WO1999043714A1

WO1999043714A1 - Nouveaux derives de polysaccharide, leur procede de production, et compositions medicinales contenant ces nouveaux derives comme principe actif

Info

Publication number: WO1999043714A1
Application number: PCT/JP1999/000899
Authority: WO
Inventors: Seigo Usuki; Yutaka Kariya
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 1999-09-02
Also published as: EP1059304A4; DE69931038D1; DE69931038T2; EP1059304B1; US6498246B1; EP1059304A1

Description

明細書

新規多糖誘導体、その製造法及びそれを有効成分とする医薬組成物技術分野

本発明は、神経突起伸張活性及びシァリダ一ゼ阻害活性を有する新規グリコサミノグリカン誘導体、その製造法並びに当該グリコサミノグリカン誘導体を有効成分とする医薬組成物に関する。背景技術

神経疾患は、神経細胞の成長が抑制されること、神経細胞が虚血による糖の供給量低下又は細胞内のエネルギー代謝阻害によって維持されなくなり壊死を起こすこと、又は神経伝達物質が分解され、神経伝達が阻害されることに起因する。故にこの疾患の治療としては、神経細胞の成長を維持すること、神経細胞の虚血を防ぐこと、又は神経細胞内のエネルギー代謝を維持することを目的としてなされてきた。即ち、神経細胞の成長活性を有する物質である神経栄養因子（神経成長因子: NGF、脳由来神経栄養因子： BDNF、毛様体神経栄養因子: CNTF、線維芽細胞増殖因子: FGFなど）を外部から投与すること又は神経栄養因子の合成を促進すること、アルドース還元酵素阻害剤を適用することによりアルドース還元酵素の活性によって生じるソルビトールの過剰生成による神経細胞の虚血及び神経細胞内でのエネルギー代謝の低下を防止すること、及びァセチルコリンエステラーゼ阻害剤を投与することによりァセチルコリンの分解を防止して神経細胞の伝達を維持することが神経疾患に対する根本的方策とされている。しかし、投与する物質の純度に起因する抗原性、酵§活性を阻害することによる副作用及び投与する物質そのものが有する毒性などが問題点となっている。

ところで、グリコサミノグリ力ンには神経突起伸張を促進する活性があることが知られている (J. Cel l Phys i ol. , 135, 293-300(1988)) 。またへパリン並びにその誘導体である過ヨウ素酸酸化還元へパリン及び過硫酸化へパリンは神経突起伸長活性を持つことが知られており、外傷性、虚血性及び毒性末梢神経障害の治療に有効であることが知られている（特開平 6-157322) が、医薬品として利用する上での上記疾患を抑制するのに充分な活性を有する物質は未だ得られていない一方、現在抗ウィルス剤、特にインフルエンザ治療剤としては、例えば GS4104 (W096/26933) ゃザナミビル (zanami v i r： 4-guan i d i no-Neu4Ac2en： W091/1632 0 、 W094/07885) 等のシァリダーゼ（ノイラミニダーゼ）阻害剤が有効であることが一般に知られている。

へパリン及びその誘導体は生体物質であるため抗原性が低いが、抗血液凝固活性が高いため医薬品として使用する際の用途及び濃度が大幅に限定されていた。一般にへパリンを体内へ投与する場合は、その抗血液凝固活性の高さによる出血活性が重大な問題点となっている。そこで、抗血液凝固活性が低く、更に神経障害改善効果が増強された新たな物質が期待されている。

発明の開示

上記課題の解決に鑑み、本発明者らは、血液に対する抗凝固活性が低く、優れた神経障害改善効果を持つ物質を得ることを目的として鋭意検討した結果、特定の構造を有するグリコサミノグリカン誘導体が高い神経突起伸長活性、すなわち、神経障害改善活性を有することを見い出し、当該物質は抗血液凝固活性がへパリンに比して大幅に低下していることを確認することにより本発明を完成した。すなわち、へキソサミンとへキスロン酸の二糖の繰り返し単位構造を基本骨格として有し、部分的にその構成単糖であるへキスロン酸の 2位と 3位の炭素原子間は開裂しており、更に開裂していないへキスロン酸の少なくとも一部がその 2位に硫酸基を有しない、新規なグリコサミノグリカン誘導体が、抗血液凝固活性が低く、しかも優れた神経突起伸長活性を有することを見い出し、当該性質を利用することにより神経障害の改善に優れた効果を有する医薬組成物を提供することを可能とした。また、更に本発明者らは、細胞死及び神経突起の退縮に際し、シァリダーゼ活性が上がり細胞膜上で神経栄養因子活性の維持、促進に関わることが知られているガングリオンドが減少することに基づき、探索を進めた結果、上記新規なグリコサミノグリカン誘導体が、驚くべきことに強いシァリダ一ゼ阻害活性を有することを見出し、上記グリコサミノグリカン誘導体の当該阻害活性を利用したシァリダ一ゼ阻害剤を提供することを可能とした。

本発明の第 1の要旨は、以下の（a ) 、（b ) 及び（c ) の性質を有し、且つ (d) に記載の一般式（ 1 ) で表される構造を、へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造で形成される基本骨格 1分子あたりに 1以上有する新規グリコサミノグリカン誘導体である。

(a) グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマ卜グラフィ一による分析を組み合わせた二糖分析により得られる二糖体組成において、 2-デォキシ -2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキシ- 2- 0-スルホ - - L- threo- hex-4-エノピラノシルゥ口ン酸） -6-0-スルホ -D-グルコース（以下 ADiHS- tri(U， 6， N)Sとも記載する）のモル％が 0〜10%、 2-デォキシ- 2-スルファミノ -4-0- (4-デォキシ- α- い threo- hex- 4-エノピラノシルゥ口ン酸） -6 - 0-スルホ -D -グルコース（以下 ADiH S - di(6，N)Sとも記載する）のモル％が 95〜70%であり、 2-デォキン- 2-スルファミノ - 4- 0- (4-デォキシ- い threo- hex - 4-エノビラノシルゥ口ン酸）- D-グルコ一ス（以下 ADiHS- NSとも記載する）のモル％が 5〜20%であること。

(b) 標準血漿に最終濃度 3 g/mlで添加して測定した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT) が 50秒以下であること。

(c) 重量平均分子量が 9, 000〜13， 000 Da (ダルトン）であること。

( d ) 一般式（ 1 )

(但し、 R¹は H又は S0₃Hであり、 R²は C0CH₃又は S0₃Hを示す。 )

本発明の第 2の要旨は、下記工程①及び②を含む、上記（a) 、（b) 及び（ c) の性質を有し、且つ（d) に規定する特定構造を有する新規グリコサミノグリカン誘導体の製造方法であり、第 3の要旨は、該グリコサミノグリカン誘導体を有効成分とする医薬組成物である。

① へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリ力ンを開裂処理して、その骨格中に存在する 2位に硫酸基を有しないへキス口ン酸の少なくとも一部の 2位と 3位の炭素原子間のみを開裂するェ程、

② へキス口ン酸の 2位の硫酸基を特異的に除去しうる脱硫酸化手段によりェ程①の生成物を脱硫酸化処理し、 2位に硫酸基を有する全へキスロン酸の 90%以上の当該硫酸基を脱硫酸化する工程。

