PL178294B1

PL178294B1 - Heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole oraz sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym i zawierający ją środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL178294B1
Application number: PL94303336A
Authority: PL
Inventors: Jean-François Branellec; José Espejo; Philippe Picart
Original assignee: Choay Sa
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 2000-04-28
Also published as: AU672291B2; HU9401446D0; EP0623629A1; FI107388B; JPH07126302A; CA2122930C; ATE141618T1; NO306952B1; TW438812B; CZ113294A3; GR3021648T3; CZ287889B6; MY110862A; EP0623629B1; HUT70553A; DE69400385T2; ES2093494T3; NO941686D0; CN1066155C; CA2122930A1

Abstract

1 Heparyna o niskim ciezarze czasteczkowym i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole, znam ienna tym , ze stanowi heparyne naturalna po- chodzaca z blony sluzowej jelita swini, pluca bydlecego lub dow olna inna he- paryne w yekstrahow ana z tkanek lub narzadów róznych zwierzat, zdepolim eryzow ana przy uzyciu kw asu azotaw ego, o sredniej masie czaste- czkowej mniejszej niz 8000, przy czym co najmniej 60% wszystkich jej skladników m a srednia m ase czasteczkow a m niejsza niz 8000 i wykazuje aktywnosc ham ujaca czym nk X a n ie m niejsza niz 60 U l/m g i stosunek aktyw- nosci hamujacej czynnik X a do aktywnosci ham ujacej czynnik IIa nie mniej- szy niz 1,5 1 sumarycznie zawiera 500 ppb lub mniej zwiazków nitrozowych 5 Sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o ruskim ciezarze czasteczkowym, która stanowi heparyne naturalna pochodzaca z blony sluzo- wej jelita swini, pluca bydlecego lub dow olna inna heparyne w yestrahow ana z tkanek lub narzadów róznych zw ierzat, zdepolim eryzow ana przy uzyciu kwasu azotawego, o sredniej m asie czasteczkowej mniejszej niz 8000, przy czym co najm m ej 60% w szystkich jej skladników m a srednia mase czastecz- kow a mniejsza niz 8000 i w ykazuje aktywnosc ham ujaca czynnik X a me m niejsza niz 60 U l/m g i stosunek aktywnosci hamujacej czynnik X a do akty- wnosci hamujacej czynnik IIa m e m niejszy niz 1,5, i sumarycznie zaw iera 500 ppb lub mniej zwiazków nitrozow ych i je j farm aceutycznie dopuszczalnych soli przy czym te heparyne o niskim ciezarze czasteczkowym , otrzymuje sie na drodze dzialania na wodny roztw ór heparyny naturalnej pod postacia,soli sodowej o stezeniu 5-15% m /v roztworem azotynu sodowego, w ilosci 15-69 g azotynu na kg uzytej heparyny, w obecnosci kwasu solnego przy pH 1-5, ko- rzystnie 1,5-4, w ciagu 20-50 minut, a nastepnie na drodze redukcji tak otrzy- manego produktu, korzystnie w srodow isku zasadowym, przy uzyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjsciow ej heparyny, przy czym nadm iar bo- rowodorku sodowego rozklada sie kw asem solnym, a srodowisko reakcyjne ewentualnie zobojetnia sie, po czym straca sie etanolem, po którym ewentual- nie przeprowadza sie jedno lub kilka frakcjonowan alkoholowych tak otrzy- manej heparyny o niskim ciezarze czasteczkowym , znam ienny tym , ze roztwór wodny o stezeniu 5-15% m /v tej h eparyny o niskim ciezarze czastecz- kowym poddaje sie naswietlaniu ultrafioletem dlugosci fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50 C, przy pH roztw oru wynoszacym 3-8, 21 Srodek farm aceutyczny zaw ierajacy skladnik aktywny i substancje pomocnicze, znam ienny tym , ze ja k o skladnik aktywny w dawce jednostko- wej zawiera 10-5000 m g heparyny o niskim ciezarze czasteczkowym , która stanowi zdepolim eryzow ana heparyne z azotynowej naturalnej heparyny po- chodzacej z blony sluzowej jelita swini, pluca bydlecego lub dow olna in n a he- paryne w yekstrahow ana z tkanek lub narzadów róznych zwierzat, o sredniej masie czasteczkowej mniejszej m z 8000, przy czym co najmniej 60% wszy- stkich je j skladników m a srednia m ase czasteczkow a m niejsza niz 8 0 0 0 1 w y- kazujaca aktywnosc ham ujaca czynnik X a me m niejsza m z 60 U l/m g i stosunek aktywnosci hamujacej czynnik X a do aktywnosci ham ujacej czyn- nik II a me mniejszy niz 1,5, i sum arycznie zawierajaca 500 ppb lub mniej zwiazków nitrozowych, a jako substancje pomocnicze roztwór stezonego kwasu solnego lub roztw ór farm aceutycznego wodorotlenku wapniowego qsp majacy pH 5-7,5, ja k rów niez w ode do preparatów do wstrzykiw ania qsp F IG .1 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole oraz sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym i zawierający ją środek farmaceutyczny.

Znany jest ze zgłoszeń patentowych EP-A-0014184 i EP-A-0027089 sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym na drodze depolimerezac-i αzotenowej.

Znany jest z artykułu P. PRINCZ i in., Water Supply, 1988, 6,199 - 205 sposób usuwania azotanów z wody pitnej z równoczesną sterylizacją wody, przez naświetlanie ultrafioletem o długości fali poniżej 200 nm, korzystnie 85 nm, i przy zasadowym odczynie. Jednakże praca ta, dotycząca obróbki wody, nie pozwalała przewidzieć, czy naświetlanie promieniami ultrafioletowymi dałoby się zastosować do produktu biologicznie aktywnego, bez wywierania szkodliwego wpływu na własności biologiczne i/lub fizykochemiczne.

Znanajest z publikacji w Pharmeuropa, październik 1991,3, nr3, str. 161 -165, pt.: „Heparines de faible masse moleculaire”, oraz z monografii zgłoszonej do Farmakopei Europejskiej „Heparina massae molecularis minoris”, luty 1993 (PA/PH/-Exp. 3T (92) 93) heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym jako składnik aktywny leków, które weszły do powszechnego stosowania pod nazwą „heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym” lub „heparyny o małej masie cząsteczkowej”. Wszelkie szczegóły dotyczące heparyn o niskim ciężarze cząsteczkowym stosowanych jako leki, ich oznaczenia i stopnia ich sulfatacji wyrażonego stosunkiem siarczany/grupy karboksylowe, podane są w tych publikacjach. Ze zgłoszeń patentowych opublikowanych pod numerami FR-A-2478646, EP-A-0037319, EP-A-0076279, EP-A- 0181259 znane są otrzymywane w ten sposób heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, stosowane jako składniki aktywne leków. Znane są środki farmaceutyczne zawierające heparynę znane pod międzynarodowymi nazwami zwyczajowymi (DCI) jako nadroparyna wapniowa, dalteparyna sodowa i rewiparyna sodowa i stanowią składniki aktywne leków znajdujących się w handlu lub obecnie badanych. W szczególności, rewiparyna sodowa stanowi składnik aktywny preparatu CLIVARIN® znajdującego się na rynku niemieckim. Inne heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymywane przez depolimeryzację azotynową także występują w lekach będących do dyspozycji lekarzy w Niemczech (MONOEMBOLEX® NM), w Austrii (SANDOPARIN® i TROPARIN®) oraz w Szwajcarii (SANDOPARINE®).

Depolimeryzacja azotynowa polega na tworzeniu nielotnych związków nitrozowych (zwanych poniżej związkami N-NO lub po prostu N-NO) przez dodanie grupy -NO do dających się nitrozować składników obecnych w heparynie lub jej fakcjach bądź fragmentach. Chociaż ilość związków nitrozowych obecnych we &2^-2Λ heparyny jest bardzo mała i nie stanowi przeszkody dla stosowania ich jako leków, gdyż chodzi o związki nielotne, wytwarzanie tych produktów w skali przemysłowej wymaga manipulacji dużymi ilościami proszków. Całkowite lub praktycznie całkowite ich wyeliminowanie mogłoby więc okazać się użyteczne dla poprawienia charakterystyk heparyn o niskim ciężarze cząsteczkowym, stosowanych jako składniki aktywne środków farmaceutycznych.

178 294

W przypadku heparyn o niskim ciężarze cząsteczkowym, których średnia masa cząsteczkowajest mała, na przykład w przypadku produktu nazywanego poniżej CY 222, którego średnia masa cząsteczkowa wynosi 2700-3300 Da, ilość związków nitrozowych może być większa niż w produktach mających wyższą masę cząsteczkową. Produkt CY 222 odpowiada definicji produktów zastrzeżonych w opisach patentowych FR-2478646 oraz EP-00307319 i może być wytworzony sposobami w nich opisanymi.

Bardzo pożądana, z podanych przyczyn, jest więc możliwość dysponowania frakcjami heparyny otrzymanymi przez depolimeryzację praktycznie wolnymi od związków nitrozowych.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że poddając heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymaną przez depolimeryzację azotynową naświetlaniu ultrafioletem można usunąć prawie całkowicie obecne w niej związki nitrozowe i otrzymać oczyszczonąheparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym mającą sumaryczną zawartość związków nitrozowych równą, lub nieco mniejszą niż w heparynie naturalnej.

Heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole, według wynalazku stanowi heparynę naturalną pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną inną heparynę wyestrahowaną z tkanek lub narządów różnych zwierząt, zdepolimeryzowaną przy użyciu kwasu azotawego, o średniej masie cząsteczkowej mniejszej niż 8000, przy czym co najmniej 60% wszystkich jej składników ma średnią masę cząsteczkową mniejszą niż 8000 i wykazuje aktywność hamującą czynnik Xa nie mniejszą niż 60 UI/mg i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do aktywności hamującej czynnik IIa nie mniejszy niż

1,5 i iumarycznie zzwiira 500 ppp lub imiiej związków nitrozowych,korzystnie stanowi heparynę zdepolimeryzowanąpod koniec depolimeryzacji nzotynowej i ma postać soli sodowej lub soli wapniowej, a óoazyutoiej stanowi naturalną heparynę pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną inną heparynę wyestraeowaoą z tkanek lub narządów różnych zwierząt, zdepolimeryzowaną z użyciem kwasu azotawego, i ma ewentualnie postać soli sodowej, ma większościową masę cząsteczkową 1700 -3300, pmy czym 90% składników ma masę cząsteczkową 1000-8000, zawiera strukturę 2-O-ublfo-a-L-idopiranosuronowąoa końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-O-sblfo-2,5-aoeydro-D-manoitoIb na końcu ulegającym redukcji u większościjej składników, wykazuje stopień sulfatacji około 2,1, aktywność hamujączczyonió Xa 60 - 80 Ul/mg, aktywność hrmbjącączyooió Ila nie wyższąniż 25 Ul/mg i zawiera sumarycznie 100 ppb lub mniej związków nitrozowych, pmy czym korzystnie heparyna w postaci soli sodowej sumarycznie zawiera 50 ppb lub mniej związków nitrozowych.

Sposób wytwarzania i ocoyszczroia heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi heparynę naturalną pochodną z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną inną heparynę wyekstrahowaną z tkanek lub narządów różnych zwierząt, odepoIimeryoowanz przy użyciu kwasu azotawego, o średniej masie cząsteczkowej mniejszej niż 8000, pmy czym co najmniej 60% wszystkich jej składników ma średniąmasę cząsteczkową moiejsząniż 8000 i wykazuje aktywność hamującą czynnik Xa nie mniejszą niż 60 Ul/mg i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do aktywności hamującej czynnik IIa nie mniejszy niż 1,5, i sumarycznie zawiera 500 ppb lub mniej związków nitrozowych i jej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, przy czym tę heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, otrzymuje się na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej o stężeniu 5-15% m/v roztworem rootynb sodowego, w ilości 15-69 g azotynu na kg użytej heparyny, w obecności kwasu solnego przy pH 1 -5, korzystnie 1,5-4, w ciągu 20-50 minut, a następnie na drodze redukcji tak otrzymanego produktu, korzystnie w środowisku zasadowym, pmy użyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjściowej heparyny, pmy czym nadmiar borowodorku sodowego rozkłada się kwasem solnym, a środowisko reakcyjne ewentualnie zobojętnia się, po czym strąca się etanolem, po którym ewentualnie przeprowadza się jedno lub kilka frakcjonowań alkoholowych tak otrzymanej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, według wynalazku polega na tym, że roztwór wodny o stężeniu 5-15% m/v tej heparyny o niskim ciężarne cząsteczkowym poddaje się naświetlaniu ultrafioletem o długości fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50°C, przy pH roztworu

178 294 wynoszącym 3-8, przy czym ewentualnie roztwór ten poddaje się oczyszczeniu chromatograficznemu, i wyodrębnia się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, oczyszczoną i pozbawioną całkowicie związków nitrozowych przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem, po czym ewentualnie przekształca się sól sodową w inną sól farmaceutycznie dopuszczalny korzystnie naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy 254 nm, w temperaturze 15-35°C i przy pH 5-8.

Korzystnie sposób według wynalazku polega na tym, że heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymuje się na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej kwasem solnym i azotynem zasadowym użytym w ilości 3,5-4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując pH kwaśne i kontrolując obecność jonów azotynowych do momentu ich niewykrywalności, a następnie, na drodze alkalizacji, po której następuje redukcja borowodorkiem sodowym, heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym wyodrębnia się w środowisku obojętnym przez wytrącenie etanolem, przy czym naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy pH około 7, i tak otrzymany roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej a, po wypłukaniu kolumny wodą i przy pH około 7, wyodrębnia się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem, przy czym korzystnie naświetlanie ultrafioletem prowadzi się w ciągu 9-15 minut z użyciem lampy UV 16 W, przy czym stężenie roztworu produktu poddanego naświetlaniu UV wynosi 8-12% m/v.

W innej postaci sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi zdepolimeryzowaną heparynę naturalną pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną inną heparynę wyestrahowaną z tkanek lub narządów różnych zwierząt, zdepolimeryzowaną przy użyciu kwasu azotawego, otrzymaną na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej o stężeniu 5-15% m/v roztworem azotynu sodowego, w ilości 15-69 g azotynu na kg użytej heparyny, w obecności kwasu solnego przy pH 1-5, korzystnie 1,5-4, w ciągu 20-50 minut, a następnie na drodze redukcji tak otrzymanego produktu, korzystnie w środowisku zasadowym, przy użyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjściowej heparyny, przy czym nadmiar borowodorku sodowego rozkłada się kwasem solnym, a środowisko reakcyjne ewentualnie zobojętnia się, po czym strąca się etanolem, po którym ewentualnie przeprowadza się jedno lub kilka frakcjonowań alkoholowych tak otrzymanej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, o średniej masie cząsteczkowej mniejszej niż 8000, przy czym co najmniej 60% wszystkich jej składników ma średniąmasę cząsteczkową mniejszą niż 8000 i wykazującą aktywność hamującą czynnik Xa nie mniejszą niż 60 Ul/mg i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do asktywności hamującej czynnik Ha nie mniejszy niż 1,5, i sumarycznie zawierającą 500 ppb lub mniej związków nitrozowych, i mającą postać soli sodowej lub soli wapniowej ijej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, polega na tym, że wodny roztwór tej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, o stężeniu 5-15% m/v poddaje się naświetlaniu ultrafioletem o długości fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 3-8, korzystnie naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy 254 nm, w temperaturze 15-35°C i przy pH 5-8.

Korzystnie sposób według wynalazku polega na tym, że wodny roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym poddaje naświetlaniu ultrafioletem przy 254 nm w ciągu 9-15 minut przy użyciu lampy UV 16 W, przy czym stężenie roztworu produktu poddawanego naświetlaniu UV wynosi 8-12% m/v, po czym ewentualnie roztwór ten poddaje się oczyszczeniu chromatograficznemu i wyodrębnia się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, oczyszczoną i pozbawioną całkowicie związków nitrozowych przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem, przy czym ewentualnie przekształca się sól sodową w inną sól dopuszczalną farmaceutycznie, korzystnie roztwór wodny heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymuje się na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postaciąsoli sodowej kwasem solnym i azotynem zasadowym użytym w ilości 3,5-4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując pH kwaśne i kontrolując obecność jonów azotynowych do momentu ich niewykrywalności, a następnie, na drodze alkalizacji, po której następuje redukcja borowodorkiem sodo178 294 wym, heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym wyodrębnia się w środowisku obojętnym przez wytrącenie etanolem, i tym, że po poddaniu naświetlaniu ultrafioletem przy 254 nm, pH około 7, tak otrzymany roztwór wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej i, po wypłukaniu kolumny wodą i przy pH około 7, wyodrębnia się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem.

W innej korzystnej postaci wynalazku sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym ijej dopuszczalnych farmaceutycznie soli, przy czym ta heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym stanowi heparynę naturalnąpochodzącąz błony śluzowej jelita świni, zdepolimeryzowaną przy użyciu kwasu azotawego i będącą ewentualnie pod postacią soli sodowej, otrzymmąna drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej o stężeniu 5-15% m/v roztworem azotynu sodowego, w ilości 15-69 g azotynu na kg użytej heparyny, w obecności kwasu solnego przy pH 1-5, korzystnie 1,5-4, w ciągu 20-50 minut, a następnie na drodze redukcji tak otrzymanego produktu, korzystnie w środowisku zasadowym, przy użyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjściowej heparyny, przy czym nadmiar borowodorku sodowego rozkłada się kwasem solnym, a środowisko reakcyjne ewentualnie zobojętnia się, po czym strąca się etanolem, po którym ewentualnie przeprowadza się jedno lub kilka frakcjonowań alkoholowych, o większościowej masie cząsteczkowej, 1700-3300, przy czym 90% składników ma masę cząsteczkową 1000-8000, zawierającą strukturę 2-O-sulfo-a-L-idopiranosuronową na końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-O-sulfo-2,5-anhydro-Dmannitolu na końcu ulegającym redukcj i u większości j ej składników, wykazującą stopień sulfatacji około 2,1, aktywność hamującą czynnik Xa 60- 80 Ul/mg, aktywność hamującą czynnik Ha nie wyższą od 25 Ul/mg i zawierającą sumarycznie 100 ppb lub mniej związków nitrozowych, według wynalazku polega na tym, że wodny roztwór o stężeniu 5-15% m/v heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, otrzymanej przez depolimeryzację azotynową, poddaje się naświetlaniu ultrafioletem o długości fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 3-8, a korzystnie naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy 254 nm, w temperaturze 15-35°C i przy pH 5-8.

