CN1096034A - 纯化的肝素裂分，其制备方法和含有它们的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

经亚硝酸降解得到的肝素裂分，其含有最多 150ppb亚硝基化合物。将已用亚硝酸盐降解的肝素 进行UV照射来制备该肝素裂分。

Description

本发明涉及纯化的肝素裂分（fraction），更具体地，涉及不含亚硝基化合物的肝素裂分，涉及制备它们的方法和含有它们的药物产品。
更具体地，本发明涉及通过亚硝酸降解得到的肝素裂分，其基本不含亚硝基化合物。
已知通过如专利申请EP-A-0，014，184和EP-A-0，027，089中描述的亚硝酸降解得到肝素裂分。通过亚硝酸降解制备的一些肝素裂分为常用“低分子量肝素”或“小分子量肝素”药物产品的活性成分。关于用作药物产品的低分子量肝素的详细情况，它们的测定和以硫酸盐/羧基比表示的硫酸化率可以参见以下出版物：“Héparines  de  faible  masse  moleculaire”〔小分子量肝素〕，Pharmeuropa，1991年10月，3，N.3，第161-165页和为欧洲药典推荐的专著“Heparina  massae  molecularis  minoris”〔小分子量肝素〕，1993年2月（PA/pH/Exp.3T（92）93）。一些如此制备的肝素和其用作药品的活性成分描述在专利申请或专利公开FR-A-2478646、EP-A-0，037，319，EP-A-0，076，279和EP-A-0，181，259中。它们的国际非专利商标名称（the International Nonproprietary Names（INN））为nadroparin钙、dalteparin钠和reviparin钠，并构成上市或有望上市特特品的活性成分。特别是reviparin钠构成在德国上市的特制品CLIVARIN
Figure 941053822_IMG2
的活性成分。通过亚硝酸降解得到的低分子量肝素也存在于德国（MONOEMBLEX NM）、奥地利（SANDOPARIN
Figure 941053822_IMG4
和TROPARIN
Figure 941053822_IMG5
）和瑞典（SANDOPARINE
Figure 941053822_IMG6
）医疗人员控制的一些特制品中。
亚硝酸降解通过向存在于肝素或其裂分或碎片中的易于亚硝基化的化合物上加上-NO基团，形成非一挥发性亚硝基化合物（以下也称为N-NO化合物或更简单地称为N-NO）。虽然存在于肝素裂分中的亚硝基化合物的量很小并且不妨碍它们作为药物的用途，但工业规模制备这些产品需要处理大量的粉末。因此可以看出将它们彻底去除或几乎彻底去除以完善用作药物制品活性成分的低分子量肝素的特性是有用的。
在平均分子量小的低分子量肝素中，如在一种以下将称为CY222（平均分子量为1，700Da到3，300Da）的产品中，亚硝基化合物的量可能高于具有更高分子量的产品中的含量。此产品适于专利申请和专利公开FR-2，478，646和EP-0，037，319中权利要求的产品定义，并可根据相同申请或专利描述的方法制备。
因为上述原因，非常需要能够提供通过亚硝酸降解得到、并且基本不含亚硝基化合物的肝素裂分。
一种通过波长低于200nm（优选185nm）的紫外线在碱性pH下照射除去饮用水中的亚硝酸盐并同时消毒的方法描述在P.PRINCZ等的论文中，Water  Supply，1988，6，199-205。但是，关于水处理的该文献没有迹象表明紫外线照射是否可用于生物活性产品而不对其生物和/或理化性质产生负作用。
