CN105396861A - 一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，所述方法包括：采用EDTA去除蛋壳外表面有机物质及内表面壳膜，并粉碎成末；往粉碎后的蛋壳粉末中加入体积浓度2-23％的乙酸水溶液，对所述蛋壳进行脱矿处理；在16℃以下，将脱矿处理后的溶液经离心分离出第一上清液和第一沉淀物，第一沉淀物即为酸不溶性有机基质。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：采用低浓度的乙酸进行脱矿，低浓度乙酸的酸性较弱，有利于保护禽类蛋壳中的有机基质，使其不被破坏。同时，乙酸分阶段逐步加入，可以进一步保护有机基质不被破坏，还可以更有效地实现脱矿效果。且乙酸极易溶于水，有利于后续过程中乙酸的去除。
Description
技术领域
本发明属于有机基质的提取技术领域，具体涉及一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法。
背景技术
禽类蛋壳属于生物矿化物质，由有机物质和大量矿物质共同构成，要获取蛋壳中的有机基质首先必须充分去除与之紧密结合的矿物质。目前，去除禽类蛋壳中的矿物质，提取有机基质主要有两种方法：一种是采用0.6MEDTA(相当于质量浓度22.5％)去除矿物质；另一种是采用一次性加入体积浓度50％乙酸或低浓度盐酸去除矿物质。采用0.6MEDTA去除矿物质，会使得提取出来的蛋壳有机基质结合EDTA，难以除去，影响后续的深加工。而采用一次性加入高浓度乙酸或者低浓度盐酸去除矿物质的过程中，有机基质长时间处于极低pH环境(即强酸环境)中，会使部分有机基质的成分受到破坏，影响提取得到的有机基质的性能和品质。
此外，禽类蛋壳脱矿后，需要对乙酸和溶解的矿物盐进行透析去除，目前缺乏程序性的透析工艺。
再者，现有的禽类蛋壳有机基质提取技术最终获得的仅仅是一组基质，其中包含多种成分，不利于后续的精细开发应用。
发明内容
有鉴于此，实有必要提供一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，采用低浓度的乙酸进行脱矿，低浓度乙酸的酸性较弱，有利于保护禽类蛋壳中的有机基质，使其不被破坏。同时，乙酸分阶段逐步加入，可以进一步保护有机基质不被破坏，还可以更有效地实现脱矿效果。且乙酸极易溶于水，有利于后续过程中乙酸的去除。
本发明提供了一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，所述方法包括：
采用EDTA(乙二胺四乙酸，EthyleneDiamineTetraaceticAcid)去除蛋壳外表面有机物质及内表面壳膜，并粉碎成末；
往粉碎后的蛋壳粉末中加入体积浓度2-23％的乙酸水溶液，对所述蛋壳进行脱矿处理；每100重量份蛋壳粉末，需要1500-3000重量份、体积浓度为2-23％的乙酸水溶液；
在16℃以下，将脱矿处理后的溶液经离心分离出第一上清液和第一沉淀物，所述第一沉淀物即为酸不溶性有机基质。
本发明所述的禽类蛋壳包括但不限于鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟、孔雀、鹌鹑、鸟类等蛋壳。
优选地，所述采用EDTA去除蛋壳外表面有机物质及内表面壳膜，并粉碎成末具体包括：
采用重量浓度2-10％EDTA浸泡所述蛋壳10-40min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，晾干/烘干后，将蛋壳粉碎成末。
优选地，所述往粉碎后的蛋壳粉末中加入体积浓度2-23％的乙酸水溶液，对所述蛋壳进行脱矿处理具体包括：
配置体积浓度为2-23％的乙酸水溶液；
往100重量份的蛋壳粉末中，加入500-1000重量份的配置好的乙酸水溶液，于20℃以下搅拌脱矿4-12小时；按照相同处理先后共3次加入配置好的乙酸水溶液，以使矿物质充分溶解。
优选地，所述脱矿处理的搅拌速度为500-1200转/分钟(rmp)。
优选地，所述在16℃以下，将脱矿处理后的溶液经离心分离出第一上清液和第一沉淀物，具体包括：
在16℃以下，以20000-40000xg离心力离心10-30min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O(重蒸水)洗涤，以20000-40000xg离心力离心两次，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。
优选地，所述方法还包括：
将所述第一上清液用透析袋进行透析脱盐脱酸；
在16℃以下，将透析脱盐脱酸后的溶液进行离心分离出第二上清液和第二沉淀物，所述第二沉淀物即为水不溶性有机基质。
优选地，所述将所述第一上清液用透析袋进行透析脱盐脱酸，具体包括：用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，所述透析袋分子截留量为2-15kDa，透析时间为4-12小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:(20-30)；用去离子水重复透析脱盐脱酸三次后，用ddH2O(重蒸水)透析脱盐脱酸4-20小时。
优选地，所述在16℃以下，将透析脱盐脱酸后的溶液进行离心分离出第二上清液和第二沉淀物，所述第二沉淀物即为水不溶性有机基质，具体包括：
在16℃以下，以2000-6000xg离心力离心10-60min，将透析脱盐脱酸后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤1次以上，以2000-6000xg离心力离心10-60min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
优选地，所述方法还包括：
将第二上清液用超滤离心管进行浓缩，获得水和酸兼溶性有机基质。
优选地，所述将第二上清液用超滤离心管进行浓缩，获得水和酸兼溶性有机基质，具体包括：将所述第二上清液于超滤离心管中，所述超滤离心管分子截留量为2-15kDa，用2000-6000xg离心力离心5-60min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
与现有技术相比，本发明的禽类蛋壳中有机基质的提取方法具有以下有益效果：
1)采用低浓度的乙酸进行脱矿，低浓度乙酸的酸性较弱，有利于保护禽类蛋壳中的有机基质，使其不被破坏。同时，乙酸分阶段逐步加入，可以进一步保护有机基质不被破坏，还可以更有效地实现脱矿效果。且乙酸极易溶于水，有利于后续过程中乙酸的去除。
2)对透析脱盐脱酸过程中样品与水的比例进行了选择，并且按时间段多遍透析，既能充分脱盐脱酸，还能实现程序化；另一方面，本发明对每遍透析用水的品质进行了界定，在实现充分脱盐脱酸的同时，还能降低水成本。
3)本发明的提取方法通过工艺过程的设计，可以提取不同性质的有机基质(酸不溶性组分、水不溶组分、水和酸兼溶性组分)，这样有利于产品的后续精细开发。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
本发明的实施例提供一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)采用重量浓度为2-10％EDTA(乙二胺四乙酸，EthyleneDiamineTetraaceticAcid)浸泡所述蛋壳10-40min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，晾干/烘干后，将蛋壳粉碎成末。
2)配置体积浓度为2-23％的乙酸水溶液；往100重量份的蛋壳粉末中，加入500-1000重量份配置好的乙酸水溶液，于20℃以下搅拌脱矿4-12小时；按照相同处理先后共3次加入配置好的乙酸水溶液，以使矿物质充分溶解。所述脱矿处理的搅拌速度为500-1200转/分钟(rmp)。每次脱矿多使用的乙酸水溶液的质量份数、温度、时间可以相同，也可以不同。
3)在16℃以下，以20000-40000xg离心力离心10-30min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O(重蒸水)洗涤，以20000-40000xg离心力重复离心两次，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。两次离心的离心力及离心时间可以相同，也可以不同。
本发明的禽类蛋壳中有机基质的提取方法，采用低浓度的乙酸进行脱矿，低浓度乙酸的酸性较弱，有利于保护禽类蛋壳中的有机基质，使其不被破坏。同时，乙酸分阶段逐步加入，可以进一步保护有机基质不被破坏，还可以更有效地实现脱矿效果。且乙酸极易溶于水，有利于后续过程中乙酸的去除。
在一实施例中，本发明的禽类蛋壳中有机基质的提取方法进一步包括：
4)用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，所述透析袋分子截留量为2-15kDa，透析时间为4-12小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:(20-30)；用去离子水重复透析脱盐脱酸三次后，用ddH2O(重蒸水)透析脱盐4-20小时。
5)在16℃以下，以2000-6000xg离心力离心10-60min，将透析脱盐脱酸后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤1次以上，以2000-6000xg离心力离心10-60min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
本发明的提取方法进一步对透析脱盐脱酸过程中样品与水的比例进行了选择，并且按时间段多遍透析，既能充分脱盐脱酸，还能实现程序化；另一方面，本发明对每遍透析用水的品质进行了界定，在实现充分脱盐脱酸的同时，还能降低水成本。
在一实施例中，本发明的禽类蛋壳中有机基质的提取方法进一步包括：
6)将所述第二上清液于超滤离心管中，所述超滤离心管分子截留量为2-15kDa，用2000-6000xg离心力离心5-60min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
再一方面，本发明的提取方法通过工艺过程的设计，可以提取不同性质的有机基质(酸不溶性组分、水不溶组分、水和酸兼溶性组分)，这样有利于产品的后续精细开发加工。
本发明所述的禽类蛋壳包括但不限于鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟、孔雀、鹌鹑、鸟类等蛋壳。
实施例1
一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)采用5％EDTA浸泡所述蛋壳30min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，烘干后，将蛋壳粉碎成末。
2)配置体积浓度为10％的乙酸水溶液；往10g的蛋壳粉末中，加入80g(约80ml)的配置好的乙酸水溶液，于20℃搅拌脱矿4小时；接着，再加入80g(约80ml)的配置好的乙酸水溶液，于20℃搅拌脱矿4小时；最后，加入60g(约60ml)的配置好的乙酸水溶液，于20℃搅拌脱矿8小时，使矿物质充分溶解。所述脱矿处理的搅拌速度为1000转/分钟。
3)在16℃以下，以30000xg离心力离心20min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O(重蒸水)洗涤，以30000xg离心力离心两次，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。
4)用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，所述透析袋分子截留量为2kDa，透析时间为4小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:25；用去离子水重复透析脱盐脱酸三次后，用ddH2O(重蒸水)透析脱盐8小时。
5)在16℃以下，以4000xg离心力离心40min，将透析脱盐脱酸后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤2次，以4000xg离心力离心40min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
6)将所述第二上清液于超滤离心管中，超滤离心管分子截留量为2kDa，用4000xg离心力离心40min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
实施例2
一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)采用10％EDTA浸泡所述蛋壳15min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，晾干后，将蛋壳粉碎成末。
2)配置体积浓度为5％的乙酸水溶液；往10g的蛋壳粉末中，加入100g(约100ml)的配置好的乙酸水溶液，于15℃搅拌脱矿6小时；接15℃搅拌脱矿6小时；最后，加入90g(约90ml)的配置好的乙酸水溶液，于15℃搅拌脱矿10小时，使矿物质充分溶解。所述脱矿处理的搅拌速度为500转/分钟。
3)在15℃下，以20000xg离心力离心30min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O(重蒸水)洗涤，以20000xg离心力离心两次，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。
4)用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，所述透析袋分子截留量为8kDa，透析时间为8小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:20；用去离子水重复透析脱盐三次后，用ddH2O(重蒸水)透析脱盐4小时。
5)在15℃下，以2000xg离心力离心60min，将透析脱盐后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤4次，以2000×g离心力离心60min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
6)将所述第二上清液于超滤离心管中，所述超滤离心管分子截留量为8kDa，用2000xg离心力离心60min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
实施例3
一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)采用质量浓度为3％EDTA浸泡所述蛋壳40min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，烘干后，将蛋壳粉碎成末。
2)配置体积浓度为23％的乙酸水溶液；往10g的蛋壳粉末中，加入50g(约50ml)的配置好的乙酸水溶液，于10℃搅拌脱矿12小时；重复脱矿三次，使矿物质充分溶解。所述脱矿处理的搅拌速度为700转/分钟。
3)在12℃下，以40000xg离心力离心10min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O(重蒸水)洗涤，以40000xg离心力离心两次，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。
4)用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，所述透析袋分子截留量为10kDa，透析时间为12小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:30；用去离子水重复透析脱盐脱酸三次后，用ddH2O(重蒸水)透析脱盐脱酸8小时。
5)在12℃下，以6000xg离心力离心15min，将透析脱盐后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤2次，以6000xg离心力离心10min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
6)将所述第二上清液于超滤离心管中，所述超滤离心管分子截留量为8kDa，用6000xg离心力离心5min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
实施例4
一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)采用质量浓度为2％EDTA浸泡所述蛋壳40min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，烘干后，将蛋壳粉碎成末。
2)配置体积浓度为2％的乙酸水溶液；往10g的蛋壳粉末中，加入100g(约100ml)的配置好的乙酸水溶液，于20℃搅拌脱矿12小时；重复脱矿三次，使矿物质充分溶解。所述脱矿处理的搅拌速度为1000转/分钟。
3)在16℃下，以35000xg离心力离心25min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O(重蒸水)洗涤，以35000xg离心力离心两次，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。
4)用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，所述透析袋分子截留量为6kDa，透析时间为12小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:28；用去离子水重复透析脱盐脱酸三次后，用ddH2O(重蒸水)透析脱盐脱酸20小时。
5)在16℃下，以4000xg离心力离心35min，将透析脱盐后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤2次，以4000xg离心力离心15min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
6)将所述第二上清液于超滤离心管中，所述超滤离心管分子截留量为6kDa，用3000xg离心力离心30min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
实施例5
一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)采用质量浓度为8％EDTA浸泡所述蛋壳20min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，烘干后，将蛋壳粉碎成末。
2)配置体积浓度为15％的乙酸水溶液；往10g的蛋壳粉末中，加入60g(约60ml)的配置好的乙酸水溶液，于18℃搅拌脱矿10小时；重复脱矿三次，使矿物质充分溶解。所述脱矿处理的搅拌速度为800转/分钟。
3)在16℃下，以25000xg离心力离心20min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O(重蒸水)洗涤，以20000xg离心力再次离心15min，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。
4)用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，所述透析袋分子截留量为12kDa，透析时间为4小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:26；用去离子水重复透析脱盐脱酸三次后，用ddH2O(重蒸水)透析脱盐脱酸15小时。
5)在16℃下，以3000xg离心力离心40min，将透析脱盐后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤3次，以5000xg离心力离心15min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
6)将所述第二上清液于超滤离心管中，超滤离心管分子截留量为6kDa，用2500xg离心力离心20min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
实施例6
一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，该方法包括以下步骤：
1)采用质量浓度为6％EDTA浸泡所述蛋壳25min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，烘干后，将蛋壳粉碎成末。
2)配置体积浓度为12％的乙酸水溶液；往10g的蛋壳粉末中，加入80g(约80ml)的配置好的乙酸水溶液，于0℃搅拌脱矿8小时；重复脱矿三次，使矿物质充分溶解。所述脱矿处理的搅拌速度为900转/分钟。
3)在5℃下，以25000xg离心力离心20min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O(重蒸水)洗涤，以20000xg离心力再次离心15min，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。
4)用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，透析袋分子截留量为3kDa，透析时间为6小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:22；用去离子水重复透析脱盐脱酸三次后，用ddH2O(重蒸水)透析脱盐脱酸12小时。
5)在5℃下，以4500xg离心力离心30min，将透析脱盐后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤3次，以6000xg离心力离心15min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
6)将所述第二上清液于超滤离心管中，超滤离心管分子截留量为12kDa，用5000xg离心力离心40min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求或等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。
Claims (10)
1.一种禽类蛋壳中有机基质的提取方法，其特征在于，所述方法包括：
采用EDTA去除蛋壳外表面有机物质及内表面壳膜，并粉碎成末；
往粉碎后的蛋壳粉末中加入体积浓度2-23％的乙酸水溶液，对所述蛋壳进行脱矿处理；
在16℃以下，将脱矿处理后的溶液经离心分离出第一上清液和第一沉淀物，所述第一沉淀物即为酸不溶性有机基质。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述采用EDTA去除蛋壳外表面有机物质及内表面壳膜，并粉碎成末具体包括：
采用重量浓度为2-10％EDTA浸泡所述蛋壳10-40min后，洗去所述蛋壳外表面的有机物质和内表面的壳膜，晾干/烘干后，将蛋壳粉碎成末。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述往粉碎后的蛋壳粉末中加入体积浓度2-23％的乙酸水溶液，对所述蛋壳进行脱矿处理具体包括：
配置体积浓度为2-23％的乙酸水溶液；
往100重量份的蛋壳粉末中，加入500-1000重量份的配置好的乙酸水溶液，于20℃以下搅拌脱矿4-12小时；按照相同处理先后共3次加入配置好的乙酸水溶液，以使矿物质充分溶解。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述脱矿处理的搅拌速度为500-1200转/分钟。
5.根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述在16℃以下，将脱矿处理后的溶液经离心分离出第一上清液和第一沉淀物，具体包括：
在16℃以下，以20000-40000xg离心力离心10-30min，分离出第一上清液和第一沉淀物，将第一沉淀物用ddH2O洗涤，以20000-40000xg离心力离心两次，将第一沉淀物冻干得酸不溶性有机基质。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括：
将所述第一上清液用透析袋进行透析脱盐脱酸；
在16℃以下，将透析脱盐脱酸后的溶液进行离心分离出第二上清液和第二沉淀物，所述第二沉淀物即为水不溶性有机基质。
7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述将所述第一上清液用透析袋进行透析脱盐脱酸，具体包括：用去离子水对所述第一上清液进行透析脱盐脱酸，所述透析袋分子截留量为2-15kDa，透析时间为4-12小时，所述第一上清液与所述去离子水的体积比为1:(20-30)；用去离子水重复透析脱盐脱酸三次后，用ddH2O透析脱盐脱酸4-20小时。
8.根据权利要求6或7所述的提取方法，其特征在于，所述在16℃以下，将透析脱盐脱酸后的溶液进行离心分离出第二上清液和第二沉淀物，所述第二沉淀物即为水不溶性有机基质，具体包括：
在16℃以下，以2000-6000xg离心力离心10-60min，将透析脱盐脱酸后的溶液离心分离出第二上清液和第二沉淀物，将第二沉淀物洗涤1次以上，以2000-6000xg离心力离心10-60min后，将第二沉淀物冻干，获得水不溶性有机基质。
9.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括：
将第二上清液用超滤离心管进行浓缩，获得水和酸兼溶性有机基质。
10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述将第二上清液用超滤离心管进行浓缩，获得水和酸兼溶性有机基质，具体包括：将所述第二上清液于超滤离心管中，所述超滤离心管分子截留量为2-15kDa，用2000-6000xg离心力离心5-60min，将所述第二上清液浓缩后冻干，得水和酸兼溶性有机基质。
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