CN105884933A - 禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，其包括以下步骤：壳膜与钙化壳的分离；将壳膜干燥、粉碎；从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离。本发明的方法可以分离出高纯度的透明质酸，直接从禽类蛋壳中提取透明质酸，不仅来源广泛，而且得到的透明质酸来自动物的自然组织，分子量稳定，无内毒素。
Description
技术领域
本发明属于透明质酸的提取领域，具体涉及一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法。
背景技术
透明质酸是一种富含阴离子的直链线性大分子多糖，能够和动物体内多种细胞生长因子、酶、细胞因子以及受体相结合，诱发信号转导，从而调控细胞生长、分化及凋亡。因此，透明质酸被广泛用于医药(例如，用于治疗关节炎、肌腱和软组织损伤、作为癌症纳米药物佐剂等)、食品保健和化妆品(例如，用于抗皱化妆品等)领域。
目前，透明质酸的来源主要有两种方法，一种是动物组织，如公鸡鸡冠、胎儿肚脐，多来源于屠宰车间或医院；另一种是通过微生物发酵。前一种方法由于动物组织产量有限，限制透明质酸的产量；后一种方法，由于产生的透明质酸分子量(长度)较难把握，且容易受内毒素污染，影响了透明质酸的进一步应用。
发明内容
有鉴于此，实有必要提供一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法可以分离出高纯度的透明质酸，直接从禽类蛋壳中提取透明质酸，不仅来源广泛，而且得到的透明质酸来自动物的自然组织，分子量稳定，无内毒素。
本发明提供的禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，包括以下步骤：
壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为2～20％乙酸，或者质量浓度为1～5wt％的EDTA二钠盐/EDTA四钠盐浸泡蛋壳，将壳膜分离；
将壳膜干燥、粉碎；
从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括：采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质；以及用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，或者用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖；所述阴离子交换柱为Vivapure Q Max H阴离子交换柱；所述阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800；
去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，具体包括：
ⅰ)用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素在水溶液或50mM，pH为7～9的Tris-HCl缓冲液中水解成碎片，得到反应液1备用；
ⅱ)将反应液1循环2遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱或往反应液1中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜(反应液1与树脂体积比为(5～30)：1)，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合物；或者往反应液1中加入NaCl，使得最终NaCl的浓度为0.5M，煮3分钟使酶变性沉淀，之后离心、取上清液，往上清液加入含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物沉淀析出；
将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离，具体包括：采用Q-Sepharose阴离子交换层析柱，Easy Purification Systems纯化系统或HPLC系统，用浓度范围为0.05～5M，浓度梯度为0.2～0.5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测光波的激发波长214nm、发射波长280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素。
优选地，壳膜与钙化壳的分离过程中，蛋壳浸泡的时间为12～96h。
优选地，所述将壳膜干燥、粉碎，具体包括：将壳膜冷冻干燥1～5天，或者于20～90℃烘1～5天；用粉碎仪或超细粉碎仪将壳膜粉碎。
优选地，所述采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质，具体包括：
将壳膜粉悬浮于含0～0.6wt％十二烷基磺酸钠的PBS缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～11，所述壳膜与PBS缓冲液的质量比为1：(10～80)；
加入链霉蛋白酶Actinase E，于37～39℃下进行水浴处理12～28小时，Actinase E与壳膜的质量比为1：(2～50)；于90～95℃灭活Actinase E 10～30分钟；
加入蛋白酶K于53～56℃水浴处理6～24小时，蛋白酶K与壳膜质量比为1：(70～100)，于90～95℃灭活蛋白酶K 10～40分钟；或者用碱性蛋白酶于53～63℃水浴处理6～24小时，酶与壳膜质量比1：(80～100)；于90～95℃灭活碱性蛋白酶10～40分钟；
用悬浮桶转子3200～6000xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用。
优选地，所述用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，具体包括：将上清液循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱(或往上清液中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，上清液与树脂体积比为(5-30)：1)，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤去除阴离子交换柱(或阴离子交换树脂)上的杂蛋白或杂质，最后3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，将总糖胺聚糖盐溶液用超滤管或透析袋脱盐，所述超滤管或透析袋的截留量为3～10kDa；或者将总糖胺聚糖盐溶液用4～5倍体积的甲醇于-20～8℃沉淀12～18小时，再用体积浓度95％甲醇连续洗涤沉淀3遍；将沉淀物冻干或空干得总糖胺聚糖；
优选地，所述用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖，具体包括：直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.01～0.5g氯化十六烷吡啶，混匀后于2～8℃放置过夜以沉淀总糖胺聚糖，于2～8℃用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，用含5～20wt％乙酸钾的70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，再用70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干沉淀，即得到总糖胺聚糖。