(発明の実施の形態）

以下に本発明を更に詳説する。

本発明物質

本発明物質は上述の如く、（a ) 、（b ) 及び（c ) の性質を有し、且つ（d ) に規定する特定構造を有する新規グリコサミノグリカン誘導体である。

本明細書中における「へキソサミン」とは、へキソース（六単糖）の 2位炭素原子にアミノ基、ァセチルァミノ基又はスルホアミノ基を有し、 6位ヒドロキシル基が硫酸化されていることもある単糖を指称し、「へキスロン酸」とは、へキソースの 6位炭素原子がカルボキシル基を形成し、 2位ヒドロキシル基が硫酸化されていることもある単糖を指称し、「グリコサミノダリカン」とは、上記へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位で形成される構造を基本骨格とする多糖を指称し、「硫酸化グリコサミノダリカン」とは特に上記グリコサミノグリカンのうち硫酸基を有するへキソサミン又はへキスロン酸を構成単糖として有するグリコサミノグリ力ンであって、 2位に硫酸基を有しないへキスロン酸を少なくとも 1以上構成単糖として有している多糖を指称する。

なお、本発明における上記（a ) のグリコサミノグリカン誘導体の二糖体組成は、後述する実施例の試験法 1に記載の二糖分析法による測定値から算出したものであり、また（c ) の重量平均分子量は実施例の試験法 2に記載の分子量測定法による測定値である。更に（b ) の APTTは実施例の試験法 4に記載の APTT測定法による測定値である。

( a ) に規定する二糖体組成は、試験法 1に記載の酵素消化と高速液体クロマトグラフィーを組み合わせた二糖分析により特定が可能な下記一般式（7 ) で示される不飽和二糖の総量 [2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4- 0-(4-デォキン-な _L- t hreo- hex-エノピラノシルゥロン酸）- D -グルコース（以下 A DiHS- OSと記載する）、 2-ァセトアミド -2-デォキシ _4- 0- (4-デォキシ- α -い threo-hex- 4-エノピラノシルゥロン酸） -6-0-スルホ -D-グルコース（以下 ADiHS-6Sと記載する）、 2-デォキシ- 2-スルファミノ - 4- 0 -（4-デォキシ -α-レ threo- hex - 4-エノビラノシルゥ口ン酸）- D -グルコース（厶 DiHS- NS) 、 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4- 0_(4-デォキシ- 2-0-スルホ -な-し- threo- hex- 4-エノビラノシルゥ口ン酸） -D -グルコース（以下厶 DiHS_USと記載する）、 2-デォキシ- 2-スルファミノ- 4-0- (4-デォキン-な-い threo- hex_4-エノビラノシルゥ口ン酸）- 6-0-スルホ -D-グルコース（ADiHS- di(6 ，N)S) 、 2-デォキシ- 2-スルファミノ- 4- 0_(4-デォキシ- 2-0-スルホ -α-い threo - hex-4-エノビラノシルゥ口ン酸）- D-グルコース（以下 ADiHS- di(U，N)Sと記載する）、 2-ァセトアミド- 2-デォキシ- 4-0- (4-デォキシ- 2-0-スルホ - - L- threo - he X - 4_エノビラノシルゥ口ン酸）_6-0-スルホ -D -グルコース（以下 ADiHS-dKU， 6)S と記載する）、 2-デォキシ- 2-スルファミノ- 4- 0_(4-デォキシ- 2-0-スルホ -α -い threo-hex- 4-エノビラノシルゥ口ン酸）- 6-0 -スルホ -D-グルコース（ADiHS_tri( U，6,N)S) のモル％の合計] を 100%として、上記特定の構造を持つ各不飽和二糖の割合を示したものであり、当該数値は酵素消化前のグリコサミノグリカン誘導体の硫酸基の位置及び数を反映するものである。

表 1

不飽和二糖構造式の置換基

R¹ R² R³

厶 DiHS- 0S H C0CH₃ H

△ DiHS - 6S S0:,H C0CH;, H

△ DiHS- NS H SO3H H 99/43714

ADiHS-US H COCH_r SO3H

厶 DiHS- di(6，N)S S0₃H S0₃H H

厶 DiHS- di(U，N)S H SO3H SO3H

ADiHS-di(U, 6)S S0₃H COCH_; SO3H

△ DiHS- tri(U， 6，N)S S0₃H SO3H SO3H

また、上記略号の示す構造は以下の通り表記されることもある。

△ DiHS- OS： AHexAl→4GlcNAcヽ ADiHS- 6S： AHexAl→4GlcNAc(6S)、 ADiHS-NS ：厶 HexAl→4GlcNS、 ADiHS-US： AHexA(2S)l→4GlcNAc, ADiHS-di(6, N)S： ΔΗ exAl→4GlcNS(6S)、 ADiHS- di (U， N)S : AHexA(2S)l→4GlcNS、 ADiHS-di (U， 6)S ： AHexA(2S)l→4GlcNAc(6S), ADiHS- tri(U， 6， N)S : AHexA(2S)l→4GlcNS(6S)₀ 上記式中、 ΔΗεχΑは不飽和へキスロン酸、 GlcNAcは Ν-ァセチルダルコサミン、 GlcNSは N-硫酸化ダルコサミン、力ッコ内は硫酸基の結合位置を示す。

上記二糖分析法において生成する一般式（7) の構造を有する不飽和二糖は、分析対象となるグリコサミノグリカンの基本骨格を構成する一般式（3) 及び（ 4) のへキスロン酸と一般式（6) のへキソサミンが結合した、一般式（2) 中の（A) — (B) の基本構造より生じる。

本発明のグリコサミノグリ力ン誘導体は、グリコサミノグリカンより誘導された特定の物性を有する新規多糖類であるが、便宜上グリコサミノグリ力ン誘導体として本明細書中で記載する。

本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、試験法 1に記載の二糖分析法による測定値から算出した二糖体組成のうち ADiHS-triOJ, 6， N)Sのモル％が 0〜10%、好ましくは 0〜5%、より好ましくは 2~4%であり、 ADiHS-dK6，N)Sのモル％力く 9 5〜70%、好ましくは 90〜80%、より好ましくは 82〜87%であり、更に ADiHS-NS のモル％が 5〜20%、好ましくは 10〜15%、より好ましくは 11〜14%である硫酸化多糖であり、且つその重量平均分子量は試験法 2に記載の分子量の測定法による測定値が 9，000~13， 000Da、より好ましくは 10， 000〜12， OOODaである。

また、本発明のグリコサミノグリカン誘導体はへキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位で形成される構造を基本骨格とするグリコサミノグリ力ン誘導体である。前記へキソサミンとしてはダルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンなどが挙げられる力ダルコサミンが好ましい。へキソサミンはァミノ基又は 6 位ヒドロキシル基のうちの一方あるいは両方が硫酸化されている、すなわち N— 硫酸化及びノ又は 6— 0—硫酸化されていることが好ましいが、硫酸基を持たないへキソサミンであっても何ら支障はない。へキス口ン酸としては D-グルクロン酸、レイズロン酸などが挙げられる。へキスロン酸の一部はその 2位と 3位の炭素原子間で開裂し、好ましくは酸化的開裂反応後、該開裂部位が還元されており、開裂していないへキスロン酸は、その 2位のヒドロキシル基の一部又は全部が硫酸基で置換されていないことが好ましい。そして基本骨格中の繰り返し単位の中に上記開裂されたへキスロン酸とへキソサミンが結合した前記一般式（ 1 ) で表される構造単位がグリコサミノグリ力ン誘導体 1分子あたり 1以上存在する。また、本発明グリコサミノグリカン誘導体は、標準血漿に最終濃度 3 /z g/mlで添加して測定した際の活性化部分卜ロンボプラスチン時間（APTT) が 50秒以下である特性を有する。このような特性を有する本発明グリコサミノグリ力ン誘導体は下記の一般式（2 ) で示すことができる。

