HU221595B - Tisztított heparinfrakciók, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények - Google Patents
Tisztított heparinfrakciók, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények Download PDFInfo
- Publication number
- HU221595B HU221595B HU9401446A HU9401446A HU221595B HU 221595 B HU221595 B HU 221595B HU 9401446 A HU9401446 A HU 9401446A HU 9401446 A HU9401446 A HU 9401446A HU 221595 B HU221595 B HU 221595B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- heparin
- molecular weight
- solution
- sodium
- product
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
A találmány legfeljebb 500 ppb nitrozovegyületet tartalmazó salétromosdepolimerizálással előállított heparinfrak- ciókra vonatkozik. Ezeketa termékeket úgy állítják elő, hogy a nitrittel depolimerizáltheparinokat ultraibolya sugarakkal besugározzák. A találmányvonatkozik az ilyen heparinfrakciókat tartalmazógyógyszerkészítményekre is. ŕ
Description
A találmány tárgya tisztított heparinfrakciók, pontosabban nitrozovegyület-mentes heparinfrakciók, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények.
Közelebbről találmányunk olyan heparinfrakciókra vonatkozik, amelyeket salétromos depolimerizációval állítunk elő, és amelyek gyakorlatilag egyáltalán nem tartalmaznak nitrozovegyületeket. Ismert, hogy heparinfrakciók állíthatók elő salétromos depolimerizációval, lásd például az EP-A-0014184. vagy az EP-A-0027089. számú európai szabadalmi bejelentést. Bizonyos heparinfrakciók, amelyeket salétromos depolimerizációval állítanak elő, gyógyszerhatóanyagok, amelyek a használatban „alacsony molekulasúlyú heparinok” vagy „kis molekulatömegű heparinok” néven szerepelnek. A „Heparines de faible masse moleculaire”, Pharmeuropa, 1991. október, 3, 3. szám, 161-165, valamint a Pharmacopée Européenne „Heparina massae molecularis minoris”, 1993. február (PA/PH/Exp.) 3 (92) 93 irodalmi helyeken részletes ismertetés található a gyógyszerként használatos kis molekulatömegű heparinokról, azok meghatározásáról, szulfatálási fokukról, amelyet szulfát/karboxil arányban fejeznek ki. Az így előállított kis molekulatömegű heparinok, amelyek gyógyszerhatóanyagként használhatók, az FR-A-2478646, az EP-A-0037319, EP-A-0076279, az EP-A-0181259 számú szabadalmi bejelentésekben vagy közzétett szabadalmi leírásokban szerepelnek. Ezek a heparinok a következő nemzetközi szabad neveken (DCI) ismertek: nadroparin-kalciumsó, dalteparin-nátriumsó, reviparin-nátriumsó. Ezek a termékek kereskedelmi forgalomban lévő vagy potenciális gyógyszer-specialitások hatóanyagai. így például a reviparin-nátriumsó a hatóanyaga a Németországban CLIVARINR néven forgalmazott gyógyszerkészítménynek. Egyéb salétromos depolimerizációval előállított kis molekulatömegű heparinok is benne vannak az orvosok rendelkezésére bocsátott különböző gyógyszerkészítményekben, így például Németországban a MONO-EMBOLEXR NM termékben, Ausztriában a SANDOPARINR és TROPARINR termékben, és Svájcban a SANDOPARINER termékben.
A salétromos depolimerizációs eljárás abból áll, hogy nem illékony nitrózus vegyületeket állítanak elő (ezeket a továbbiakban N-NO-vegyületeknek vagy egyszerűbben N-NO-nak nevezzük), oly módon, hogy a heparinban vagy frakcióiban vagy fragmenseiben jelen lévő nitrozálható vegyületekhez egy NO-csoportot adnak. Habár a heparinfrakciókban jelen lévő nitrozovegyületek mennyisége nagyon kicsi és ez nem káros a heparinfrakciók gyógyszerként történő felhasználása szempontjából, mivel nem illékony vegyületekről van szó, az ezen termékek ipari méretű gyártásakor nagy mennyiségű porokat kell mozgatni. A nitrozovegyületek teljes vagy gyakorlatilag teljes eltávolítása tehát hasznos lehet a gyógyszerhatóanyagként használt kis molekulatömegű heparinok jellemzőinek tökéletesítése érdekében. Az olyan kis molekulatömegű heparinok esetében, amelyeknél az átlagos molekulatömeg alacsony, például annál a terméknél, amelyet a későbbiekben CY 222-nek nevezünk (ennek átlagos molekulatömege 1700 Da és 3300 Da közötti), a nitrozovegyületek mennyisége nagyobb lehet, mint a magasabb molekulatömegű termékeké. Ez a tennék megfelel az FR-2478646. és EP-0037319. számú szabadalmi bejelentésben és közzétett szabadalmi leírásban az igénypontokban szereplő termékek definíciójának, és az említett szabadalmi bejelentésben vagy szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint állítható elő.
A fentiekben tárgyalt okok miatt kívánatos tehát salétromos depolimerizációval előállított és gyakorlatilag nitrozovegyület-mentes heparinfrakciók kifejlesztése.
Ismert egy ivóvízből való nitráteltávolítási eljárás a víz egyidejű sterilizálásával, oly módon, hogy 200 nmnél kisebb, előnyösen 185 nm-nél kisebb hullámhosszú ultraibolya sugarakkal végeznek besugárzást lúgos pHnál (lásd P. Princz és munkatársai, Water Supply, 1988, 6, 199-205). Ez a vízkezeléssel kapcsolatos dokumentum azonban nem tartalmaz semmilyen utalást arra, hogy az ultraibolya sugarakkal végzett besugárzás alkalmazható lenne biológiailag aktív anyagra anélkül, hogy annak biológiai és/vagy fizikokémiai tulajdonságaira káros hatást gyakorolna.
Felismertük, hogy ha egy salétromos depolimerizációval előállított heparinfrakciót ultraibolya sugárzásnak teszünk ki (ezt a továbbiakban UV-vel jelöljük), akkor gyakorlatilag teljesen eltávolithatók a jelen lévő nitrozovegyületek és olyan tisztított heparinfrakciót kapunk, amelynek összes nitrozovegyület-tartalma megegyezik^ sőt alacsonyabb, mint a természetes hepariné.
Azt tapasztaltuk továbbá, hogy szokásos körülmények között az UV-sugárzás nem módosítja a heparinfrakciók szerkezetét, azok teljesen megőrzik biológiai és fizikokémiai tulajdonságaikat.
Találmányunk tárgya tehát egyrészt salétromos depolimerizációval előállított heparinfrakciók, amelyek összes nitrozovegyület-tartalma <500 part per billión (ppb), előnyösen ál 50 ppb, még előnyösebben álOO ppb, különösen előnyösen 50 ppb. Az 50 ppb a jelenlegi ismereteink szerint a legkisebb kimutatható mennyiség. Ezek a frakciók előnyösen kis molekulatömegű heparinok.
Előnyösen találmányunk salétromos depolimerizációval előállított kis molekulatömegű tisztított heparinra vonatkozik. A találmányunk tárgya tehát egyrészt természetes eredetű, előnyösen sertésbél-, marhatüdőnyálkából származó vagy bármely más állati szövetből vagy szervből kivont heparin salétromos depolimerizálásával előállított depolimerizált heparin, amely a következő jellemzőkkel rendelkezik:
- átlagos molekulatömege <8000 Da,
- valamennyi összetevője legalább 60%-ának molekulatömege <8000Da,
- az Xa antifaktorhatás nem kisebb, mint 60 Ul/mg,
- az Xa antifaktorhatás/IIa antifaktor arány nem kisebb, mint 1,5,
- az összes nitrozovegyület-tartalom <500 ppb, előnyösen 150 ppb, még előnyösebben 100 ppb, különösen előnyösen 50 ppb, és az említett depolimerizált heparin gyógyászatilag alkalmazható só formájú, előnyösen nátrium- vagy kalciumsó.