现在发现将通过亚硝酸降解得到的肝素裂分用紫外线（以下简称为UV）作用，几乎可以彻底除去存在的亚硝基化合物，并可得到亚硝基化合物总含量等于或低于天然肝素的含量的纯化肝素裂分。
还发现在所用条件下，UV照射不会改变肝素裂分的结构，肝素裂分保留它们的所有生物和理化性质。
因此，本发明的一个方面涉及通过亚硝酸降解得到的肝素裂分，其中亚硝基化合物的含量不超过500ppb（十亿分之一），不超过150ppb为好，优选不选100ppb，更优选不超过50ppb，50ppb的含量为现知最低可测定量。所述裂分优选为低分子量肝素。
本发明的一个优选方面涉及通过亚硝酸降解得到的纯化低分子量肝素，又称为降解肝素，通过优选源自豪猪肠粘膜或小牛肺的天然来源肝素或任何其它从各种动物的组织或器官中提取到的肝素通过亚硝酸降解得到，其具有下列特征：
-平均分子量低于8，000Da，
-至少所有组份的60%分子量低于8，000Da，
-抗性因子Ⅹa活性不低于60IU/mg，
-抗性因子Ⅹa/抗性因子Ⅱa活性比不低于1.5，
-亚硝基化合物的总含量不超过500ppb，不超过150ppb为好，优选不超过100ppb，更优选不超过50ppb，
所述降解肝素为药用盐形式，优选钠盐或钙盐。
参照低分子量肝素的国际标准来评价抗性因子Ⅹa活性和抗性因子Ⅹa/抗性因子Ⅱa活性化;参见WHO  1-85/600。
根据欧洲药典推荐的专著（见上文参考文献）测定上述平均分子量。
在本说明书中，用术语“不含亚硝基化合物”来表述通过亚硝酸降解得到的、亚硝基化合物总含量最高为500ppb（最高为150ppb为好，特别是最高为100ppb，优选最高为50ppb）的肝素裂分或低分子量肝素。术语“组分”用于指组成低分子量肝素的一系列分子。
作为本发明目的的不含亚硝基化合物的低分子量肝素，其大部分组分在非还原性末端有2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸（idopyranosuronic）结构，在还原性末端有6-O-磺基-2，5-脱水-D-甘露糖醇结构，其硫酸化率与天然来源的末降解肝素基本没有区别。此硫酸化率为2-2.5，优选为2.0-2.3。
根据本发明的低分子量肝素最好具有可变分子量分布，90%的组分分子量在2，000Da和10，000Da之间，优选在2，000Da到9，000Da之间，最好在2，000Da到8，000Da之间。另外，这些肝素的优势分子量为3，000Da-6，000Da，优选为4，000Da-5，000Da。
本发明另一优选低分子量肝素的优势分子量为1，700Da-3，300Da、全部组分的90%的分子量为1，000Da-8，000Da。
术语“优势分子量”用于指相应于用UV检测器在λ＝205mm处测得的排阻色谱图中峰值的组分的分子量。
纯化CY222，定义为通过来自豪猪肠粘膜的天然肝素亚硝酸降解得到的降解肝素的钠盐，其特征如下：
-优势分子量为1，700Da-3，300Da，90%的组分分子量在1，000Da到8，000Da之间，
-其大部分组分在非还原末端有2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸结构，在还原性末端有6-O-磺基-2，5-脱水-D-甘露糖醇结构，
-硫酸化率为约2.1，
-抗性因子Ⅹa活性为60-80IU/mg，
-抗性因子Ⅱa活性不大于25IU/mg，特别是10-15IU/mg，
-亚硝基化合物的总含量不超过100ppb（每mg产品1×10-7mg亚硝基化合物），优选不超过50ppb（每mg产品5×10-8mg亚硝基化合物），