ただし、（A ) は下記一般式（3 ) で示されるグルクロン酸残基、下記一般式 ( 4 ) で示されるィズロン酸残基、又は下記一般式（5 ) で示される開裂されたへキスロン酸残基であり、

OR³

(B) は下記一般式（6 ) で示されるへキソサミン誘導体残基をそれぞれ示す _c

ただし、一般式（3 ) 〜（6 ) において R¹及び R³はそれぞれ独立に H又は S0₃H であり、 R²はそれぞれ独立に C0CH₃又は S0₃Hを示す。

また、一般式（2 ) で表される本発明グリコサミノグリカン誘導体の分子中には、 R'又は R²の少なくとも一方が S0₃Hである一般式（6 ) で示されるへキソサミン残基が存在する。

さらに、一般式（2 ) において、 nは 15 n≤40、好ましくは 20 n≤30を充たす整数であり、（A) の少なくとも一つは一般式（5 ) の残基である。

上記本発明のグリコサミノグリカン誘導体（以下、本発明物質と称することもある）は、へキソサミンとへキスロン酸を基本骨格とし、硫酸基を有する糖鎖の誘導体であれば、前記（_a) 〜（d) の特性を充足する限り特に限定はされないが、へパラン硫酸又はへパリンの誘導体が好ましく、特にへパリンの誘導体が好ましい。本発明物質は、一部のへキスロン酸が 2位と 3位の炭素原子間で開裂した構造である。また、本発明物質を構成する開裂していないへキスロン酸の 2位のヒドロキシル基の硫酸化率は 10%未満であり、 5%未満であることが好ましい。本発明グリコサミノグリカン誘導体は上記一般式（2 ) で示すことができ、式中 O 99/43714 nは 15 n 40、好ましくは 20 n 30、すなわち 30〜80糖残基、好ましくは 40〜 60糖残基を有する多糖である。また、当該物質の抗血液凝固活性は低く、健常人から採取した標準血漿に最終濃度 3 z g/mlで添加して測定した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT) が、 50秒以下であることが好ましい。

本発明物質のグリコサミノグリカン誘導体は、実施例中の Wi s tar系ラッ卜大脳皮質神経細胞の初代培養細胞を使用した神経突起伸張活性試験において、培地中の最終濃度1 ^ 2/1111〜10 // ^1111の濃度範囲で添加、培養を行った場合に、標準へパリンと比して 1. 5倍以上の活性を有することが好ましい。

また、本発明物質は実施例に記載の方法で測定したシァリダーゼ阻害活性、特にィンフルェンザウィルスのシァリダ一ゼ阻害活性が、公知のシァリダーゼ阻害剤や標準へパリンに比し、著しく強いものが好ましい。

本発明製造方法

本発明製造方法は、へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とし、へキスロン酸の一部はその 2位と 3位の炭素原子間で開裂、好ましくは酸化的開裂反応による開裂後、更に該開裂部位が還元され、未開裂のへキスロン酸の 2位の硫酸基の大部分が脱硫酸化されているグリコサミノグリカン誘導体を製造するもので、下記の①及び②の工程を含むことよりなる製造方法である。

① へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とするグリコサミノグリカンを開裂処理し、その 2位に硫酸基を有しないへキスロン酸の少なくともその一部を 2位と 3位の炭素原子間のみを開裂する工程、

② へキスロン酸の 2位の硫酸基を特異的に除去しうる脱硫酸化手段によりへキスロン酸の 2位の硫酸基を特異的に除去しうる脱硫酸化手段により工程①の生成物を脱硫酸化処理し、 2位に硫酸基を有するへキス口ン酸の 2位の硫酸基の 90 %以上を脱硫酸化する工程。

1 . 硫酸化グリコサミノグリカン（原料）

本発明方法のグリコサミノグリ力ンは、へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とし、 2位に硫酸基を有しないへキスロン酸を少なくとも 1以上構成単糖として有している多糖である。前記グリコサミノグリカンとしては、例えばへパリン、へパラン硫酸などが挙げられ、好ましいが、特に上記へキスロン酸の 2位ヒドロキシル基の硫酸化率が高く、下記工程①によるへキスロン酸の開裂が適度に抑えられることからへパリンが好ましい。

2 . 工程①：へキスロン酸の開裂処理

本発明方法における工程①に記載の「開裂処理」とは、硫酸化グリコサミノグリ力ンの構成単糖中、 2位に硫酸基を有しないへキスロン酸の 2位と 3位の炭素原子間のみを特異的に開裂させる処理であれば特に限定はされないが、具体的には酸化，還元反応処理が挙げられる。当該酸化 ·還元反応処理は、酸化剤を用いた酸化反応により上記特定のへキス口ン酸の 2位と 3位の炭素原子間を開裂して酸化的開裂反応生成物を得た後、へキスロン酸の開裂部に生じたアルデヒド基を還元反応処理により還元する方法によって行われる。上記酸化剤としては本反応の目的を達成することが可能な物質であれば特に限定はされないが、過ヨウ素酸塩や過酸化水素などが挙げられ、その中でも特に過ヨウ素酸塩が好ましい。過ヨウ素酸塩としては過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸力リウム等の過ヨウ素酸アル力リ金属塩が挙げられるが、過ヨウ素酸ナトリウ Aが好ましい。

上記開裂処理として酸化 ·還元反応処理を行う場合は、例えば過ヨウ素酸ナトリゥムを0. 01〜0. 3\1、好ましくは 0. 05〜0. 2Mの濃度で含有し、上記硫酸化グリコサミノグリカンを 0. 5〜10%、好ましくは 1〜7%の濃度で含有する溶液中において、 pHは 3〜7、好ましくは 4〜5、処理温度は 0〜37°C、好ましくは 0〜10°C、さらに好ましくは 4°Cの条件下、 1曰以上、好ましくは 3日間酸化反応を行う。酸化反応後、過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを、 100~500mMのエチレングリコールあるいはグリセリンなどを添加することによって還元反応により分解する。その後、必要に応じて、蒸留水による透析を行ったり、さらに凍結乾燥あるいはエタノール沈澱法などの方法を用いてへキスロン酸の酸化的開裂反応生成物を得ることができる。