HU 221 595 Bl
Az Xa antifaktorhatást és az Xa antifaktorhatás/IIa antifaktor arányt a kis molekulatömegű heparinok nemzetközi etalonjához képest határozzuk meg; referencia: OMS 1-85/600.
A fentiekben definiált átlagos molekulatömeget az 5 Európai Gyógyszerkönyv számára javasolt monográfia szerint határozzuk meg (lásd fentebb a referencia adatait).
Leírásunkban a „összes nitrozovegyülettől mentes” kifejezést az olyan salétromos depolimerizációval előállí- 10 tott kis molekulatömegű heparinok vagy heparinfrakciók jellemzésére használjuk, amelyek legfeljebb 500 ppb, előnyösen legfeljebb 150 ppb, még előnyösebben legfeljebb 100 ppb, különösen előnyösen legfeljebb 50 ppb összes nitrozovegyületet tartalmaznak. Az „összetevők” 15 kifejezésen azon molekulák összességét értjük, amelyekből a kis molekulatömegű heparin felépül.
A nitrovegyület-mentes kis molekulatömegű heparinok, amelyek találmányunk tárgyát képezik, legtöbb összetevőjük esetén 2-O-szulfo-a-L-idopiranozuron 20 szerkezetűek a nem redukáló végükön és 6-O-szulfo2,5-anhidro-D-mannit szerkezetűek a redukáló végükön. Szulfatációs fokuk lényegében nem tér el a természetes eredetű, nem frakcionált heparinétól. Ez a szulfatációs fok 2 és 2,5 közötti, előnyösen 2,0 és 2,3 kö- 25 zötti.
A találmány szerinti előnyös kis molekulatömegű heparinok esetén a molekulatömeg-eloszlás változó, az összetevőik 90%-ának a molekulatömege 2000 Da és 10 000 Da közötti, előnyösen 2000 Da és 9000 Da, 30 még előnyösebben 2000 Da és 8000 Da közötti. Egyébkőit ezen heparinok fő molekulatömege 3000 Da és 6000 Da, előnyösen 4000 Da és 5000 Da közötti.
Ugyancsak előnyös a találmány szerinti azon kis molekulatömegű heparin, amelynek fő molekulatö- 35 mege 1700 Da és 3300 Da közötti, és az összes összetevő 90%-ának a molekulatömege 1000 és 8000 Da közötti.
A „fő molekulatömeg” kifejezésen a heparin összetevői azon molekulatömegét értjük, amely megfelel a 40 kromatográfiás kizárással kapott kromatográfiás profil csúcsának UV-detektor alkalmazásával lambda=205 nm-nél.
A találmány szerint előnyös heparinfrakció a tisztított CY 222 nevű termék. Ez sertésbél-nyálkahártyából 45 származó természetes eredetű heparin salétromossavas depolimerizálásával előállított depolimerizált heparinnátriumsó, amelynek jellemzői:
- fő molekulatömege 1700 Da és 3300 Da közötti, oly módon, hogy összetevői 90%-ának molekula- 50 tömege 1000 és 8000 Da közötti,
- összetevői legnagyobb részénél a nem redukáló végénél 2-O-szulfo-a-L-idopiranozuron szerkezet, a redukáló végénél 6-O-szulfo-2,5-anhidroD-mannit szerkezet, 55
- 2,1 körüli szulfatációs fok,
- Xa antifaktor aktivitása 60-80 Ul/mg,
- Ha antifaktor aktivitása nem nagyobb, mint 25 Ul/mg, pontosabban 10-15 Ul/mg közötti,
- összes nitrozovegyület-tartalma 5100 ppb, 60 vagyis 1 χ 10~7 mg nitrozovegyület 1 mg termékben, előnyösen <50 ppb (5 χ 10~8 mg nitrozovegyület 1 mg termékben).
A találmány szerinti, nitrozovegyületet nem tartalmazó heparinfrakciók (kis molekulatömegű heparinok) előállítására szolgáló eljárások ugyancsak találmányunk körébe tartoznak.
Találmányunk tárgya tehát továbbá eljárás legfeljebb 500 ppb összes nitrozovegyületet tartalmazó heparinfrakciók előállítására, amelyet úgy végzünk, hogy egy salétromos depolimerizációval előállított heparinfrakció vizes oldatát ultraibolya-besugárzásnak vetjük alá.
Kiindulási vegyületként bármely salétromos depolimerizációval előállított heparinfrakciót használhatunk. Az ilyen kiindulási termék általában 1000 és 20 000 ppb közötti mennyiségben tartalmaz összes nitrozovegyületet.
A nitrozovegyületek mennyiségének meghatározását a B. Pignatelli és munkatársai, Analyst, 1989. szeptember, 114, 1103-1108. oldal, valamint az Analyst,
1987. július, 112,945-949. oldal irodalmi helyen ismertetett, a heparinra és frakcióira előnyösen a kis molekulatömegű heparinokra adaptált eljárással végezzük.
A találmány szerinti eljárást végezhetjük gyógyszerészeti minőségű kis molekulatömegű heparinon, amelyet vízben feloldunk, vagy az ipari gyártás során a salétromos depolímerizációs lépés után a gyógyszerészeti; minőségű tiszta termék izolálása előtt. Előnyösen, gyógyszerészeti minőségű kis molekulatömegű hepa* rint alkalmazunk.
A találmány szerinti eljáráshoz tehát alapanyagként; bármely salétromos depolimerizálással előállított kis molekulatömegű heparint használhatunk. Eljárásunk akkor a leghatásosabb, ha olyan depolimerizált heparinoldatot használunk, amely nem tartalmaz szuszpenzióban lévő mikrorészecskéket. Ilyen mikrorészecskék jelen lehetnek például, ha a depolimerizált heparin rosszul oldódik, vagy különböző szennyezések vannak jelen, vagy a depolimerizáció vagy a tisztítás során felhasznált reagensek is visszamaradhatnak. A különböző depolimerizált heparinoldatokat tehát előnyösen először leszűijük.
A találmány szerinti eljárás rendkívül hatékony és rugalmas, mivel egyszeri, gyors és biztonságos módon teszi lehetővé a nitrozovegyületek eltávolítását. Ezenkívül a találmány szerinti eljárás a heparinfrakció szerkezetében semmilyen módosítást nem vált ki, a heparinfrakció biológiai tulajdonságai és fizikokémiai jellemzői szigorúan azonosak maradnak.
A találmány szerinti eljárást elvégezhetjük úgy, hogy a tisztítandó salétromos depolimerizációval előállított heparinfrakció, előnyösen kis molekulatömegű heparin, 5-15%-os (m/V) vizes oldatát UV-besugárzásnak vetjük alá 180-350 nm, előnyösen 254 nm hullámhossznál, 5-50 °C közötti, előnyösen 15-35 °C közötti hőmérsékleten, még előnyösebben szobahőmér- g sékleten.
Az oldat pH-ja enyhén savas vagy enyhén lúgos, ál- r tálában 3 és 8 közötti, előnyösen 5 és 8 közötti.
HU 221 595 BI
A besugárzás időtartama az alkalmazott besugárzó rendszertől, a sugárzás teljesítményétől és a heparinfrakcióban lévő eltávolítandó nitrozovegyületek mennyiségétől függ. Ez az időtartam általában 2-30 perc, bár 9-15 perc alatt a tisztítás általában lényegében teljes. 5
UV-sugárzó rendszerként használhatunk statikus rendszert vagy dinamikus rendszert is, amelyben a heparinfrakció-oldat az UV-sugárforrás körül cirkulál. Előnyben részesítjük a dinamikus rendszereket. Ez utóbbi esetben az UV-sugárforrás csatlakozhat egy hengeres cső- 10 hoz („zárt” típusú készülék) vagy egy csatornához („nyitott” típusú készülék). „Zárt” típusú készülékként használhatunk egy UV JR1-50 (KATADYN) típusú sterilizátort vagy bármely ekvivalens készüléket.