此产品代表根据本发明的一种优选肝素裂分。
本发明的不含亚硝基化合物的肝素裂分根据本发明的另一方面来制备。
因此，本发明还涉及亚硝基化合物总量最多为500ppb的肝素裂分的制备方法，其特征在于，将亚硝酸降解得到的肝素裂分水溶液进行紫外照射。
亚硝酸降解得到的任意肝素裂分都可以作为原料。该原料中的亚硝基化合物的总含量通常为1，000-20，000ppb。
用B.Pignatelli等在Analyst，1989年9月，114，1103-1108页和在Analyyst，1987年7月，112，945-949页上描述的方法测定亚硝基化合物的总量，该方法适于分析肝素及其裂分，特别是低分子量肝素。
本发明方法可以处理溶于水的药物级低分子量肝素，或者在工业制备过程中，在亚硝酸降解步骤之后、分离纯净的药物级产物之前实施本发明方法。优选使用药物级低分子量肝素。
因此，亚硝酸降解制得的任意低分子量肝素都可用作本发明方法的原料。为使本发明方法效率最大，最好使用无悬浮微粒的降解肝素溶液。这些微粒可能是由于降解肝素的溶解性不好、或者各种杂质、或者用于降解或提纯的试剂的残余物引起的。因此，最好先过滤各种降解肝素溶液。
由于本发明方法可简便、快速且安全地除去亚硝基化合物，所以它非常有效可行。另外，本发明方法不会改变肝素裂分的结构，其生物性能和理化性质与先前完全相同。
在5℃-50℃、较好在15℃-35℃、优选在室温下，将5-15%m/V的亚硝酸降解制得的肝素裂分、最好是待提纯的低分子量肝素的水溶液置于波长为180-350nm、优选为254nm的紫外照射下，来实施本发明方法。
该溶液的pH呈微酸性或微碱性、特别是在3-8间、优选在5-8之间。
照射时间决定于所用照射系统、照射量和肝素裂分中待除去的亚硝基化合物总量。它约为2-30分钟，但一般情况下，照射9-15分钟后纯化就基本完全。
UV照射系统可以是静态系统，或者是可使肝素裂分溶液绕UV照射源循环的动态系统。优选动态系统。对于动态系统，UV照射源可与圆筒（“密闭”型装置）或导管（“开放”型装置）结合。“密闭”型装置可使用JR1-50（KATAPYN）UV杀菌器或任意其它等价装置。
图1示出了一种“密闭”型装置的切面图。该装置由UV灯（1）和固定在其周围的石英罩（2）组成。含低分子量肝素溶液绕有石英罩保护的UV灯循环（循环液体物流（3））。该溶液从位于UV灯一端的进口（4）是入，其出口（5）位于UV灯的另一端。
采用动态系统时，为达到除去亚硝基化合物所需的照射时间，必须适当调整肝素裂分溶液绕UV照射源循环的流速。应当考虑的各种参数有循环液体物流的直径、UV照射源的大小和/或功率、该水溶液的肝素裂分浓度和该裂分中待除去亚硝基化合物的量。
使用常规方法，可将如此制得的除去所有亚硝基化合物的肝素裂分、或者优选是低分子量肝素回收。
当原料是已达到药物级的低分子量肝素时，将该产物溶于水中，将该溶液pH调整至3-8、最好5-8，并且用本发明方法处理该溶液。
也可以用天然的末降解肝素、最好以其盐特别是肝素钠的形式作为原料，它优选来自豪猪肠粘膜。这种情况下，本发明方法是在制备完全没有亚硝基化合物的纯化的最终产品过程中在亚硝酸降解之后的一个步骤。以肝素为起始原料的总体方法是本发明另一目的。
因此，本发明的另一方面涉及用亚硝酸降解来制备低分子量肝素的方法，该肝素中亚硝基化合物的总含量不超过500ppb、最好不超过150ppb、优选不超过100ppb、更优选不超过50ppb，其特征在于：