その後、更に過ヨウ素酸酸化によってへキスロン酸の開裂部に生成したアルデヒド基を還元してへキスロン酸の酸化 ·還元反応処理を完了する。前記アルデヒド基の還元は、還元剤として水素化ホウ素アル力リ金属塩又は水素化アルミニゥムリチウム等を使用して行うことができる力 <、還元剤は特に水素化ホウ素アル力リ金属塩が好ましく、水素化ホウ素ナトリウムが最も好ましい。還元剤として水素化ホウ素ナトリウムを用いる場合、例えば 0. 1〜0. 5M、好ましくは 0. 2Mの水素化ホウ素ナトリゥムを含む pH8. 5〜9. 5の 1〜20%、好ましくは 5〜10 %の上記酸化的開裂反応生成物（w/v) を含む溶液を 4°C、 3時間反応させることによって実施することが好ましい。更に、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを反応液の pHを 4〜5 に調節することによつて分解し、蒸留水に対する透析によつて還元反応を停止して過ヨウ素酸酸化 ·還元反応生成物のナ卜リウム塩を得ることが好ましい。

特に原料としてへパリンを使用した場合は、過ヨウ素酸塩と水素化ホウ素アル力リ金属塩を使用する酸化 ·還元反応処理による開裂処理を行うことが好ましく、当該処理によりへパリンの過ヨウ素酸化還元生成物である過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリンが得られる。

上記硫酸化グリコサミノグリ力ンの構成単糖中のへキスロン酸を特異的に開裂させる処理によって得られる硫酸化グリコサミノグリ力ンのへキスロン酸開裂物は、次工程②において少なくとも一部のへキスロン酸の 2位の硫酸基が脱硫酸化される。

3 . 工程②：脱硫酸化処理

本発明方法における工程②に記載の「脱硫酸化処理」とは、工程①で生じた「硫酸化グリコサミノグリカンのへキスロン酸開裂物」を構成する 2位に硫酸基を有するへキスロン酸において、当該 2位の硫酸基を選択的に脱硫酸化する処理（選択的脱硫酸化処理）であれば特に限定されず実施されるが、完全に脱硫酸化することを目的とする場合にはアルカリ性条件下で行う方法、即ち、加水分解反応による方法、特に水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物水溶液又は水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムなどのアル力リ土類金属水酸化物水溶液、好ましくはアル力リ金属水酸化物水溶液、特に好ましくは水酸化ナトリウム水溶液に上記工程①で得られた硫酸化グリコサミノグリカンのへキス口ン酸開裂物を溶解して溶液とした後、ただちに凍結して凍結乾燥を行う工程を含む方法が好ましい。

具体的にはグリコサミノグリカンのへキスロン酸開裂物の溶液を、好ましくは氷冷（0°C ) 〜室温（24°C ) において 0. 0125〜0. 2Nのアルカリ金属水酸化物水溶液又はアル力リ土類金属水酸化物水溶液にグリコサミノグリカンのへキスロン酸開裂物を溶解して調製した後、凍結乾燥を行う。その後更に、この凍結乾燥物が 1〜2. 5M、好ましくは 2Mとなるように、再度アルカリ金属水酸化物水溶液又はァルカリ土類金属水酸化物水溶液（0. 0125〜0. 2N) へ溶解し、その後、酸好ましくは弱酸、さらに好ましくは酢酸などのカルボン酸によって PHを 8〜10に調整した後、ただちに蒸留水に対して 1日以上、好ましくは 2日間透析を行い、凍結乾燥あるいはエタノール沈澱法を行うことが好ましい。

硫酸化グリコサミノグリカンのへキスロン酸開裂物の脱硫酸化は、通常、開裂していないへキスロン酸の 2位の硫酸基の 70%以上、好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上が除去されるように行う。

本発明方法において原料の硫酸化グリコサミノグリカンとしてへパリンを使用して工程①で得られる過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリンを用い、上記部分的脱硫酸化処理を行った場合、本発明の部分的 2-0-脱硫酸化過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリン力く得られる。

出発物質としてへパリンから、上記工程①の開裂処理及び②の脱硫酸化処理により本発明のグリコサミノグリカン誘導体を製造する反応工程の概略図を図 1に示す。図中、（a ) はへパリンの模式図、（b ) はへキスロン酸の酸化的開裂反応によりアルデヒド基が生成した反応生成物、（c ) は（b ) のアルデヒド基を還元反応処理した還元反応処理物、（d ) は 2 — 0—硫酸基を選択的に脱硫酸化した本発明グリコサミノグリカン誘導体を意味する。

本発明組成物 1

本発明組成物 1は本発明物質であるグリコサミノグリカン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を有効成分として含有する神経疾患治療剤である。

神経突起伸張活性を有するグリコサミノグリカン誘導体は、その活性を利用する医薬組成物、例えば中枢神経の障害（例えばアルツハイマー症及び虚血性痴呆症など）又は末梢神経の障害（例えば糖尿病性神経障害、アルコール性神経障害、筋萎縮性側索硬化症（ALS) 、外傷又は医薬品の副作用による末梢神経損傷、及びギランバレー症候群など）に対する神経疾患治療剤として有用である。また、本発明組成物 1の有効成分である本発明グリコサミノグリカン誘導体は、神経細胞の生存維持、シナプス機能の維持、軸索機能の維持に関与する細胞膜上のガングリオシドのシァリダーゼによる分解を抑え、神経変性に伴う神経機能の低下を防止することからも神経機能低下抑制剤として治療剤及び予防剤に利用可能である。

本発明組成物 2

本発明組成物 2は本発明物質であるグリコサミノグリカン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を有効成分として含有するシァリダーゼ阻害剤である。

シァリダーゼ阻害活性を有する本発明物質のグリコサミノグリカン誘導体は、その活性を利用するシァリダーゼ阻害剤として利用することが可能である。特にウィルスのシァリダーゼを阻害することによってウィルスの增殖を阻害することができ、抗ウィルス剤、特に抗インフルエンザ治療薬として使用しうる。特に、シァリダーゼ阻害活性を有し、ィンフルェンザ治療薬として使用されている公知のシアル酸誘導体と比較して、本発明物質は格段に優れたシァリダーゼ阻害活性を示す。

本明細書中において、「治療薬」とは、患者の状態を健常な状態へ改善する薬剤や、疾病を緩和するための薬剤のみならず、疾病への感染、罹患を防ぐ「予防のための薬剤」の概念をも包含する。

本発明組成物 1及び 2の有効成分として利用されるグリコサミノグリカン誘導体の薬理学的に許容されうる塩としては、アミン塩、第四級アンモニゥム塩、ァルカリ金属塩及びアル力リ土類金属塩のうち薬理学的に許容されるものが挙げられ、具体的には例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシゥム塩等を例示することができるカ^ 特にアル力リ金属塩であるナトリウム塩及び力リゥム塩などが好ましく、その中でも生体への親和性などの面からナトリウム塩が最も好ましい。

本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、標準へパリンに比して抗血液凝固活性が低い特性を呈するものである。特に好ましいグリコサミノグリ力ン誘導体は、後記試験法 4に記載の方法に従い、測定溶液中での濃度（最終濃度）を 3 / g/m 1として APTTを測定すると、測定値が 50秒以下となることが最も好ましい。また、医薬組成物としての本発明組成物に使用するグリコサミノグリカン誘導体（本発明物質）は後述のトロンビン時間（以下「TT」と記載する）測定法により算出した ΤΤ活性と、 ΑΡΤΤ測定法により算出した ΑΡΤΤ活性の少なくとも一方が、標準へパリンと比較して 5%以下となることが好ましい。さらにより好ましいものは、 T T活性、 APTT活性が共に標準へパリンと比較して 3%以下であり、両活性の関係が 0≤TT活性 ZAPTT活性≤0. 5であるところの、相対的に ΤΤ活性が低いものは、医薬組成物に用いた場合、出血活性が低いことが期待され有用である。