Az 1. ábrán metszetben ábrázolunk egy „zárt” tipu- 15 sú készüléket. A készülék egy 1 UV-lámpából áll, amely körül egy 2 kvarchüvely helyezkedik el. A kis molekulatömegű heparint tartalmazó oldat a kvarchüvellyel védett UV-lámpa körül cirkulál. Ez a 3 cirkuláló folyadékhüvely. Az oldat egy 4 bejáraton lép be, 20 amely az UV-lámpa egyik szélénél található, és az 5 kijáraton lép ki, amely az UV-lámpa másik széle vonalában helyezkedik el.
Amikor dinamikus rendszert használunk, a heparinfrakció-oldat áramlási sebességét, amellyel az UV-su- 25 gárforrás közül cirkulál, megfelelő módon kell beállítani ahhoz, hogy a nitrozovegyületek eltávolításához szükséges besugárzási időt kapjuk. Az ezt befolyásoló paraméterek a cirkuláló folyadékáram átmérője, az UV-sugárforrás mérete és/vagy teljesítménye, a hepa- 30 rinffakciót tartalmazó vizes oldat koncentrációja, és az ebben a frakcióban lévő eltávolítandó nitrozovegyületek mennyisége.
A heparinffakciót vagy előnyösen a teljes nitrozovegyületektől mentes alacsony molekulatömegű hepa- 35 rint, amelyet így előállítunk, ismert módszerekkel nyerhetjük ki.
Amikor kiindulási vegyületként már gyógyszerészeti minőségű kis molekulatömegű heparint használunk, akkor elegendő, ha a tennéket vízben feloldjuk, az ol- 40 dat pH-ját 3 és 8 közé, előnyösen 5 és 8 közé állítjuk be, és ezt az oldatot a találmány szerinti eljárással kezeljük.
Kiindulási anyagként használhatunk nem ffakcionált, természetes eredetű heparint is, előnyösen só fór- 45 mában, például heparin-nátriumsó formájában. Előnyös a sertésbél nyálkájából származó termék. Ebben az esetben a találmányunk szerinti eljárás egy lépést jelent a nitrozovegyület-mentes tisztított végtermék előállításában a salétromos depolimerizáció után. A hepa- 50 rinból kiinduló teljes eljárás találmányunk egy további tárgyát képezi.
Találmányunk tárgya tehát eljárás kis molekulatömegű heparin salétromos depolimerizálásával történő előállítására, amely heparin összes nitrozovegyület-tar- 55 talma <500 ppb, előnyösen <150 ppb, különösen előnyösen <100 ppb, még előnyösebben <50 ppb. Az eljárást úgy végezzük, hogy
a) egy nem frakcionált heparin-nátriumsó vizes
5-15%-os (m/V) oldatát alkálifém-nitrit-oldattal, 60 előnyösen nátrium-nitrit-oldattal reagáltatjuk 1 kg heparinhoz 15-69 g nitritet véve, sósav jelenlétében 1-5, előnyösen 1,5 és 4 közötti pH-nál 20-50 percig, majd a kapott tennéket előnyösen lúgos közegben 1 kg kiindulási heparinra számítva 5-20 g nátrium-bór-hidriddel redukáljuk, a nátrium-bór-hidrid-felesleget sósavval elbontjuk, adott esetben a reakcióelegyet semlegesítjük, majd etanollal kicsapatjuk, majd adott esetben a kapott kis molekulatömegű heparint egy vagy több alkoholos frakcionálásnak vetjük alá, majd
b) az így kapott oldatot ultraibolya sugárzásnak vetjük alá, adott esetben kromatográfiás eljárással tisztítjuk a kapott terméket, majd a depolimerizált tisztított és nitrozovegyület-mentes heparinrnátriumsót nátrium-kloriddal és etanollal kicsapatva izoláljuk, és kívánt esetben a nátriumsót más, gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.
Előnyös a kalciumsó.
A találmány szerinti eljárást előnyösen tisztított CY
222 nevű termék előállítására alkalmazzuk. Ez a termék sertésbél-nyálkahártyából származó természetes eredetű heparin salétromossavas depolimerizálásával előállított depolimerizált heparin-nátriumsó, amelynek jellemzői: »
- fő molekulatömege 1700 Da és 3300 Da közötti;
oly módon, hogy összetevői 90%-ának molekula- j tömege 1000 és 8000 Da közötti,
- összetevői legnagyobb részénél a nem redukálód végénél 2-O-szulfo-a-L-idopiranozuron szerkezet, a redukáló végénél 6-O-szulfo-2,5-anhidroD-mannit szerkezet, j
- 2,1 körüli szulfatációs fok, {,
- Xa antifaktor aktivitása 60-80 Ul/mg, |
-Ha antifaktor aktivitása nem nagyobb, mint |
Ul/mg, pontosabban 10-15 Ul/mg közötti, f
- összes nitrozovegyület-tartalma <100 ppb. r
A nitrozovegyület-tartalom előnyösen <50 ppb. Ezt az eljárást úgy végezzük, hogy
a) egy nem frakcionált, természetes eredetű heparinnátriumsó vizes oldatát sósavval és a felhasznált heparin tömegére vonatkoztatva 3,5-4 tömeg% alkálifém-nitrittel reagáltatjuk, miközben az elegy pH-ját savasan tartjuk és követjük a nitritionok jelenlétét negatív reakcióig, majd az elegyet lúgosítjuk, nátrium-bór-hidriddel redukáljuk és a depolimerizált terméket semleges közegben etanolos kicsapatással izoláljuk, majd
b) a kapott termék vizes oldatát 7 körüli pH-értéknél .
ultraibolya-sugárzó rendszerbe helyezzük 254 nmen, majd az így kapott oldatot ioncserélő oszlopra visszük és az oszlop vizes és 7 körüli pH-nál végzett öblítése után a végterméket nátrium-kloridot és etanolos kicsapatással nyeljük ki.
Az a) lépésben alkálifém-nitritként a megadott mennyiségben nátrium-nitritet használunk.
A b) lépésben az ultraibolya-sugárzó rendszer elő- j nyösen 16 wattos lámpával van ellátva és a 254 nm-es UV-besugárzás időtartama mintegy 9-15 perc. Előnyös a dinamikus UV-besugárzó rendszer, különösen
HU 221 595 Bl előnyös az úgynevezett „zárt” típusú készülék. Az UVsugárzásnak kitett oldatok koncentrációja előnyösen 8-12% (m/V).
Találmányunk vonatkozik az olyan gyógyszerkészítményekre is, amelyek hatóanyagként egy tisztított, nitrozovegyület-mentes heparinfrakciót, előnyösen tisztított nitrozovegyület-mentes, a fentiekben ismertetett kis molekulatömegű heparint tartalmaznak.
A találmány szerinti készítményekben a heparinfrakció lehet liofilizátum formájú vagy szubkután injekcióra alkalmas oldat formájú, ilyenkor oldószerként steril, biológiailag alkalmas oldószert, például vizet vagy fiziológiás oldatot használunk. A termék lehet ampullákban, flakonokban, előre megtöltött injekcióstűkben vagy „toll” típusú öninjekcióra alkalmas készülékekben kiszerelve. Az egyes egységnyi adagot tartalmazó gyógyszerkészítmény-forma 50-50 000 U1 Xa antifaktort tartalmazhat.
A találmány szerinti heparinfrakciók adagolhatok intravénás injekció útján is, önmagukban vagy egyéb hatóanyagokkal keverve. A frakciók adagolhatók továbbá ónba vagy tüdőbe történő ködpermetezéssel is.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények közül előnyös az, amely hatóanyagként a CY 222 nitrozovegyület-mentes terméket tartalmazza, amelyet a fentiekben definiáltunk, 10 mg-tól 5000 mg-ot tartalmazó adagolási egységekben CY 222 nátriumsó formában.
Amint már fentebb említettük, a teljes nitrozovegyületek mennyiségének meghatározását az B. Pignatelli és munkatársai, Analyst, 1989. szeptember, 114, 1103-1108. oldal, valamint az Analyst, 1987. július, 112, 945-949. oldal irodalmi helyen ismertetett, a heparinra és a kis molekulatömegű heparinokra adaptált eljárással végeztük.