（a）在盐酸存在下，在pH为1-5、优选为1.5-4下，用亚硝酸碱金属盐、优选亚硝酸钠的溶液处理未降解肝素钠在水中的5-15%m/V溶液20-50分钟，其中亚硝酸盐用量为15-69g/kg肝素，并且最好在碱性介质中、用5-20g硼氢化钠/kg肝素原料还原如此制得的产物，过量的硼氢化钠用盐酸破坏，适当时中和反应介质，并且用乙醇沉淀出产物，然后将如此得到的低分子量肝素进行一次或多次乙醇分级，然后
（b）将如此得到的溶液进行紫外照射;
（c）适当时用色柱谱提纯，并用氯化钠和乙醇适当沉淀、将纯化的没有亚硝基化合物的降解肝素钠分离;
（d）将该钠盐转化成另一种可药用盐、优选为钙盐。
本发明的优选方面涉及纯化的CY222的制备方法，CY222定义为通过亚硝酸降解来自豪猪粘肠膜的天然来源肝素制得的降解肝素的钠盐，它具有：
-优热分子量为1，700Da-3，300Da，
-90%的组分分子量为1，000Da-8，000Da，
-其大部分组分在非还原末端有2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸结构，在还原性末端有6-O-磺基-2，5-脱水-D-甘露糖醇结构，
-硫酸化率为约2.1，
-抗性因子Ⅹa活性为60-80IU/mg，
-抗性因子Ⅱa活性不大于25IU/mg，特别是10-15IU/mg，
-亚硝基化合物的总含量不超过100ppb，优选超过50ppb，
所述方法的特征在于：
（a）未降解肝素钠水溶液用盐酸和相对于所引入肝素的3.5-4%（重量）的亚硝酸碱金属盐处理，保持pH酸性，监视亚硝酸根离子的存在直至出现阴性反应，然后将混合物碱化，用硼氢化钠还原产品，在中性介质中通过用乙醇沉淀分离降解产品，然后
（b）将由此得到的产品水溶液在pH约7时置于254nm的紫外线照射系统下，然后将由此得到的溶液导入一阴离子交换柱的顶部，用水洗脱柱子后及pH约7时，用氯化钠和乙醇沉淀回收终产品。
在步骤（a）中，用上述比例的亚硝酸钠作为亚硝酸的碱金属盐。
在步骤（b）的方法中，优选紫外照射系统装有16W灯，在254nm的紫外线下照射约9-15分钟。优选动态UV照射系统、特别是“密闭”型装置。UV照射的溶液浓度最好为8-12%m/V。
本发明另一方面涉及含有作为活性成分的上述设有亚硝基化合物的纯化肝素裂分（优选没有亚硝基化合物的纯化低分子量肝素）的药物组合物。
对于本发明的组合物，肝素裂分可以是冷冻干燥物的形式，或在无菌皮下注射液、生理可接受溶剂如水中，可在安瓿、小药瓶、预充满的注射器或“笔”形自注射装置中的生理溶液中。每单位药物剂量组合物可含50-50，000IU抗性因子Ⅹa。
本发明的肝素裂分还可单独或与其它活性成分混合通过静脉注射给药。另外，它们还可鼻内或肺内喷雾给药。
本发明的一种优选药物组合物含有如上所述无亚硝基化合物的CY222作为活性成分，每剂量单位含有10mg到5，000mg钠盐形式的CY222。
如上所述，用B.Pignatelli等在Analyst，1979年9月，114，第1103-1108页和Analyst，1987年7月，112，第945-949页中描述的适应于肝素和低分子量肝素的方法测定总亚硝基化合物。
分析方法
待分析的产物优选呈粉末状，因此，要测定溶液中亚硝基化合物的总含量时，要首先将该溶液冷冻干燥，然后分析冷冻干燥品。
1.试剂
100mg肝素裂分所用的试剂如下：
-用20%m/V氨基磺酸处理过的乙酸乙酸（200g氨基磺酸在1，000ml乙酸乙酯中的溶液，搅拌3天，并且使用前用纸过滤），
-在乙酸中的15%氢溴酸（带有聚乙烯塞子的小琥珀色瓶，含有5ml  30%氢溴盐，在氩气下密封并避光保存。使用时，加入5ml纯净乙酸，振荡该混合物，并贮于黑暗中的小容器中。一系列的分析使用一个管形瓶）。