优选地，所述用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素在水溶液或50mM Tris-HCl缓冲液中水解成碎片，具体包括：将总糖胺聚糖溶解于水或50mM，pH为7～9的Tris-HCl缓冲液中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应12～24小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片。
优选地，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.01～0.15mU、0.1～1mU、0.5～3mU和0.01～0.3mU。
优选地，所述将反应液1加入阴离子交换柱或往反应液1中加入阴离子交换树脂结合过夜，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合物，具体包括：将反应液1循环两遍加入Vivapure QMax H阴离子交换柱或往反应液1中加入强碱性阴离子交换树脂LewatitMonoPlus M800结合过夜，上清液与树脂体积比为(10-30)：1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤去除阴离子交换柱或阴离子交换树脂上糖胺聚糖水解后的碎片及其它杂质，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液，最后用超滤管或透析袋脱盐，所述超滤管或透析袋的截留量3～10kDa；或者先用0.5～5倍体积的甲醇于-20～8℃沉淀12～18小时，用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀，再用体积浓度70～95％甲醇洗涤沉淀3遍，最后将糖胺聚糖冻干或空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
优选地，所述往反应液1中加入NaCl，使得最终NaCl的浓度为0.5M，高温水浴后离心、取上清液，往上清液加入含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物沉淀析出，具体包括：往反应液1加入NaCl，使NaCl的最终浓度为0.5M，煮3分钟(这里加入NaCl以促进肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶水浴变性沉淀，并且提高透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的产率)后，用固定角转子15000～30000xg离心力离心，取上清液，往上清液加入2～5倍体积的含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀析出，最后用固定角转子15000～30000xg离心力离心，再用体积浓度70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
与现有技术相比，本发明的禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法可以从禽类蛋壳膜中分离出高纯度的透明质酸，不仅来源广泛，而且得到的透明质酸来自动物的自然组织，分子量稳定，无内毒素。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
本发明实施例提供了一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为2～20％乙酸，或者质量浓度为1～5wt％的乙二胺四乙酸二钠盐/乙二胺四乙酸四钠盐(EDTA二钠盐/EDTA四钠盐)浸泡蛋壳12～96h后，手工剥离或震荡分离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
本发明采用体积浓度为2～20％乙酸，或者质量浓度为1～5wt％的EDTA二钠盐/EDTA四钠盐对禽类蛋壳进行处理，可以快速、高效的将壳膜与钙化壳进行分离。
2)将壳膜冷冻干燥1～5天，或者于20～90℃烘1～5天；用粉碎仪或超细粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于含0～0.6wt％十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，该磷酸盐缓冲液的pH值为7～11，所述壳膜与PBS的质量比为1：(10～80)；本发明使用十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液,可以增强后续蛋白酶的活性，有利于更好的降解壳膜中的蛋白质。
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：(2～50)；于37～39℃下进行水浴处理12～28小时，期间间歇性地震荡悬浮反应液，接着于90～95℃灭活Actinase E 10～30分钟；
再加入蛋白酶K于53～56℃水浴处理6～24小时，蛋白酶K与壳膜的质量比为1：(70～100)，之后于90～95℃灭活蛋白酶K 10～40分钟；或者用碱性蛋白酶(alcalase)于53～63℃水浴处理6～24小时，碱性蛋白酶与壳膜的质量比1：(80～100)；之后于90～95℃灭活alcalase 10～40分钟；
本发明采用蛋白酶K或者碱性蛋白酶可以进一步降解未能被链霉蛋白酶降解的蛋白质，能够更充分的将壳膜中的蛋白质降解，同时蛋白酶K或者碱性蛋白酶在降解余下壳膜蛋白质的同时，还可以有效降解链霉蛋白酶，从而省去了后续去除链霉蛋白酶的过程，简化了工艺步骤。
用悬浮桶转子3200～6000xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
将上清液循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱(或往上清液中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，以充分结合总糖胺聚糖，上清液与阴离子交换树脂的体积比为(5～30)：1)，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换柱(或阴离子交换树脂)以充分洗掉杂蛋白或其它杂质，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，将总糖胺聚糖盐溶液用超滤管或透析袋脱盐去除NaCl，该超滤管或透析袋的截留量为3～10kDa；或者将总糖胺聚糖盐溶液用4～5倍体积的甲醇于-20～8℃沉淀12～18小时，固定角转子15000～30000xg离心，再用体积浓度95％甲醇连续洗涤沉淀3遍；将沉淀物冻干或空干得总糖胺聚糖，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及硫酸软骨素/硫酸皮肤素；
或者，直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.01～0.5g氯化十六烷吡啶，混匀后于2～8℃放置过夜以充分沉淀总糖胺聚糖，于2～8℃用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，用含5～20wt％乙酸钾的70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，再用70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干沉淀，即得到总糖胺聚糖，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及硫酸软骨素/硫酸皮肤素。
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)将上述总糖胺聚糖溶解于水或50mM，pH＝7～9的Tris-HCl缓冲液(Tris：Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应12～24小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.01～0.15mU、0.1～1mU、0.5～3mU和0.01～0.3mU；