Az analitikai eljárást a következőképpen végezzük: Az elemezendő termékek előnyösen por alakúak, következésképpen az oldatban jelen lévő teljes nitrozovegyületek meghatározása esetén először áz oldatot liofilizáljuk, majd a liofilizált mintát elemezzük.
- Az eljáráshoz a következő reagensekre van szükség:
100 mg heparinfrakcióhoz a következő reagenseket használjuk:
- etil-acetát, amelyet 20%-os (tömeg/térfogat) szulfaminsavval kezelünk (200 g szulfaminsav 1000 ml etil-acetáttal készített oldatát 3 napig keveijük, majd szűrőpapíron leszűijük felhasználás előtt);
- 15%-os ecetsavval készített hidrogén-bromid-oldat (kis aranysárga flakonok polietiléndugóval, amelyek 5 ml 30%-os hidrogén-bromidot tartalmaznak, amelyeket argongáz-atmoszférában zárunk le és sötétben tartunk. A felhasználás pillanatában hozzáadunk 5 ml tiszta ecetsavat, megkeveijük és kis edényben tartjuk sötétben. Egy sorozatméréshez egy flakont használunk fel);
- 95%-os formamid, amelyet 5%-os (m/V) szulfaminsawal kezelünk (1 g szulfaminsavat 20 ml formamidban 5% tisztított víz jelenlétében feloldunk).
- Az etanololdatokat és a vizsgálandó mintákat a következőképpen készítjük el:
- N-nitrozo-di-n-propil-amin (NDPA) etanololdat 78,62 g tiszta etanolt válaszfalon keresztül 1 g N-nitrozo-di-n-propil-amint tartalmazó ISOPAC szigma lombikba injektálunk. A koncentráció 10 000 ppm NDPA (3379 ppm N-NO). Ezután az oldatot 1/100-ra hígítjuk tiszta etanollal és 0,5 ml-es aliquot mennyiségeket kis lezárt flakonokba helyezünk. A koncentráció 100 ppm NDPA. A mintákat sötétben 4 °C-on tároljuk.
Alsó etalonoldat: Az alkalmazás pillanatában 1/100os etanolos, majd 1/17-es kezelt formamidos hígítást készítünk. A koncentráció így 0,0588 ppm NDPA vagy 19,9 ppb N-NO.
Közepes etalonoldat: Ezt úgy készítjük, hogy a felhasználás pillanatában 1/61-edes etanolos, majd 1/11edes kezelt formamidos hígítást készítünk. A koncentráció 0,149 ppm NDPA vagy 50,4 ppb N-NO lesz •gyFelső etalonoldat: A felhasználás pillanatában 1/10-es etanolos, majd 1/10-es kezelt formamidos hígítást készítünk. A koncentráció 1 ppm NDPA vagy 338 ppb N-NO lesz.
- A vizsgálandó mintákat úgy készítjük el, hogy heparinfrakció-mintákat 12 órán keresztül 60 °C-on foszfor-pentoxid felett megszárítunk. 100 mg heparinfrakciót 1 ml kezelt formamiddal feloldunk és az elegyet 30 percig keverő-rázó készülékben keverjük.
- Az alkalmazott készüléket a 2. ábrán mutatjuk ' be. A készülék egy 1 500 ml-es pirex lombikból áll, amelyet 2-15 °C-ra lehűtött kettős hűtővel látunk el. A hűtőt három darab 3 jelű sorba kötött buborékoltatóhoz kapcsoljuk, a buborékoltatok egyenként 30 ml 30%-os nátrium-hidroxidot tartalmaznak. A buborékoltatok két sorba kötött hideg csapdához kapcsolódnak, a 4 olvadt etanolos -20 °C-os, a másik az 5 olvadt izopentánt tartalmaz -160 °C-on. Ezek végül a 6 TEA kemény lumineszcenciás detektorhoz kapcsolódnak (Thermedics Detection INC., 610-es típus), ekvivalens berendezés is használható. A detektor a 7 integrátor/regisztráló készülékhez kapcsolódik.
A lombikot egyrészt egy 8 átfúrt dugóval látjuk el, ez lehetővé teszi az argongáz bevezetésére szolgáló cső elhelyezését. A lombikon a másik oldalon csiszolatos dugó van, amely lehetővé teszi a 9 CPG típusú válaszfal rögzítését, ezen keresztül injektáljuk a mintát. Az argonáram és a TEA vákuumszivattyú által létrehozott vákuum viszi a gázt a TEA felé.
- A mérést a következőképpen végezzük:
4.1. A detektor beszabályozását a következőképpen végezzük:
A TEA-t a gyártó cég instrukciói alapján szabályozzuk be, oly módon, hogy maximális érzékenységet és reprodukálhatóságot érjünk el.
Egy órával a mérés előtt kinyitjuk az oxigént 2 bar nyomáson, az áramlási sebességet a TEA 610 (Thermedics Detection Inc.) áramlásisebesség-mérőn 0,02-re állítjuk be.
HU 221 595 Bl
4.2. A nátrium-hidroxidos tartályok elkészítése úgy történik, hogy az egyes tartályokba 30 ml 30%-os nátrium-hidroxidot helyezünk.
4.3. A hideg csapdákat a következőképpen készítjük el:
A -120 °C-os csapdát: 250 ml etanolt tartalmazó Dewar-készülékbe lassan faspatulával való keverés közben massza eléréséig cseppfolyós nitrogént öntünk.
A -160 °C-os csapdát úgy készítjük el, hogy egy 250 ml izopentánt tartalmazó Dewar-készülékben lassan faspatulával végzett keverés közben massza eléréséig cseppfolyós nitrogént töltünk.
A két űvegcsapdát a megfelelő Dewar-edényekbe helyezzük és sorba kötjük.
4.4. A lombik-hűtő együttes dehidratálása úgy történik, hogy 50 ml etil-acetátot egy órán keresztül argonatmoszférában visszafolyató hűtő alatt forralunk anélkül, hogy a TEA-ra kötnénk.
4.5. A reakciót és a mérést a következőképpen végezzük: tiszta száraz, válaszfallal ellátott új lombikba 30 ml kezelt etil-acetátot helyezünk, ezt felszereljük a hűtő alá (a kriosztátot 2 órával előbb -15 °C-ra bekapcsoljuk), felhelyezzük a lombikfűtőt és 4-es helyzetben fűteni kezdjük. Bekötjük az argonbevezető csövet, az áramlási sebességet 0,11/percre állítjuk be és ellenőrizzük az áramkör tömítettségét. Csak a TEA-ra való kötést hagyjuk nyitva a túlnyomás elkerülése érdekében. Amikor az etil-acetát már forr, a rendszert finoman vákuum alá helyezzük és egyidejűleg a TEA-ra való csatlakozást lezáijuk. Kialakul az áramkörben a vákuum, amikor a rendszer egyensúlyban van, a vákuum mintegy 2-4 Hgmm-es. A TEA készülék 0 pontját az integrátor regisztrálókészülék teljes skálájának 10%-ára állítjuk be.
A válaszfalon (septum) keresztül először 0,5 ml tisztított vizet, majd 2 ml hígított hidrogén-bromidot, majd ismét 2 ml hígított hidrogén-bromidot injektálunk. Az egyes adagolások között ellenőrizzük, hogy az integrátor regisztrálókészülék visszatér-e az alapvonalra. Miután a reagenseket a lombikba injektáljuk, megváijuk az alapvonalra való visszatérést és 50 μΐ etalont vagy mintát injektálunk. Minden adagolás között megváijuk az alapvonalra történő visszatérést. Az adagolás során mindig öt mintát adagolunk két etalon között és ügyelünk arra, hogy a teljes művelet ne tartson tovább 60 percnél.