-用5%m/V氨基磺酸处理过的95%甲酰胺（1g氨基磺酸在20ml甲酰胺中的溶液，它含有5%纯化水）。
2.标准溶液和待分析样品的制备
-N-亚硝基二正丙基胺（NDPA）的标准溶液
通过隔膜向含有1g  N-亚硝基二正丙基胺的Sigma  ISOPAC瓶中注射78.62g纯净乙醇。NDPA的浓度为10，000ppm（3379ppm的N-NO）。然后用纯净乙醇将其稀释至1/100，并在小封闭管形瓶中分成0.5ml的等份。其浓度为100ppm的NDPA。管形瓶在+4℃下避光保存。
＊低浓度标准溶液：使用时，在乙醇中稀释至1/100，然后用在处理过的甲酰胺中稀释至1/17。其浓度为0.0588ppm的NDPA、即19.9ppb的N-NO。
＊中等浓度标准溶液：使用时，在乙醇中稀释至1/61，然后在处理过的甲酰胺中稀释至1/11。其浓度为0.149ppm的NDPA、即50.4ppb的N-NO。
＊高浓度标准溶液：使用时，在乙醇中稀释至1/10，然后在处理过的甲酰胺中稀释至1/10。其浓度为1ppm的NDPA、即338ppb的N-NO。
-待分析样品
肝素裂分样品在60℃下使用五氧化磷真空干燥12小时，将100mg肝素裂分溶于1ml处理过的甲酰胺中，并在振动器上将该混合物振动30分钟。
3.所用装置
所用装置如图2所示。
该装置包括500ml派热克期（pyrex）圆底烧瓶（1），其上装有冷却至-15℃的双面冷凝器（2）。（2）与串联的三个鼓泡器（3）连接，（3）中都盛有30ml30%的氢氧化钠。这些鼓泡器与两个并联的冷阱连接，其中一个用在-120℃的熔融乙醇制备（4），另一个用在-160℃的熔融异戊烷制备（5）。这些冷阱最后与化学荧光与化学荧光检测器（TEA）Model610.（Thermedics  Detection  lnc.）或等同装置（6）连接。该检测器与积分仪/记录仪（7）连接。
该烧瓶在一边装有穿孔的活塞（8），（8）中插有可导入氩气流的导管。在另一边装有螺纹接头，其上连接GC型隔膜，通过它将样品注入。氩气流和TEA的真空泵形成的真空使气体流向TEA。
4.操作程序
4.1调整检测器
根据生产者的说明调整检测器，使其灵敏度和重现性最好。
分析前1小时，在2巴压力下打开氧气供应并调整其流速如TEA610（Thermedics  Detection  lnc.）的流速计所示为0.02。
4.2氢氧化钠阱的制备
每个阱中装让30ml的30%氢氧化钠。
4.3冷阱的制备
-120℃冷阱：在木质搅棒搅拌下，向含有250ml乙醇的Dewar瓶中慢慢倒入液氮，直至形成膏状物。
-160℃冷阱：在木质搅棒搅拌下，向含有250ml异戊烷的Dewar瓶中慢慢倒入液氮，直至形成膏状物。
两种玻璃冷阱分别置于它们的Dewar瓶中，在环路中将它们串联。
4.4烧瓶-冷凝器装置的脱水
不要与TEA连通，在氩气中将50ml乙酸乙酯回流1小时。
4.5反应和分析
向装有隔膜的新的干净、干燥圆底烧瓶中加入30ml处理过的乙酸乙酯，烧瓶上装有冷凝器（该低温恒稳器应提前2小时在-15℃打开），烧瓶加热器置于位置4加热烧瓶。连通氩气导管，流速调至0.1升/分钟，并检查整个环路系统是否漏气。为避免压力过高，仅打开与TEA的连接。乙酸乙酯回流时，很温和地抽真空，同时关闭与TEA的连通。系统平衡时，整个环路系统中的真空达到2-4mmHg。在积分仪/记录仪为10%全部量程下将TEA调零。