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się roztwór heparyny poddawanej naświetlaniu ultrafioletem, o niskim ciężarze cząsteczkowym, o stężeniu wynoszącym 8-12% m/v, przy czym ewentualnie roztwór ten poddaje się oczyszczeniu chromatograficznemu, i wyodrębnia się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, oczyszczoną i pozbawioną całkowicie związków nitrozowych przez wytrącenie chlorkiem sodu i etanolem, przy czym ewentualnie przekształca się sól sodową w inną sól dopuszczalną farmaceutycznie.

Korzystnie wodny roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymuje się przez działanie na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej kwasem solnym i azotynem zasadowym użytym w ilości 3,5-4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując pH kwaśne i kontrolując obecność jonów azotynowych do momentu ich niewykrywalności, a następnie, na drodze alkalizacji, po której następuje redukcja borowodorkiem sodowym, heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym wyodrębnia się w środowisku obojętnym przez wytrącenie etanolem, i roztwór wodny tak otrzymanego produktu poddaje się, przy pH około 7, naświetlaniu ultrafioletem, przy 254 nm w ciągu 9-15 minut z użyciem lampy UV16 W, a następnie tak otrzymany roztwór wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej i, po wypłukaniu kolumny wodą i przy pH około 7, wyodrębnia się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem.

W innej korzystnej postaci wynalazku sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym pod postacią soli sodowej, i jej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, przy czym ta heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym stanowi heparynę naturalną pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, zdepolimeryzowaną przy użyciu kwasu azotawego i będącą ewentualnie pod postacią soli sodowej, otrzymaną na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej o stężeniu 5-15% m/v roztworem azotynu sodowego, w ilości 15-69 g azotynu na kg użytej heparyny, w obecności kwasu solnego przy pH 1-5, korzystnie 1,5-4, w ciągu 20-50 minut, a następnie na drodze redukcji tak otrzymanego produktu,

178 294 korzystnie w środowisku zasadowym, przy użyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjściowej heparyny, przy czym nadmiar borowodorku sodowego rozkłada się kwasem solnym, a środowisko reakcyjne ewentualnie zobojętnia się, po czym strąca się etanolem, po którym ewentualnie przeprowadza sięj edno lub kilka frakcj onowań alkoholowych, przy czym ta heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym ma większościową masę cząsteczkową 1700-3300, a 90% składników ma masę cząsteczkową 1000-8000, zawiera strukturę 2-O-sulfo-a-L-idopiranosuronowąna końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-ma™itolu na końcu ulegającym redukcji u większości jej składników, wykazuje stopień sulfatacji około 2,1, aktywność hamującą czynnik Xa 60 - 80 Ul/mg, aktywność hamującą czynnik Ha nie wyższąod 25 Ul/mg i zawiera sumerycznie 50 ppb lub mniej związków nitrozowych, według wynalazku polega na tym, że wodny roztwór tej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, o stężeniu 5 -15% m/v poddaje się naświetlaniu ultrafioletem o długości fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 3-8, a korzystnie naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy 254 nm, w temperaturze 15-3 5 °C i przy pH 5-8. Korzystnie sposób według wynalazku polega na tym, że roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, o stężeniu 8-12% m/v, poddaje się naświetlaniu ultrafioletem w ciągu 9-15 minut przy użyciu lampy UV 16 W, przy czym ewentualnie roztwór ten poddaje się oczyszczeniu chromatograficznemu, i wyodrębnia się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, oczyszczoną i pozbawioną całkowicie związków nitrozowych przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem, przy czym ewentualnie przekształca się sól sodową w inną sól dopuszczalną farmaceutycznie, przy czym wodny roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymuje się na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej kwasem solnym i azotynem zasadowym użytym w ilości

3,5-4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując pH kwaśne i kontrolując obecnośćjonów azotynowych do momentu ich niewykrywalności, a następnie, na drodze alkalizacji, po której następuje redukcja borowodorkiem sodowym, heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym wyodrębnia się w środowisku obojętnym przez wytrącenie etanolem, przy czym po poddaniu naświetlaniu ultrafioletem przy 254 nm, przy pH około 7, tak otrzymany roztwór wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej i po wypłukaniu kolumny wodą i przy pH około 7, wyodrębnia się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem.

Środek farmaceutyczny zawierający składnik aktywny i substancje pomocnicze według wynalazku zawiera jako składnik aktywny w dawce jednostkowej 10-5000 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi zdepolimeryzowaną heparynę z azotynowej naturalnej heparyny pochodzącej z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną inną heparynę wyekstrahowanąz tkanek lub narządów różnych zwierząt, o średniej masie cząsteczkowej mniejszej niż 8000, przy czym co najmniej 60% wszystkichjej składników ma średniąmasę cząsteczkowąmniejsząniż 8000 i wykazującąaktywność hamującą czynniki Xa nie mniejsząniż 60 Ul/mg i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do aktywności hamującej czynnik Ila nie mniejszy niż 1,5, i sumarycznie zawierającą 500 ppb lub mniej związków nitrozowych, a jako substancje pomocnicze w ilości q. s. p. (quantum sufficit per) roztwór stężonego kwasu solnego lub roztwór farmaceutycznego wodrotlenku wapniowego mający pH 5-7,5, jak również wodę do preparatów do wstrzykiwania q. s. p. 0,2-1 ml.

Korzystnie środek według wynalazku zawierajako składnik aktywny w dawce jednostkowej 10-5000 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi heparynę zdepolimeryzowanąpod koniec depolimeryzacji azotynowej i ma postać soli sodowej lub soli wapniowej.

W korzystnej postaci wynalazku środek farmaceutyczny zawierający składnik aktywny i substancje pomocnicze zawiera według wynalazku jako składnik aktywny w dawce jednostkowej 10-5000 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi zdepolimeryzowaną heparynę z azotynowej naturalnej heparyny pochodzącej z błony śluzowej jelita świni zdepolimeryzowanąz użyciem kwasu azotawego, i ma ewentualnie postać soli sodowej, mającą większościową masę cząsteczkową 1700-3300, przy czym 90% składników ma masę cząsteczkową 1000-8000, zawiera strukturę 2-O-sulfo-a-L-idopiranosuronowąna końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-O-sulίb-2,5-anhydbO-D·mannitolu na końcu ulegającym redukcji u wię178 294 kszości jej składników, wykazuje stopień sulfatacji około 2,1, aktywność hamującą czynnik Xa 60-80 UI/mg, aktywność hamującą czynnik Ila nie wyższą od 25 UI/mg i sumarycznie zawiera 100 ppb lub mniej związków nitrozowych, ajako substancje pomocnicze q. s. p. roztwór stężonego kwasu solnego lub roztwór farmaceutycznego wodorotlenku wapniowego mający pH 5-7,5, j ak również wodę do preparatów do wstrzykiwania q. s. p. 0,2-1 ml, a korzystnie zawiera on j ako składnik aktywny w dawce jednostkowej 10-5000 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym o postaci soli sodowej sumarycznie zawierającej 50 ppb lub mniej związków nitrozowych.

Stwierdzono także, że w zastosowanych warunkach naświetlanie ultrafioletem nie zmienia struktury heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która zachowuje wszystkie własności biologiczne i fizykochemiczne.

Aktywność hamująca czynnik Xa i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do aktywności hamującej czynnik Ila ocenia się w oparciu o międzynarodowy wzorzec heparyn o niskim ciężarze cząsteczkowym (odsyłacz OMS 1-85/600). Średnią masę cząsteczkową oznacza się według Monografii zgłoszeniowej do Farmakopei europejskiej (patrz wyżej).

W niniejszym opisie terminu „nie zawierający żadnych związków nitrozowych” używa się do określenia heparyn o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymanych przez depolimeryzację azotynową i zawierających najwyżej 500 ppb, korzystnie najwyżej 150 ppb, jeszcze korzystniej najwyżej 100 ppb, a najkorzystniej najwyżej 50 ppb sumy związków nitrozowych. Termin „składniki” oznacza zbiór cząsteczek, z których składa się heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym. Heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym nie zawierające żadnych związków nitrozowych, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, mają w większości składników strukturę 2-O-sulfo-«.-L-idopiranosuronową na końcu nie ulegającym redukcji oraz strukturę 6-O-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolu na końcu ulegającym redukcji i stopień sulfatacji nie różniący się wyraźnie od stopnia sulfatacji nie frakcjonowanej heparyny pochodzenia naturalnego. Stopień sulfatacji wynosi 2 - 2,5, a korzystnie 2,0 - 2,3.

Heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, korzystnie według niniejszego wynalazku, mająróżny rozkład masy cząsteczkowej, przy czym masa cząsteczkowa 90% ich składnikówjest rozłożona między 2000 Da i 10000 Da, korzystnie między 2000 Da i 9000 Da, ajeszcze korzystniej między 2000 Da i 8000 Da. Ponadto, heparyny te mają większościową masę cząsteczkową 3000-6000 Da, a korzystnie 4000-5000 Da.

Inna korzystna heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym według wynalazku ma większościową masę cząsteczkową 1700-3300 Da, przy czym masa cząsteczkowa 90% wszystkich składników wynosi 1000-8000 Da.

Termin „większościowa masa cząsteczkowa” oznacza masę cząsteczkową składników heparyny odpowiadającą wierzchołkowi profilu chromatograficznemu otrzymanego przez chromatografię eksluzyjną, przy stosowaniu detektora UV przy λ = 205 nm.