4.6. Meghatározzuk az összes nitrozovegyület mennyiségét.
Az N-NO mennyiségét ppb-ben kifejezve a következő képlettel számítjuk ki:
minta felülete χ Cs χ 0,05 χ 44 χ 1000 N-NO ppb-ben=etalon felülete χ 0,05 χ 0,1 χ 130,2
A képletben
- Cs: az etalon koncentrációja NDPA ppm-ben (0,0588 vagy 0,149 vagy 1 ppm),
- 0,05: (a számlálóban) bevitt etalon (ml-ben),
- 44: az N-NO molekulatömege,
- 1000: a ppm ppb-vé alakítása,
- 0,05 (a nevezőben): a bevitt minta (ml-ben),
- 0,1: a bevitt minta grammokban,
- 130,2: az NDPA molekulatömege.
Találmányunkat a következőkben példákkal illusztráljuk.
1. példa
100 ppb-nél kisebb összes nitrozoszármazékot tartalmazó tisztított nadroparin-kalciumsó előállítása
A) lépés: Depolimerizáció és etanolos frakcionálás kg sertésbél nyálkájából származó heparin-nátriumsót tisztított vízben reaktorban feloldunk úgy, hogy a végső koncentráció mintegy 10,3% (m/V) legyen. Az oldat pH-ját koncentrált sósavval 2,5-re állítjuk be.
A reaktorba 572 g nátrium-nitritet adagolunk, közben a pH-t koncentrált sósav segítségével 2,5 értéken tartjuk.
A depolimerizációs reakciót keményítős kálium-jodidos indikátor papír segítségével követjük. A reakciót akkor tekintjük befejezettnek, amikor a teszt negatív. A reakcióelegy pH-ját koncentrált nátrium-hidroxiddal 10-re állítjuk be, majd 200 g nátrium-bór-hidridet adunk hozzá. Az elegyet 15 órán keresztül keverjük, majd pH-ját koncentrált sósavval 4 és 3,5 közé állítjuk be a bór-hidrid- felesleg lebontása érdekében. Ezután az elegy pH-ját koncentrált nátrium-hidroxiddal 7-re állítjuk be. Egy térfogat vizes oldatra számítva 2 térfogat etanol hozzáadásával csapadékot képzünk. Ezt. hagyjuk dekantálni, majd a vizes alkoholos felülúszót« eltávolítjuk. A csapadékot 4001 tisztított vízben felold-s juk, az oldathoz nátrium-kloridot adunk mintegy ' 20 000 pS/cm fajlagos vezetőképesség eléréséig. A pH-t ezután koncentrált sósavval 4 körüli értékre állítjuk be és az oldathoz keverés közben 1 térfogatrész abszolút etanolt adunk. Az elegyet 60 órán keresztül hagyjuk ülepedni, majd a felülúszó vizes alkoholos fázist eltávolítjuk. A nadroparint nátriumsó formájában kapjuk meg.
A csapadékot tisztított vízben feloldjuk, körülbelül 18%-os (tömeg/térfogat) oldatot kapunk a kiindulási heparin-nátriumsó mennyiségére vonatkoztatva, majd a pH-t koncentrált nátrium-hidroxiddal 7-re állítjuk be. Az oldatot 0,2 pm porozitású szűrőbetétekkel ellátott rendszeren leszűrjük. A szűrt nadroparin-nátriumsót tartalmazó oldatból mintát veszünk, amelyet nem reagáltatunk tovább a b) lépésben leírt módon (UVsugárzás). Ezt a mintát „összehasonlító mintának” nevezzük.
B) lépés: UV-besugárzás
Az UV-besugárzáshoz JR1-50 típusú Katadyncsövet használunk. Az alkalmazott hullámhossz 254 nm. Az átáramlási sebességet előzetesen perisztaltikus szivattyúval tisztított víz felhasználásával állítjuk be a megfelelő értékre (4800 ml/óra) oly módon, hogy újracirkuláltatás nélkül egy áthaladás alatt az összes UV-besugárzási idő mintegy 9 perc legyen. Ezután adagoljuk a kezelendő nadroparin-nátriumsó-oldatot és az áramkört tisztított vízzel mossuk a kezelt tennék teljes kinyeréséig. A terméket a Katadyn JR1-50 cső kimenetéhez tett kádban gyűjtjük össze.
HU 221 595 Bl
C) és D) lépés: Kromatográfiás tisztítás és kalciumsóvá alakítás
Az előző lépésben előállított nadroparinoldatot anionos kolonnán tisztítjuk (0,51/kg heparin-nátriumsó figyelembevételével). Az összegyűjtött felfogott folyadék fajlagos vezetőképességét nátrium-kloriddal 10 000-20 000 pS/cm-re állítjuk be és 1,5 térfogatrész etanolt adunk hozzá. Az elegyet mintegy 41 órán keresztül hagyjuk ülepedni és a felülúszót eltávolítjuk.
A csapadékot tisztított vízben feloldjuk (C=18% (tömeg/térfogat) a felhasznált heparin-nátriumsó mennyiségében számolva), majd kalcium-kloridhexahidrátot adagolunk (9,63 grammot 1 g felhasznált heparin-nátriumsóhoz). 1,5 térfogatrész etanol hozzáadásával etanolos kicsapatást végzünk. Ezután megismételjük a kalcium-klorid-hexahidráttal végzett sóképzési lépést és az etanolos kicsapatási tisztítási lépést. A kapott csapadékot 60 °C alatti hőmérsékleten megszárítjuk.
A kapott terméket 1. számú adagnak nevezzük.
Az A) lépésben előállított „összehasonlító mintát” ugyancsak a C)-D) lépésben leírt eljárással kezeljük, és igy a nadroparin-kalciumsóból nyerünk „összehasonlító mintát”.
A nadroparin-kalciumsó 1. számú adagjából, valamint az összehasonlító mintából vett mintán különböző fizikokémiai vizsgálatokat végzünk és meghatározzuk biológiai aktivitásukat. Az eredményeket az I. és II. táblázatban tüntetjük fel.
1. táblázat
Fizikokémiai vizsgálatok
| A vizsgálat | 1. számú adag (UV-besu- gárzással) | Összehasonlító minta (UV-besu- gárzás nélkül) |
| Teljes nitrozovegyület | 53 ppb | 3150 ppb |
| Szabad szulfát | 0,05% | 0,06% |
| 5%-os oldat pH-ja | 6,0 | 6,0 |
| Szabad NH2 | <30 ppm | <30 ppm |
| HPLC-GPC (UV 205 nm) Átlagos tömeg szerinti molekulatömeg (Mw) | 5017 Da | 4933 Da |
| Átlagos szám szerinti molekulatömeg (Mn) | 4043 Da | 4052 Da |
| Molekulatömeg a csúcson | 4181 Da | 4192 Da |
| Diszperzió | 1,24 | 1,21 |
| %PM>10000Da | 2,4 | 2,1 |
| %PM>8000Da | 7,2 | 6,9 |
| %PM<2000Da | 3,0 | 2,9 |
| %PM<1800Da | 2,4 | 2,3 |
PM=molekulatömeg
II. táblázat Biológiai vizsgálatok
| A vizsgálat | 1. számú adag (UV-besugárzással) | Összehasonlító minta (UV-besu- gárzás nélkül) |
| Xa antifaktor-aktivitás | 124 Ul/mg | 124 Ul/mg |
| Ila antifaktor-aktivitás | 29,3 Ul/mg | 30,4 Ul/mg |
Az I. és II. táblázatban feltüntetett eredményekből látható, hogy az UV-besugárzás egyáltalán nem változtatja meg a nadroparin tulajdonságait. Az 1. számú adag különböző fizikokémiai és biológiai tulajdonságai, valamint a terméke kromatográfiás profilja, a különböző szennyezések aránya, az Xa és a Da antifaktoraktivitás azonos az UV-sugárral nem kezelt összehasonlító minta ilyen tulajdonságaival, egyetlen kivételt látunk, az összes nitrozovegyületek mennyisége a kezeletlen összehasonlító mintában mintegy hatvanszorosa az UV-besugárzással kezelt 1. számú adagban talált összes nitrozovegyületek mennyiségének.