通过隔膜，依次注和0.5ml纯化水、2ml稀氢溴酸，然后再注入2ml稀氢溴酸;在每次注射之间，检查在积分仪/记录仪上的指示信号是否回到基线。向烧瓶中已注入试剂时，使指示计回到基线，然后注入50μl标准溶液或样品。在每次注射之间，使指示计回到基线。在这些分析中，在2个标准之间插入5个样品，以这种方式进行操作，整个操作不超过60分钟。
4.6亚硝基化合物总含量的计算
N-NO的量（单位ppb）用下式计算：
N-NO（ppb）＝ (样品面积×Cs×0.5×44×1000)/(标样面积×0.05×0.1×130.2)
式中：
-Cs：标样中NDPA的浓度（单位ppm）（0.0588或0.149或1ppm）
-0.05：（分子）标样的试验样品（ml）
-44：N-NO的分子量
-1，000：将ppm转化成ppb
-0.05：（分母）样品的试验样品（ml）
-0.1：以克计的样品试样
-130.2：NDPA的分子量。
下列实施例说明本发明。
实施例1
亚硝基衍生物总含量低于100ppb的纯化nadroparin钙的制备
步骤A：降解和乙醇分级
在一反应器中，将20kg来自豪猪肠粘膜的肝素钠用纯化水溶解，使其最终浓度为10.3%（m/V）。用浓盐酸将该溶液的pH调至2.5。
用浓盐酸将pH保持在2.5的同时，向反应器中加入572g亚硝酸钠。
用淀粉/碘化钾试纸监测降解反应。呈阴性时表明反应完成。用浓氢氧化钠将反应溶液的pH调至10，然后加入200g硼氢化钠。将该混合物搅拌15小时，然后用浓盐酸将pH调至4-3.5，以分解过量的硼氢化物。然后加入浓氢氧化钠将pH调至7。然后向该水溶液中加入2倍体积的乙醇，沉淀出产物。使沉淀物沉降，然后除去水-醇上层清液。将沉淀物溶于400升纯化水中。向该溶液中加入氯化钠，直至其电导率达到20，000μS/cm。然后用浓盐酸将pH调至4，并搅拌下向该溶液中加入1倍体积的绝对乙醇。使产物沉降约60小时，然后除去水-醇上层清液。这样制得Nadroparin的钠盐。
然后将该沉淀物溶于纯化水中，根据开始时加入的肝素钠的量，得到浓度为约18%m/V的溶液，并用浓氢氧化钠将pH调至7。然后在装有孔隙度为0.2μm的滤槽的系统中过滤。从含有nadraparin钠的滤液中，取出未根据步骤B的方法处理（UV照射处理）的样品，该样品作为“对照”。
步骤B：UV照射处理
为进行UV照射处理，使用了有用体积为750ml的katadyn型JR1-50管。所用波长为254nm。预先通过蠕动泵用纯水调整流速（4，800ml/hr.）使一次性总UV照射时间为约9分钟。然后，引入待处理的nadroparin钠溶液，用纯化水洗涤管道直至处理的产物完全回收于连在katadyn  JR1-50管出口的容器中。
步骤C：色谱纯化和转化成钙盐
在阴离子交换柱上纯化上步得到的nadroparin溶液（加入0.5升/kg肝素钠）。用氯化钠将收集的流份的电导率调至10，000-20，000μS/cm，然后加入1.5体积乙醇。使产物沉降约43小时，然后除去上层清液。
将该沉淀物溶于纯化水中（基于加入的肝素钠，C＝18%m/V），并加入六水合氯化钙（9.63g/g肝素钠）。然后加入1.5体积乙醇使其沉淀。重复用六水氯化钙的成盐步骤和用乙醇沉淀的纯化步骤。在不超过60℃下，将得到的沉淀物干燥。
这样制得批料1。
根据本步骤C所述方法，同样处理步骤A得到的“对照”批料，并分离出nadroparin钙“对照”批料。
对批料1的和nadroparin钙“对照”批料的样品进行了理化分析，并测定了它们的生物活性。
表Ⅰ和Ⅱ给出了试验结果。
表I 理化试验
监测的参数 批料1（UV照射） 对照（无UV处理）
亚硝基化合物总量 53ppb 3,150ppb
游离磺酸盐 0.05% 0.06%
5％溶液PH 6.0 6.0