本明細書中における標準へパリンとは、実施例に記載された標準へパリンと同一の物質である。

本発明物質を有効成分として含有する医薬組成物を、生体内に投与する際の剤形及び投与経路としては、対照となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。例えば、それらをそのまま、又は他の薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤等と共に医薬組成物製剤（例えば、注射剤、坐剤、錠剤、力プセル剤、液剤、軟膏、ゲル剤）として、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ゥマ等）に対して、非経口的又は経口的に安全に投与することができる。

上記神経疾患治療剤の投与形態としては非経口的投与が好ましく、前記投与形態に適した形態としては注射剤が挙げられ、その投与方法は注射あるいは点滴などによる静注が好ましい態様として挙げられるが、これに限定されるものではない。

ィンフルェンザ治療薬の投与形態としては経口投与及び非経口投与いずれの投与形態も適宜選択することが可能である。経口投与に適した剤形としては例えば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、エアゾール剤及びスプレー（噴霧）剤等が挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては液剤が挙げられる。更に、特にィンフルェンザ治療薬を予防のために使用する形態としては経口投与により投与される液剤も好ましく、該液剤をスプレー等の手段を用いて投与する形態が好ましい形態として挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

上述の医薬組成物の有効成分であるグリコサミノグリカン誘導体の配合量並びに投与量は、その製剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、患者の体重等に応じて個別的に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、患者に投与されるグリコサミノグリカン誘導体量は静注では 1日当たり概ね 100 / g/kg〜100mg/kg程度を例示することができる。また、上記製剤の投与回数は 1 日 1回程度でも可能であり、 1日 2〜4回、又はそれ以上の回数に分けて投与することもできる。また、例えば点滴などにより連続的に投与することも可能である。なお、上述した医薬組成物の有効成分であるグリコサミノグリカン誘導体は、後述する実施例において細胞に対する毒性は見られなかった。へパリンのマウス (雄、雌）における急性毒性試験による LD₅。は、経口投与で 5，000mg/kg以上、皮下又は腹腔内投与で、 2， 500mg/kg以上、静注で l，000mg/kg程度であることが知られている。本発明の医薬組成物の有効成分であるグリコサミノグリ力ン誘導体は、 APTT活性、 TT活性が標準へパリンと比して共に 3 %未満と極めて低いため、このことからも医薬組成物の有効成分であるグリコサミノグリカン誘導体（本発明物質）の安全性の高さが裏付けられる。図面の簡単な説明

図 1は本発明グリコサミノグリカン誘導体の製造工程の一例を示す模式図である o

図 2は標準へパリン（a ) 及び本発明物質（b ) の H P L Cによる溶出チヤ一ト図である。

図 3は標準へパリン、本発明物質及び過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリンの培地中の濃度による神経突起伸張活性の変化を示す図である。図中、縦軸は神経突起伸長活性（％) 、横軸は培地中の濃度（/z g/ml) を示す。

図 4は標準へパリン及び本発明物質の濃度変化による APTT及び TTの変化を示す図である。図中、縦軸は凝固時間（秒）、横軸は最終濃度（^ g/ml) を示す。図 5は不飽和二糖標準品（a ) 、標準へパリン（b ) 、及び本発明物質（c ) の二糖体分析における HPLCによる溶出チヤ一ト図である。

図 6は本発明物質の神経細胞死抑制活性への影響を示す。図中、縦軸は救済された細胞割合（％) 、横軸は最終濃度（/ g/ml) を示す。

図 7は標準へパリン及び本発明物質のシァリダーゼ活性への影響を示す。図中、縦軸はシァリダ一ゼ活性（％) を示す。

図 8は本発明物質及び NeuAc2enのシァリダーゼ活性への影響を示す。図中、縦軸はシァリダ一ゼ活性（％) 、横軸は溶液濃度（ z g/ml ) を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。

なお、実施例における試験法は以下の通りである。

試験法 1

[酵素消化による二糖分析]

本発明物質及び標準へパリンの硫酸基の位置の分析は、次のようにして行ったすなわち、それぞれのグリコサミノグリカンを酵素消化し、生成した不飽和二糖

(前記一般式 (7)) を高速液体クロマトグラフィー（HPLC) で分析した [新生化学実験講座 3、糖質 II (東京化学同人刊、 1991) p49— 62に記載の「2· 8グリコサミノグリカン分解酵素と HPLCを組み合わせた構造解析」参照] 。各不飽和二糖のピーク面積を計算して、全面積に対するピーク面積をパーセントとして表した

(1 ) 標準へパリン及び本発明物質の分解酵素による消化

新生化学実験講座 3、糖質 II p.53— 59に記載の方法により消化酵素で分解した。標準へパリン及び本発明物質各 l.Omgを 2mM酢酸カルシウムを含む 20m酢酸ナトリウム（pH7.0) 220〃 1に溶解して、 20mUのへパリチナ一ゼ、 20mUのへパリチナ一ゼ I及び IIを加えて、 37°Cで 2時間反応させた。

(2) HPLCによる分析

標準へパリン又は本発明物質の分解酵素による消化を行った後の溶液 50 / 1を、 HPLC (医理化、モデル 852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（Dionex 社、 CarboPac PA- 1カラム 4. Ommx 250議）を使用し、 232nmでの吸光度を測定した。不飽和二糖スタンダード（生化学工業（株）製）を基準とし（Yamada, et a 1.， J. Biol. Chem. , 270, 8696-8706， (1995)) 、流速 lmlZ分で、塩化リチウムを用いたグラジェント系（50mM→2.5M) を用いる方法に準拠した（Kariya, et al.， Comp. Biochem. Physiol., 103B, 473, (1992)) 。

試験法 2

[分子量測定]

標準へパリン又は本発明物質の 1%溶液 5 1を HPLCによるゲルろ過で分析したカラムは TSKgel— (G4000 + G3000 + G2500) PWX (東ソ一、 7.8誦 X30cm) を用 714 い、 0.2N塩化ナトリウムで、 40°C、 0.6mlZ分の流速で展開した。検出には示差屈折計（島津製作所、 AID-2A) を用いた。表一 1における重量平均分子量はへパリンの分子量標準品を対照として求めた（Kaneda et al.， Biochem. Biophys. R es. Comm. , 220, 108-112(1996)) 。

試験法 3

[神経突起伸張活性の測定]

妊娠 17日の Wistar系ラット（日本 SLC社）より胎児を無菌的に取り出した。さらに、胎児より脳を取り出し、無硫酸化 DMEM培地 (無水 CaCl ₂ 500mg、 Fe(N0)₃/9 H₂0 0.25m g, KC1 lOOOmg, MgC 193.3mg、 NaHC0₃ 9250mg、 NaH₂P0₄/H₂0 3 12.5mg、フエノールレッド 37.5mg、ピルビン酸ナトリウム 275mg、 MEMァミノ酸 100ml (ギブコ No.11130- 051) 、 L -グリシン 75mg、いグルタミン 1460m g、ぃセリン 105mg、 MEMビタミン溶液 100ml (ギブコ No.11120- 052) 、 NaCl