采用Tris-HCl缓冲液可以增强肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、尤其角质素酶的活性，使得肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素的水解更彻底。肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III配合使用，可以更充分地将肝素/硫酸乙酰肝素降解成糖链碎片，其与阴离子交换柱或阴离子交换树脂结合很弱甚至不结合，所以容易被洗涤掉。
ⅱ)将反应液1循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱(或往反应液1中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，反应液1与阴离子交换树脂的体积比为(10～30)：1)，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换柱(或阴离子交换树脂)以充分洗掉降解的糖链碎片或杂蛋白，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液，最后用超滤管或透析袋(该超滤管或透析袋的截留量3～10kDa)脱盐；或者先用0.5～5倍体积的甲醇于-20～8℃沉淀12～18小时，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀，再用体积浓度70～95％甲醇连续洗涤沉淀3遍；最后将糖胺聚糖冻干或空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物；
或者，往反应液1加入NaCl，使得最终NaCl的浓度为0.5M，煮3分钟(这里加入NaCl以促进肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶水浴变性沉淀，并且提高透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的产率)后，用固定角转子15000～30000xg离心力离心，取上清液，往上清液加入2～5倍体积的含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀析出，最后用固定角转子15000～30000xg离心力离心，再用体积浓度70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
采用Q-Sepharose阴离子交换层析柱，Easy Purification Systems纯化系统或HPLC系统，用浓度范围为0.05～5M，浓度梯度为0.2～0.5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测光波的激发波长214nm、发射波长280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素。随后用超滤管或透析袋(截留量3-10kDa)脱盐；或者用4～5倍体积的无水甲醇于-20～8℃分别将透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀析出12～18小时，固定角转子15000～30000xg离心去除上清液，用体积浓度70～95％甲醇分别洗涤透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素三遍；再冻干或空干。
6)透明质酸的最终鉴定：将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶于37℃降解过夜，每微克透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素中酶用量分别为0.01～0.15mU，之后用二氨基吖啶酮标记，进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品，最终可以从上述吸收峰对应的几个样品中确定透明质酸。
本发明所述的禽类蛋壳包括但不限于鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟、孔雀、鹌鹑、鸟类等的蛋壳。本发明所述的透明质酸提取方法(含消化蛋白质、提取总糖胺聚糖、去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素、将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离)也适用于其它动物组织(脱脂、脱矿或无脂、无矿的动物组织材料)中透明质酸的提取。
采用本发明的方法从禽类蛋壳膜中分离出高纯度的透明质酸，不仅来源广泛，而且得到的透明质酸来自动物的自然组织，分子量稳定，无内毒素。
实施例1
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为3％乙酸，浸泡蛋壳12h后，手工剥离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
2)将壳膜冷冻干燥1天，用粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于含0.001wt％十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，pH＝8.4)中，所述壳膜与PBS的质量比为1：50；
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，于38℃下进行水浴处理20小时，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：10；于90℃灭活Actinase E 15分钟；
再加入蛋白酶K于55℃水浴处理10小时，蛋白酶K与壳膜质量比为1：85，于95℃灭活蛋白酶K 18分钟；
用悬浮桶转子4500xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.2g氯化十六烷吡啶，混匀后于5℃放置过夜后，于5℃固定角转子25000xg离心去除上清液，用含10wt％乙酸钾的95％乙醇洗涤沉淀3遍，再用95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干沉淀，即得到总糖胺聚糖，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素/硫酸皮肤素。
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)将上述总糖胺聚糖溶解于双蒸水中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应12小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.01mU、0.1mU、1mU和0.02mU。
ⅱ)将反应液1循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换柱，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液，之后用超滤管脱盐，所述超滤管的截留量8kDa，最后将糖胺聚糖冻干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物溶于双蒸水形成待检液，采用Easy Purification Systems纯化系统，将待检液循环两遍注入Q-Sepharose阴离子交换层析柱，用0.1M、0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置激发波长A214nm、发射波长A280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素。用5倍体积的甲醇于4℃分别将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀12小时，用体积浓度90％甲醇分别洗涤透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素三遍，再空干。将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶37℃降解过夜，用二氨基吖啶酮标记后进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品从这些样品中确定透明质酸。