游离NH2 ＜30ppm ＜30ppm
HPLC-GPC(UV 205 nm)重均分子量（Mw)数均分子量（Mn)峰值分子量分布%MW＞10,000 Da%MW＞8,000Da%MW＜2,OOODa%MW＜1,800Da 5,017Da4,043Da4,181Da1.242.47.23.02.4 4,933Da4,052Da4,192Da1.212.16.92.92.3
表II 生物试验
监测参数 批料2（UV照射） 对照（无UV处理）
抗性因子Xa活性 124IU/mg 123IU/mg
抗性因子IIa活性 29.3IU/mg 30.4IU/mg
表Ⅰ和Ⅱ中结果说明UV处理不会引起nadroparin降解。实际上，批料1的各种理化和生物性质，如产品的色谱图、各种杂质的含量、抗性因子Ⅹa活性和抗生因子Ⅱa活性均与未经UV照射的对照相同。只有一个例外，未处理对照中亚硝基化合物的总含量约为进行UV照射处理的批料1中亚硝基化合物总含量的60倍。
另外，电子顺磁共振分析结果证明用UV照射处理不会引起自由基释放。
实施例2
亚硝基化合物总含量低于50ppb的CY222钠盐的制备。
步骤A：降解
在一反应器中，将来自豪猪肠粘膜的250g肝素钠用纯化水溶解，以达到终浓度10.3%（m/V）。用浓盐酸调节pH至2.5。保持pH2.5，向反应器中引入9.49g亚硝酸钠。用淀粉/碘化钾试纸监视降解反应。当实验为阴性时，反应完全。用浓氢氧化钠调节反应溶液的pH至10-10.5，然后加入2.5g硼氢化钠。搅拌混合物15小时，然后用浓盐酸调pH至3.5-4以破坏过量的硼氢化物。通过加入浓氢氧化钠调pH至7。然后每体积溶液中加入2体积乙醇，沉淀产品。让沉淀下沉，除去上清液。从而得到CY222的钠盐。这样得到的产品含有3，000到10，000ppb的亚硝基化合物（3次制备的结果）。
步骤B：UV照射处理
将前述步骤的沉淀溶解在纯化水中以得到所引入肝素钠的浓度约为10%m/V的终溶液，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7。调节泵的输出量后，所得溶液被转至254nm的紫外照射系统（Katadyn  JR1-50系统，装有16W灯）之下。暴露于UV照射的时间为9-15分钟。
步骤C：用色谱和最后沉淀方法纯化
UV照射处理后得到的溶液在含（每kg肝素钠）至少两升阴离子交换树脂的色谱柱上纯化。用氯化钠调节所收集流份的电导率为30-35mS/cm，用盐酸调pH至7。然后每体积水溶液中加入2体积乙醇。让沉淀下沉，去除上清液。将沉淀溶解在纯化水中以得到浓度为20%m/V（基于开始加入的肝素钠的量）的终溶液，用氯化钠调节该溶液电导率到30-35mS/cm，用浓盐酸或浓氢氧化钠调pH至7-7.5。然后该溶液用2体积绝对乙醇沉淀，让沉淀下沉。收集沉淀、用乙醇洗涤、在不超过60℃温度下干燥。纯CY222，定义为通过来自豪猪肠粘膜的肝素经亚硝酸降解得到的降解肝素的钠盐，此产品具以下特征：
-优势分子量为1，700Da-3，300Da，90%的组分分子量为1，000Da到8，000Da之间。
-其大部分组分在非还原性末端有2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸结构，在还原性末端有6-O-磺基-2，5-脱水-D-甘露糖醇结构，
-硫酸化率为约2.1，
-抗性因子Ⅹa活性为60-80IU/mg，
-抗性因子Ⅱa活性不大于25IU/mg，特别是10-25IU/mg，
-亚硝基化合物的含量低于50ppb。

Claims (14)