15150mg、 D-グルコース 11250mgに滅菌蒸留水を加えて 2.5Lとして pHを 7.2に調整）中で小脳、中脳、間脳及び髄膜を取り除き大脳皮質を得た。

10匹分の大脳皮質を 60mmのディッシュ上で安全かみそりで縦横各々 100回細切し、 10mlリン酸緩衝生理食塩液（PBS) を 2回加えて大脳皮質接片を 50mlのフアルコンチューブに分注し、 11mlの無硫酸化 DMEM培地を加えた。軽く振盪することにより均一に懸濁しながら、 0.5mlずつ 0.1%ポリエチレンィミンコートした 24穴プレート（底面積 2cm²)にまいた。培養開始 2時間後に 100 1を抜き取り、培地中の最終濃度の 10倍の濃度で被検物質を含む 50 zlの PBS、 50 1の400^ の塩素酸 /無硫酸化 DMEM培地を添加した。 2日間 37°C5%C0₂条件下で培養した後、 1%ダルタルアルデヒド/ PBS 500〃 1をゆっくり重層して室温で 20分間固定した。サクシヨンで上清を除去した後、 0.5ml PBSをゆっくり重層しすぐにサクシヨンで除去した。 20%ギムザ液 Zリン酸カリウム緩衝液を重層して室温に 2時間放置した。サクシヨンで上清を除去した後、 0.5mlの PBSを加えた。光学顕微鏡下 40倍でゥェル全視野に存在する 50〜200 zmの大脳皮質神経細胞集塊 100個のうち突起伸張が観察されたものを計数して割合（％) を算出した。

試験法 4

[APTT及び TTの測定] APTTの測定のため、ラッ卜の下大動脈より 3.2%クェン酸 1/10容量で採取し、血液を 1， 000 xg、 10分間遠心分離して得た血漿 100 1と様々な濃度の各サンプル 100 1とを測定用カップに入れ、 37°Cで 1分間保温した。その後、あらかじめ 37 °Cに保温しておいたァクチン（商品名：吉富製薬（株）） 100〃 1を添加し、さらに 2分間保温した。次いで、 37°Cに保温しておいた 0.02M CaCl₂溶液を添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を血液凝固自働測定装置（KC-10A :ァメルング社製）で測定した。また表一 2において、本発明物質及び標準へパリンそれぞれの APTTが 1 0 0秒となる培地中の最終濃度を求め、標準へパリンの前記濃度を本発明物質の前記濃度を基準として百分率で算出し、この数値（％) を本発明物質の APTT活性とした。

TTの測定のため、上記ラット血漿 100〃 1と様々な濃度の各サンプル 100〃 1とを測定用カップに入れ、 37°Cで 1分間保温した。その後、 37°Cに保温したトロンビン（10 U/ml) 100 /1を添加し、この時より凝固が起こるまでの時間を上記血液凝固自働測定装置で測定した。表一 2において、本発明物質及び標準へパリンそれぞれの TTが 1 0 0秒となる培地中の最終濃度を求め、標準へパリンの前記濃度を本発明物質の前記濃度を基準として百分率で算出し、この数値（％) を本発明物質の TT活性とした。

[本明細書における標準へパリン]

以下に示す物性のへパリンを標準へパリンとした。

( 1 ) 上記試験法 1に記載の二糖分析法による測定値から算出した標準へパリンのニ糖体組成は表— 3に記載のとおり、 ADiHS- OS： 4.1%、 ADiHS-NS： 3.4% 、 ADiHS-6S： 3.7%. ADiHS-US： 2.6%, ADiHS-di (6, N)S： 12.7%. 厶 DiHS- di (U，N)S : 7.6%、 ADiHS_di(U，6)S： 1.7%、 ADiHS_tri(U， 6， N)S： 64.2%であり

、この結果から 23.9%のゥロン酸の 2位には硫酸基が存在しないことが示されているは全てモル％比を表す）。

(2) 抗血液凝固活性が 160 IU/mgである。

(3) 重量平均分子量が11，000〜14，000 Daである。

実施例 1 (製造例）

1. 標準へパリンの過ヨウ素酸酸化 ·還元によるへキスロン酸の部分開裂処理 3714 P

へパリンナトリウム塩（重量平均分子量： 13, 700 Da、 Syntex社製 Lo t No. 4021 0910 :標準へパリン） 1. 3gを、過ヨウ素酸ナトリウムの存在下で酸化した。すなわちこの酸化反応は、 50mlの 0. 05Nの過ヨウ素酸ナトリウム、 50mMの酢酸ナトリゥムを含んだ PH5の溶液中で、へパリンナトリウム塩を 4°C、 3日間酸化処理して行った。酸化処理後、過剰の過ヨウ素酸を最終濃度 250mMのグリセリンを加えることで還元分解し、蒸留水に対して 2日間透析し、その後凍結乾燥することにより 1. 2gの過ヨウ素酸酸化へパリンを得た。この過ヨウ素酸酸化へパリンの生成時に生じたアルデヒド基を、 30mlの 0. 2N水素化ホウ素ナトリウム、 0. 25N炭酸水素ナトリウムを含んだ pH9の該酸化へパリン 1. 2gを含む溶液を 4°C、 3時間反応させることでこの過ヨウ素酸酸化へパリンのアルデヒド基を還元した。過剰の水素化ホウ素ナトリウムは、氷酢酸で反応液の pHを 5に調節し、 30分間室温で放置することで分解し、ふたたび 5Nの水酸化ナトリウムで pHを 9に調節した後、蒸留水への 2日間の透析と凍結乾燥により、 1. lgの過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリンのナトリウム塩を得た。

2 . 過ヨウ素酸酸化 '還元へパリンの部分的 2-0-脱硫酸化

上記 1で得た 1. lgの過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリンのナトリウム塩を、 20mlの 0. 05Nの水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、室温にて 20分間放置した。この溶液を凍結乾燥して選択的に 2位の硫酸基を脱硫酸化し、凍結乾燥パウダーを 10mlの 1N水酸化ナトリウム溶液で溶解し、 20%酢酸溶液で pH9に調節し、 30分間室温に放置した。その後、蒸留水に対して 2日間透析し、再び凍結乾燥して、脱硫酸化された過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリン（選択的 2-0-脱硫酸化過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリン）のナトリウム塩 0. 8gを得た。

上記試験法に従い、 HPLCにより本発明物質の重量平均分子量を測定し、その結果を図 2及び表一 1に示した。

表一 1

3 . 神経突起伸長活性、 APTT、 TTの測定表一 1に記載の標準へパリン及び上記 2により得られた本発明物質、更に上記 1により得られた過ヨウ素酸酸化 ·還元へパリンのそれぞれについて、上記試験法 3によりその神経突起伸張活性を調べ図 3に示した。その結果、本発明物質を 10 z g/mlで加えた際に大幅な神経突起伸長活性が見られた。さらに、上記標準へパリン及び本発明物質について、上述の方法により APTT及び TTを調べ、その結果を図 4に示した。また、試験法 4に則り APTT活性及び TT活性を算出し、 TT活性/ APTT活性を算出した。更に標準へパリン及び本発明物質の最終濃度を 3 g/mlに調整して試験法 4に則り APTTを測定した。これら各種測定の結果を標準へパリン及び本発明物質について表— 2に記載した。表一 2