实施例2
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为5％乙二胺四乙酸二钠盐，浸泡蛋壳36h后，手工剥离或震荡分离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
2)将壳膜冷冻干燥2天，用超细粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于含0.002wt％十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，pH＝8.5)中，所述壳膜与PBS的质量比为1：40；
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，于37℃下进行水浴处理28小时，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：40；于90℃灭活Actinase E 10分钟；
再加入蛋白酶K于53℃水浴处理10小时，蛋白酶K与壳膜质量比为1：70，于95℃灭活蛋白酶K 18分钟；
用悬浮桶转子4200xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.1g氯化十六烷吡啶，混匀后于6℃放置过夜后，于6℃固定角转子30000xg离心力离心去除上清液，用含10wt％乙酸钾的90％乙醇洗涤沉淀3遍，再用90％乙醇洗涤沉淀3遍，空干沉淀，即得到总糖胺聚糖，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、硫酸角质素、肝素/硫酸乙酰肝素、以及硫酸软骨素/硫酸皮肤素。
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)将上述总糖胺聚糖溶解于水中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应15小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶的用量分别为0.02mU、0.1mU、1mU和0.02mU；
ⅱ)将反应液1循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换柱，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液；随后用超滤管(该超滤管的截留量10kDa)脱盐；最后将糖胺聚糖冻干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物溶于双蒸水形成待检液，采用Easy Purification Systems纯化系统，将待检液循环两遍注入Q-Sepharose阴离子交换层析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、1.3M、1.6M、1.8M、2.1M、2.4M、2.7M、3M、3.3M、3.6M、3.9M、4.5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测波为激发波长A214nm、发射波长A280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素。用4倍体积的甲醇于4℃分别将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀18小时，用体积浓度95％甲醇分别洗涤透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素三遍，再空干。将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶37度降解过夜，用二氨基吖啶酮标记后进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品从这些样品中确定透明质酸。
实施例3
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为10％乙酸浸泡蛋壳12h后，手工剥离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
2)将壳膜冷冻干燥3天，用超细粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于无十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，pH＝8.2)中，所述壳膜与PBS的质量比为1：30；
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，于39℃下进行水浴处理12小时，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：10；于90℃灭活Actinase E 15分钟；
再加入蛋白酶K于55℃水浴处理10小时，蛋白酶K与壳膜的质量比为1：90，于93℃灭活蛋白酶K 30分钟；
用悬浮桶转子6000xg离心力离心上述经蛋白酶处理的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
往上清液中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，上清与树脂体积比为1：10，依次用0.1M、0.5M的NaCl洗涤阴离子交换树脂，最后3.3M的NaCl洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，随后用透析袋(截留量6kDa)脱盐，最后将总糖胺聚糖冷冻干燥，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素/硫酸皮肤素、以及硫酸角质素。
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)将上述总糖胺聚糖溶解于水中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应12小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.02mU、0.5mU、1mU和0.05mU；
ⅱ)往上述反应液加入NaCl，终浓度0.5M，煮3分钟后，固定角转子20000×g离心，取上清，之后加入4.5倍体积的含饱和乙酸钠的95％乙醇沉淀透明质酸和硫酸软骨素/硫酸皮肤素，4℃过夜，固定角转子25000×g离心，用无乙酸钾的95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物溶于双蒸水形成待检液，采用Easy Purification Systems纯化系统，将待检液循环两遍注入Q-Sepharose阴离子交换层析柱，之后用0.1M、0.35M、0.7M、1.05M、1.4M、1.75M、2.1M、2.45M、2.8M、3.15M、3.5M、3.85M、4.2M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测波为激发波长A214nm、发射波长A280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素。用超滤管(截留量6kDa)脱盐分别洗涤透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素，再冻干。将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶37度降解过夜，用二氨基吖啶酮标记后进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品从这些样品中确定透明质酸。