1、通过亚硝酸降解得到的肝素裂分，其亚硝基化合物总含量不超过500ppb。
2、根据权利要求1的肝素裂分，其特征在于它为低分子量肝素。
3、根据权利要求2的低分子量肝素，其特征在于它为来自豪猪肠粘膜或小牛肺的天然来源肝素或从各种动物组织或器官中提取的其它肝素通过亚硝酸降解得到的降解肝素的药用盐形式，其具有以下特征：
-平均分子量低于8，000Da，
-至少所有组分的60%的平均分子量低于8，000Da，
-抗性因子Ⅹa活性不低于60IU/mg，
-抗性因子Ⅹa/抗性因子Ⅱa活性比不低于1.5。
4、根据权利要求3的低分子量肝素，其为钠盐或钙盐形式。
5、源自豪猪肠粘膜的天然肝素经亚硝酸降解得到的降解肝素钠盐，其具有以下特征：
-优势分子量为1，700Da到3，300Da之间，
-90%的组分分子量在1，000Da到8，000Da之间，
-其大部分组分在非还原性末端有2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸结构，在还原性末端有6-O-磺估-2，5-脱水-D-甘露糖醇结构，
-硫酸化率为约2.1，
-抗性因子Ⅹa活性为60-80IU/mg，
-抗性因子Ⅱa活性不大于25IU/mg，
-亚硝基化合物的总含量不超过100ppb。
6、根据权利要求5的降解肝素钠盐，其特征在于亚硝基化合物的总含量不超过50ppb。
7、权利要求1-6之任一的肝素裂分的制备方法，其特征在于将经亚硝酸降解得到的肝素裂分的水溶液进行紫外线照射。
8、根据权利要求7的方法，其特征在于将浓度为5-15%m/V的经亚硝酸降解得到的肝素裂分水溶液暴露于波长为180-350nm的紫外线照射系统之下，温度为5℃到50℃，溶液的pH为3-8。
9、根据权利要求7和8的方法，其特征在于在15-35℃的温度及pH5-8下，暴露在254nm紫外线下。
10、权利要求1-5之任一低分子量肝素的制备方法，其特征在于：
（a）5-15%m/V的未降解肝素钠盐水溶液用亚硝酸钠溶液，以每kg所引入肝素15-69g亚硝酸盐的比例，在盐酸存在下，pH1-5（优选1.5-4）下处理20-50分钟，由此得到的产品优选在碱性介质中用5-20g硼氢化钠（每kg开始时引入的肝素）进行还原，过量的硼氢化钠用盐酸破坏，适当时中和反应介质并用乙醇沉淀产品，然后，适当时将由此得到的低分子量肝素进行一次或多次醇分级，然后
（b）由此得到的溶液进行紫外照射射
（c）适当时进行色谱纯化，通过用氯化钠和乙醇沉淀分离纯化的不含亚硝基化合物的降解肝素钠，并适当
（d）将钠盐转化为另一种药用盐。
11、权利要求6的产品的制备方法，其特征在于;
（a）未降解肝素钠水溶液用盐酸和相对于所引入肝素的3.5-4%（重量）的亚硝酸碱金属盐处理，保持pH酸性，监视亚硝酸根离子的存在直至出现阴性反应，然后将混合物碱化，用硼氢化钠还原产品，在中性介质中通过用乙醇沉淀分离降解产品，然后
（b）将由此得到的产品水溶液在pH约7时置于254nm的紫外线照射系统下，然后将由此得到的溶液导入一阴离子交换柱的顶部，用水洗脱柱子后及pH约7时，用氯化钠和乙醇沉淀回收终产品。
12、根据权利要求11的方法，其特征在于在步骤（b）中，用16W  UV灯在254nm紫外照射系统处理9-15分钟，进行紫外照射的产品溶液的浓度为8-12%m/V。
13、含有权利要求1-6之任一的肝素裂分作为活性成分的药物组合物。
14、每剂量单位含10mg-5，000mg权利要求1-6之任一的肝素裂分作为活性成分的药物组合物。
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