APTT活性と比較して TT活性が低い物質は、医薬品として投与した際に抗血液凝固活性が低く、安全性が高いことが知られており、本発明物質がそのような物質であることが明らかとなつた。

更に、得られた本発明物質について、上記試験法 1による二糖分析を行い、その結果を図 5に示し又その測定値から二糖体組成を算出して結果を表一 3に記載した。

表一 3

Δ DiHS-

OS S 6S US (6,N)S (U, S (U,6)S (U,6, )S 標準へパリン 4.1 3.4 3.7 2.6 12.7 7.6 1.7 64.2 本発明物質 0.0 11.9 0.0 0.0 84.2 0.0 0.0 3.9

4.神経細胞死抑制活性の測定

本発明物質の運動神経細胞に対する細胞死抑制活性を測定した。

すなわち、予め 0.し¾ポリエチレンイミンで処理した 96穴マルチプレ' 卜に NSC - 714

34細胞（Cashman氏（トロント大学）より恵与：マウスの運動神経由来培養細胞株 ) 1X10⁵個/ mlを含む無血清の DMEM培地 0.09mlを添加して培養を行う。 2時間の培養後、本発明物質の 100、 1000、 10000jag/mlの水溶液を添加した（それぞれの培地中の最終濃度は 10、 100、 1000 /g/ml) 。その後、 46時間培養を継続し、 MTT法を用いて生存細胞数を血球計数板を用いて測定した。 2時間の培養後の生存細胞数とを比較して、本発明物質を添加しなかった対照の 48時間培養後の死細胞数を 100%として、本発明物質を添加した際の死細胞数との差（細胞死から救済された細胞数）の割合を百分率として算出した（図 6) 。

その結果、本発明物質 100及び 1000 zg/mlの水溶液を添加した系において、顕著に細胞死を抑制し細胞を救済する活性が観察された。 100^g/mlの水溶液を添加した際の細胞死を起こした細胞数は、標準へパリンと比較して、約半数であり、約半数の細胞が細胞死から救済されることが明らかとなった。また、生存した細胞においては、中枢神経由来の細胞と同様に神経突起の伸長促進活性が観察された。

5. シァリダーゼ阻害活性の測定

標準へパリン、本発明物質、及び公知のシァリダーゼ阻害剤である NeuAc2en ( 2—デォキシー 2， 3—デヒドロ一 N—ァセチルノイラミン酸）にっき、シァリダーゼ阻害活性を測定した。

5.1基質の調製

GM2ガングリオシド（ャトロン社製） lmgを 15mlのガラスチューブへ入れ、 0.8m 1の蒸留水を添加してソニケーシヨンにより溶解させた。そして、この溶液に 0.1 mlPdCl₂溶液（PdC12を 25mg/mlで蒸留水に添加した後、 30分間ソニケ一シヨンを行い、これを 2000xgで遠心分離して得られる上清画分）を添加して、撹拌した o 0.1mlの IN NaOHヽ 40〃 1の NaB³H₄ ( NEN社製： 100mCi/mmoK 1M NaOH) を添加して撹拌した後、窒素ガスでチューブ内を置換した後、室温で 24時間撹拌し、ミクロスパーテルにー搔きの NaBH₄を添加して更に 3時間室温で撹拌した。その後、 1M酢酸約 0.6mlを徐々に加えて反応を終了させ、この反応液を AG50W- X8 (バイオラッド社製：樹脂量 3ml、メタノールにより膨潤）のミニカラムに通塔し、 10ml のメタノールにより完全に溶出させる。この溶出した基質を窒素ガスで乾固させ、基質の [³H]GM2を調製した。

5.2シァリダーゼ活性の測定

上記 4.1で調製した基質 [³H]GM2(15nmol)、 1¾ Triton X-100(10 zl)、 0.1M酢酸ナトリウム/酢酸緩衝液（40 1)、 NSC- 34細胞（シァリダーゼを発現している運動神経由来培養細胞株）のホモジナイズ液（10 1、 lOO^gタンパク）、蒸留水 10 fi ならびに本発明物質又は標準へパリンの水溶液（10 g/ml) を 10 /1添加して、 37°Cで 1時間インキュベートした。インキュベート後、 5mlの蒸留水を添加し、 Sep-pak C18カートリッジカラム（Waters社製）に通塔し、メタノール（3ml ) 、その後クロ口ホルム：メタノール（l:l(v/v)、 3ml) により溶出した。溶出液を、 DEAE-セフアデックス A- 25カラム（フアルマシア社製：樹脂 lml、メタノールにより膨潤）に通塔し、クロ口ホルム：メタノール（l:l(v/v)、 3ml) により溶出させ、溶出液を乾固させた後、液体シンチレ一シヨンカウンターで放射能の量を測定して比較した。標準へパリン又は本発明物質の代わりに 10^1の蒸留水を添加した対照の放射能の量を 100 とした（図 7 ) 。

その結果、本発明物質は、標準へパリンと比較して、よりガングリオンドを分解するシァリダーゼの阻害活性が強いことが明かとなり、シァリダーゼ活性の上昇及び Z又はガングリオシドの減少を伴う疾病に適用できることが示された。更に、上記測定において、 10 g/mlの本発明物質及び標準へパリンの 10/zlの代わりに、本発明物質（10、 100、 1000/zg/ml) 又は NeuAc2en (10、 100、 1000 / g/ml) の水溶液 10〃 1を用いて同様にシァリダーゼ活性を測定した（図 8 ) 。その結果、本発明物質は、 NeuAc2enと比較して、よりシァリダーゼ阻害活性が強いことが明らかになった。

実施例 2 (製剤例）

( 1 ) 注射剤

前記実施例 1において製造した本発明物質（30mg/ml) を、終濃度 5mg/mlとなるよう 5%マンニトール水溶液に溶解し、これを無菌濾過した後、 2mlずつアンプルに分注して注射剤を製造した。

(2 ) スプレー剤

前記実施例 1において製造した本発明物質（30mg/ml) を、終濃度 lmg/mlとなるよう PBSに溶解し、これを無菌濾過した後、 20mlずつ、滅菌したスプレー容器に充塡して、スプレー剤を製造した。

( 3 ) 錠剤

前記の本発明物質の凍結乾燥物 100mg、乳糖 670mg、バレイショデンプン 150mg 、結晶セルロース 60mg及び軽質無水ゲイ酸 50mgを混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース 30mgをメタノールに溶解した溶液（ヒドロキシプロピルセルロース 10重量を添加して練合造粒した。次にこれを径 0. 8讓のスクリーンで押し出して顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム 15mgを添加して圧縮成型し、 200mgの錠剤を製造した。

( 4 ) カプセル剤

前記の本発明物質の凍結乾燥物 100mg、バレイショデンプン 150mg、軽質無水ケィ酸 50mg、ステアリン酸マグネシウム 10mg及び乳糖 765mgを均一に混合し、この混合物を 200mgずつ分取して硬力プセルに充塡してカプセル剤を製造した。

( 5 ) 軟膏剤

前記の本発明物質の凍結乾燥物 100mg、鉱油 4g、石油ゼリー 8g、混合メチルプロピルパラバン 60mg、非イオン性界面活性剤 lg及び精製水 30gを均一に混合し、この混合物を容器に充填して軟膏剤を製造した。産業上の利用可能性

本発明の新規グリコサミノグリカン誘導体は、抗血液凝固活性が低く、優れた神経突起伸張活性を有するので、当該物質を有効成分として含有する中枢神経或いは末梢神経などの神経疾患に対する有用な医薬組成物を提供することができる。また、本発明の新規グリコサミノグリカン誘導体は、強力なシァリダーゼ阻害活性を有するため、当該物質を有効成分として含有する抗ウィルス剤を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1. 以下の（a) 、（b) 及び（c) の性質を有し、且つ（d) に記載の一般式（ 1 ) で表される構造を、へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造で形成される基本骨格 1分子あたりに 1以上有することを特徵とするグリコサミノグリカン誘導体又はその塩。

(a) グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィ —による分析を組み合わせた二糖分析により得られるニ糖体組成において 2-デォキシ- 2-スルファミノ- 4-0_(4-デォキシ -2- 0-スルホ -α-レ threo- hex-4-エノビラノシルゥロン酸）- 6-0-スルホ -D-グルコースのモル％が 0〜10%、 2-デォキシ- 2 - スルファミノ -4-0- (4-デォキシ- -い threo- hex- 4 -エノビラノシルゥ口ン酸） - 6- 0 -スルホ - D-グルコースのモル％が 95~70%であり、 2-デォキシ- 2-スルファミノ - 4- 0-(4-デォキン-な _L-threo- hex- 4-エノピラノシルゥ口ン酸）- D-グルコースのモル％力く 5~20%であること。

( b ) 標準血漿に最終濃度 3 u g/mlで添加して測定した際の活性化部分ト口ンボプラスチン時間（APTT) が 50秒以下であること。

(c) 重量平均分子量が 9，000~13，000 Da (ダルトン）であること。

(d) —般式（ 1 )

(但し、 R'は H又は S0₃Hであり、 R²は C0CH₃又は S0₃Hを示す。 )

2. 下記一般式（2 ) の構造を有するグリコサミノグリカン誘導体であって、標準血漿に最終濃度 3 ig/mlで添加して測定した際の活性化部分卜口ンボプラスチン時間（APTT) が 50秒以下であることを特徴とするグリコサミノグリカン誘導体又はその塩。 HO - [ (A) - (B) ]„-H ( 2 )

ただし、（A) は下記一般式（ 3 ) で示されるグルクロン酸残基、下記一般式 (4 ) で示されるィズロン酸残基又は下記一般式（ 5 ) で示される開裂されたへキスロン酸残基のいずれかであり、

(B) は下記一般式（6) で示されるへキソサミン残基をそれぞれ示す c

ただし、一般式（3 ) 〜 ( 6 ) において R '及び R³はそれぞれ独立に H又は S0₃H であり、 R²は C0CH₃又は S0₃Hを示す。

また、一般式（2 ) において、 πは 15 n≤40を充たす整数であり、（A ) の少なくとも一つは一般式（5 ) の残基である。

3 . 下記の工程①及び②を含む方法により得られ、少なくとも前記一般式（5 ) で示される開裂されたへキスロン酸残基を有するグリコサミノグリカン誘導体又はその塩。

① へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンを開裂処理して、その骨格中に存在する 2位に硫酸基を有しないへキスロン酸の少なくとも一部の 2位と 3位の炭素原子間のみを開裂するェ程、

4 . へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンがへパリンであることを特徴とする請求項 3記載のグリコサミノグリカン誘導体又はその塩。

5 . 工程①の開裂処理が、過ヨウ素酸塩を使用する酸化的開裂反応を含むことを特徴とする請求項 3又は 4記載のグリコサミノグリカン誘導体又はその塩。

6 . 工程①において、更に酸化的開裂反応生成物を還元することを特徴とする請求項 5記載のグリコサミノグリカン誘導体又はその塩。

7 . 請求項 3の工程②におけるへキス口ン酸の 2位の硫酸基の脱硫酸化手段が、アル力リ金属水酸化物又はアル力リ土類金属水酸化物を使用する加水分解反応であることを特徴とする請求項 3〜 6のいずれか一項記載のグリコサミノグリ力ン誘導体又はその塩。

8 . 培地中の最終濃度 l g/ml〜10 / g/mlのグリコサミノグリカン誘導体を Wi s tar系ラット大脳皮質の初代培養細胞に接触させた際の該細胞の神経突起伸張活性が、同濃度範囲内の標準へパリンと比して 1. 5倍以上であることを特徴とする請求項 1 ~ 7のいずれか一項記載のグリコサミノグリカン誘導体又はその塩。

9 . 請求項 1〜8のいずれか一項に記載のグリコサミノグリカン誘導体又はその薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。

1 0 . 医薬組成物が神経疾患治療剤であることを特徴とする請求項 9記載の医薬組成物。

1 1 . 神経疾患治療剤が中枢神経疾患治療剤であることを特徴とする請求項 1 0記載の医薬組成物。

1 2 . 神経疾患治療剤が末梢神経疾患治療剤であることを特徴とする請求項 1 0記載の医薬組成物。

1 3 . 請求項 1〜 8のいずれか一項に記載のグリコサミノグリ力ン誘導体又はその薬理学的に許容し得る塩を有効成分として含有することを特徴とするシァリダーゼ阻害剤。

1 4 . インフルエンザウイルスのシァリダ一ゼを阻害する阻害剤であることを特徴とする請求項 1 3記載のシァリダーゼ阻害剤。

1 5 . インフルエンザ治療剤であることを特徵とする請求項 1 3記載のシァリダ一ゼ阻害剤。

1 6 . 下記の工程①及び②を含む、へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とし、該へキス口ン酸はその一部が 2位と 3位の炭素原子間で開裂されているグリコサミノグリカン誘導体の製造法。

① へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリ力ンを開裂処理して、その骨格中に存在する 2位に硫酸基を有しないへキスロン酸の少なくともその一部を 2位と 3位の炭素原子間において選択的に開裂する工程、

② へキス口ン酸の 2位の硫酸基を特異的に除去しうる脱硫酸化手段によりェ程①の生成物を脱硫酸化処理して、 2位に硫酸基を有する全へキスロン酸の 90% 以上の当該硫酸基を脱硫酸化する工程。

1 7 . へキソサミンとへキスロン酸の繰り返し単位構造を基本骨格とする硫酸化グリコサミノグリカンがへパリンであることを特徴とする請求項 1 6記載のグリコサミノグリカン誘導体の製造法。

1 8 . 工程①の開裂処理が、過ヨウ素酸塩を使用する酸化的開裂反応を含むことを特徴とする請求項 1 6又は 1 7記載のグリコサミノグリカン誘導体の製造法 c

1 9 . 工程①において、更に酸化的開裂反応生成物を還元することを特徴とする請求項 1 8記載のグリコサミノグリ力ン誘導体の製造法。

2 0 . 工程②におけるへキスロン酸の 2位の硫酸基の脱硫酸化手段が、アル力リ金属水酸化物又はアル力リ土類金属水酸化物を使用する加水分解反応であることを特徴とする請求項 1 6 ~ 1 9のいずれか一項記載のグリコサミノグリカン誘導体の製造法。