实施例4
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用质量浓度为2wt％的EDTA二钠盐浸泡蛋壳72h后，手工剥离或震荡分离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
2)将壳膜于90℃烘1天；用粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于含0.02wt％十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液,pH＝7.8)中，所述壳膜与PBS的质量比为1：30；
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，于37.5℃下进行水浴处理15小时，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：45；于92℃灭活Actinase E 12分钟；
再加入蛋白酶K于55℃水浴处理10小时，蛋白酶K与壳膜的质量比为1：75，于95℃灭活蛋白酶K 15分钟；
用悬浮桶转子5500xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
将上清液循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱，依次用0.05M、0.1M的NaCl洗涤阴离子交换柱，最后3.3M的NaCl洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，随后用透析袋(截留量3kDa)脱盐，最后将总糖胺聚糖冷冻干燥，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素/硫酸皮肤素、以及硫酸角质素。
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)上述总糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl缓冲液(该缓冲液的pH＝7.2；Tris：Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应18小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.1mU、0.1mU、0.5mU和0.5mU；
ⅱ)往反应液1中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，反应液1与阴离子交换树脂的体积比为15：1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换树脂，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液，用5倍体积的甲醇于6℃沉淀15小时，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀，再用体积浓度90％甲醇连续洗涤沉淀3遍，最后将糖胺聚糖空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物溶于双蒸水形成待检液，采用HPLC系统，将待检液循环两遍注入Q-Sepharose阴离子交换层析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、1.3M、1.6M、1.9M、2.2M、2.5M、2.8M、3.1M、3.4M、3.7M、4M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测波为激发波长A214nm、发射波长A280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素。用4倍体积的甲醇于-20℃分别将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀15小时，用体积浓度90％甲醇分别洗涤透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素三遍，再空干。将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶37度降解过夜，用二氨基吖啶酮标记后进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品从这些样品中确定透明质酸。实施例5
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用质量浓度为5wt％的EDTA二钠盐浸泡蛋壳45h后，手工剥离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
2)将壳膜60℃烘3天，用超细粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于含0.01wt％十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液,pH＝8.0)中，所述壳膜与PBS的质量比为1：25；
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，于38.2℃下进行水浴处理18小时，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：50；于93℃灭活Actinase E 10分钟；
用碱性蛋白酶(alcalase)于53℃水浴处理20小时，酶与壳膜的质量比1：80；于95℃灭活alcalase 20分钟；
用悬浮桶转子5000xg离心力离心上述经蛋白酶消化的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
往上清液中加入阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，上清液与阴离子交换树脂的体积比为15：1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换树脂，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，将总糖胺聚糖盐溶液用5倍体积的甲醇于-20℃沉淀12小时，再用体积浓度95％甲醇连续洗涤沉淀3遍；将沉淀物空干得总糖胺聚糖，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及硫酸软骨素/硫酸皮肤素；
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)将上述总糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl缓冲液(该缓冲液的pH＝7.6；Tris：Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应20小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.02mU、0.1mU、1.5mU和0.05mU；
ⅱ)往反应液1中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，反应液1与阴离子交换树脂的体积比为15：1，先后用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换树脂，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液，用3倍体积的甲醇于-8℃沉淀18小时，得硫酸软骨素/硫酸皮肤素、透明质酸沉淀，再用体积浓度95％甲醇连续洗涤沉淀3遍，最后将糖胺聚糖空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物溶于双蒸水形成待检液，采用Easy Purification Systems纯化系统，将待检液循环两遍注入Q-Sepharose阴离子交换层析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、1.3M、1.6M、1.9M、2.2M、2.5M、2.8M、3.1M、3.4M、3.7M、4M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测波为激发波长A214nm、发射波长A280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素。用超滤管(截留量8kDa)脱盐洗涤透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素，再冻干。将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶37度降解过夜，用二氨基吖啶酮标记后进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品从这些样品中确定透明质酸。
实施例6
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用质量浓度为3wt％的EDTA二钠盐浸泡蛋壳72h后，手工剥离或震荡分离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
2)将壳膜于60℃烘2天，用超细粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于含0.01wt％十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，pH＝8.0)中，所述壳膜与PBS的质量比为1：50；
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，于38℃下进行水浴处理18小时，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：35；于91℃灭活Actinase E 18分钟；
用碱性蛋白酶(alcalase)于56℃水浴处理6小时，酶与壳膜的质量比1：100；于95℃灭活alcalase 15分钟；
用悬浮桶转子5500xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
将上清液循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换柱，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液；将总糖胺聚糖盐溶液用4倍体积的甲醇于-12℃沉淀18小时，用固定角转子23000xg离心力离心弃上清，再用体积浓度95％甲醇连续洗涤沉淀3遍；将沉淀物空干得总糖胺聚糖，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及硫酸软骨素/硫酸皮肤素；
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)将上述总糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl缓冲液(该缓冲液的pH＝7.5；Tris：Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应14小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.1mU、01mU、0.5mU和0.1mU；
ⅱ)将反应液1循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换柱，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液，用5倍体积的甲醇于-20℃沉淀12小时，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀，再用体积浓度85％甲醇连续洗涤沉淀3遍，最后将糖胺聚糖空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物溶于双蒸水形成待检液，采用HPLC纯化系统，将待检液循环两遍注入Q-Sepharose阴离子交换层析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、1.3M、1.6M、1.9M、2.2M、2.5M、2.8M、3.1M、3.4M、3.7M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测波为激发波长A214nm、发射波长A280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素。用4.2倍体积的甲醇于-8℃分别将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀15小时，用体积浓度90％甲醇分别洗涤透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素三遍，再空干。将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶37度降解过夜，用二氨基吖啶酮标记后进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品从这些样品中确定透明质酸。
实施例7
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用质量浓度为2％的EDTA四钠盐浸泡蛋壳80h后，手工剥离或震荡分离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
2)将壳膜于50℃烘干4天，用超细粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于含0.005wt％十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，pH＝8.2)中，所述壳膜与PBS的质量比为1：60；
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，于39℃下进行水浴处理15小时，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：20；于95℃灭活Actinase E 12分钟；
用碱性蛋白酶(alcalase)于55℃水浴处理15小时，酶与壳膜的质量比1：85；于94℃灭活alcalase 25分钟；
用悬浮桶转子4800xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
往上清液中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，上清液与阴离子交换树脂的体积比为20:1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换树脂，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液；将总糖胺聚糖盐溶液用透析袋脱盐，该透析袋的截留量为10kDa，将脱盐后的溶液冻干得总糖胺聚糖，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及硫酸软骨素/硫酸皮肤素；
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)将上述总糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl缓冲液(该缓冲液的pH＝7.2；Tris：Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应13小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.15mU、0.5mU、0.5mU和0.2mU；
ⅱ)往反应液1加入NaCl，使得最终NaCl的浓度为0.5M，煮5分钟后，用固定角转子25000xg离心力离心，取上清液，往上清液加入4倍体积的含饱和乙酸钠的体积浓度为95％的乙醇，于4℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀析出，最后用固定角转子25000xg离心力离心，再用体积浓度95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物溶于双蒸水形成待检液，采用HPLC纯化系统，将待检液循环两遍注入Q-Sepharose阴离子交换层析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、1.3M、1.6M、1.9M、2.2M、2.5M、2.8M、3.1M、3.4M、3.7M、4M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测波为激发波长A214nm、发射波长A280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素。随后用超滤管(截留量10kDa)脱盐洗涤透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素，再冻干。将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶37度降解过夜，用二氨基吖啶酮标记后进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品从这些样品中确定透明质酸。
实施例8
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)壳膜与钙化壳的分离：用质量浓度为5wt％的EDTA四钠盐浸泡蛋壳36h后，手工剥离或震荡分离，即可迅速分离、获得大量壳膜；
2)将壳膜冷冻干燥2天，用超细粉碎仪将壳膜粉碎；
3)从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括以下步骤：
A.消化蛋白质
将壳膜粉悬浮于含0.005wt％十二烷基磺酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，pH＝7.5)中，所述壳膜与PBS的质量比为1：70；
加入链霉蛋白酶(Actinase E)，于37℃下进行水浴处理20小时，链霉蛋白酶与壳膜的质量比为1：8；于94℃灭活Actinase E 12分钟；
用碱性蛋白酶(alcalase)于55℃水浴处理12小时，酶与壳膜的质量比1：80；于94℃灭活alcalase 25分钟；
用悬浮桶转子5200xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用；
B.提取总糖胺聚糖：
往上清液中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，上清液与阴离子交换树脂的体积比为12：1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤阴离子交换树脂，最后用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，将糖胺聚糖盐溶液用超滤管脱盐，该超滤管的截留量为6kDa，将脱盐后的溶液冻干得总糖胺聚糖，所得的总糖胺聚糖含有透明质酸、肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、以及硫酸软骨素/硫酸皮肤素；
4)去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸角质素：
ⅰ)将上述总糖胺聚糖溶解于50mM Tris-HCl缓冲液(该缓冲液的pH＝7.6；Tris：Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应12小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片，得到反应液1备用，其中，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.05mU、0.3mU、0.8mU和0.03mU；
ⅱ)往反应液1加入NaCl，使NaCl的终浓度为0.5M，煮5分钟后，用固定角转子24000xg离心力离心，取上清液，往上清液加入5倍体积的含饱和乙酸钠的体积浓度为95％的乙醇，于2℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素沉淀析出，最后用固定角转子24000xg离心力离心，再用体积浓度95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
5)将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离
将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物溶于双蒸水形成待检液，采用HPLC纯化系统，将待检液循环两遍注入Q-Sepharose阴离子交换层析柱，用0.1M、0.4M、0.7M、1M、1.3M、1.6M、1.9M、2.2M、2.5M、2.8M、3.1M、3.4M、3.7M、4M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测波为激发波长A214nm、发射波长A280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素。用4倍体积的甲醇于-10℃分别将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀20小时，固定角转子23000×g离心弃上清，用体积浓度85％甲醇分别洗涤透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素三遍，再空干。将上述收获的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素分别取少许，用透明质酸酶37℃降解过夜，用二氨基吖啶酮标记后进行LC-MS分析，参考透明质酸二糖标准品从这些样品中确定透明质酸。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求或等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。
Claims (10)
1.一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为2～20％乙酸，或者质量浓度为1～5wt％的EDTA二钠盐/EDTA四钠盐浸泡蛋壳，将壳膜分离；
将壳膜干燥、粉碎；