Oczyszczony CY 222, określonyjako sól sodowa heparyny zdepolimeryzowanej otrzymanej przez depolimeryzację kwasem azotawym heparyny pochodzenia naturalnego z błony śluzowej jelita świni, mający

- większościowąmasę cząsteczkowąrozłożonąmiędzy 1700 Da i 3300 Da, przy czym 90% składników ma masę cząsteczkową rozłożoną między 1000 Da i 8000 Da

- strukturę 2-O-sulfo-a-idopiranosuronową na końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-0-suHb-2,5-anhydro-D-mannitolu na końcu ulegającym redukcji większości składników

- stopień sulfatacji około 2,1

- aktywność hamującą czynnik Xa równą 60 - 80 Ul/mg

- aktywność hamującą czynnik Ila nie wyższąod 25 Ul/mg, ściślej równą 10-15 Ul/mg

- sumaryczną zawartość związków nitrozowych mniejszą lub równą 100 ppb (1 x 10-mg związków nitrozowych na mg produktu), korzystnie mniejszą lub równą 50 ppb (5 x 10- mg związków nitrozowych na mg produktu) stanowi korzystnąfrakcję heparyny według niniejszego wynalazku.

Jako produkt wyjściowy w sposobie wytwarzania heparyny niskim ciężarze cząsteczkowym według wynalazku można użyć dowolnej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym

178 294 otrzymanej przez depolimeryzację azotynową. Produkt taki ma zazwyczaj sumaryczną zawartość związków nitrozowych w zakresie od 1000 do 20000 ppb.

Oznaczanie sumarycznej zawartości związków nitrozowych prowadzi się metodą opisaną w pracy B.Pignatelli i in., Analyst, wrzesień 1989.114. str. 1103-1108 oraz Analyst, lipiec 1987, 112. str. 945 - 949, dostosowaną do heparyn o niskim ciężarze cząsteczkowym.

Sposób według wynalazku można stosować w odniesieniu do heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym o jakości farmaceutycznej, rozpuszczonej w wodzie, lub też podczas produkcji przemysłowej, po etapie depolimeryzacji azotynowej i przed wyodrębnieniem produktu czystego ojakości farmaceutycznej. Korzystnie stosuje się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym o jakości farmaceutycznej. JiOko siurowiec w sposobie według wynahadkumożna więc zastosować dowolnąheparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymanąprzez depolimeryzację azotynową. Dla otrzymania maksimum skuteczności korzystnie jest stosować roztwory heparyny zdepolimeryzowanej nie zawierające mikrocząsteczek w zawiesinie. Obecność mikrocząsteczek może być spowodowana złym rozpuszczeniem heparyny zdepolimeryzowanej lub różnymi zanieczyszczeniami, bądź też pozostałościami reagentów użytych podczas depolimeryzacji lub podczas oczyszczania. Dlatego roztwory heparyny zdepolimeryzowanej korzystnie poddaje się wcześniej filtracji.

Sposób według wynalazku jest wyjątkowo skuteczny i elastyczny, gdyż pozwala na usunięcie związków nitrozowych prosto, szybko i pewnie. Ponadto sposób według wynalazku nie powoduje żadnej zmiany w strukturze heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, której własności biologiczne i charakterystyki fizyczne pozostają takie same.

Sposób według wynalazku można prowadzić przez ekspozycję wodnego roztworu o stężeniu 5-15% m/v frakcji heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymanej przez depolimeryzację azotynową, korzystnie heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym przeznaczonej do oczyszczanie, pod układem promieniowania UV o długości fali 180-350 nm, korzystnie 254 nm, w temperaturze 5-50°C, korzystniej 15-35°C, jeszcze korzystniej w temperaturze pokojowej. Odczyn roztworu jest lekko kwaśny lub lekko zasadowy i pH wynosi 3-8, a korzystnie 5-8.

Czas promieniowania zależy od użytego układu promieniowania, od mocy promieniowania i od sumarycznej ilości związków nitrozowych do usunięcia, zawartych we frakcji heparyny. Wynosi od 2-30 minut, choćjuż po 9-15 minutach oczyszczeniejest zazwyczaj niemal całkowite.

Jako układ promieniowania UV można stosować układ statyczny bądź układ dynamiczny pozwalający roztworom heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym krążyć wokół źródła promieniowania UV Korzystniejsze sąukłady dynamiczne. W tym przypadku źródło promieniowania UV może być przyłączone do cylindrycznej rury (aparat typu „zamknięty”) bądź do kanału (aparat typu „otwarty”). Jako aparat typu „zamknięty” można stosować sterylizator UV JR1-50 (KATADYN) lub dowolny równoważny aparat.

Figura 1 rysunku przedstawia przekrój aparatu typu „zamknięty”. Aparat ten składa się z lampy UV (1), do której dopasowana jest osłona kwarcowa (2). Roztwory zawierające heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym krążą wokół lampy UV zabezpieczonej osłoną kwarcową (osłona cieczy krążącej (3)). Roztwory te wprowadza się przez wlot (4) umieszczony na poziomie jednego z końców lampy UV, podczas gdy wylot (5) mieści się na jej drugim końcu.

Gdy stosuje się układ dynamiczny, natężenie przepływu roztworów heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, zjakim krążąone wokół źródła promieniowania UV, winno być odpowiednio dopasowane tak, aby uzyskać czas promieniowania niezbędny do usunięcia związków nitrozowych. Innymi parametrami, które mogą mieć wpływ, są średnica przewodu dla cieczy krążącej, wymiar i/lub moc źródła promieniowania UV, stężenie wodnego roztworu heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym i ilość związków nitrozowych do usunięcia, zawartych w tym roztworze.

Tak otrzymaną heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, nie zawierającą żadnych związków nitrozowych, można odzyskiwać znanymi metodami.

178 294

Jeśli jako produkt wyjściowy stosuje się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym mającąjuż jakość farmaceutyczną, wystarczy rozpuścić produkt w wodzie, doprowadzić pH roztworu do 3-8, korzystnie do 5-8, i poddać ten roztwór czynnościom przewidzianym w sposobie według wynalazku.

Jako produkt wyjściowy można również stosować heparynę pochodzenia naturalnego nie frakcjonowaną, korzystnie w postaci soli, zwłaszcza heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym w postaci soli sodowej, korzystnie pochodzącą z błony śluzowej jelita świni. W tym przypadku sposób według wynalazku stanowi etap w wytwarzaniu czystego produktu końcowego nie zawierającego żadnych związków nitrozowych, po depolimeryzacji azotynowej.

Według korzystnej postaci, niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania oczyszczonego CY 222, określonego jako sól sodowa heparyny zdepolimeryzowanej otrzymanej przez depolimeryzację kwasem azotawym heparyny pochodzenia naturalnego z błony śluzowej jelita świni, mającego:

- większościową masę cząsteczkową rozłożoną między 1700 Da i 3300 Da

- 90% składników o masie cząsteczkowej rozłożonej między 1000 Da i 8000 Da

- strukturę 2-0-sulfo-a-L-idopiranosuronowąna końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolu na końcu ulegającym redukcji w większości jego składników

- stopień sulfatacji około 2,1

- aktywność hamującą czynnik Xa równą 60 - 80 Ul/mg

- aktywność hamującą czynnik Ila nie wyższą od 25 Ul/mg

- zawartość związków nitrozowych mniejszą lub równą 100 ppb, korzystnie mniejszą lub równą 50 ppb, przy czym sposób ten charakteryzuje się tym, że:

(a) na wodny roztwór heparyny sodowej pochodzenia naturalnego nie frakcjonowanej działa się kwasem solnym i ilością azotynu alkalicznego wynoszącą 3,5 - 4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując przez cały czas odczyn kwaśny i przestrzegając obecności jonów azotynowych aż do reakcji negatywnej, po czym prowadzi się alkalizację i redukcję borowodorkiem sodowym i wyodrębnia w środowisku obojętnym zdepolimeryzowany produkt przez wytrącenie etanolem, po czym (b) wodny roztwór tak otrzymanego produktu, o pH około 7, przepuszcza się pod układem promieniowania ultrafioletowego przy 254 nm, następnie tak otrzymany roztwór wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej i, po przemyciu kolumny wodąi przy pH około 7, odzyskuje się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem.

W etapie (a) stosuje się jako azotyn alkaliczny, w proporcjach opisanych powyżej, azotyn sodu.

W etapie (b) układ promieniowania ultrafioletowego zawiera korzystnie lampę 16 W a czas ekspozycji na promieniowanie UV przy 254 nm wynosi korzystnie 9-15 minut. Korzystny jest dynamiczny układ promieniowania UV, zwłaszcza aparat typu „zamknięty”. Stężenie roztworów poddanych promieniowaniu UV wynosi korzystnie 8-12% m/v.

Dla środków według niniejszego wynalazku, heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym może mieć postać liofilizatu lub roztworu do wstrzyknięć podskórnych, w sterylnym rozpuszczalniku biologicznie dopuszczalnym, takim jak woda, lub w roztworze fizjologicznym, w ampułkach, w buteleczkach, w strzykawkach uprzednio napełnionych lub w urządzeniach do autoiniekcji typu „pióro”. Każda dawka jednostkowa środków farmaceutycznych może zawierać 50-50000 Ul hamowania czynnika Xa.

Heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym według wynalazku można również podawać przez wstrzyknięcie dożylne, samą lub w mieszaninie z innymi składnikami aktywnymi. Można ją również podawać przez rozpylenie śródnosowe lub śródpłucne.

Korzystny środek farmaceutyczny według niniejszego wynalazku zawiera jako składnik aktywny CY 222 całkowicie pozbawiony związków nitrozowych, taki jak opisany powyżej, w dawkach jednostkowych zawierających 10-5000 mg CY 222 w postaci soli sodowej.

178 294

Jak zaznaczono poprzednio, oznaczanie sumy związków nitrozowych prowadzi się metodąB. Pignatelli i in., opisaną w Analyst, wrzesień 1979, 114. str. 1103 -1198 i w Analyst, lipiec 1987, 112. str. 945 - 949, dostosowaną do heparyn o niskim ciężarze cząsteczkowym.

Metoda analityczna

Produkty do analizy są korzystnie proszkami, w związku z czym w przypadku oznaczania sumy związków nitrozowych obecnych w roztworze prowadzi się najpierw liofilizację roztworu a następnie analizuje zliofilizowanąpróbkę.

- Odczynniki

Odczynniki stosowane dla 100 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym sąnastępujące:

- octan etylu potraktowany kwasem amidosulfonowym 20% m/v (roztwór 2000 g kwasu amidosulfonowego w 1000 ml octanu etylu mieszany w ciągu 3 dni i przesączony przed użyciem przez bibułę)

- kwas bromowodorowy 15% w kwasie octowym (małe butelki przyciemnione z korkiem polietylenowym, zawierające 5 ml 30% kwasu bromowodorowego, zamknięte w atmosferze argonu i przechowywane w ciemności. W momencie użycia dodaje się 5 ml czystego kwasu octowego, miesza i przechowuje w małym naczyniu w ciemności. Stosuje się 1 buteleczkę na serię oznaczeń)

- formamid (95%) potraktowany kwasem amidosulfonowym 5% m/v (roztwór 1 g kwasu amidosulfonowego w 20 ml formamidu zawierającego 5% oczyszczonej wody)

- Sporządzanie roztworów wzorcowych i próbki do analizy

- Roztwór wzorcowy N-nitrozo-di-n-propyloaminy (NDPA)

Do butelki ISOPAC Sigma zawierającej 1 g N-nitrozo-di-n-propyloaminy wstrzykuje się przez septum 78,62 g czystego etanolu. Stężenie wynosi 10000 ppm NDPA (3379 ppm N-NO). Następnie rozcieńcza się do 1/100 czystym etanolem i wprowadza porcje po 0,5 ml do małych kapslowanych buteleczek. Stężenie wynosi 100 ppm NDPA. Przechowuje się w ciemności w temperaturze +4°C.

Roztwór wzorca dolnego: w momencie użycia rozcieńcza się do 1/100 etanolem, następnie do 1/17 formamidem potraktowanym jak wyżej. Stężenie wynosi 0,0588 ppm NDPA lub 19,9 ppb N-NO.

Roztwór wzorca średniego: w momencie użycia rozcieńcza się do 1/61 etanolem a następnie do 1/11 formamidem potraktowanym jak wyżej. Stężenie wynosi 0,149 ppm NDPA lub 50,4 ppb N-NO.

Roztwór wzorca górnego: w momencie użycia rozcieńcza się do 1/10 etanolem a następnie do 1/10 formamidem potraktowanym jak wyżej. Stężenie wynosi 1 ppm NDPA lub 338 ppb N-NO.

- Próbka do analizy

Próbki heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym suszy się w ciągu 12 godzin w temperaturze 60°C pod próżniąwobec bezwodnika fosforowego. Rozpuszcza się 100 mg heparyny w 1 ml formamidu potraktowanego jak wyżej i miesza się w ciągu 30 minut w mieszarce - wytrząsarce.

- Zastosowana aparatura

Zastosowaną aparaturę przedstawiono na fig. 2 rysunku.

Montaż

Aparat składa się z kolby o pojemności 500 ml ze szkła pyrex (1), na której zamontowana jest chłodnica z podwójnym płaszczem (2) oziębiona do -15°C. Chłodnica ta połączona jest z trzema płuczkami ustawionymi szeregowo (3), z których każda zawiera 30 ml 30% wodorotlenku sodowego. Płuczki sąpołączone z dwiema wymrażarkami ustawionymi szeregowo, z których j edna zawiera etanol w stanie topnienia o temperaturze -120°C (4), a druga izopentan w stanie topnienia o temperaturze -160°C (5). Te ostatnie sąprzyłączone do detektora chemiluminescencyjnego (TEA), Model 610 (Thermedics Detection INC.) lub podobny (6). Detektorjest połączony z integratorem/rejestratorem (7).

Kolba jest wyposażona z jednej strony w przewiercony korek (8) umożliwiający wprowadzenie rurki przez którą dopływa strumień argonu. Z drugiej strony kolba ma króciec z gwintem wy178 294 posażony w korek umożliwiający umieszczenie septum typu CGP (9) przez które wstrzykuje się próbkę. Strumień argonu i próżnia wytwarzania przez pompę próżniową TEA kierują gazy do TEA.

- Przepis roboczy

4.1. Regulacja detektora

TEA reguluje się zgodnie z wytycznymi producenta w celu uzyskania maksymalnej czułości i powtarzalności. Na godzinę przed oznaczeniem otwiera się tlen, ciśnienie 2 x 10³ kPa, nastawia przepływ na 0,02 na przepływomierzu TEA 610 (Thermedics Detection INC.).

4.2. Przygotowanie płuczek z wodorotlenkiem sodowym

Każdą płuczkę napełnia się 30 ml 30% wodorotlenku sodowego.

4.3. Przygotowanie wymrażarek

Wymrażarka o temperaturze -120°C: do naczynia Dewara zawierającego 250 ml etanolu wprowadza się powoli, mieszając drewnianą łopatką, ciekły azot aż do uzyskania pasty.

Wymrażarka o temperaturze -160°C: do naczynia Dewara zawierającego 250 ml izopentanu wprowadza się powoli, mieszając drewnianą łopatką, ciekły azot aż do uzyskania pasty.

Dwie szklane wymrażarki umieszczone w odpowiednich naczyniach Dewara, włącza się szeregowo do obiegu.

4.4. Odwodnienie zestawu kolba - chłodnica ml octanu etylu utrzymuje się w ciągu 1 godziny, w atmosferze argonu, w temperaturze refuksu, przy odłączonym TEA.

4.5. Reakcja i oznaczanie

Do nowej kolby, czystej i suchej, wyposażonej w septum, wprowadza się 30 ml octanu etylu potraktowanego jak poprzednio, zamontowuje na niej chłodnicę (kriostat powinien być uruchomiony na 2 godziny wcześniej przy -15°C), umieszcza łaźnię grzejną i rozpoczyna ogrzewanie (pozycja 4). Przyłącza się przewód argonu, ustawia przepływ na 0,1 l/minutę i sprawdza szczelność całego obiegu. Tylko bocznik TEA pozostaje otwarty dla uniknięcia nadciśnienia. Gdy octan etylu zacznie wrzeć, bardzo łagodnie przechodzi się do próżni i równocześnie zaciska się bocznik TEA. W całym układzie wytwarza się próżnia, która osiąga 2,67-5,33 kPa gdy układ jest zrównoważony. Nastawia się zero na TEA przy 10% całkowitej skali integratora/rejestratora. Przez septum wstrzykuje się kolejno 0,5 ml oczyszczonej wody, 2 ml rozcieńczonego roztworu kwasu bromowodorowego, a następnie ponownie 2 ml rozcieńczonego kwasu bromowodorowego, przy czym po każdym wstrzyknięciu weryfikuje się powrót linii podstawy na integratorze/rt-estratorze. Po wstrzyknięciu reagentów do kolby odczekuje się na powrót linii podstawy i wstrzykuje 50 (l wzorca lub próbki. Między każdym wstrzyknięciem odczek^e się na powrót linii podstawy. Podczas oznaczeń wprowadza się 5 próbek na 2 wzorce i postępuje tak, aby pełna manipulacja trwała nie dłużej niż 60 minut.

4.6. Ocena sumarycznej ilości związków nitrozowych

Ilość N-NO, w ppb, oblicza się ze wzoru:

N-NO w ppb powierzchnia próbki x Cs x 0,05 x 44 x 1000 powierzchnia wzorca x 0,005 x 0,1 x 130,2 gdzie:

Cs: stężenie wzorca w ppm NDPA (0,0588 lub 0,149 lub 1 ppm) 0,05: (licznik) pobrana próba wzorca (ml)

44: masa cząsteczkowa N-NO

1000: konwersja ppm w ppb

0,05: (mianownik) pobrana próba próbki (ml)

0,1: pobrana próba próbki w gramach 130,2: masa cząsteczkowa NDPA.

178 294

Poniższe arnykłady ilustrują niniejszy wynalazek, nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. Wytwarzanie oczyszczonej oadaoparyny wapniowej o łącznej zawartości związków nitrozowych poniżej 100 ppb.