Megjegyezzük még, hogy az elektronikus paramágneses rezonanciával végzett vizsgálatok eredményei igazolták, hogy az UV-besugárzás nem váltja ki szabad gyökök felszabadulását.
2. példa ppb-nél kevesebb teljes nitrozovegyületet tártál? mazó CY 222 nátriumsó előállítása
A) lépés: Depolimerizálás
250 g sertésbélnyálkából származó heparin-nátriumsót tisztított vízben feloldunk egy reaktorban, oly. módon, hogy mintegy 10,3% (tömeg/térfogat) végső koncentrációt kapjunk. Az oldat pH-ját koncentrált sósavval 2,5-re állítjuk be, majd a reaktorba 9,49 g nátrium-nitritet adagolunk és a pH-t 2,5 értéken tartjuk. Az depolimerizációs reakciót keményítős kálium-jodidos indikátorpapír segítségével követjük. A reakciónak akkor van vége, amikor a teszt negatívvá válik. A reakcióelegy pH-ját koncentrált nátrium-hidroxiddal 10 és 10,5 közé állítjuk be, majd 2,5 g nátrium-bór-hidridet adagolunk. Az elegyet 15 órán keresztül keverjük, majd pH-ját koncentrált sósavval 3,5 és 4 közé állítjuk be a bór-hidrid-felesleg lebontása érdekében. Ezután a pH-t koncentrált nátrium-hidroxiddal 7-re állítjuk be és 1 térfogatrész oldatra számított 2 térfogatrész etanol hozzáadásával a terméket kicsapatjuk. A csapadékot hagyjuk leülepedni és a felülúszót eltávolítjuk. így a CY 222-t nátriumsó formájában kapjuk meg. A kapott tennék 3000 és 10 000 ppb közötti mennyiségben tartalmaz nitrozovegyületeket (három készítményből nyert eredmények).
B) lépés: UV-besugárzás
Az előző lépésben előállított csapadékot tisztított vízben feloldjuk úgy, hogy a felhasznált heparin-nátriumsóra számítva mintegy 10%-os (tömeg/térfogat) oldatot kapjunk. Az oldat pH-ját sósavval vagy nátriumhidroxiddal 7-re állítjuk be. A szivattyú áramlási sebességét beállítjuk, majd a kapott oldatot 254 nm-es
HU 221 595 Bl ultraibolya-sugárzó berendezésen átvezetjük (16 wattos lámpával ellátott Katadyn JR1-50 típusú készülék). Az UV-besugárzás időtartama 9-15 perc.
C) lépés: Kromatográfiás tisztítás és végső csapadékképzés
Az UV-besugárzás után kapott oldatot kromatográfiás oszlopon tisztítjuk, amely 1 kg felhasznált heparinnátriumsóra számítva legalább 2 1 anionos gyantát tartalmaz. Az egyesített átfolyt oldat fajlagos vezetőképességét nátrium-kloriddal 30-35 mS/cm-re állítjuk be, majd az oldat pH-ját is beállítjuk sósavoldat segítségével. Ezután 1 térfogatrész vizes oldatra számítva 2 térfogatrész etanolt adagolunk. A képződő csapadékot hagyjuk leülepedni és a felülúszót eltávolítjuk. A csapadékot tisztított vízben oldjuk úgy, hogy 20%-os (m/v) végső koncentrációjú oldatot kapjunk a kiindulási heparinnátriumsó mennyiségére vonatkoztatva. Az oldat fajlagos vezetőképességét ezután nátrium-kloriddal 30-35 mS/cm-re és az oldat pH-ját koncentrált sósavval vagy koncentrált nátrium-hidroxiddal 7-7,5 közé állítjuk be. Az oldatot ezután 2 térfogatrész abszolút etanol hozzáadásával kicsapatjuk és a csapadékot hagyjuk leülepedni. A csapadékot kinyerjük, etanollal mossuk és 60 °C alatti hőmérsékleten megszárítjuk. így a tiszta CY 222-t kapjuk, amelyet a következőképpen definiálunk: sertésbél-nyálkahártyából származó természetes eredetű heparin salétromsavas depolimerizálásával előállított depolimerizált heparin-nátriumsó, amelynek jellemzői:
- fő molekulatömege 1700 Da és 3300 Da közötti, oly módon, hogy összetevői 90%-ának molekulatömege 1000 és 8000 Da közötti,
- összetevői legnagyobb részénél a nem redukáló 2-O-szulfo-a-L-idopiranozuron szerkezet, a redukáló végénél 6-O-szulfo-2,5-anhidro-D-mannít szerkezet,
- 2,1 körüli szulfatációs fok,
- Xa antifaktor aktivitása 60-80 Ul/mg,
- Ha antifaktor aktivitása nem nagyobb, mint 25 Ul/mg, pontosabban 10-15 Ul/mg közötti,
- összes nitrozovegyület-tartalma <50 ppb.
Claims (15)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Salétromos depolimerizációval előállított heparinfrakció, amelynek összes nitrozovegyület-tartalma <500 ppb.
- 2. Az 1. igénypont szerinti heparinfrakció, azzal jellemezve, hogy kis molekulatömegű heparin.
- 3. A 2. igénypont szerinti kis molekulatömegű heparin, azzal jellemezve, hogy természetes eredetű, előnyösen sertésbél-, marhatúdőnyálkából származó vagy bármely más állati szövetből vagy szervből kivont heparin salétromos depolimerizálásával előállított depolimerizált heparin, amely a következő jellemzőkkel rendelkezik:- átlagos molekulatömege <8000 Da,- valamennyi összetevője legalább 60%-ának molekulatömege <8000 Da,- az Xa antifaktorhatás nem kisebb, mint 60 Ul/mg,- az Xa antifaktorhatás/IIa antifaktor arány nem kisebb, mint 1,5, gyógyászatilag alkalmazható só formájában.
- 4. A 3. igénypont szerinti kis molekulatömegű heparin nátriumsó vagy kalciumsó formájában.
- 5. Az 1. igénypont szerinti heparinfrakciók közül a sertésbél-nyálkahártyából származó természetes eredetű heparin salétrom depolimerizálással előállított depolimerizált heparin-nátriumsó, amelynek jellemzői:- fő molekulatömege 1700 Da és 3300 Da közötti, oly módon, hogy összetevői 90%-ának molekulatömege 1000 és 8000 Da közötti,- összetevői legnagyobb részénél a nem redukáló végénél 2-O-szulfo-alfa-L-idopiranozuron szerkezet, a redukáló végénél 6-O-szulfo-2,5-anhidro-D-mannit szerkezet,- 2,1 körüli szulfatációs fok,- Xa antifaktor aktivitása 60-80 Ul/mg,- Ua antifaktor aktivitása nem nagyobb, mint 25 Ul/mg,- összes nitrozovegyület-tartalma <100 ppb.
- 6. Az 5. igénypont szerinti depolimerizált heparin nátriumsója, azzal jellemezve, hogy összes nitrozovegyület-tartalma S50 ppb.
- 7. Eljárás az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti · heparinfrakció előállítására, azzal jellemezve, hogy egy salétromos depolimerizációval előállított heparinfrakció vizes oldatát ultraibolya-besugárzásnak vetjük alá.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy salétromos depolimerizálással előállított heparinfrakció 5-15%-os (m/V) vizes oldatát 180-350 nm közötti hullámhossznál 5-50 °C közötti hőmérsékleten ultraibolya-sugárzásnak vetünk alá, oly módon, hogy az oldat pH-ja 3 és 8 közötti.
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 254 nm hullámhosszon, 15-35 °C közötti hőmérsékleten és 5-8 közötti pH-értéknél végezzük.