从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括：采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质；以及用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，或者用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖；
去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，具体包括：
ⅰ)用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素在水溶液或50mM，pH为7～9的Tris-HCl缓冲液中水解成碎片，得到反应液1备用；
ⅱ)将反应液1加入阴离子交换柱或往反应液1中加入阴离子交换树脂结合过夜，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合物；或者往反应液1中加入NaCl，使NaCl的最终浓度为0.5M，煮沸后离心、取上清液，往上清液加入含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物沉淀析出；
将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离，具体包括：采用Q-Sepharose阴离子交换层析柱，Easy Purification Systems纯化系统或HPLC系统，用0.05～5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测光波的激发波长214nm、发射波长280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，壳膜与钙化壳的分离过程中，蛋壳浸泡的时间为12～96h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将壳膜干燥、粉碎，具体包括：将壳膜冷冻干燥1～5天，或者于20～90℃烘1～5天；用粉碎仪或超细粉 碎仪将壳膜粉碎。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质，具体包括：
将壳膜粉悬浮于含0～0.6wt％十二烷基磺酸钠的PBS缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～11，所述壳膜与PBS缓冲液的质量比为1：(10～80)；
加入链霉蛋白酶Actinase E，于37～39℃水浴处理12～28小时，Actinase E与壳膜的质量比为1：(2～50)；于90～95℃灭活Actinase E 10～30分钟；
加入蛋白酶K于53～56℃水浴处理6～24小时，蛋白酶K与壳膜质量比为1：(70～100)，于90～95℃灭活蛋白酶K 10～40分钟；或者用碱性蛋白酶于53～63℃水浴处理6～24小时，酶与壳膜质量比1：(80～100)，于90～95℃灭活碱性蛋白酶10～40分钟；
用悬浮桶转子3200～6000xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，具体包括：将上清液加入阴离子交换柱，或往上清液中加入阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为(5～30)：1；
依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤去除阴离子交换柱或阴离子交换树脂上的杂蛋白或杂质，最后3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，将总糖胺聚糖盐溶液用超滤管或透析袋脱盐，所述超滤管或透析袋的截留量为3～10kDa；或者将总糖胺聚糖盐溶液用4～5倍体积的甲醇于-20～8℃沉淀12～18小时，用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，再用体积浓度95％甲醇连续洗涤沉淀3遍；将沉淀物冻干或空干得总糖胺聚糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖，具体包括：直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.01～0.5g氯化十六烷吡啶，混匀后于2～8℃放置过夜， 于2～8℃用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，用含5～20wt％乙酸钾的70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，再用70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干沉淀，即得到总糖胺聚糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素在水溶液或50mMTris-HCl缓冲液中水解成碎片，具体包括：将总糖胺聚糖溶解于水或50mM，pH为7～9的Tris-HCl缓冲液中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应12～24小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.01～0.15mU、0.1～1mU、0.5～3mU和0.01～0.3mU。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将反应液1加入阴离子交换柱或往反应液1中加入阴离子交换树脂结合过夜，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗涤结合不紧密的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素碎片以及其它杂质，最后洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合物，具体包括：将反应液1加入阴离子交换柱或往反应液1中加入阴离子交换树脂结合过夜，上清液与阴离子交换树脂体积比为(5～30)：1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤去除阴离子交换柱或阴离子交换树脂中的糖胺聚糖碎片及其它杂质，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液；最后或者用超滤管或透析袋脱盐，所述超滤管或透析袋的截留量3～10kDa；或者先用0.5～5倍体积的甲醇于-20～8℃沉淀12～18小时，用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀，再用体积浓度70～95％甲醇洗涤沉淀3遍，最后将糖胺聚糖冻干或空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述往反应液1中加入NaCl，使NaCl的最终浓度为0.5M，高温水浴，离心、取上清液，往上清液加入含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明 质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物沉淀析出，具体包括：往反应液1加入NaCl，使得最终NaCl的浓度为0.5M，煮3分钟后，用固定角转子15000～30000xg离心力离心，取上清液，往上清液加入2～5倍体积的含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀析出，最后用固定角转子15000～30000xg离心力离心，再用体积浓度70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物。
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