Etap A: Depolimeryzacja i frakcjonowanie etanolowe

W reaktorze umieszczono 20 kg heparyny o niskim ciężarne cząsteczkowym w postaci soli sodowej pochodzącej z błony śluzowej jelita świni i rozpuszczono ją w oczyszczonej wodzie tak, aby otrzymać stężenie końcowe około 10,3% (m/v). Wartość pH roztworu doprowadzono do 2,5 za pomocąutężooego kwasu solnego. Do reaktora wprowadzono 572 g azotynu sodowego, ^ιό-mując pH przy 2,5 za pomocą stężonego kwasu solnego. Przebieg reakcji kontrolowano papierkiem wsóaźoiórwymjodosóaobiowym. Reakcję uznano za zakończoną, gdy test był negatywny. Za pomocą stężonego wodorotlenku sodowego doprowadzono pH roztworu reakcyjnego do 10, po czym dodano 200 g borowodorku sodowego. Całość mieszano w ciągu 15 godzin, po czym wartość pH doprowadzono do 4-3,5 za pomocą stężonego kwasu solnego w celu rozłożenia nadmiaru borowodorku. Następnie wartość pH doprowadzono do 7 przez dodanie stężonego wodorotlenku sodowego, po czym przeprowadzono wytrącanie przez dodanie 2 objętości etanolu na objętość roztworu wodnego. Całość pozostawiono do dekantecji, po czym usunięto naduąco wodoorlóohol.owy. Osad rozpuszczono w 4001 oczyszczonej wody. Do orrnymanego roztworu dodano chlorku sodowego do bnyskroia przewodności właściwej około 20000 pS/cm. Następnie wartość pH doprowadzono do około 4 za pomocą stężonego kwasu solnego i w trakcie mieszania dodano do roztworu arny mieszaniu 1 objętość absolutnego etanolu. Całość pozostawiono do dekanracji na około 60 godzin, po czym usunięto oadsązz wodnoalóoeoIowy. W ten sposób otrzymano nadroaraynę w postaci soli sodowej. Osad rozpuszczono w oczyszczonej wodzie tak, aby uzyskać roztwór o stężeniu około 18% m/v w odniesieniu do ilości heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym w postaci soli sodowej użytej aoznąrkowo i doprowadzono pH do 7 za pomocą stężonego wodorotlenku sodowego. Następnie roztwór przesączono przez układ wyposażony w pochłaniacze o porowatości 0,2 ppm. Z przesączonego roztworu zawierającego nadaopraynę sodową pobrano próbkę, która później nie została potraktowana sposobem opisanym w etapie B (obróbka przez promieniowanie UV). Próbkę tę nazwano „kontrola”

Etap B: Obróbka przez promieniowanie UV

Do obróbki przez promieniowanie UV użyto rurę Katadyn typu JR1 -50 o objętości użytkowej 750 ml. Zatosowana długość fali wynosiła 254 nm. Wcześniej za pomocą pompy arrytraltyczoej uregulowano natężenie prneaływb przejścia stosując oczyszczoną wodę, w taki sposób (4800 ml/godzinę), aby uzyskać pmy jednym przejściu bez zawracania łączny czas ekspozycji pod UV około 9 minut. Następnie wprowadzono roztwór oadaoparyny sodowej do obróbki i przemyto obieg oczyszczoną wodą do całkowitego odzyskania potraktowanego produktu w zbiorniku przyłączonym do wylotu z rury Katadyn JR1-50.

Etap C: Oczyszczanie przez chromatografię i przeprowadzenie w sól wapniową

Otrzymany w poprzednim etapie roztwór nadrraaryny oczyszczono na kolumnie aaiooitowej (0,5 l/kg użytej heparyny sodowej). Przewodnictwo właściwe zebranych efluentów doprowadzono do 10000-20000 pS za pomocą chlorku sodowego i dodano 1,5 objętości etanolu. Pozostawiono do dekantacji w ciągu 41 godzin, po czymbsboięto nadsącz. Osad rozpuszczono w oczyszczonej wodzie (stężenie = 18% m/v w odniesieniu do ilości użytej początkowo heparyny sodowej) i dodano sześciowodny chlorek wapniowy (9,69 g/g użytej heparyny sodowej). Następnie prowadzono wytrącanie etanolowe przez dodanie 1,5 objętości etanolu. Powtórzono etap wysyłania sześciowodoym chlorkiem wapniowym i etap oczyszczania przez wytrącanie etanolowe. Otrzymany osad wysuszono w temperaturze poniżej 60°C.

W ten sposób otrzymano partię 1.

Partię „kontrola” otizymanąw etapie A również potraktowano w sposób opisany w Etapie C i wyodrębniono partię „kontrola” ο^^ο^- wapniowej.

Dla próbki partii 1 i partii „kontrola” nadTOpaT-ny wapniowej wykonano analizy fizykochemiczne i oznaczenia aktywności biologicznej.

178 294

Wyniki zestawiono w tabelach 1 i 2.

Tabela 1 Próby fizykochemiczne

Właściwości	Seria 1 (traktowanie UV)	Kontrola (bez traktowania UV)
1	2	3
Związki nitrozowe łącznie (ppb)	53	3150
Wolne siarczany (%)	0,05	0,06
pH 5% roztworu	6,0	6,0
Wolne NH2 (ppm)	<30	<30
HPLC-GPC (UV 205 nm) Wagowo średnia masa cząsteczkowa (Mw) (Da)	5017	4933
Liczbowo średnia masa cząsteczkowa (Mn) (Da)	4043	4052
Ciężar cząsteczkowy na wierzchołku (Da)	4181	41,92
Dyspersja	1,24	1,21
% c. cz.> 10000 Da	2,4	2,1
% c. cz. > 8000 Da	7,2	6,9
% c. cz. <2000 Da	3,0	2,9
% c. cz .< 1800 Da	2,4	2,3

Tabela 2 Próby biologiczne

Właściwości	Seria 1 (traktowanie UV)	Kontrola (bez traktowania UV)
Aktywność hamująca czynnik Xa	124 Ul/mg	123 Ul/mg
Aktywność hamująca czynnik IIa	29,3 Ul/mg	30,4 Ul/mg

Rezultaty podane w tabelach 1 i 2 wykazały, że traktowanie UV nie spowodowało żadnego uszkodzenia nadroparyny. Charakterystyki fizykochemiczne i biologiczne partii 1 takichjak profil chromatograficzny produktu, zawartość różnych zanieczyszczeń, aktywność hamująca czynnik Xa i aktywność hamująca czynnik IIa były identyczne z kontrolą nie traktowaną promieniowaniem UV, z jednym wyjątkiem. Sumaryczna zawartość związków nitrozowych w kontroli nie traktowanej była około 60 razy większa od sumarycznej zawartości związków nitrozowych partii 1 poddanej promieniowaniu UV.

Ponadto, rezultaty analiz metodą paramagnetycznego rezonansu elektronowego potwierdziły, że traktowanie promieniami UV nie powodowało uwalniania wolnych rodników, pojawiających się zwykle w wyniku zastosowania promieniowania UV w związku z czym wytworzona heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym nie zostaje zniszczona w wyniku wtórnej reakcji.

Przykład II. Wytwarzanie soli sodowej CY 222 o sumarycznej zawartości związków nitrozowych mniejszej od 50 ppb

Etap A: Depolimeryzacja

W reaktorze rozpuszczono w oczyszczonej wodzie 250 g heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym w postaci soli sodowej pochodzącej z błony śluzowej jelita świni tak, aby otrzymać stężenie końcowe około 10,3% (m/v). pH doprowadzono do 2,5 zapomocą stężonego kwasu solnego. Do reaktora wprowadzono 9,49 g azotynu sodowego utrzymując pH 2,25. Przebieg reakcji depolimeryzacji kontrolowano papierkiem wskaźmikowymjoćloskrobiowym. Reakcję uznawano za zakończoną, gdy test był negatywny. Wartość pH roztworu reakcyjnego doprowadzono

178 294 do 10-10,5 za pomocą stężonego wodorotlenku sodu, po czym dodano 2,5 g borowodorku sodowego. Mieszaninę utrzymywano przy mieszaniu w ciągu 15 godzin, po czym doprowadzono pH do 3,5-4 za pomocą stężonego kwasu solnego w celu rozłożenia nadmiaru borowodorku. Przez dodanie stężonego wodorotlenku sodowego doprowadzono pH do 7. Następnie wytrącono osad dodając 2 objętości etanolu na objętość roztworu. Osad pozostawiono do dekantacji i usunięto nadsącz. W ten sposób otrzymano CY 222 w postaci soli sodowej. Tak otrzymany produkt zawierał łącznie 3000-10000 ppb związków nitrozowych (wyniki 3 prób).

Etap B: Obróbka promieniowaniem UV.

Osad z etapu poprzedniego rozpuszczono w oczyszczonej wodzie tak, aby otrzymać roztwór końcowy o stężeniu m/v w odniesieniu do ilości użytej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym w postaci soli sodowej. Za pomocą stężonego kwasu solnego lub wodorotlenku sodowego doprowadzono pH do 7. Po uregulowaniu natężenia przepływu przez pompę tak otrzymany roztwór przepuszczono pod układem promieniowania ultrafioletowego przy 254 nm (układ Katadyn JR-1-50 wyposażony w lampę 16 W). Czas ekspozycji na promieniowanie UV wynosił 9-15 minut.

Etap C: Oczyszczanie przez chromatografię i końcowe wytrącania

Roztwór otrzymany po obróbce promieniami UV oczyszczono na kolumnie chromatograficznej zawierającej co najmniej 21 żywicy anionowej na kg użytej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym w postaci soli sodowej. Przewodność właściwą zebranych efluentów doprowadzono do 30-35 mS/cm za pomocą chlorku sodowego i doprowadzono pH do 7 za pomocąkwasu solnego. Następnie dodano 2 objętości etanolu na objętość roztworu wodnego. Osad pozostawiono do dekantacji, po czym usunięto nadsącz. Osad rozpuszczono w oczyszczonej wodzie tak, aby uzyskać roztwór końcowy o stężeniu 20% m/v w odniesieniu do ilości heparyny sodowej użytej początkowo. Przewodność właściwą roztworu doprowadzono do 30-35 mS/cm za pomocą chlorku sodowego a pH do 7-7,5 za pomocą stężonego kwasu solnego lub stężonego wodorotlenku sodowego. Następnie dodano 2 objętości absolutnego etanolu, wytrącono osad i pozostawiono do dekantacji. Osad zebrano, przemyto go etanolem i wysuszono w temperaturze poniżej 60°C. W ten sposób otrzymano czysty CY 222 określony jako sól sodowa zdepolimeryzowanej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymanej przez depolimeryzację kwasem azotawym heparyny z błony śluzowej jelita świni, mający:

- większościową masę cząsteczkową rozłożoną między 1700 Da i 3300 Da, przy czym u 90% składników rozłożoną między 1000 Da i 8000 Da.

- u większości jego składników strukturę 2-O-sulfo-a-L-idopiranosuronowąna końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-O-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolu na końcu ulegającym redukcji

- stopień sulfatacji około 2,1

- aktywność hamującą czynnik Xa wynoszącą 60-80 Ul/mg

- aktywność hamującą czynnik IIa nie większą od 25 Ul/mg, a zwłaszcza 10-15 Ul/mg

- zawartość związków nitrozowych niniejszą od 50 ppb.

178 294

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym i jej farmaceutycznie dopuszczalne sole, znamienna tym, że stanowi heparynę naturalną pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną innąheparynę wyekstrahowaną z tkanek lub narządów różnych zwierząt, zdepolimeryzowaną przy użyciu kwasu azotawego, o średniej masie cząsteczkowej mniejszej niż 8000, przy czym co najmniej 60% wszystkich jej składników ma średniąmasę cząsteczkową mniejszą niż 8000 i wykazuje aktywność hamującą czynnik Xa nie mniejszą niż 60 Ul/mg i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do aktywności hamującej czynnik IIa nie mniejszy niż

1,5 i sumarycznie zawiera 500 ppb lub mniej związków nitrozowych.
2. Heparyna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi heparynę zdepolimeryzowaną pod koniec depolimeryzacji azotynowej i ma postać soli sodowej lub soli wapniowej.
3. Heparyna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi naturalną heparynę pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną inną heparynę wyestrahowanaz tkanek lub narządów różnych zwierząt, zdepolimeryzowaną z użyciem kwasu azotawego, i ma ewentualnie postać soli sodowej, ma większościową masę cząsteczkową 1700-3000, przy czym 90% składników ma masę cząsteczkową 1000-8000, zawiera strukturę 2-O-sulfo-a-L-idopiranosuronowąna końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-0-sulfo-2,5-anhydrO-D-mannitolu na końcu ulegającym redukcji u większości jej składników, wykazuje stopień sulfatacji około 2,1, aktywność hamującą czynnik Xa 60-80 Ul/mg, aktywność hamującą czynnik IIa nie wyższą niż 25 Ul/mg i zawiera sumarycznie 100 ppb lub mniej związków nitrozowych.
4. Heparyna według zastrz. 2 albo 3, o postaci soli sodowej, znamienna tym, że sumarycznie zawiera 50 ppb lub mniej związków nitrozowych.
5. Sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi heparynę naturalną pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną inną heparynę wyestrahowaną z tkanek lub narządów różnych zwierząt, zdepolimeryzowaną przy użyciu kwasu azotawego, o średniej masie cząsteczkowej mniejszej niż 8000, przy czym co najmniej 60% wszystkich jej składników ma średniąmasę cząsteczkową mniejszą niż 8000 i wykazuje aktywność hamującączynnik Xa nie mniejsząniż 60 Ul/mg i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do aktywności hamującej czynnik IIa nie mniejszy niż 1,5, i sumarycznie zawiera 500 ppb lub mniej związków nitrozowych ijej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, przy czym tę heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, otrzymuje się na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej o stężeniu 5-15% m/v roztworem azotynu sodowego, w ilości 15-69 g azotynu na kg użytej heparyny, w obecności kwasu solnego przy pH 1-5, korzystnie 1,5-4, w ciągu 20-50 minut, a następnie na drodze redukcji tak otrzymanego produktu, korzystnie w środowisku zasadowym, przy użyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjściowej heparyny, przy czym nadmiar borowodorku sodowego rozkłada się kwasem solnym, a środowisko reakcyjne ewentualnie zobojętnia się, po czym strąca się etanolem, po którym ewentualnie przeprowadza się jedno lub kilka frakcjonowań alkoholowych tak otrzymanej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, znamienny tym, że roztwór wodny o stężeniu 5-15% m/v tej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym poddaje się naświetlaniu ultrafioletem długości fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 3-8, przy czym ewentualnie roztwór ten poddaje się oczyszczeniu chromatograficznemu, i wyodrębnia się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, oczyszczoną i pozbawioną całkowicie związków

178 294 nitrozowych przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem, po czym ewentualnie przekształca się sól sodową w inną sól dopuszczalną farmaceutycznie.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy 254 nm, w temperaturze 15-35°C i przy pH 5 - 8.
7. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymuje się na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej kwasem solnym i azotynem zasadowym użytym w ilości 3,5-4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując pH kwaśne i kontrolując obecność jonów azotynowych do momentu ich niewykrywalności, a następnie, na drodze alkalizacji, po której następuje redukcja borowodorkiem sodowym, heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym wyodrębnia się w środowisku obojętnym przez wytrącenie etanolem, przy czym promieniowanie ultrafioletowe prowadzi się przy pH około 7, i tak otrzymany roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej a, po wypłukaniu kolumny wodą i przy pH około 7, wyodrębnia się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem.
8. Sposób według zastrz. 5 albo 6, albo 7, znamienny tym, że naświetlanie ultrafioletem prowadzi się w ciągu 9-15 minut z użyciem lampy UV16 W, przy czym stężenie roztworu produktu poddanego naświetlaniu ultrafioletem wynosi 8-12% m/v.
9. Sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi zdepolimeryzowjmąheparynę naturalnąpochodzącąz błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną innaheparynę wyekstrahowanąz tkanek lub narządów różnych zwierząt, zdepolimeryzowaną przy użyciu kwasu azotawego, otrzymaną na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postaciąsoli sodowej o stężeniu 5-15% m/v roztworem azotynu sodowego, w ilości 15-69 g azotynu na kg użytej heparyny, w obecności kwasu solnego przy pH 1-5, korzystnie, 1,5-4, w ciągu 20-50 minut, a następnie na drodze redukcji tak otrzymanego produktu, korzystnie w środowisku zasadowym, przy użyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjściowej heparyny, przy czym nadmiar borowodorku sodowego rozkłada się kwasem solnym, a środowisko reakcyjne ewentualnie zobojętnia się, po czym strąca się etanolem, po którym ewentualnie przeprowadza sięjedno lub kilka frakcjonowań alkoholowych tak otrzymanej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, o średniej masie cząsteczkowej mniejszej niż 8000, przy czym co najmniej 60% wszystkich jej składników ma średnią masę cząsteczkową mniejszą niż 8000 i wykazującąaktywność hamującączynnik Xa nie mniejsząniż 60 UI/mg i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do aktywności hamującej czynnik lianie mniejszy niż 1,5, ^.sumarycznie zawierającą 500 ppb lub mniej związków nitrozowych, i mającą postać soli sodowej lub soli wapniowej i jej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że wodny roztwór tej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, o stężeniu 5-15% m/v poddaje się naświetlaniu ultrafioletem o długości fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 3-8.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy 254 nm, w temperaturze 15-35°C i przy pH 5-8.
11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że wodny roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym poddaje naświetlaniu ultrafioletem przy 254 nm w ciągu 9-15 minut przy użyciu lampy UV 16 W, przy czym stężenie roztworu produktu poddawanego naświetlaniu UV wynosi 8-12% m/v, po czym ewentualnie roztwór ten poddaje się oczyszczeniu chromatograficznemu i wyodrębnia się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, oczyszczoną i pozbawioną całkowicie związków nitrozowych przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem, przy czym ewentualnie przekształca się sól sodową w inną sól farmaceutycznie dopuszczalną.
12. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że roztwór wodny heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymuje się na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej kwasem solnym i azotynem zasadowym użytym w ilości

3,5-4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując pH kwaśne i kontrolując obecnośćjonów azotynowych do momentu ich niewykrywalności, a następnie, na drodze alkalizacji,

178 294 po której następuje redukcja borowodorkiem sodowym, heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym wyodrębnia się w środowisku obojętnym przez wytrącenie etanolem, i tym, że po poddaniu naświetlaniu ultrafioletem przy 254 nm, pH około 7, tak otrzymany roztwór wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej i, po wypłukaniu kolumny wodą i przy pH około 7, wyodrębnia się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem.
13. Sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym i jej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, przy czym ta heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym stanowi heparynę naturalną pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, zdepolimeryzowanąprzy użyciu kwasu azotawego i będącą ewentualnie pod postacią soli sodowej, otrzymaną na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej o stężeniu 5-15% m/v roztworem azotynu sodowego, w ilości 15-69 g azotynu na kg użytej heparyny, w obecności kwasu solnego przy pH 1-5, korzystnie 1,5-4, w ciągu 20-50 minut, a następnie na drodze redukcji tak otrzymanego produktu, korzystnie w środowisku zasadowym, przy użyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjściowej heparyny, przy czym nadmiar borowodorku sodowego rozkłada się kwasem solnym, a środowisko reakcyjne ewentualnie zobojętnia się, po czym strąca się etanolem, po którym ewentualnie przeprowadza się jedno lub kilka frakcjonowań alkoholowych, o większościowej masie cząsteczkowej 1700-3300, przy czym 90% składników ma masę cząsteczkową 1000-8000, zawierającą strukturę 2-O-si^l!f^-^ć^-^l^-^i(^(^]^ii^r^i^(^i^i^i^r^r^(^\wąna końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolu na końcu ulegającym redukcji u większości jej składników, wykazującą stopień sulfatacji około 2,1, aktywność hamującączynnik Xa 60-80 Uł/mg, aktywność hamującą czynnik Ila nie wyższą od 25 UI/mg i zawierającą sumarycznie 100 ppb lub mniej związków nitrozowych, znamienny tym, że wodny roztwór o stężeniu 5-15% m/v heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, otrzymanej przez depolimeryzację azotynową, poddaje się naświetlaniu ultrafioletem o długości fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50C, przy pH roztworu wynoszącym 3-8.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy 254 nm, w temperaturze 15-35°C i przy pH 5-8.
15. Sposób według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że stosuje się roztwór heparyny poddawany naświetlaniu ultrafioletem, o niskim ciężarze cząsteczkowym, o stężeniu wynoszącym 8-12% m/v, przy czym ewentualnie roztwór ten poddaje się oczyszczeniu chromatograficznemu, i wyodrębnia się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, oczyszczoną i pozbawioną całkowicie związków nitrozowych przez wytrącenie chlorkiem sodu i etanolem, przy czym ewentualnie przekształca się sól sodową w inną sól farmaceutycznie dopuszczalną.
16. Sposób według zastrz. 13 albo 14, znamienny tym, że wodny roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymuje się przez działanie na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej kwasem solnym i azotynem zasadowym użytym w ilości 3,5-4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując pH kwaśne i kontrolując obecność jonów azotynowych do momentu ich niewykrywalności, a następnie, na drodze alkalizacj i, po której następuj e redukcja borowodorkiem sodowym, heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym wyodrębnia się w środowisku obojętnym przez wytrącenie etanolem, i roztwór wodny tak otrzymanego produktu poddaje się, przy pH około 7, naświetlaniu ultrafioletem, przy 254 nm w ciągu 9-15 minut z użyciem lampy Uv 16 W, a następnie tak otrzymany roztwór wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej i, po wypłukaniu kolumny wodą i przy pH około 7, wyodrębnia się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem.
17. Sposób wytwarzania i oczyszczania heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym pod postaciąsoli sodowej, ijej farmaceutycznie dopuszczalnych soli, przy czym ta heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym stanowi heparynę naturalną pochodzącą z błony śluzowej jelita świni, zdepolimeryzowaną przy użyciu kwasu azotawego i będącą ewentualnie pod postaciąsoli sodowej, otrzymaną na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej o stężeniu 5-15% m/v roztworem azotynu sodowego, w ilości 15-69 g azotynu na kg użytej heparyny, w obecności kwasu solnego przy pH 1-5, korzystnie 1,5-4, w ciągu 20-50 minut, a następnie na drodze redukcji tak otrzymanego produktu, korzystnie w środowisku zasadowym,

178 294 przy użyciu 5-20 g borowodorku sodowego na kg wyjściowej heparyny, przy czym nadmiar borowodorku sodowego rozkłada się kwasem solnym, a środowisko reakcyjne ewentualnie zobojętnia się, po czym strąca się etanolem, po którym ewentualnie przeprowadza się jedno lub kilka frakcjonowań alkoholowych, przy czym ta heparyna o niskim ciężarze cząsteczkowym ma większościową masę cząsteczkową 1700-3300, a 90% składników ma masę cząsteczkową 1000-8000, zawiera strukturę 2-O-sulfb-a-L-idopiranosuronową na końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-O-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolu na końcu ulegającym redukcji u większości jej składników, wykazuje stopień sulfatacji około 2,1, aktywność hamującą czynnik Xa 60-80 Ul/mg, aktywność hamującą czynnik Ila nie wyższą od 25 UI/mg i zawiera sumarycznie 50 ppb lub mniej związków nitrozowych, znamienny tym, że wodny roztwór tej heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, o stężeniu 5-15% m/v poddaje się naświetlaniu ultrafioletem o długości fali 180-350 nm, w temperaturze 5-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 3-8.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że naświetlanie ultrafioletem prowadzi się przy 254 nm, w temperaturze 15-35°C i przy pH 5-8.
19. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, o stężeniu 8-12% m/v, poddaje się naświetlaniu ultrafioletem w ciągu

9-15 minut przy użyciu lampy UV 16 W, przy czym ewentualnie roztwór ten poddaje się oczyszczeniu chromatograficznemu, i wyodrębnia się heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym, oczyszczoną) pozbawionącałkowicie związków nitrozowych przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem, przy czym ewentualnie przekształca się sól sodowąw inną sól farmaceutycznie dopuszczalną.
20. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że wodny roztwór heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym otrzymuje się na drodze działania na wodny roztwór heparyny naturalnej pod postacią soli sodowej kwasem solnym i azotynem zasadowym użytym w ilości

3,5-4% wagowych w stosunku do użytej heparyny, utrzymując pH kwaśne i kontrolując obecnośćjonów azotynowych do momentu ichniewykrywalności, a następnie, na drodze alkalizacji, po której następuje redukcja borowodorkiem sodowym, heparynę o niskim ciężarze cząsteczkowym wyodrębnia się w środowisku obojętnym przez wytrącenie etanolem, przy czym, po poddaniu naświetlaniu ultrafioletem przy 254 nm, przy pH około 7, tak otrzymany roztwór wprowadza się na szczyt kolumny anionowymiennej i po wypłukaniu kolumny wodą i przy pH około 7, wyodrębnia się produkt końcowy przez wytrącenie chlorkiem sodowym i etanolem.
21. Środek farmaceutyczny zawierający składnik aktywny i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako składnik aktywny w dawce jednostkowej zawiera 10-5000 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi zdepolimeryzowaną heparynę z azotynowej naturalnej heparyny pochodzącej z błony śluzowej jelita świni, płuca bydlęcego lub dowolną inną heparynę wyekstrahowaiąz tkanek lub narządów różnych zwierząt, o średniej masie cząsteczkowej mniejszej niż 8000, przy czym co najmniej 60% wszystkich jej składników ma średnią masę cząsteczkowąmniejsząniż 8000 i wykazującą aktywność hamującą czynnik Xa nie mniejszą niż 60 Ul/mg i stosunek aktywności hamującej czynnik Xa do aktywności hamującej czynnik Ila nie mniejszy niż 1,5, i sumarycznie zawierającą 500 ppb lub mniej związków nitrozowych, a jako substancje pomocnicze roztwór stężonego kwasu solnego lub roztwór farmaceutycznego wodorotlenku wapniowego qsp mający pH 5-7,5, jak również wodę do preparatów do wstrzykiwania qsp 0,2-1 ml.
22. Środek według zastrz. 21, znamienny tym, że jako składnik aktywny w dawce jednostkowej zawiera 10-5000 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi heparynę zdepolimeryzowanąpod koniec depolimeryzacji azotynowej i ma postać soli sodowej lub soli wapniowej.
23. Środek farmaceutyczny zawierający składnik aktywny i substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako składnik aktywny w dawce jednostkowej zawiera 10-5000 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym, która stanowi zdepolimeryzowanąheparynę z azotynowej naturalnej heparyny pochodzącej z błony śluzowej jelita świni zdepolimeryzowanąz użyciem kwasu azotawego, i ma ewentualnie postać soli sodowej, mającąwiększbściową masę cząsteczkową

178 294

1700-3300, przy czym 90% składników ma masę cząsteczkową 1000-8000, zawiera strukturę 2-O-sulfo-a-L-idopiranosmOnowąna końcu nie ulegającym redukcji i strukturę 6-0-sulfo-2,5-anhydro-D-mannitolu na końcu ulegającym redukcji u większości jej składników, wykazuje stopień sulfatacji około 2,1, aktywność hamującą czynnik Xa 60-80 UI/mg, aktywność hamującą czynnik IIa nie wyższąod 25 Ul/mg i sumarycznie zawiera 100 ppb lub mniej związków nitrozowych, a jako substancje pomocnicze roztwór stężonego kwasu solnego lub roztwór farmaceutycznego wodorotlenku wapniowego qsp mający pH 5-7,5, jak również wodę do preparatów do wstrzykiwania qsp 0,2-1 ml.
24. Środekwedkig zastre.23,zrtamienny tym, żejakżsldaonikaktywnyw dawc ejedno stkowej zawiera on 10-5000 mg heparyny o niskim ciężarze cząsteczkowym o postaci soli sodowej sumerycznie zawierającej 50 ppb lub mniej związków nitrozowych.