- 10. A 7. igénypont szerinti eljárás az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti kis molekulatömegű heparin előállítására, azzal jellemezve, hogya) olyan vizes oldatból indulunk ki, amelyet úgy állítunk elő, hogy egy nem frakcionált heparin-nátriumsó vizes 5-15%-os (m/V) oldatát alkálifém-nitrit-oldattal, előnyösen nátrium-nitrit-oldattal reagáltatjuk 1 kg heparinhoz 15-69 g nitritet véve, sósav jelenlétében 1-5, előnyösen 1,5 és 4 közötti pH-nál 20-50 percig, majd a kapott terméket előnyösen lúgos közegben 1 kg kiindulási heparinra számítva 5-20 g nátrium-bór-hidriddel redukáljuk, a nátrium-bór-hidrid-felesleget sósavval elbontjuk, adott esetben a reakcióelegyet semlegesítjük, majd etanollal kicsapatjuk, majd adott esetben a kapott kis molekulatömegű heparint egy vagy több alkoholos frakcionálásnak vetjük alá, majdb) az így kapott oldatot ultraibolya sugárzásnak vetjük alá, majd adott esetben kromatográfiás eljárással tisztítjuk a kapott terméket, majd a depolimerizált tisztított és nitrozovegyület-mentes heparin-nátrium8HU 221 595 Bl sót nátrium-kloriddal és etanollal kicsapatva izoláljuk, és kívánt esetben a nátriumsót más, gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás a 6. igénypont szerinti termék előállítására, azzal jellemezve, hogya) egy nem frakcionált, természetes eredetű heparinnátriumsó vizes oldatát sósavval és a felhasznált heparin tömegére vonatkoztatva 3,5-4 tömeg% alkálifém-nitrittel reagáltatjuk, miközben az elegy pH-ját savasan tartjuk és követjük a nitritionok 10 jelenlétét negatív reakcióig, majd az elegyet lúgosítjuk, nátrium-bór-hidriddel redukáljuk és a depolimerizált terméket semleges közegben etanolos kicsapatással izoláljuk, majdb) a kapott tennék vizes oldatát 7 körüli pH-értéknél ultraibolya-sugárzó rendszerbe helyezzük 254 nmen, majd az így kapott oldatot ioncserélő oszlopra visszük és az oszlop vizes és 7 körüli pH-nál végzett öblítése után a végterméket nátrium-kloridos és etanolos kicsapatással nyeljük ki.5
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben 254 nm-es ultraibolya-sugárzó rendszert használunk 9-15 percig, 16 wattos UVlámpával, és 8-12%-os (tömeg/térfogat) koncentrációjú oldatot teszünk ki UV-besugárzásnak.
- 13. Gyógyszerkészítmények, amelyek hatóanyagként egy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti heparinfrakciót tartalmazzák.
- 14. A 13. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények, amelyek hatóanyagként adagolási egységenként
- 15 10-5000 mg 6. igénypont szerinti terméket tartalmaznak.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9305534A FR2704861B1 (fr) | 1993-05-07 | 1993-05-07 | Fractions d'héparine purifiées, procédé d'obtention et compositions pharmaceutiques les contenant. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9401446D0 HU9401446D0 (en) | 1994-08-29 |
| HUT70553A HUT70553A (en) | 1995-10-30 |
| HU221595B true HU221595B (hu) | 2002-11-28 |
Family
ID=9446915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9401446A HU221595B (hu) | 1993-05-07 | 1994-05-06 | Tisztított heparinfrakciók, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5599801A (hu) |
| EP (1) | EP0623629B1 (hu) |
| JP (1) | JP3529835B2 (hu) |
| KR (1) | KR100328095B1 (hu) |
| CN (1) | CN1066155C (hu) |
| AT (1) | ATE141618T1 (hu) |
| AU (1) | AU672291B2 (hu) |
| BR (1) | BR9401920A (hu) |
| CA (1) | CA2122930C (hu) |
| CZ (1) | CZ287889B6 (hu) |
| DE (1) | DE69400385T2 (hu) |
| DK (1) | DK0623629T3 (hu) |
| ES (1) | ES2093494T3 (hu) |
| FI (1) | FI107388B (hu) |
| FR (1) | FR2704861B1 (hu) |
| GR (1) | GR3021648T3 (hu) |
| HK (1) | HK1007432A1 (hu) |
| HU (1) | HU221595B (hu) |
| IL (1) | IL109587A (hu) |
| MY (1) | MY110862A (hu) |
| NO (1) | NO306952B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ260460A (hu) |
| PL (1) | PL178294B1 (hu) |
| RU (1) | RU2133253C1 (hu) |
| TW (1) | TW438812B (hu) |
| ZA (1) | ZA943152B (hu) |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5763427A (en) * | 1995-03-31 | 1998-06-09 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US5744457A (en) * | 1995-03-31 | 1998-04-28 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US6001820A (en) * | 1995-03-31 | 1999-12-14 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis |
| US5980865A (en) * | 1995-08-18 | 1999-11-09 | Baker Norton Pharmaceuticals, Inc. | Method for treating late phase allergic reactions and inflammatory diseases |
| WO1997016556A1 (en) | 1995-10-30 | 1997-05-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed polysaccharide lyases derived from heparinase i |
| US5767269A (en) * | 1996-10-01 | 1998-06-16 | Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. | Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics |
| IT1290814B1 (it) * | 1997-03-24 | 1998-12-11 | Istituto Scient Di Chimica E B | Glicosaminoglicani aventi elevata attivita' antitrombotica |
| US7056504B1 (en) | 1998-08-27 | 2006-06-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II |
| JP2003527822A (ja) * | 1998-08-27 | 2003-09-24 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | ヘパリナーゼｉおよびｉｉ由来の合理的に設計されたヘパリナーゼ |
| WO2000065521A2 (en) * | 1999-04-23 | 2000-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | System and method for polymer notation |
| CA2402160C (en) | 2000-03-08 | 2012-02-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Heparinase iii and uses thereof |
| IT1318432B1 (it) * | 2000-03-30 | 2003-08-25 | Inalco Spa | Glicosaminoglicani derivati dal polisaccaride k5 aventi elevataattivita' anticoagulante ed antitrombotica e processo per la loro |
| US8227449B2 (en) * | 2000-03-30 | 2012-07-24 | Glycores 2000 S.R.L. | Glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide having high anticoagulant and antithrombotic activities and process for their preparation |
| WO2002023190A2 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to low molecular weight heparin |
| AU2002224408B2 (en) * | 2000-10-18 | 2007-08-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to pulmonary delivery of polysaccharides |
| US20050027117A1 (en) * | 2000-12-18 | 2005-02-03 | Pasqua Oreste | Anticoagulant and antithrombotic LMW-glycosaminoglycans derived from K5 polysaccharide and process for their preparation |
| JP2002293804A (ja) * | 2001-03-28 | 2002-10-09 | Itoham Foods Inc | 低分子量ヘパリンの製造法 |
| EP2284535A1 (en) | 2002-03-11 | 2011-02-16 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Low molecular weight heparins |
| EP1582531A1 (en) | 2004-03-24 | 2005-10-05 | Aventis Pharma S.A. | Process for oxidizing unfractionated heparins and detecting presence or absence of glycoserine in heparin and heparin products |
| ITMO20040199A1 (it) * | 2004-07-29 | 2004-10-29 | Biofer Spa | Procedimento per la purificazione da gruppi e n no rsidui di eparine a basso peso molecolare ottentite tramite nitrosazione. |
| JP2006291028A (ja) * | 2005-04-11 | 2006-10-26 | Q P Corp | 低分子ヘパリンまたはその塩、ならびにその製造方法 |
| EP1792621B1 (en) | 2005-11-30 | 2012-04-04 | Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche "G. Ronzoni" | Orally administrable heparin derivatives |
| US9139876B1 (en) | 2007-05-03 | 2015-09-22 | Momenta Pharmacueticals, Inc. | Method of analyzing a preparation of a low molecular weight heparin |
| CN102791742B (zh) * | 2010-01-19 | 2014-12-24 | 动量制药公司 | 评价肝素制剂 |
| KR101794877B1 (ko) * | 2010-09-14 | 2017-11-07 | 고쿠리츠 다이가쿠 호징 미야자키 다이가쿠 | 고순도 헤파린 및 그 제조방법 |
| WO2012115952A1 (en) | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Evaluating heparin preparations |
| CN102633905B (zh) * | 2011-04-11 | 2014-10-08 | 南通天龙畜产品有限公司 | 一种肝素钠中不被亚硝酸降解且在肝素钠保留时间附近出峰的物质的去除方法 |
| CN104045744B (zh) * | 2014-06-26 | 2016-01-06 | 常州千红生化制药股份有限公司 | 达肝素钠的制备方法 |
| CN104098716B (zh) * | 2014-07-16 | 2015-04-22 | 南京健友生化制药股份有限公司 | 一种达肝素钠精品的生产方法 |
| US10688249B2 (en) * | 2015-06-11 | 2020-06-23 | Virchow Biotech Pvt. Ltd. | Multiple dose pharmaceutical compositions containing heparin and/or heparin-like compounds and devices and methods for delivering the same |
| CN105294885A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-02-03 | 山东大学 | 一种新来源亚硝酸降解低分子肝素的制备方法 |
| JP2021513593A (ja) * | 2018-02-14 | 2021-05-27 | バイオロジカル イー リミテッド | ダルテパリンナトリウムを調製する改善された方法 |
| RU186728U1 (ru) * | 2018-10-19 | 2019-01-30 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "МИРЭА - Российский технологический университет" | Лабораторное устройство для отмывки порошковых продуктов химических реакций от посторонних примесей |
| BR112022000255A8 (pt) | 2019-07-09 | 2022-03-22 | Optimvia Llc | Métodos para sintetizar polissacarídeos anticoagulantes |
| CN110845641A (zh) * | 2019-11-07 | 2020-02-28 | 中国药科大学 | 一种肝素寡糖及其在制备抗血管生成药物中的应用 |
| CN110787489A (zh) * | 2019-11-20 | 2020-02-14 | 江苏千牧生物科技股份有限公司 | 一种肝素钠加工使用的分离装置及加工的工艺 |
| EP4182452A4 (en) | 2020-07-14 | 2024-07-31 | Optimvia Llc | METHOD FOR THE SYNTHESIS OF NON-ANTICOAGULATING HEPARAN SULFATE |
| CN115304688A (zh) * | 2022-08-25 | 2022-11-08 | 湖北亿诺瑞生物制药有限公司 | 一种达肝素钠的制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2478646A2 (fr) * | 1980-03-20 | 1981-09-25 | Choay Sa | Composition mucopolysaccharidique ayant une activite regulatrice de la coagulation, medicament la contenant et procede pour l'obtenir |
| US4438261A (en) * | 1980-05-19 | 1984-03-20 | Riker Laboratories, Inc. | Anticoagulant substance |
| US4351938A (en) * | 1980-05-19 | 1982-09-28 | Riker Laboratories, Inc. | Anticoagulant substance |
| CA1171375A (en) * | 1980-09-15 | 1984-07-24 | Ulf P.F. Lindahl | Oligosaccharides having selective anticoagulation activity |
| FR2503714B1 (fr) * | 1981-04-10 | 1986-11-21 | Choay Sa | Procede d'obtention de mucopolysaccharides biologiquement actifs, de purete elevee, par depolymerisation de l'heparine |
| US5094815A (en) * | 1988-05-18 | 1992-03-10 | Cornell Research Foundation, Inc. | Photolytic interface for HPLC-chemiluminescence detection of non volatile N-nitroso compounds |
| US5032679A (en) * | 1988-12-15 | 1991-07-16 | Glycomed, Inc. | Heparin fragments as inhibitors of smooth muscle cell proliferation |
| IT1243300B (it) * | 1990-12-20 | 1994-05-26 | Fidia Spa | Derivati dell'eparina |
| US5385937A (en) * | 1991-04-10 | 1995-01-31 | Brigham & Women's Hospital | Nitrosation of homocysteine as a method for treating homocysteinemia |
-
1993
- 1993-05-07 FR FR9305534A patent/FR2704861B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-05 AU AU61912/94A patent/AU672291B2/en not_active Expired
- 1994-05-05 NZ NZ260460A patent/NZ260460A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-05-05 CA CA002122930A patent/CA2122930C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-06 ES ES94400994T patent/ES2093494T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-06 ZA ZA943152A patent/ZA943152B/xx unknown
- 1994-05-06 DK DK94400994.3T patent/DK0623629T3/da active
- 1994-05-06 IL IL109587A patent/IL109587A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-05-06 FI FI942095A patent/FI107388B/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-05-06 HU HU9401446A patent/HU221595B/hu unknown
- 1994-05-06 RU RU94015595A patent/RU2133253C1/ru active
- 1994-05-06 AT AT94400994T patent/ATE141618T1/de active
- 1994-05-06 NO NO941686A patent/NO306952B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-05-06 US US08/239,320 patent/US5599801A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-06 DE DE69400385T patent/DE69400385T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-06 CZ CZ19941132A patent/CZ287889B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-06 BR BR9401920A patent/BR9401920A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-05-06 MY MYPI94001141A patent/MY110862A/en unknown
- 1994-05-06 PL PL94303336A patent/PL178294B1/pl unknown
- 1994-05-06 EP EP94400994A patent/EP0623629B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-07 KR KR1019940010033A patent/KR100328095B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-05-07 TW TW083104157A patent/TW438812B/zh not_active IP Right Cessation
- 1994-05-07 CN CN94105382A patent/CN1066155C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 JP JP09533794A patent/JP3529835B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-11-14 GR GR960403019T patent/GR3021648T3/el unknown
-
1998
- 1998-06-25 HK HK98106616A patent/HK1007432A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU221595B (hu) | Tisztított heparinfrakciók, eljárás előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények | |
| RU2617764C2 (ru) | Неантикоагулянтные гликозаминогликаны, содержащие повторяющиеся дисахаридные звенья, и их медицинское применение | |
| JP2006519246A (ja) | 高純度フォンダパリヌクスナトリウム医薬組成物 | |
| CN103463565A (zh) | 一种莪术油注射液及其制备方法 | |
| ES2317280T3 (es) | Proceso para preparar heparina de bajo peso molecular. | |
| CN104548278B (zh) | 一种依诺肝素钠封管注射液及其制备方法 | |
| CN102961389A (zh) | 一种含有氨基葡萄糖的组合物及其制备方法和检测方法 | |
| CN105596291B (zh) | 一种磺达肝癸钠注射液组合物 | |
| CN103371969A (zh) | 重酒石酸间羟胺注射液及其制剂工艺 | |
| CN105640876A (zh) | 一种盐酸莫西沙星氯化钠注射液的制备工艺 | |
| CN102525893B (zh) | 盐酸去氧肾上腺素注射液及其制剂工艺 | |
| CN104434788B (zh) | 一种阿替洛尔注射液的制备方法 | |
| CN114767627B (zh) | 一种乳酸环丙沙星氯化钠注射液的制备方法 | |
| CN111249227A (zh) | 一种磺达肝癸钠注射液的制备方法 | |
| CN112957322A (zh) | 一种乳酸左氧氟沙星氯化钠注射液及其制备方法 | |
| WO2020157257A1 (en) | Injectable carbamazepine composition essentially free of 10-br-carbamazepine | |
| CN102525894A (zh) | 盐酸异丙肾上腺素注射液及其制剂工艺 | |
| DE69012818T2 (de) | Zusammensetzung zur beseitigung und inaktivierung von schadstoffen im blut oder sonstigen extrazellularen körperflüssigkeiten. | |
| CN111920807B (zh) | 阿苯达唑包合物及其超声波法制备工艺 | |
| CN115869255B (zh) | 一种呋塞米注射液的组成及制备方法 | |
| CN1748702A (zh) | 一种新包装的盐酸纳洛酮注射液及其生产方法 | |
| CN116549384A (zh) | 一种高浓度大蒜素组合物注射液及其制备工艺 | |
| EP3932391A1 (en) | Method to prepare pharmaceutical compositions | |
| CN118021738A (zh) | 药物组合物及其制备方法 | |
| CN107041870A (zh) | 一种预防运动创伤手术后静脉血栓的注射液及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SANOFI-SYNTHELABO, FR |