | 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 | 一种硫酸化肝素寡糖及其制备方法和应用 |
WO2018053111A1 (en) | 2016-09-15 | 2018-03-22 | University Of Utah Research Foundation | In situ gelling compositions for the treatment or prevention of inflammation and tissue damage |
CN113388044B (zh) * | 2020-03-11 | 2023-03-31 | 中国科学院昆明植物研究所 | 一种蜗牛糖胺聚糖化合物、其药学上可接受的盐、制备方法及应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS609043B2 (ja) * | 1976-06-22 | 1985-03-07 | 生化学工業株式会社 | 脱硫酸化ムコ多糖体の製造法 |
CA2130295A1 (en) * | 1993-08-26 | 1995-02-27 | Richard A. Berg | Ionically crosslinked glycosaminoglycan gels for soft tissue augmentation and drug delivery |
AU2435795A (en) | 1994-05-06 | 1995-11-29 | Glycomed Incorporated | O-desulfated heparin derivatives, methods of making and uses thereof |
EP1371666B1 (en) * | 1994-07-01 | 2007-08-15 | Seikagaku Corporation | Use of desulfated heparin |
-
1999
- 1999-08-02 KR KR1020007003403A patent/KR20010030803A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-08-02 AU AU49330/99A patent/AU4933099A/en not_active Abandoned
- 1999-08-02 AT AT99933225T patent/ATE270677T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-08-02 CA CA002305619A patent/CA2305619C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-02 WO PCT/JP1999/004155 patent/WO2000006608A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1999-08-02 DE DE69918523T patent/DE69918523T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-02 CN CN99801643A patent/CN1286699A/zh active Pending
- 1999-08-02 EP EP99933225A patent/EP1022289B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-02 JP JP2000562404A patent/JP4575595B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-02 US US09/509,478 patent/US6492503B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-06-04 JP JP2010128387A patent/JP5189137B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8456447B2 (en) | 2003-02-14 | 2013-06-04 | Next Holdings Limited | Touch screen signal processing |
US8466885B2 (en) | 2003-02-14 | 2013-06-18 | Next Holdings Limited | Touch screen signal processing |
US8508508B2 (en) | 2003-02-14 | 2013-08-13 | Next Holdings Limited | Touch screen signal processing with single-point calibration |
US8432377B2 (en) | 2007-08-30 | 2013-04-30 | Next Holdings Limited | Optical touchscreen with improved illumination |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2305619C (en) | 2008-05-20 |
DE69918523T2 (de) | 2005-07-28 |
KR20010030803A (ko) | 2001-04-16 |
EP1022289A4 (en) | 2001-10-17 |
EP1022289A1 (en) | 2000-07-26 |
JP2010235956A (ja) | 2010-10-21 |
US6492503B1 (en) | 2002-12-10 |
ATE270677T1 (de) | 2004-07-15 |
AU4933099A (en) | 2000-02-21 |
CA2305619A1 (en) | 2000-02-10 |
EP1022289B1 (en) | 2004-07-07 |
CN1286699A (zh) | 2001-03-07 |
JP4575595B2 (ja) | 2010-11-04 |
DE69918523D1 (de) | 2004-08-12 |
WO2000006608A1 (fr) | 2000-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5189137B2 (ja) | グリコサミノグリカンの製造法 | |
US5696100A (en) | Method for controlling O-desulfation of heparin and compositions produced thereby | |
US5280016A (en) | Non-anticoagulant heparin derivatives | |
EP0394971A1 (en) | Oligosaccharide-containing inhibitors of endothelial cell growth and angiogenesis | |
EP0862585A1 (en) | Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby | |
AU1669592A (en) | New non-anticoagulant heparin derivatives | |
AU2435795A (en) | O-desulfated heparin derivatives, methods of making and uses thereof | |
FR2684385A1 (fr) | Heparosanes-n,o-sulfates de haute masse moleculaire, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. | |
KR20090109104A (ko) | 바이오틴 또는 바이오틴 유도체와의 1개 이상의 공유 결합을 포함하는 저분자량 헤파린, 이의 제조 방법 및 이의 용도 | |
JP3929486B2 (ja) | 脱硫酸化多糖の製造法及び脱硫酸化ヘパリン | |
EP1358215B1 (en) | Glycosaminoglycans derived from k5 polysaccharide having high antithrombin activity and process for their preparation | |
JP4051099B2 (ja) | 低分子化ヘパリン、その製造法及び医薬組成物 | |
US7812151B2 (en) | Low molecular weight polysaccharides having antithrombotic activity | |
JP2010518251A (ja) | ビオチンまたはビオチン誘導体との少なくとも1つの共有結合を含むヘパリン、これらの調製方法およびこれらの使用 | |
US6498246B1 (en) | Glycosaminoglycan derivatives and processes for preparing same | |
JP4412756B2 (ja) | 新規多糖誘導体、その製造法及びそれを有効成分とする医薬組成物 | |
US20200254003A1 (en) | Oligosaccharide compound for inhibiting intrinsic coagulation factor x-enzyme complex, and preparation method therefor and uses thereof | |
AU2002222358B2 (en) | Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high antithrombin activity and process for their preparation | |
JP4469442B2 (ja) | フルクトース1,6−ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤 | |
CA2194220C (en) | Process for producing desulfated polysaccharide, and desulfated heparin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121016 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121214 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130115 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130123 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160201 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |